DE10006175A1 - Verwendung von Neuregulin-beta - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft u. a. die Verwendung von Neuregulin-beta in einem Screening-Verfahren für Wirkstoffe als Target, insbesondere die Verwendung von Neuregulin-beta in einem Screening-Verfahren für Wirkstoffe als Target zur Beeinflussung von von Glutamatrezeptoren vermittelten Calcium-Konzentrationsänderungen, insbesondere die Verwendung von Neuregulin-beta in einem Screening-Verfahren für Wirkstoffe als Target, wobei das Screening-Verfahren ein Verfahren zur Erfassung von multidimensionalen Funktionsdaten für die Effekt-/Effektraum-Analyse von Wirkstoffen ist, DOLLAR A - bei dem in eine Fließzell-Vorrichtung eingebrachte und auf Substraten aufgebrachte Zellkultursysteme mit jeweils geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen und/oder mit Isotopengemischen verschiedener Elemente inkubiert, DOLLAR A - die Zellkultursysteme stimuliert und DOLLAR A - zeitlich synchron die in Abhängigkeit von den Stimulationsbedingungen resultierenden Fluoreszenzsignale direkt am Zellkultursystem zeitlich aufgelöst erfaßt und/oder die Isotopengemische im Perfusat zeitlich aufgelöst erfaßt und/oder die Isotopengemische direkt an den Zellkultursystemen zeitlich integtral erfaßt werden, DOLLAR A - wobei eine synchronisierte Fraktionierung und weitergehende Analyse des Perfusates, DOLLAR A - eine Charakterisierung und Identifizierung von sich unter den gewählten Bedingungen verändernden und/oder spezifisch verhaltenden Proteinen der Zellkultursysteme und DOLLAR A - schließlich eine Integration der gewonnenen multidimensionalen Funktionsdaten für die ...

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Neuregulin-β als Indikator und/oder Target in einem Screening-Verfahren für Wirkstoffe.

Neureguline (auch ARIA, neurogenic differentiation factors, Hereguline und GGF) gehören zu einer Familie weitverbreiteter und bekannter Wachstums- und Differenzierungsfaktoren. Beispielsweise ist in der Publikation von Ozaka M. et al, Nature 1997, Dec 10-25, 390(6661): 691-4 der induzierende Einfluß des Neuregulin-β auf die Expression der NR2C-Untereinheit des NMDA-Rezeptors beschrieben.

Seit einiger Zeit sind die Techniken der Proteom-Analyse eingeführt. Unter dem Begriff "Proteom" ist die Gesamtheit aller exprimierten Proteine einer Zelle eines Gewebes oder eines Organismus zu verstehen (siehe: "From Genome to Proteome" von Michael J. Dunn, 2000, Wiley/VCH, Weinheim; "Proteome Research, Two-Dimensional Gel-Elektrophoresis and Identification Methods" von Thierry Rabilloud, 2000, Springer-Verlag, Berlin; siehe auch: "Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics" von Marc R. Wilkins, u. a., 1997, Springer-Verlag, Berlin). Die Techniken der Proteom-Analyse sind die 2-D-PAGE (zweidimensionale Gelelektrophorese) zur Auftrennung der einzelnen Proteine in einer komplexen biologischen Probe und Methoden der Massenspektrometrie, insbesondere MALDI-TOF-MS (matrix-assisted laser desorption ionisation time of flight mass spectrometry) und ESI-MS (electro spray ionisation mass spectrometry) (siehe: "Mass Spectrometry: Principles and Applications", Edmond De Hoffmann, Jean Charette, Vincent Stroobant, Jul Trottier (August 1996), John Wiley & Sons, ISBN: 0471966975). Während auf dem Gebiet der Genome die entsprechenden Analyse-Techniken wohl als ausgereift gelten können, fehlen auf dem Gebiet der Proteome nach wie vor Techniken, die es einem erlauben, neben der eigentlichen Analyse von Proteinen und deren Bruchstücken auch die im Zusammenhang mit physiologischen Vorgängen stattfindenden komplexen zeitlichen Abläufe der verschiedensten Akionen und Wechselwirkungen auch zeitlich aufgelöst zu erfassen und somit Rückschlüsse auf die eigentlichen kinetischen Vorgänge und die zugrundeliegenden Interaktionen und deren Partner zu ziehen. Auf diesem Wege wäre es möglich, gezielt pharmazeutische Wirkstoffe zu testen.

In diesem Zusammenhang wird erfindungsgemäß unter dem Begriff "Effektraum- /Effektorraum-Analyse" folgendes verstanden:

Ein Effektraum ist definiert durch ein Koordinatensystem, bei dem jede Koordinate die möglichen Größen oder Amplituden eines Effekts repräsentieren, z. B. die möglichen Konzentrationen des intrazellulären Calciums, die unter physiologischen und pathophysiologischen Umständen in einer Nervenzelle erreicht werden können. Alle in Betracht zu ziehenden Effekte bilden dann den Effektraum, bei drei möglichen Effekten ist ein solcher Effektraum dreidimensional, bei n Effekten n-dimensional.

Gleiches gilt für die Betrachtung der Konzentrationen von Effektoren, z. B. Neurotransmittern etc. Die "Effektraum-/Effektorraum-Analyse" integriert experimentelle Bestimmungen/Messungen zu den Konditionen von Effekten und Effektoren in einem gegebenen System im Hinblick auf den medizinisch/physiologisch interessanten Übergang zwischen Effektraum und Effektorraum, der durch Affinitäten, Reaktions- und Transport- und andere kinetische Parameter definiert wird.

Beim Screening von Wirkstoffen ist mindestens ein Parameter, also ein Indikator oder ein Target, für den betrachteten Effektraum eines Zellsystems notwendig, um das Screening als solches zu ermöglichen. Daneben können jedoch unabhängig hiervon bzw. als quasi Vorstufe zum Screening durch genaue Beobachtung und Auswertung der einzelnen Ergebnisse mittels Korrelationsanalyse auch Indikatoren und/oder Targets ermittelt werden. Unter Indikatoren im erfindungsgemäßen Sinne werden Stoffe bezeichnet, die in einem Effektraum einen Parameter darstellen, da sie bei zu untersuchenden physiologischen Vorgängen aktiv in Erscheinung treten, beispielsweise durch Konzentrationsänderung und somit quasi sichtbar und effektraumgebunden bzw. systemgebunden eben einen Indikator darstellen. Im allgemeinen werden die zu untersuchenden Zellsysteme mit einer bestimmten Substanz stimuliert, beispielsweise mit Glutamat, die Ergebnisse aufgezeichnet, miteinander korreliert und ggfs. neue Indikatoren herausgefunden. Die Indikatoren stehen dabei in der Regel nicht direkt sondern über mehrere Schritte indirekt kausal mit den Stimulierungen in Verbindung. Unter dem Begriff Target werden erfindungsgemäß Stoffe bezeichnet, die in einem Effektraum einen Parameter darstellen, da sie bei zu untersuchenden physiologischen Vorgängen aktiv in Erscheinung treten, beispielsweise durch Konzentrationsänderung und somit quasi sichtbar und effektraumgebunden bzw. systemgebunden eben einen speziellen Typ von Indikator darstellen. Im allgemeinen werden die zu untersuchenden Zellsysteme mit einer bestimmten Substanz stimuliert, beispielsweise mit Glutamat, die Ergebnisse aufgezeichnet, miteinander korreliert und ggfs. diese neuen speziellen Indikatoren herausgefunden. Diese speziellen Indikatoren, nämlich die Targets, stehen dabei in der Regel nicht über mehrere Schritte indirekt - wie bei den eigentlichen Indikatoren - sondern direkt kausal mit den Stimulierungen in Verbindung. Somit ist jeder Indikator potentiell ein Target und umgekehrt; dies hängt selbstverständlich vom zu untersuchenden Zellsystem und dem Effektraum ab.

Problem der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine solche Zielstruktur in einem Screening- Verfahren für Wirkstoffe bereitzustellen.

Dieses Problem wird durch Verwendungen nach den Ansprüchen 1, 2 und 3 gelöst.

Zunächst geht es erfindungsgemäß um die Verwendung von Neuregulin-β als Indikator und/oder Target in einem Screening-Verfahren für Wirkstoff. Es konnte überraschenderweise gezeigt werden, daß Neuregulin-β als Indikator und/oder Target in einem solchen Screening- Verfahren eingesetzt werden kann.

Darüberhinaus geht es um die Verwendung von Neuregulin-β als Indikator und/oder Target in einem Screening-Verfahren für Wirkstoffe zur Beeinflussung von von Glutamatrezeptoren vermittelten Calcium-Konzentrationsänderungen (unter Calcium ist hier Ca²⁺ zu verstehen).

Schließlich geht es um die Verwendung von Neuregulin-β als Indikator und/oder Target in einem Screening-Verfahren für Wirkstoffe, wobei das Screening-Verfahren ein Verfahren zur Erfassung von multidimensionalen Funktionsdaten für die Effektraum-/Effektorraum-Analyse von Wirkstoffen ist.

Bei dem Verfahren zur Erfassung von multidimensionalen Funktionsdaten für die Effekt- /Effektraum-Analyse von Wirkstoffen werden zunächst in eine Fließzell-Vorrichtung eingebrachte und auf Substraten aufgebrachte Zellkultursysteme mit jeweils geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen und/oder mit Isotopengemischen verschiedener Elemente inkubiert. Anschließend werden die Zellkultursysteme stimuliert und zeitlich synchron die in Abhängigkeit von den Stimulationsbedingungen resultierenden Fluoreszenzsignale direkt am Zellkultursystem zeitlich aufgelöst erfaßt und/oder die Isotopengemische im Perfusat zeitlich aufgelöst erfaßt und/oder die Isotopengemische direkt an den Zellkultursystemen zeitlich integral erfaßt, wobei eine synchronisierte Fraktionierung und weitergehende Analyse des Perfusates, eine Charakterisierung und Identifizierung von sich unter den gewählten Bedingungen verändernden und/oder spezifisch verhaltenden Proteinen der Zellkultursysteme und schließlich eine Integration der gewonnenen multidimensionalen Funktionsdaten für die Effektraum-/Effektorraum-Analyse von Wirkstoffen vorgenommen wird.

Erfindungsgemäß sind unter den Begriffen "LTP" und "LTD" "Langzeit-Potenzierung" und "Langzeit-Depression" zu verstehen. Es konnte überraschenderweise die direkte Beteiligung von Neuregulin-β an neuronalen Langzeit-Prozessen gezeigt werden, die durch glutamat- induzierte Änderungen der intrazellulären Calcium-Konzentrationen über die NMDA- Rezeptoren vermittelt wird (allgemeine Literaturhinweise: Anwyl R., "The robe of amino acid receptors in synaptic plasticity", in: Cortical plasticity, LTP and LTD (Fazeli M. S. & Collingride G. L. eds.) Bios. Scientific Publishers, Oxford, 9-28 (1996); Cormier, R. J., Mauk, M. D. & Kelly, P. "Glutamate iontophoresis induces long-term potentiation in the absence of evoked presynaptic activity", Neuron 10, 907-919 (1993); Malgaroli, A. & Tsien, R. W. "Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons", Nature 357, 134-139 (1992); Soskic-V, Gorlach M., Poznanovic S., Boehmer F. D., Godovac-Zimmermann J., "Functioncal proteomics analysis of signal transduction pathways of the platelet-derived growth factor beta receptor", Biochemistry 38, 1757-64 (1999); Wong et al., "The anticonvulsant MK-801 is a potent NMDA antagonist", Proc. Natl Acad Sci USA 83, 7104-7106 (1986)).

Erfindungswesentlich ist die Tatsache, daß lediglich und auf überraschende Art und Weise nur mit Hilfe der speziellen und synchronen Zusammenschaltung der oben genannten Arbeitsschritte es erstmals möglich ist, die hohen Anforderungen an die Reproduzierbarkeit der einzusetzenden Analysetechniken für solch zu untersuchende Zellsysteme zu gewährleisten (es handelt sich um chaotische Systeme). Eine sukzessive Anwendung der einzelnen Analyseschritte würden nicht zu den gewünschten auswertbaren Ergebnissen führen.

Zunächst ist es vorteilhaft, wenn das Neuregulin-β als Indikator und/oder Target zur Beeinflussung von LTP, LTD, epileptoformen und/oder epileptogenen Ereignissen und/oder erregungs-toxischen Phänomenen eingesetzt wird, da aus den unten gezeigten Ergebnissen hervorgeht, daß Neuregulin-β ein charakteristischer Schlüsselfaktor bei den gedächtnis­ relevanten physiologischen Phänomenen LTP/LTD ist.

Es ist vorteilhaft, wenn die Zellkultursysteme auf in die Fließzell-Vorrichtung zu applizierende Objektträger kultiviert werden, da nur so gewährleistet ist, daß die Zellen auf schnellstmöglichem Weg intakt und ohne Ablösungen den Funktionstests zugeführt wird.

Weiterhin ist es von Vorteil, wenn die in die Fließzell-Vorrichtung eingebrachte Zellkultursysteme zunächst mikroskopisch charakterisiert werden, um die basalen Voraussetzungen für weitere funktionelle Anwendungen zu überprüfen.

Die mikroskopische Charakterisierung ist vorteilhafterweise eine morphologische Charakterisierung im Phasenkontrast oder eine video-mikroskopische Erfassung vom Zellverhalten unter Einfluß verschiedener physikalischer Parameter und/oder in Abhängigkeit von den Substraten, da die genannten Parameter am besten eine schnelle Einschätzung der Intaktheit und Lebensfähigkeit der Zellen erlauben.

Die Inkubation wird in vorteilhafter Weise, da in der Praxis bewährt, mittels Fura-2, Indo-1, Bis-Fura-2, Quin-2 und Derivate, Mag-Fura-2, Mag-Fura-5 oder Mag-Indo-1 als Fluoreszenzfarbstoff durchgeführt. Darüberhinaus sind noch weitere Fluoreszenzfarbstoffe wie beispielsweise Anthracen-9,10-dipropionsäure einsetzbar. Bei den zuerst genannten Namen handelt es sich um Trivialnamen allgemein bekannter Fluoreszenzfarbstoffe sind, die auch im Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6^th edition, R. P. Haugland, 1996, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA aufgeführt sind.

Die Inkubation wird vorteilhafterweise mittels eines Isotopengemisches in Form von Ionen oder Verbindungen mindestens eines der Elemente Wasserstoff, Calcium, Magnesium, Zink, Mangan, Selen, Kupfer, Cadmium, Cobalt, Kohlenstoff, Stickstoff, Eisen, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor durchgeführt, da diese Elemente die wichtigsten Elemente sind, die in lebenden Systemen vorkommen.

Es ist von Vorteil, wenn die Stimulation mittels Liganden von glutamatergen, GABA-ergen, cholinergen Liganden durchgeführt wird, da sich diese in der Praxis bewährt haben. Weiterhin sind Liganden für Serotonin-, Catecholamin-, Opioid-, Melatonin-, Peptid-Rezeptoren, spannungsgesteuerte Ionen-Kanäle, Transportsysteme für Neurotransmitter, Ionen und Metabolite denkbar. Als Agonisten sind insbesondere Acetylcholin und Nicotin zu nennen.

Weiterhin ist es von Vorteil, wenn die zeitlich aufgelöste Erfassung der Isotopengemische im Perfusat mittels ICP-MS und/oder die zeitlich integrale Erfassung der Isotopengemische mittels ICP-MS durchgeführt wird, da es zum einen möglich ist, zeitgleiche extrem empfindliche Konzentrationsmessungen beliebiger Elemente durchzuführen und zum anderen bei Verwendung geeigneter stabiler Isotopenmarker kompartiment-spezifische Verteilungen bestimmter Elemente/Ionen zu analysieren.

Außerdem wird in vorteilhafterweise die weitergehende Analyse des Perfusates mittels Fluoreszenz-HPLC und/oder mit Hilfe von enzymgekoppelten Säulen und/oder elektrochemisch oder fluorometrisch (siehe hierzu: Klapproth H., Reinheimer T., Metzen J., Munch M., Bittinger F., Kirkpatrick C. J., Hohle K. D., Schemann M., Racke K., Wessler I., 1997, Non-neuronal acetylcholine, a signalling molecule synthezised by surface cells of rat and man, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol., 355(4): 515-23; oder Rieny J., Tucek S., Vins I., 1992, Sensitive method for HPLC determination of acetylcholine, choline and their analogues using fluorometric detection, J. Neurosci Methods, 41(1): 11-17) und/oder massenspektrometrisch, beispielsweise mittels EI-MS (Elektronenstoß-Ionisations- Massenspektrometrie; Proben werden durch einen Elektronenstrahl ionisiert), FAB-MS (fast atom bombardement mass spectrometry: Proben werden durch Beschuß mit Edelgas-Atomen ionisiert), FD-MS (Feld-Desorptions-Massenspektrometrie; unter dem Einfluß hoher elektrischer Felder werden von einem Draht, auf den eine feste Probe aufgetragen ist, positive Ionen desorbiert und analysiert), MALDI-TOF-MS und ESI-MS durchgeführt, da sich diese Methoden in der Praxis bewährt haben.

Es ist von Vorteil, wenn bei der Analyse das Perfusat mit Fluoreszenzlabeln derivatisiert und anschließend über HPLC mit einem Fluoreszenzdetektor identifiziert und quantifiziert werden, da auf diese Weise die erforderlichen hohen Empfindlichkeiten erreicht werden, um in den relativ kleinen Volumina der Fließzell-Vorrichtung die in Frage kommenden Stoffe in einem Arbeitsgang nachweisen (1-50 Femto-Mole).

Folgende Ausführungsformen haben sich in vorteilhafter Weise in der Praxis bewährt:

Bei der Analyse von Aminosäuren werden diese mit o-Phthaldialdehyd und 2- Mercaptoethanol unter alkalischen Bedingungen derivatisiert und anschließend identifiziert. Bei der Analyse von Catecholaminen werden diese mit Benzylamin unter Einfluß von Kaliumhexacyanoferrat zu fluoreszierenden Verbindungen derivatisiert und anschließend identifiziert. Bei der Analyse von Acetylcholin und Cholin werden diese elektrochemisch mit Hilfe einer enzymgekoppelten Säule detektiert. Bei der Analyse von Nukleotiden, insbesondere Adenin-Nukleotiden, werden diese durch Reaktion mit Chloracetaldehyd derivatisiert und als Etheno-Verbindungen detektiert.

Die Charakterisierung und Identifizierung von sich unter den gewählten Bedingungen verändernden und/oder spezifisch verhaltenden Proteinen der Zellkultursysteme wird mittels 2-D-Page und MALDI-TOF-MS und/oder ESI-MS durchgeführt, da sich diese Methoden in der Praxis bewährt haben.

Es ist von Vorteil, wenn alle Messungen temperaturkontrolliert durchgeführt werden, da Änderungen der Temperatur um 0,5-1°C, insbesondere im Zentralnervensystem, eine wichtige physiologische Rolle spielen (siehe: Kavanau, J. L., "Memory, sleep and the evolution of mechanisms of synaptic efficacy maintenance", 1997, Neuroscience, 79, 7-44).

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Zellwachstum und Zellverhalten auf und bezüglich für die Zellkultursysteme verwendeten Trägern analysiert werden, so daß in vorteilhafter Weise alle interessierenden Eigenschaften der Trägermaterialien, insbesondere in Bezug auf künstliche Ersatzstoffe in der Implantationsmedizin aber auch in Bezug auf die Authentizität von Zellkultursystemen für ihren jeweiligen Krankheits- oder Gewebe- Modellcharakter, analysiert werden können und folglich eine Validierung der verwendeten Modellsysteme möglich ist.

Aus dem Stand der Technik bekannt sind Fließzell-Vorrichtungen (Firma GlycoTech Corporation; siehe www.Glycotech.com), die insbesondere eine Kammerhöhe von ca. 150 µm aufweisen, die aber für die erfindungsgemäßen Zwecke nicht geeignet sind.

Eine erfindungsgemäße Fließzell-Vorrichtung, insbesondere für den Einsatz in Verfahren zur Erfassung von multidimensionalen Funktionsdaten für die Effektraum-/Effektorraum-Analyse von Wirkstoffen, mit Grundplatte mit Strömungskanal, Oberplatte und Verschlußring, ist dadurch gekennzeichnet, daß die von der Grundplatte mit Strömungskanal und der aufliegenden Deckplatte gebildeten Kammer eine Kammerhöhe von 30 bis 100 µm aufweist. Die individuell einstellbare Kammerhöhe ist in vorteilhafter Weise mittels in mindestens einer der beiden Platten (Ober- und Grundplatte) einzulassenden Stiften, insbesondere aus Metall oder Teflon, zu realisieren.

Mit einer solchen Fließzell-Vorrichtung ist es erstmals möglich durch die spezifische Ausgestaltung, insbesondere niedermolekulare Transmitterfreisetzungen durch neuronale Zellen nachzuweisen. Durch ein besonders günstiges Zellen-/Volumen-Verhältnis ist eine physiologische Scherrate der Flüssigkeit auf den Zellen überraschenderweise überhaupt erst realisierbar. Physiologische Scherraten sind diejenigen Scherraten, wie sie beispielsweise in Blutgefäßen oder anderen biologischen Hohlräumen, in denen sich bewegte Flüssigkeiten befinden, auftreten können (0,1-5 Pa). Durch die sehr hoch ausgeprägte Strömungslaminarität sind gleichmäßige Verteilungen von Wirkstoffen und gleichmäßige Bedingungen an nahezu allen Punkten der Durchfließ-Vorrichtung vorhanden. Darüberhinaus ist eine unmittelbare Lyse von Präparaten möglich.

Mit dieser Fließzell-Vorrichtung ist es erstmals möglich, die sehr hohen Anforderungen bezüglich der Empfindlichkeit der abgegebenen Stoffe so zu erfüllen, daß zuverlässige Konzentrationsaussagen bezüglich dieser Stoffe möglich sind (bei zu großen Volumina wären die Konzentrationen der einzelnen Stoffe zu gering).

Zunächst ist es vorteilhaft, wenn die Kammerhöhe der Fließzell-Vorrichtung 30 bis 50 µm beträgt, da so ein für die Mikroskopie optimaler Objektabstand im Hinblick auf hohe Vergrößerungen und große Lichtausbeuten gewährleistet wird. Außerdem wird durch das kleine Volumen der Fließzell-Vorrichtung eine zu große Verdünnung der durch die Zellen abgegebenen Stoffe verhindert; desweiteren ergibt sich durch diese Geometrie eine sehr günstige Reynold-Zahl für laminare Strömung.

In vorteilhafter Weise sind die Zu- und Ableitungen nahezu in der Strömungskanal-Ebene angeordnet, um Turbulenzen zu vermeiden.

In vorteilhafter Weise sind die Innenoberflächen der Kammer nahezu planar ausgebildet, da auf diese Art und Weise gleichmäßige Bedingungen in Bezug auf Druck, Scherraten und die Mikroskopie (Justierung der Ebenen) zu gewährleisten sind.

Weiterhin weist die Fließzell-Vorrichtung zusätzlich ein Objektträger-Aufnahmerahmen zwischen Grund- und Oberplatte auf, um Norm-Objektträger aufnehmen zu können. Dies stellt eine Kompatibilität mit Laborautomaten für die Histologie und/oder Immuncytochemie sicher.

Der Objektträger-Aufnahmerahmen ist metallisch, um in vorteilhafter Weise hohe mechanische Festigkeit und Verbindungssteifigkeit zu erreichen und eine Sterilisation bei T <= +100°C zu ermöglichen.

Die Fließzell-Vorrichtung weist vorteilhafterweise eine elastische Dichtung zwischen Grund- und Oberplatte auf, da so ein definierter Abstand und die Dichtigkeit der Kammer gewährleistet sind.

Es ist von Vorteil, wenn die elastische Dichtung aus Silikon besteht, weil dieses Material unter Standardbedingungen autoklavierbar ist und im Hinblick auf die Zellverträglichkeit neutrale Eigenschaften aufweist.

Die Grund- und/oder Oberplatte besteht vorteilhafterweise aus Polycarbonat, da dieses Material Transparenz (UV/Vis) für alle in Frage kommenden mikroskopischen Techniken gewährleistet.

Die Fließzell-Vorrichtung weist in bewährter Weise mehrere nahezu parallel angeordnete Kammern auf, um mehrere Wirkstoffe unter exakt gleichen Bedingungen im Hinblick auf die Zell-Populationen zu testen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich in besonderer Weise zum Screening für Wirkstoffe, insbesondere zur Ermittlung von Targets. Unter dem Begriff "Targets" werden Zielstrukturen verstanden. Hierbei handelt es sich um Proteine oder Metabolite, denen eine entscheidende Schlüsselfunktion bei einem krankheitsrelevanten physiologischen Prozeß zukommt und die sich deswegen besonders als Angriffsziel von Wirkstoffen qualifizieren.

Darüberhinaus eignen sich die verschiedenen Träger für Zellkultursysteme im erfindungsgemäßen Verfahren zur Analyse des Zellwachstums und Zellverhaltens.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Erfassung von multidimensionalen Funktionsdaten für die Effektraum-/Effektorraum-Analyse von Wirkstoffen, insbesondere zur Durchführung eines oben beschriebenen Verfahrens enthält:

• - eine Fließzell-Vorrichtung,
• - eine Einrichtung zur Stimulation der Zellkultursysteme,
• - eine Einrichtung zur synchronen und zeitlich aufgelösten direkten Erfassung von in Abhängigkeit von den Stimulationsbedingungen resultierenden Fluoreszenzsignalen an den Zellkultursystemen und/oder eine Einrichtung zur zeitlich aufgelösten Erfassung von Isotopengemischen im Perfusat und/oder eine Einrichtung zur zeitlich integralen Erfassung von Isotopengemischen direkt an den Zellkultursystemen,
• - eine Einrichtung zur synchronisierten Fraktionierung und weitergehenden Analyse des Perfusates,
• - eine Einrichtung zur Charakterisierung und Identifizierung von sich unter den gewählten Bedingungen verändernden und/oder spezifisch verhaltenden Proteinen der Zellkultursysteme und
• - eine Einrichtung zur Integration der gewonnenen multidimensionalen Funktionsdaten für die Effektraum-/Effektorraum-Analyse von Wirkstoffen.

Es ist aufgrund der oben beschriebenen vorteilhaften Eigenschaften von Vorteil, wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Fließzell-Vorrichtung der oben beschriebenen Art aufweist.

Die folgenden Ausgestaltungen haben sich in der Praxis bewährt und sind aus den zum erfindungsgemäßen Verfahren genannten Gründen als vorteilhaft anzusehen:

Die Einrichtung zur Stimulation der Zellkultursysteme ist ein computergesteuertes Applikationssystem.

Die Einrichtung zur synchronen und zeitlich aufgelösten direkten Erfassung von in Abhängigkeit von den Stimulationsbedingungen resultierenden Fluoreszenzsignalen an den Zellkultursystemen ist eine Fluoreszenzspektroskopie-Einrichtung.

Die Einrichtung zur zeitlich aufgelösten Erfassung von Isotopengemischen im Perfusat ist eine ICP-MS-Einrichtung (siehe hierzu: ICP Spectrometry and Ist Applications von Steve J. Hill (Herausgeber), 2000, CRC Press, ISBN: 0849397391).

Die Einrichtung zur zeitlich integralen Erfassung von Isotopengemischen direkt an den Zellkultursystemen ist eine ICP-MS-Einrichtung.

Die Einrichtung zur synchronisierten Fraktionierung und weitergehenden Analyse des Perfusates weist einen computergesteuertern Fraktionssammler und eine HPLC-Einrichtung mit Fluoreszenzdetektor und/oder eine Einrichtung mit enzymgekoppelten Säulen und/oder eine Einrichtung mit elektrochemischer oder fluorometrischer Detektion und/oder ein Massenspektrometer auf.

Die Einrichtung zur Charakterisierung und Identifizierung von sich unter den gewählten Bedingungen verändernden und/oder spezifisch verhaltenden Proteinen der Zellkultursysteme umfaßt eine 2-D-PAGE-Einrichtung und eine MALDI-TOF-MS-Einrichtung und/oder ESI- MS-Einrichtung.

Die Einrichtung zur Integration der gewonnenen multidimensionalen Funktionsdaten für die Effektraum-/Effektorraum-Analyse von Wirkstoffen ist eine datenbankgestützte Computer- Einrichtung.

Die Einrichtung zur Analyse des Zellwachstums und des Zellverhaltens auf und bezüglich für die Zellkultursysteme verwendeten Trägern ist eine computergestützte Bildanalyse- Einrichtung mit einem Videomikroskop.

Die Ergebnisse der erfindungsgemäßen Verwendungen können selbstverständlich auch als Zwischenergebnisse für Diagnoseverfahren verwendet werden. Die Ergebnisse dienen somit quasi als Entscheidungsgrundlage für das weitere Vorgehen bzw. bestimmen den weiteren Verlauf innerhalb eines bestimmten Diagnoseverfahrens.

Das nachfolgende Beispiel dient zur Erläuterung der Erfindung.

Anwendungsbeispiel Neuronale Zellkultur (aus Ratten-Hippocampus), LTP/LTD

Geeignete Zellkultursysteme, im Falle des Neuregulin-β hippocampale Primärkulturen aus prä- oder neonatalen Ratten (beschrieben in z. B. "Rat hippocampal neurons in low-density culture", K. Goslin, H. Asmussen, G. Banker; in "Culturing Nerve Cells, 2^nd edition 1998, S. 339 ff; K. Goslin and G. Banker, eds. MIT Press, Cambridge, Massachusetts, USA) werden auf den oben beschriebenen Objektträgern kultiviert, in die Flußzelle eingebracht und zunächst mikroskopisch charakterisiert (morphologische Aufnahmen etc. im Phasenkontrast).

Anschließend erfolgt die Inkubation der Zellen mit jeweils geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen (für die gedächtnisrelevanten Versuche an Neuronen, die zur Entdeckung der besonderen Funktion des Neuregulin-β geführt haben: Fura-2, ein calciumsensitiver Fluoreszenzfarbstoff).

Danach werden die Zellen über das computergesteuerte Applikationssystem (für die gedächtnisrelevanten Versuche an Neuronen, die zur Entdeckung des Neuregulin-β geführt haben: 100 µM Glutamat für 30 Sekunden) stimuliert.

Es erfolgt eine zeitlich aufgelöste Erfassung der Fluoreszenzsignale in einer großen Zahl von Zellen in Abhängigkeit von den Stimulationsbedingungen (Temperatur, Wirkstoff). Im Zusammenhang mit Neuregulin-β löst Glutamat einen Einstrom von Calcium-Ionen aus, der sich über die Wechselwirkung mit Fura-2 sehr empfindlich quantifizieren läßt.

Es findet quasi parallel dazu eine synchronisierte Fraktionierung und Analyse des Perfusates statt; im Falle von hippocampalen Neuronen von Neurotransmittern mittels HPLC mit Fluoreszenz-Detektion, im Falle von anderen niedermolekularen extrazellulären Komponenten mittels EI-MS und im Falle von stabilen Isotopen-Tracern und Metallionen mittels ICP-MS.

Darüberhinaus ist eine Immunfärbung der Zellen mit spezifischen Antikörpern gegen Oberflächenmarker zur weitergehenden Charakterisierung möglich.

Weiterhin findet eine Charakterisierung und Identifizierung von Proteinen statt, die sich unter den gewählten experimentellen Bedingungen verändern oder sonst auffällig verhalten mit den Techniken der Proteom-Forschung, nämlich mittels zwei-dimensionaler Gelelektrophorese, MALDI-TOF-MS und ESI-MS.

Schließlich findet eine Integration, d. h. eine Zusammenfassung, der gewonnenen multidimensionalen Funktionsdaten für die Effektraum-/Effektorraum-Analyse von Wirkstoffen statt.

Die Effektraum-/Effektorraum-Analyse ist eine Korrelationsanalyse bezüglich der einzelnen Vorgänge und den damit einhergehenden Konzentrationsänderungen bestimmter Stoffe.

Die folgenden Parameter wurden in dem beschriebenen Aufbau simultan bzw. eindeutig korrelierend bestimmt. Die Steigerung des Calciums-Einstroms in Neuronen hippocampalen Ursprungs (Beweis der neuronalen Identität durch die tau-Protein-Färbung derselben Zellen nach dem funktionellen Teil des Experiments) bei gleichbleibender Temperatur identifizieren den physiologischen Kontext (LTP-(Gedächtnis)-relevant). Damit einhergehend sind die gleichzeitigen Änderungen der Neurotransmitter-Freisetzung (GABA), des durch den stabilen Isotopen-Tracer ²⁶Mg nachgewiesenen Mg-Einstroms in die Zellen. Insbesondere das Auftreten von Neuregulin-β in der stimulierten Kondition ist ein neues und unerwartetes Ergebnis. Dieser Satz von Informationen ist dadurch erstmalig in einem gedächtnisrelevanten Zusammenhang erkannt worden. Neuregulin-β ist somit auch als potentielles Target für Wirkstoffe identifiziert, die in bezug auf Gedächtniskrankheiten getestet werden sollen. Mit dem vorgestellten Aufbau wird eine wesentlich höhere Informationsdichte erreicht als in herkömmlichen Screening-Verfahren, wo meist nur einzelne Parameter in Verbindung mit Wirkstoffen untersucht werden.

Der stabile Isotopen-Tracer ist im Anwendungsbeispiel ²⁶Mg. Zur Immunfärbung wurde ein anti-tau-Antikörper (beispielsweise durch SIGMA zu erhalten) verwendet.

Es zeigen:

Fig. 1 - eine Aufsicht einer erfindungsgemäßen Fließzell-Vorrichtung,

Fig. 2 - ein Querschnitt einer in Fig. 1 gezeigten Fließzell-Vorrichtung,

Fig. 3 - eine Aufsicht einer weiteren Fließzell-Vorrichtung.

Fig. 4 - ein 2-D-PAGE von glutamat-induzierten Änderungen hippocampaler Proteine,

Fig. 5 - eine Identifikation von Neuregulin-β durch MS/MS-Analyse mittels ESI-MS.

Fig. 1 ist eine Aufsicht einer erfindungsgemäßen Fließzell-Vorrichtung. Eine Grundplatte (1) weist einen Strömungskanal (2) auf. Auf der Grundplatte (1) liegt zentrosymmetrisch ein Verschlußring (4). Weiterhin ist ein auf der Grundplatte (1) liegender Objektträger-Aufnahmerahmen (7) zu erkennen.

Fig. 2 ist ein Querschnitt einer in Fig. 1 gezeigten Fließzell-Vorrichtung. Dort sind neben den oben erwähnten Merkmalen weiterhin die folgenden zu erkennen: Der Verschlußring (4) klemmt die Grundplatte (1) mit einer Oberplatte (3) mit Hilfe einer Silikondichtung (8) abdichtend zusammen. (Nicht näher eingezeichnete) in beide Platten (1, 3) eingelassene Stifte sorgen für eine gewisse Beabstandung und somit Festlegung einer Kammerhöhe. Der nunmehr mittels der Oberplatte (3) von oben geschlossene Strömungskanal (2) bildet eine Kammer, die eigentliche Kammer, in der die Wechselwirkungen zwischen Zellkulturen und über Zu- und Ableitungen (5, 6) ein- und abfließenden Strömungsmedien stattfinden.

Fig. 3 ist eine Aufsicht einer weiteren Fließzell-Vorrichtung. Dort sind schematisch insgesamt drei Strömungskanäle (2) zu erkennen.

In Fig. 4 ist ein 2-D-PAGE von glutamat-induzierten Änderungen hippocampaler Proteine zu erkennen. Hippocampale Zellen wurden mit Stimulationspuffer stimuliert (in mM): NaCl (125), KCL (5), CaCl₂ (2-6), MgCl₂ (0,8), Glucose (5-10), HEPES (20), L-Glutamat (0,01-­ 0,1), Glycin (0,01), Bicucullin (0,01), pH 7,2; (A = Kontrolle, B = Glutamat, C = Glutamat + MK-801; MK-801 ist ein spezifischer Glutamatrezeptor-Antagonist). Funktionelle Meß- bzw. Kontrollgröße war dabei ein mit Fura-2 gemessenes Fluoreszenz-Signal, welches proportional zur Calciumkonzentration ist (alle Stoffe sind in Chemikalienkatalogen von Torris oder Sigma nachlesbar.)

Die auffälligste und konsistenteste Änderung ist mit einem Pfeil markiert: Neu-β (32 kDa, pI = 4,7 (isoelektrischer Punkt)) ist in erheblich größerer Menge in der stimulierten Kondition zu beobachten und in den Kontrollen nur schwach oder gar nicht zu finden.

In Fig. 5 ist eine Identifikation von Neuregulin-β durch MS/MS-Analyse mittels ESI-MS zu erkennen.

Ausgewählte Peptide der MALDI-MS wurden zur Aminosäure-Sequenzierung mit ESI-MS fragmentiert. (MALDI, ESI-Sequenzierung wie in Soskic V., Görlach M, Poznanovic S., Boehmer FD, Godovac-Zimmermann J., "Functional proteomics analysis of signal transduction pathways of the platelet-derived growth factor beta receptor" (1999), Biochemistry 38, 1757-1764; oder "Proteome Research, Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods" von Thierry Rabilloud, 2000, Springer-Verlag, Berlin). Die erhaltenen Sequenzen identifizieren eindeutig ein Neuregulin-β (Details, siehe Tabelle 1).

Claims (46)

1. Verwendung von Neuregulin-β als Indikator und/oder Target in einem Screening- Verfahren für Wirkstoffe.

2. Verwendung von Neuregulin-β als Indikator und/oder Target in einem Screening- Verfahren für Wirkstoffe zur Beeinflussung von von Glutamatrezeptoren vermittelten Calcium-Konzentrationsänderungen.

3. Verwendung von Neuregulin-β als Indikator und/oder Target in einem Screening- Verfahren für Wirkstoffe, wobei das Screening-Verfahren ein Verfahren zur Erfassung von multidimensionalen Funktionsdaten für die Effekt-/Effektraum-Analyse von Wirkstoffen ist,

• - bei dem in eine Fließzell-Vorrichtung eingebrachte und auf Substraten aufgebrachte Zellkultursysteme mit jeweils geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen und/oder mit Isotopengemischen verschiedener Elemente inkubiert,
• - die Zellkultursysteme stimuliert und
• - zeitlich synchron die in Abhängigkeit von den Stimulationsbedingungen resultierenden Fluoreszenzsignale direkt am Zellkultursystem zeitlich aufgelöst erfaßt und/oder die Isotopengemische im Perfusat zeitlich aufgelöst erfaßt und/oder die Isotopengemische direkt an den Zellkultursystemen zeitlich integral erfaßt werden,
• - wobei eine synchronisierte Fraktionierung und weitergehende Analyse des Perfusates,
• - eine Charakterisierung und Identifizierung von sich unter den gewählten Bedingungen verändernden und/oder spezifisch verhaltenden Proteinen der Zellkultursysteme und
• - schließlich eine Integration der gewonnenen multidimensionalen Funktionsdaten für die Effektraum-/Effektorraum-Analyse von Wirkstoffen vorgenommen wird.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Neuregulin-β als Indikator und/oder Target zur Beeinflussung von LTP, LTD, epileptoformen und/oder epileptogenen Ereignissen und/oder erregungs-toxischen Phänomenen eingesetzt wird.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Neuregulin-β als Indikator und/oder Target zur Beeinflussung von von Glutamatrezeptoren vermittelten Calcium-Konzentrationsänderungen eingesetzt wird.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß beim Verfahren die Zellkultursysteme auf in die Fließzell-Vorrichtung zu applizierende Objektträger kultiviert werden.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die in die Fließzell-Vorrichtung eingebrachte Zellkultursysteme zunächst mikroskopisch charakterisiert werden.

8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die mikroskopische Charakterisierung eine morphologische Charakterisierung im Phasenkontrast oder eine video-mikroskopische Erfassung vom Zellverhalten unter Einfluß verschiedener physikalischer Parameter und/oder in Abhängigkeit von den Substraten ist.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation mittels Fura-2, Indo-1, Bis-Fura-2, Quin-2 und Derivate, Mag-Fura-2, Mag- Fura-5 oder Mag-Indo-1 als Fluoreszenzfarbstoff durchgeführt wird.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation mittels eines Isotopengemisches in Form von Ionen oder Verbindungen mindestens eines der Elemente Wasserstoff, Calcium, Magnesium, Zink, Mangan, Selen, Kupfer, Cadmium, Cobalt, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Eisen, Schwefel und Phosphor durchgeführt wird.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Stimulation mittels glutamatergen, GABA-ergen, cholinergen Liganden durchgeführt wird.

12. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die zeitlich aufgelöste Erfassung der Isotopengemische im Perfusat mittels ICP-MS durchgeführt wird.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die zeitlich integrale Erfassung der Isotopengemische mittels ICP-MS durchgeführt wird.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die weitergehende Analyse des Perfusates mittels Fluoreszenz-HPLC und/oder mit Hilfe von enzymgekoppelten Säulen und/oder elektrochemisch oder fluorometrisch und/oder massenspektrometrisch durchgeführt wird.

15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Analyse das Perfusat mit Fluoreszenzlabeln derivatisiert und anschließend über HPLC mit einem Fluoreszenzdetektor identifiziert und quantifiziert werden.

16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Analyse von Aminosäuren diese mit o-Phthaldialdehyd und 2-Mercaptoethanol unter alkalischen Bedingungen derivatisiert und anschließend identifiziert werden.

17. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Analyse von Catecholaminen diese mit Benzylamin unter Einfluß von Kaliumhexacyanoferrat zu fluoreszierenden Verbindungen derivatisiert und anschließend identifiziert werden.

18. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Analyse von Acetylcholin und Cholin diese elektrochemisch mit Hilfe einer enzymgekoppelten Säule detektiert werden.

19. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Analyse von Nukleotiden, insbesondere Adenin-Nukleotiden, diese durch Reaktion mit Chloracetaldehyd derivatisiert und als Etheno-Verbindungen detektiert werden.

20. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Charakterisierung und Identifizierung von sich unter den gewählten Bedingungen verändernden und/oder spezifisch verhaltenden Proteinen der Zellkultursysteme mittels 2- D-Page und MALDI-TOF-MS und/oder ESI-MS durchgeführt wird.

21. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß alle Messungen temperaturkontrolliert durchgeführt werden.

22. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellwachstum und Zellverhalten auf und bezüglich für die Zellkultursysteme verwendeten Trägern analysiert wird.

23. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fließzell-Vorrichtung eingesetzt wird, mit: Grundplatte (1) mit Strömungskanal (2), Oberplatte (3) und Verschlußring (4), wobei die von der Grundplatte (1) mit Strömungskanal (2) und der aufliegenden Deckplatte (3) gebildeten Kammer eine Kammerhöhe von 30 bis 100 µm aufweist.

24. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß daß die Kammerhöhe individuell mittels in mindestens einer der beiden Platten einzulassenden Stiften einstellbar ist.

25. Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Kammerhöhe 30 bis 50 µm beträgt.

26. Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Zu- und Ableitungen (5, 6) nahezu in der Strömungskanal-Ebene angeordnet sind.

27. Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Innenoberflächen der Kammer nahezu planar ausgebildet sind.

28. Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß diese zusätzlich ein Objektträger-Aufnahmerahmen (7) zwischen Grund- und Oberplatte (5, 6) aufweist.

29. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Objektträger- Aufnahmerahmen (7) metallisch ist.

30. Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß diese eine elastische Dichtung (8) zwischen Grund- und Oberplatte (1, 3) aufweist.

31. Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die elastische Dichtung (8) aus Silikon besteht.

32. Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Grund- und/oder Oberplatte (5, 6) aus Polycarbonat besteht.

33. Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Fließzell-Vorrichtung mehrere nahezu parallel angeordnete Kammern aufweist.

34. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung zur Erfassung von multidimensionalen Funktionsdaten für die Effekt- /Effektraum-Analyse von Wirkstoffen eingesetzt wird, mit:

• - einer Fließzell-Vorrichtung,
• - einer Einrichtung zur Stimulation der Zellkultursysteme,
• - einer Einrichtung zur synchronen und zeitlich aufgelösten direkten Erfassung von in Abhängigkeit von den Stimulationsbedingungen resultierenden Fluoreszenzsignalen an den Zellkultursystemen und/oder einer Einrichtung zur zeitlich aufgelösten Erfassung von Isotopengemischen im Perfusat und/oder einer Einrichtung zur zeitlich integralen Erfassung von Isotopengemischen direkt an den Zellkultursystemen,
• - einer Einrichtung zur synchronisierten Fraktionierung und weitergehenden Analyse des Perfusates,
• - einer Einrichtung zur Charakterisierung und Identifizierung von sich unter den gewählten Bedingungen verändernden und/oder spezifisch verhaltenden Proteinen der Zellkultursysteme und
• - einer Einrichtung zur Integration der gewonnenen multidimensionalen Funktionsdaten für die Effektraum-/Effektorraum-Analyse von Wirkstoffen.

35. Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Fließzell- Vorrichtung eine solche aus einem der Ansprüche 23 bis 33 ist.

36. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Stimulation der Zellkultursysteme ein computergesteuertes Applikationssystem ist.

37. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur synchronen und zeitlich aufgelösten direkten Erfassung von in Abhängigkeit von den Stimulationsbedingungen resultierenden Fluoreszenzsignalen an den Zellkultursystemen eine Fluoreszenzspektroskopie-Einrichtung ist.

38. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur zeitlich aufgelösten Erfassung von Isotopengemischen im Perfusat eine ICP-MS-Einrichtung ist.

39. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur zeitlich integralen Erfassung von Isotopengemischen direkt an den Zellkultursystemen eine ICP-MS-Einrichtung ist.

40. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur synchronisierten Fraktionierung und weitergehenden Analyse des Perfusates ein computergesteuerter Fraktionssammler und eine HPLC-Einrichtung mit Fluoreszenzdetektor und/oder eine Einrichtung mit enzymgekoppelten Säulen und/oder eine Einrichtung mit elektrochemischer oder fluorometrischer Detektion und/oder ein Massenspektrometer ist.

41. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Charakterisierung und Identifizierung von sich unter den gewählten Bedingungen verändernden und/oder spezifisch verhaltenden Proteinen der Zellkultursysteme eine 2-D-PAGE-Einrichtung und eine MALDI-TOF-MS-Einrichtung und/oder ESI-MS-Einrichtung ist.

42. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Integration der gewonnenen multidimensionalen Funktionsdaten für die Effektraum-/Effektorraum-Analyse von Wirkstoffen eine datenbankgestützte Computer- Einrichtung ist.

43. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Analyse des Zellwachstums und des Zellverhaltens auf und bezüglich für die Zellkultursysteme verwendeten Trägern eine computergestützte Bildanalyse- Einrichtung mit einem Videomikroskop ist.

44. Verwendung von Neuregulin-β zum Testen von Biomaterialien im Zellkontakt, insbesondere Implantationsmaterialien als nicht-aktive Medizinprodukte.

45. Verwendung von Neuregulin-β zum Screening für Wirkstoffe und/oder zur Ermittlung von Indikatoren und/oder Targets.

46. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 45 zur Ermittlung von Zwischenergebnissen für Diagnoseverfahren.