DE19727962A1 - Fluoreszierende Proteine als zelltypspezifische Reporter - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von nicht-zellschädigenden fluoreszierenden Proteinen als zelltypspezifische Reporter. Im einzelnen betrifft die Erfindung em­ bryonale Stammzellen (ES-Zellen) nicht-menschlicher Säuger, die mit einem DNA- Konstrukt stabil transfiziert sind, das eine für ein nicht-zellschädigendes fluoreszie­ rendes Protein codierende DNA-Sequenz und einen mit dieser DNA-Sequenz ope­ rativ verknüpften, zell- und/oder entwicklungsabhängigen Promotor umfaßt; ein Ver­ fahren zur Herstellung dieser ES-Zellen; eine Zellkultur erhältlich durch Kultivieren der ES-Zellen; ein Verfahren zur toxikologischen Prüfung von Substanzen unter Verwendung dieser Zellkulturen; ein Verfahren zur Erzeugung transgener nicht­ menschlicher Säuger unter Verwendung der ES-Zellen; einen durch dieses Verfah­ ren erhältlichen transgenen nicht-menschlichen Säuger und ein Verfahren zur Unter­ suchung von Zellentwicklungsstufen unter Verwendung von Zellen eines solchen nicht-menschlichen Säugers.

Embryonale Stammzellen (ES) sind Grundlage sowohl für die Erzeugung transgener Tiermodelle, als auch für den Einsatz in in vitro Zellkultursystem. Bis her wurden die sich aus ES-Zellen differenzierenden Zelltypen dadurch identifiziert, daß sie durch Antikörperfärbung bzw. durch in situ-Hybridisierung mit Antisense-Oligonukleotiden gekennzeichnet wurden. Dazu mußten allerdings die Zellen zuvor fixiert werden.

Alle bisherigen Verfahren eignen sich nicht für anschließende funktionelle Untersu­ chungen mit den von ES-Zellen differenzierten, unterschiedlichen Zelltypen. Die bis­ her einzige Methode, um funktionelle Untersuchungen an ES-Zell-abgeleiteten Zell­ derivaten in vivo durchzuführen, bestand in der morphologischen Identifizierung. Dies gelang, wenn auch nur sehr unbefriedigend, bei den Herz- und Skelettmuskel­ zellen, da diese sich durch Kontraktionen auszeichneten. Schon bei den nicht kon­ trahierenden Ventrikelzellen war die Erkennung für funktionelle Untersuchungen schwierig. So wird im Maltsev et al., 1994, Circ Res., 75, 233-244 und DD-299439 AS ein Modell beschrieben, in dem die Differenzierung von Herzzellen (Kardiomyozyten) ausgehend von einer sehr frühen Entwicklungsstufe bis zur spe­ zialisierten Schrittmacher-, ventrikulären-, oder atrialen Herzzelle in vitro stattfindet (Maltsev et al., 1994, Circ Res., 75, 233-244). Zu diesem Zweck werden totipotente embryonale Stammzellen (ES-Zellen) der Zellinie D3 unter den folgenden Zellkul­ turbedingungen in Kardiomyozyten differenziert: Die Zellen werden 2 Tage in einem hängenden Tropfen angesetzt, dann 5 Tage in Suspension gehalten und anschlie­ ßend ausplatiert (Maltsev et al., 1994, Circ Res., 75, 233-244). Innerhalb von 1-2 Tagen nach der Platierung bilden sich spontan schlagende Areale innerhalb dieser "Embryoid Bodies" (EB's). Aus diesen Arealen können mit Hilfe enzymatischer Ver­ dauung (Kollagenase) einzelne Kardiomyozyten dissoziiert werden, die funktionellen, molekularbiologischen und morphologischen (Immunhistochemie, Elektronen­ mikroskopie) Untersuchungstechniken während den verschiedenen Differenzie­ rungsstadien zugänglich sind. Neben den Kardiomyozyten befinden sich in den so erzeugten EB's unter anderem auch neuronale Zellen, Gliazellen, hämatopoietische Zellen, Endothelzellen (frühe Kapillare), glatte Muskelzellen, Skelettmuskelzellen, Knorpelzellen, Fibroblasten und Epithelzellen.

Darüber hinaus sind in der letzten Zeit bioluminiszente Proteine wie Green Fluore­ scent Protein (nachfolgend GFP) beschrieben worden (Prasher et al., Gene, Vol. 111 229-233 (1992), die als Marker für Genexpression vorgeschlagen werden (Chalfie et al., Science, Vol. 263, 802-805 (1994)). So ist in der WO-A-95107463 und WO-A- 96/27675 das Transformieren von Zellen mit GFP offenbart. Die Transformation von Säugerzellen, insbesondere deren ES-Zellen mit einer für GFP codierenden DNA- Sequenz ist jedoch weder in dieser noch in einer anderen Druckschrift beschrieben worden.

Herz-Kreislauferkrankungen gehören immer noch zu den häufigsten Todesursachen in den westlichen Industrieländern. Nur durch intensive Grundlagenforschung auf diesem Gebiet können die pathophysiologischen Ursachen erkannt und neue The­ rapieansätze gefunden bzw. toxikologische Veränderungen beschrieben werden. Für die Untersuchung zur Pathogenese von Herz-Kreislauf Erkrankungen und zum Testen neuer pharmakologischer und toxikologischer Substanzen werden Modelle benötigt, die einerseits auf den Menschen übertragbar sind, andererseits aber die aufwendigen und kostenintensiven Tierversuchsmodelle ersetzen können. Im Jahr 1991 wurden noch über 2 Millionen Tiere allein in den alten Bundesländern bei Tierversuchen eingesetzt.

Ein in letzter Zeit immer wichtigerer Ansatzpunkt der pharmakolo­ gisch/toxikologischen Forschung ist die Herzdifferenzierung. Aus der stereotypisch ablaufenden Herzzellentwicklung können Rückschlüsse auf pathologische und toxi­ kologische Veränderungen von Kardiomyozyten gezogen werden. So ist z. B. be­ kannt, daß bei der kardialen Hypertrophie (Yamazaki et al., J. Mol. Cell Cardiol. 27 (1): 133-140 (1995)) und Herzinsuffizienz (Johnson et al., Biochem. Pharmacol. 45 (12): 2365-2372 (1993)) der Rezeptorstatus und die intrazellulären Signalkaska­ den gestört sind. Diese pathologisch veränderten Kardiomyozyten ähneln teilweise wieder Herzzellen früher Differenzierungsstadien.

Die zur Aufklärung der Eigenschaften von Herzzellen früher Differenzierungsstadien notwendigen Untersuchungen können am Tier jedoch technisch nur schwer und, falls überhaupt, in sehr aufwendigen Studien durchgeführt werden: Am 12.-13. Tag ist es frühestens möglich, Kardiomyozyten aus einem Mäuseembryo zu präparieren, diese Zellen entsprechen jedoch nicht mehr einer frühen kardialen Differenzierungs­ stufe. Eine detaillierte Analyse der Rezeptorexpression während verschiedener Dif­ ferenzierungsstadien erfordert einen sehr hohen Aufwand an Tiermaterial und ist - wie vorstehend ausgeführt - technisch nur schwer durchführbar. Ebenso ist die Be­ obachtung der Entwicklung einer relativ undifferenzierten Herzzelle über mehrere Tage bis Wochen hinweg am Tiermodell nicht möglich. Um den Einsatz neuer The­ rapeutika, z. B. inotroper Substanzen oder Antiarrhythmika bzw. toxischer Stoffe, z. B. Schwermetalle oder Retinoide, auszutesten, muß im Tierversuch ein wochenlan­ ges, invasives Monitoring an Tieren z. B. Schweinen durchgeführt werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand nun darin, ein Zellkulturverfahren bereitzustellen, das eine einfache Charakterisierung der lebenden Zellen ermöglicht und funktionelle Untersuchungen zuläßt und nicht wie die bisherigen Verfahren auf Reportergenen wie z. B. Lac-Z (Niwa et al., 1991, Gene 108, 193-199; Wobus et al., 1996, J. Cell Mol. Cardiol.; Metzger et al., 1996 Circ. Res., 78, 547-552) beruht, de­ ren Expression nur nach Zellfixierung und unter Zuhilfenahme eines spezifischen Substrates nachgewiesen werden kann.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß ES-Zellen mit einem DNA-Konstrukt, in dem ein für ein nicht-zellschädigendes fluoreszierendes Protein codierendes Gen mit einem zell- und entwicklungsabhängigen Promotor gekoppelt ist, mittels Elektropo­ ration stabil transfiziert werden können. Dieses Konstrukt wird dabei in die native DNA integriert. Nach spezifischer Aktivierung intrazellulärer Signale wird der Promo­ tor aktiviert und das fluoreszierende Protein exprimiert. Somit könnten ES-Zellen, die zu einem gewissen Zeitpunkt der Differenzierung einen zellspezifischen Transkrip­ tionsfaktor aktivieren, anhand der Fluoreszenz-Emission unter Fluoreszenzanregung erkannt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit embryonale Stammzellen (ES-Zellen) nicht­ menschlicher Säuger, die mit einem DNA-Konstrukt, umfassend

• - eine für ein nicht-zellschädigendes fluoreszierendes Protein codierende DNA-Se­ quenz und
• - einen mit dieser DNA-Sequenz operativ verknüpften, zell- und/oder entwicklungs­ abhängigen Promotor

stabil transfiziert sind.

Bevorzugt stammen die ES-Zellen von Nagern, insbesondere von Mäusen. Beson­ ders bevorzugte ES-Zellen sind dabei D3-Zellen (Doetschmann et al., J. Embryol. Exp. Morphol. 87, 27 (1985)), R1-Zellen (Nagy et al., PNAS (1995)), E14-Zellen Handyside et al., Roux Arch. Develop. Biol. 198, 48 (1989)), CCE-Zellen (Bradley et al., Nature 309, 255 (1985)) und P19-Zellen (Mummery et al., Dev. Biol 109, 402 (1985)).

Als "nicht-zellschädigendes fluoreszierendes Protein" können gemaß der vorliegen­ den Erfindung das Green Fluorescent Protein (GFP) aus der Qualle Auequorea Victoria (beschreiben in WO-A-95/07463, WO-A-96/27675 und WO-A-95121 191) und dessen Derivate "Blue GFP" (Heim et al., Curr. Biol. 6 (2): 178-182 (1996)) und Red­ shift GFP" (Muldoon et al.; Biotechniques 22 (1): 162-167 (1997)) verwendet werden. Bevorzugt ist dabei das grün fluoreszierende GFP, insbesondere die in dem hinter­ legten Stamm DSM 11633 befindliche GFP-Mutante.

Unter den Begriff "zell- und/oder entwicklungsabhängiger Promotor" ist gemäß der vorliegenden Erfindung ein Promotor zu verstehen, der nur in gewissen Zelltypen und/oder nur in gewissen Zellentwicklungsstadien - sowohl in Zellkulturen (Embryoid Bodies) als auch in transgenen nicht-menschlichen Säugern, die von den erfin­ dungsgemäßen ES-Zellen abstammen - seine Promotortätigkeit entfaltet. Daneben kann aber auch jeder andere bekannte zellspezifische Promotor für z. B. Nervenzel­ len, Herzzellen, neuronale Zellen, Gliazellen, hämatopoietische Zellen, Endothelzel­ len, glatte Muskelzellen, Skelettmuskelzellen, Knorpelzellen, Fibroblasten und Epi­ thelzellen eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Promotor ein für Herz­ zellen spezifischer Promotor. Insbesondere sind die folgenden Promotoren zu nen­ nen: SMHC Minimal Promotor (spezifisch für Glattmuskelzellen, Kallmeier et al., J. Biol. Chem. 270 (52): 30949-30957 (1995)); Nkx-2.5 (spezifisch für sehr frühe Kar­ diomyozyten, Lints et al., Development, 119 (2): 419-431 (1993)); Human-α-Actin (spezifisch für Herzgewebe, Sartorelli et al., Genes Dev., 4 (10): 1811-1822 (1990)), MLC-2V (spezifisch für Herzkammern, O'Brien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (11): 5157-5161 (1993) und WO-A-96/16163).

In einer bevorzugten Ausführungsform weist das DNA-Konstrukt noch weitere funk­ tionelle DNA-Sequenzen, insbesondere Enhancer und Selektionssequenzen auf. Solche Selektionsequenzen sind z. B. Neomycin und Hygromycin.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin, ein Verfahren zur Herstellung der erfin­ dungsgemäßen ES-Zellen, umfassend

• - Einbringen eines vorstehend definierten DNA-Konstrukts in Ausgangs-ES-Zellen nicht-menschlicher Säuger und
• - Screenen nach stabil transfizierten ES-Zellen. Das Einbringen kann dabei auf jede dem Fachmann bekannte Art und Weise erfolgen. Die Elektroporation ist jedoch be­ vorzugt. Das Screenen erfolgt vorzugsweise mit Hilfe der in dem DNA-Konstrukt vor­ handenen Selektionssequenzen.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls das vorstehend beschriebene DNA-Kon­ strukt. Bevorzugte Konstrukte sind dabei die in Fig. 1 und 2 abgebildeten Reporter­ konstrukte pCX-(β-act)GFP-Neo und pCX-(α-act)GFP-Neo (DSM 11633).

Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Zellkultur mit zelltypspezifischer Expression ei­ nes nicht-zellschädigenden fluoreszierenden Proteins erhältlich durch Kultivieren der erfindungsgemäßen ES-Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die Zellen als Aggregate (Embryoid Bodies) vor. Das Herstellen des Embryoid Bodies erfolgt dabei gemäß Standardverfahren wie z. B. die Methode des "hängenden Trop­ fens" oder Methylzellulosekultur (Wobus et al., Differentiation (1991) 48,172-182).

Diese Zellstrukturen können in Verfahren zur toxikologischen Untersuchung von Substanzen, z. B. Retinoide, Schwermetall und Pharmaka, verwendet werden. Sie besitzen wesentliche Vorteile gegenüber allen bisher verwendeten Zellkulturmodellen:

• a) Die lebenden, unfixierten Zellen können in ihrer Differenzierung beobachtet wer­ den, so kann z. B. das Wachstum der Herzzellen im schlagenden Areal kontinu­ ierlich beobachtet werden.
• b) Zellen im frühen Entwicklungsstadium können elektrophysiologischen und ande­ ren Meßmethoden zugänglich gemacht werden, da sie als fluoreszierende Zellen leicht zu erkennen sind (siehe Fig. 3). Dies bedeutet eine wesentliche Vereinfa­ chung der funktionellen Untersuchung dieser Zellen.
• c) Eine Einzelzell-Präparation bedeutet einen Verlust von Zellen. Um die geringe Zahl der noch vorhandenen Zellen sichtbar zu machen, sind die das fluoreszie­ rende Protein exprimierenden Zellen vorteilhaft. Das Verfahren läßt sich durch die FACS-Sortierungsmethode ergänzen, wodurch homogene Zellpopulationen ge­ wonnen werden können. Dadurch ist es auch möglich Untersuchungen (z. B. molekularbiologische) an einer größeren Population von phänotypisch differen­ zierten ES-Zellen vorzunehmen.
• d) Da die das fluoreszierende Protein exprimierenden ES-Zellen nach Aktivierung herzspezifischer Promotoren im EB sichtbar werden, kann das Wachstum der herzspezifischen Zellen unter pharmakologisch/toxikologischen Bedingungen in einem recht einfachen Verfahren bestimmt werden. Für routinemäßige Untersu­ chungen der Wirkung verschiedener Substanzen auf die Herzzelldifferenzierung könnte das Areal im EB von fluoreszierendes Protein exprimierenden Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt werden und somit Aussagen gemacht werden, ob diese Substanzen die Differenzierung von Herzzellen quantitativ und qualitativ beeinflussen. Für quantitativ präzisere Aussagen könnten die Zellen dissoziiert und dann der FACS-Sortierungstechnik unterzogen werden (Fig. 4).

Die Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zur Erzeugung transgener nicht­ menschlicher Säuger mit zelltypspezifischer Expression eines nicht-zellschädigen­ den fluoreszierenden Proteins, umfassend

• - Injizieren von erfindungsgemäßen ES-Zellen in Blastozysten von nicht-menschlichen Säugern und
• - Übertragen der Blastozysten in Leihmütter; die durch dieses Verfahren erhältliche transgene nicht-menschliche Säuger sowie ein Verfahren zur Untersuchung von Entwicklungsstufen von Zellen nicht-menschlicher Säuger, umfassend die Untersu­ chung der entsprechenden gekennzeichneten Zellen von erfindungsgemäßen nicht­ menschlichen Säugern durch fluorimetrische Verfahren.

Im Ganztier kann durch das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren erstmals in vivo eine genaue Zelltypisierung vorgenommen werden. So sollten bereits in den frühen Organanlagen der Embryonen fluoreszierende Herzzellen beobachtet wer­ den, was eine in vivo Beobachtung der Herzentwicklung in der frühembryonalen Phase möglich machen würde. Auch dadurch könnten zu verschiedenen Entwick­ lungsstufen die Herzzellen leicht identifiziert werden.

Die Erfindung wird weiterhin durch folgende Figuren und Beispiele erläutert.

Fig. 1 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten Reportergenkonstrukt pCX-(β-act)GFP- Neo.

Fig. 2 zeigt den in Beispiel 2 verwendeten Reportergenkonstrukt pCX-(α-act)GFP- Neo (DSM 11633).

Fig. 3. Teil A: Gezeigt sind 2 junge EBs in Suspension unter transmittiertem Licht (Aa) und unter 488 nm Exzitation (Ab). Da sich in diesen frühen EBs noch keine Herzzellen differenziert haben, ist keine grüne Fluoreszenz sichtbar.

Teil B: EB nach 3 Tagen Platierung (7+3 Tage) unter transmittiert:em Licht (Ba), bei 488 nm Fluoreszenzexzitation (Bb) und in Kombination von transmittiertem Licht und 488 nm Fluoreszenzexzitation. In diesem EB konnte ein relativ kleines, spontan schlagendes Areal beobachtet werden. Dies entspricht dem Teil des EB mit sponta­ nen Kontraktionen. Die EBs wurden mit einer 20-fachen Vergrößerung aufgenom­ men.

Fig. 4: Gezeigt sind die mittels FACS-Methode erstellte Verteilungshistogramme von Zellen aus EB's, die aus ES-Zellen mit pCX-(α-act)GFP-Neo gewonnen wurden. Das Konstrukt wurde mittels AatI linearisiert:, so daß der CMV-IE Enhancer zerstört: wurde.

• (a) ES-Zellen
• (b) nach 2 Tagen Suspension (2+2 Tage)
• (c) 5 Tage nach Platieren (7+5 Tage)
  x-Achse: Intensität der GFP Fluoreszenz (FACS-Einheiten), y-Achse: gezählte Zellen

Beispiele Beispiel 1

Herstellung stabiler ES-Zellinien, die GFP unter einem starken ubiquitä­ ren Promotor exprimieren, und Differenzierung und Eigenschaften von Kardiomyo­ zyten, die von diesen Zellen abstammen.

• a) Herstellen des GFP-Expressions-Konstrukts: Der von Dr. Okabe (University of Osaka, Japan) zur Verfügung gestellte pCX-GFP-Expressionsvektor, der eine GFP- codierende Sequenz unter einem Huhn-αActin-Promotor enthält (M. Ikawa, K. Ko­ minami, Y. Yoshimura, K. Tanaka, Y. Nishimune und M. Okabe, Develop. Growth Differ. (1995) 37, 455-459), wurde wie folgt modifiziert:
  Ein SalI-XbaI-Restriktionsfragment, das ein Neomycin-(G418)-Resistenz-Gen von pTL2Neo enthielt (von Dr. Tarakhovsky zur Verfügung gestellt), wurde durch Ligasie­ rung mit glatten Enden in die SalI-Stelle von pCX-GFP eingesetzt. Das resultierende Konstrukt pCX-(β-act)GFP-Neo (Fig. 1) wurde für die Elektroporation von D3-Zellen verwendet.
• b) Elektroporation und Selektionsverfahren: Das pCX-(β-act)GFP-Neokonstrukt wurde mit Restriktase ScaI linearisiert (außerhalb der GFP-Expressionscassette) und für die Elektroporation der D3-Linie von ES-Zellen unter den folgenden Bedingungen verwendet:
  DNA: 20-40 µg, Zellen: 7 × 10/ml in 0,8 ml PBS-Puffer, Elektroporationsküvette BioRad 0,4 cm (Kat.-Nr. 165-2088), Elektroporationsapparatur BioRad (Gen Pulser), 240 V, 500 µF.

Nach der Elektroporation wurde die Zellsuspension 20 min auf Eis gelegt und dann auf eine 10-cm-Petrischale mit Gewebequalität mit G41 8-Resistenz-Feederschicht in 10 ml DMEM-Medium mit 15% FCS (Kälberfetusserum) übertragen. Zwei Tage spä­ ter wurde 300 µg/ml Neomycin (G418, Gibeo) hinzugefügt um G418-resistente Zel­ len zu selektieren. Das Medium mit G418 (300 µg/ml) wurde jeden zweiten Tag aus­ getauscht. Nach 8 bis 10 Tagen Selektion erschienen wirkstoffresistente Kolonien, die durch Fluoreszenzmikroskopie auf GFP-Expression getestet wurden.

Etwa 95% der G418-resistenten Kolonien zeigten eine starke GFP-Expression (grünes Leuchten), was auf ein hohes Ausmaß an Aktivität des β-Actin-Promotors (β-Actin ist eines der Hauptproteine des Cytoskeletts) in ES-Zellen hinweist. Die Kolonien wurden durch Ansaugen mit einer Pasteur-Pipette aufgenommen, einzeln trypsinisiert und anschließend für die Vermehrung auf 48- und 24-Napf-Platten mit Feederschichten mit G418 (300 µg/ml) übertragen. Schließlich wurden mehrere stabile ES-Klone, die 1 bis 5 Kopien des GFP-Gens unter der Kontrolle des Huhn-β- Actin-Promotors trugen, ermittelt und zur Erzeugung embryoider Körper (EBs) ver­ wendet.

• c) Differenzierung und Analyse der Kardiomyozyten: EBs wurden nach dem Stan­ dardverfahren der "hängenden Tropfen" entwickelt (A. Wobus, G. Walluka und J. Hescheler; Differentiation (1991) 48, 173-182).

In allen Stadien der Entwicklung vor dem Ausstreichen zeigten die EBs, die von ES- Zellen mit integriertem GFP-Expressionsvektor unter der Kontrolle des β-Actin-Pro­ motors abstammten, unter dem Fluoreszenzmikroskop ein starkes grünes Leuchten. Nach dem Ausstreichen verteilte sich die GFP-Expression in ungleichen Anteilen zwischen verschiedenen Zelltypen, die im Laufe der Differenzierung auftraten. Das hellste grüne Leuchten in EBs nach dem Auftreten kontraktiler Myocardiocyten fällt mit entsprechenden schlagenden Bereichen und nicht mit schlagenden Kernteilen (zentralen Teilen) von EBs zusammen.

Andere Bereiche der EBs zeigen verschiedene Ausmaße der GFP-Expression von stark bis schwach, was auf die bekannte weit verbreitete Expression von β-Actin als Hauptkomponente des Cytoskeletts bei vielfältigen Zelltypen hinweist.

Diese visuellen Beobachtungen werden durch Histogramme der Verteilung der GFP- Expression in den Zellpopulationen in den sich entwicklenden EBs bestätigt, die man durch FACS-Analyse (Flow Cytofluorimetry) erhält. Sie zeigen die Linksverschiebung und Vergrößerung anfangs scharfer, symmetrischer Peaks des Histogramms, was einen Übergang von hoher und relativ homogener GFP-Expression in einer Popula­ tion proliferierender undifferenzierter ES-Zellen zu einer breiten Verteilung derselben auf die Population sich differenzierender Zelltypen anzeigt.

EBs wurden mittels Kollagenase dissoziiert und auf Objektträgern ausgestrichen und anschließend 2-3 Tage lang kultiviert:, bevor elektrophysiologische Messungen nach dem Standardverfahren vorgenommen wurden (V. Maltsev, A.Wobus, J. Rohwedei, M. Bader und J. Hescheler; Circ. Res. (1994) 75 (2), 233-244).

Isolierte, spontan schlagende Kardiomyozyten, die GFP stark exprimieren, weisen alle elektrophysiologischen Eigenschaften auf, die für Kardiomyozyten typisch sind einschließlich Aktionspotentialen, Ca²⁺-, Na⁺-, K⁺- und I_f-Strömen, was durch die Patch-Clamp-Technik gezeigt wurde.

Stabile ES-Zellinien, die aufgrund eines in das Genom integrierten Expressionsvek­ tors GFP stark exprimieren, können sich also zu funktionell reifen kontraktilen Kar­ diomyozyten differenzieren, die dieselben elektrophysiologischen Grundeigenschaf­ ten haben wie Kardiomyozyten, die sich aus "normalen" D3-Zellen differenziert: ha­ ben.

Beispiel 2

Herstellung stabiler ES-Zellinien, die GFP unter einem herzspezifischen Promotor in sich differenzierenden Kardiomyozyten exprimieren.

• a) Herstellen des GFP-Expressions-Konstrukts: Aus dem von Dr. M. McBurney (University of Ottawa, Kanada) zur Verfügung gestelltem Plasmid pPv/B-Act-lacZ, das das Segment (-440+6) des herzspezifischen Human-α-Actin-Promotors enthielt (A.Minty, L. Kedes; Molecular and Cellular Biology (1986) 6, 2125-2136; G. Pari, K. Jardine und M. McBurney; Molecular and Cellular Biology (1991) 11, 4796-4803), wurde der Promotor durch die Restriktionsenzyme SalI und HindIII herausgeschnit­ ten. Der pCX-GFP-Expressionsvektor (siehe Beispiel 1) wurde - um den Huhn-β- Actin-Promotor durch den herzspezifischen α-Actin-Promotor zu ersetzen - mit den Restriktasen SnaBI und ApaI gespalten, wobei der Huhn-β-Actin-Promotor heraus­ geschnitten wurde. Nachfolgend wurde durch Ligasierung mit glatten Enden das oben genannte SalI-HindIII-Fragment des herzspezifischen α-Actin-Promotors einge­ fügt. Die Restriktasen Tth111I, SalI und HinfI wurden verwendet, um Plasmidklone zu selektieren, bei denen der herzspezifische α-Actin-Promotor in der richtigen Orientierung zur GFP-codierenden Sequenz eingesetzt war. Dann wurde ein Neomycin-(G418)-Resistenz-Gen, wie in Beispiel 1a) beschrieben, in die SalI-Stelle eingesetzt, und das resultierende Plasmid pCX-(α-act)GFP-Neo (Fig. 2) wurde für die Elektroporation von D3-Zellen verwendet.
• b) Elektroporation und Selektionsverfahren: Das pCX-(α-act)GFP-Neo wurde mit ScaI (außerhalb der GFP-Expressionscassette, wie in Beispiel 1b) beschrieben) oder mit AatI linearisiert, um den Cytomegalovirus-(GMV-IE)-Enhancer zu zerstören (siehe unten). Die Elektroporation und das G418-Selektionsverfahren wurden, wie in Beispiel 1b) beschrieben, durchgeführt.
• c) Analyse der Zellpopulation und GFP-Expression unter der Kontrolle des herzspe­ zifischen α-Actin-Promotors während der Differenzierung von Kardiomyozyten: EBs wurden, wie in Beispiel 1c) beschrieben, entwickelt. Im Unterschied zu den oben be­ schriebenen Mustern der GFP-Expression unter der Kontrolle des β-Actin-Promotors weisen ES-Zellen, die das in das Genom integrierte pCX-(α-act)GFP-Neo tragen, kein oder nur ein sehr schwaches durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbares Signal auf. Die FACS-Analyse zeigt, daß das mittlere Niveau der grünen Fluoreszenz von D3-Zellen mit durch SacI linearisiertem pCX-(α-act)GFP-Neo etwa 35- bis 40mal geringer ist als bei Zellinien, die pCX-(β-act)GFP-Neo tragen. Während der Entwicklung der EBs wurde eine Rechtsverschiebung und Vergrößerung des An­ fangspeaks des durch FACS erhaltenen GFP-Fluoreszenz-Histogramms erhalten. Die schlagenden Bereiche, die 2 bis 4 Tage nach dem Ausstreichen der EBs auftra­ ten, zeigen ein durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbares grünes Leuchten, das mit dem Niveau der GFP-Expression in ES-Zellen, die pCX-(β-act)GFP-Neo tragen, vergleichbar ist. Möglicherweise sind die schlagenden Bereiche, die aus funktionell reifen Kardiomyozyten bestehen, nur Bereiche mit starkem sichtbarem Leuchten unter anderen Zelltypen in sich entwickelnden EBs. Bei täglicher Überwachung ist es möglich, 1 bis 1,5 Tage, bevor sie zu schlagen beginnen, getrennte leuchtende Be­ reiche nachzuweisen.

Der herzspezifische Charakter der GFP-Expression wurde durch α-Actin-spezifi­ sches Immun-Anfärben einzelner Zellen bestätigt, das mit der GFP-Expression unter der Kontrolle des herzspezifischen α-Actin-Promotors korreliert.

• d) Herstellung von ES-Zellinien mit geringem ursprünglichem unspezifischem Niveau der GFP-Expression: Die oben genannten ES-Klone mit integriertem pCX-(α- act)GFP-Neo zeigten eindeutige Kardiomyozyten-spezifische Expressionsmuster, was zu einem erkennbaren Zusammenfallen leuchtender und schlagender Bereiche führte. Das anfängliche Niveau der GFP-Expression dieser undifferenzierten Zellen, das 5- bis 10mal höher liegt als bei einer negativen Kontrolle (intakte ES-Zellen), könnte jedoch das Auffinden der Zellen bei den allerersten Schriften der Differen­ zierung behindern.

Um das ursprüngliche Niveau der unspezifischen GFP-Expression zu senken, wurde eine Anzahl neuer Zellinien erzeugt, wobei pCX-(α-act)GFP-Neo verwendet wurde, das mit AatI-Restriktase linearisiert wurde (Fig. 2), um eine Zerstörung des CMV- IE-Enhancers zu ermöglichen. Letzterer war im ursprünglichen Expressionsvektor vorhanden, und es wurde angenommen, daß er der Grund für den anfänglichen un­ spezifischen "Hintergrund" war.

Nach der Elektroporation und dem Selektionsverfahren zeigten die G418-resistenten Klone eine viel höhere Diversifikation der anfänglichen GFP-Expression als Klone mit intaktem CMV-IE-Enhancer. Mehrere ES-Klone mit niedrigstem "Hintergrund" wurden durch FACS-Screening ausgewählt. Diese Klone haben eine etwa 5mal niedrigere Anfangsfluoreszenzintensität und könnten mit Zellen der negativen Kon­ trolle (Wildtyp) ohne GFP-Vektor vergleichbar sein. Nach der Herstellung von EBs aus entsprechenden ES-Zellklonen zeigten mehrere davon eine sowohl durch Fluo­ reszenzmikroskopie als auch durch FACS-Analyse nachweisbare GFP-Expression in sich differenzierenden Kardiomyozyten. Die FACS-Analyse zeigt eine hohe Auflö­ sung zwischen Zellen, die zur herzspezifischen Differenzierung übergegangen sind, und dem Rest der Zellpopulation, die während der EB-Entwicklung den ausgepräg­ ten eins-zu-zwei-Peakcharakter der Histogrammdynamik zeigten (Fig. 4).

Der beschriebene Ansatz erlaubt es also, die Differenzierung von ES-Zellen zu Kar­ diomyozyten "in vitro" zu untersuchen, wobei der GFP-Expressionsvektor mit herzspezifischem Promotor als "lebendes" Repoter-Gensystem verwendet wird, der Zellen in den früheren Schritten der Entwicklung sichtbar macht.

Das vorstehend beschriebene Plasmid pCX-(α-act)GFP-Neo wurden am 27.06.97 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, unter der Bezeichnung DSM 11633 hinterlegt.

Claims (16)

1. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) nicht-menschlicher Säuger, die mit einem DNA-Konstrukt, umfassend

• - eine für ein nicht-zellschädigendes fluoreszierendes Protein codierende DNA-Sequenz und
• - einen mit dieser DNA-Sequenz operativ verknüpften, zell- und/oder entwick­ lungsabhängigen Promotor

stabil transfiziert sind.

2. ES-Zellen gemäß Anspruch 1, wobei die ES-Zellen von Nagern, insbesondere von Mäusen, stammen.

3. ES-Zellen gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das nicht-zellschädigende fluo­ reszierende Protein ausgewählt ist aus Green Fluorescent Protein (GFP), Red Fluorescent Protein und Blue Fluorescent Protein und insbesondere GFP ist.

4. ES-Zellen gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Promotor ein für Herzzellen, neuronale Zellen, Gliazellen, hämatopoietische Zellen, Endo­ thelzellen, glatte Muskelzellen, Skelettmuskelzellen, Knorpelzellen, Fibro­ blasten oder Epithelzellen spezifischer Promotor ist, insbesondere ein für Herzzellen spezifischer Promotor ist.

5. ES-Zellen gemäß Anspruch 5, wobei der Promotor ausgewählt ist aus den Promotoren Nkx-2.5, Human-α-Actin und MLC-2V und insbesondere der herzspezifische Human-α-Actin Promotor ist.

6. ES-Zellen gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das DNA-Kon­ strukt weitere funktionelle DNA-Sequenzen, insbesondere Enhancer- und Selektionssequenzen, aufweist.

7. Verfahren zur Herstellung der ES-Zellen gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend

• - Einbringen eines wie in Anspruch 1 und 3 bis 6 definierten DNA-Konstrukts in Ausgangs-ES-Zellen nicht-menschlicher Säuger und
• - Screenen nach stabil transfizierten ES-Zellen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Einbringen durch Elektroporation er­ folgt.

9. DNA-Konstrukt gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 und 3 bis 6.

10. DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es Plasmid pCX-(α-act)GFP-Neo (DSM 11633) ist.

11. Zellkultur mit zelltypspezifischer Expression eines nicht-zellschädigenden fluo­ reszierenden Proteins erhältlich durch Kultivieren der ES-Zellen gemäß ir­ gendeinem der Ansprüche 1 bis 6 in vitro.

12. Zellkultur gemäß Anspruch 11, wobei die Zellen als Aggregate vorliegen.

13. Verfahren zur toxikologischen Prüfung von Substanzen, umfassend die Unter­ suchung der Auswirkungen dieser Substanzen auf Zellkulturen gemäß An­ sprüchen 11 oder 12 mittels fluorimetrischer Verfahren.

14. Verfahren zur Erzeugung transgener nicht-menschlicher Säuger mit zelltyp­ spezifischer Expression eines nicht-zellschädigenden fluoreszierenden Pro­ teins, umfassend

• - Injizieren von ES-Zellen gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 in Blas­ tozysten von nicht-menschlichen Säugern und
• - Übertragen der Blastozysten in Leihmütter.

15. Transgene nicht-menschliche Säuger erhältlich durch das Verfahren gemäß Anspruch 14.

16. Verfahren zur Untersuchung von Entwicklungsstufen von Zellen nicht­ menschlicher Säuger, umfassend die Untersuchung der entsprechenden ge­ kennzeichneten Zellen von nicht-menschlichen Säugern gemäß Anspruch 15 durch fluorimetrische Verfahren in vitro.