DE19645729C1

DE19645729C1 - Rezeptorbindungsassay, für den Rezeptorbindungsassay geeigneter rekombinanter Fusionsrezeptor, Vektor zu dessen Herstellung sowie Reagenziensatz für die Durchführung des Rezeptorbindungsassays

Info

Publication number: DE19645729C1
Application number: DE1996145729
Authority: DE
Inventors: Ulrich Prof Dr Med Loos; Waldemar B Dr Rer Nat Minich
Original assignee: BRAHMS Diagnostica GmbH
Current assignee: BRAHMS GmbH
Priority date: 1996-11-06
Filing date: 1996-11-06
Publication date: 1998-06-04
Anticipated expiration: 2016-11-07

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Rezeptorbindungsassay, insbesondere zur Bestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern in einer biologischen Probe, unter Verwendung von rekombinanten Fusionsrezeptoren, die zur Bestimmung von TSH-Rezeptor- Autoantikörpern mit Hilfe eines derartigen Assays erforderli chen rekombinanten TSH-Fusionsrezeptoren, einen Vacciniavirus- Vektor zur Herstellung derartiger Fusionsrezeptoren und einen Reagenziensatz (Kit) zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Rezeptorbindungsassays.

Es ist bekannt, biologisch aktive Substanzen, deren Anwesenheit und/oder Menge in einer biologischen Probe, und zwar einer flüssigen oder verflüssigten biologischen Probe, gemessen werden soll, mit Hilfe von Bestimmungsverfahren (Assays) zu bestimmen, bei denen spezifische Binder für die zu bestimmende Substanz in Kombination mit weiteren Reagenzien wie markierten Kompetitoren, Immobilisierungsreagenzien, Fällungsreagenzien und/oder Markierungsreagenzien zum Einsatz kommen. Die bekanntesten derartigen Bestimmungsverfahren sind dabei immundiagnostische Bestimmungsverfahren (Immunoassays), bei denen spezifische Bindungen vom Antigen-Antikörper-Typ genutzt werden. Auch wenn es in Einzelfällen aufgrund der Natur der zu bestimmenden oder als Kompetitoren zu verwendenden Antigenmole küle nicht einfach sein kann, Bestimmungsverfahren zu entwickeln, die alle Anforderungen für einen Routineeinsatz in der klinischen Praxis erfüllen, so bereitet es doch in der Regel keine grundsätzlichen Schwierigkeiten, derartige Assays so zu gestalten, daß am Ende der Bestimmung ein Reaktionsprodukt, das Markierungsanteile enthält und damit eine Information über die Anwesenheit und/oder Menge der zu bestimmenden Substanz liefert, an eine feste Phase gebunden vorliegt, z. B. an die Wände eines Teströhrchens. Insbesondere ist es in der Regel nicht besonders schwierig, als Bestandteil eines solchen Assays verwendete spezifische Binder vom Antikörpertyp ohne Beein trächtigung ihrer für das Bestimmungsverfahren wichtigen spezifischen Bindungsfähigkeit direkt oder indirekt zu markieren und/oder zu immobilisieren.

Anders liegen die Verhältnisse im Falle von Rezeptorbindungs assays, d. h. im Falle von Bestimmungsverfahren (Assays), bei denen wenigstens einer der spezifischen Bindungspartner ein Rezeptor ist. Die Bindung von Biomolekülen von peptidischer oder proteinischer Natur, z. B. von Hormonen oder auch Auto antikörpern, an Rezeptoren ist in der Regel sehr komplexer Natur, und die Ausbildung einer spezifischen Bindung zwischen Rezeptor und Biomolekül ist sehr viel empfindlicher gegenüber strukturellen Veränderungen insbesondere des Rezeptors, als das bei einem üblichen Bindungspaar Antigen/Antikörper der Fall ist. Versuche, Rezeptoren zu immobilisieren und/oder zu markieren, führen in der Regel zu strukturellen Veränderungen, die die Funktionalität von Rezeptoren stark beeinträchtigen. Das führt dazu, daß zahlreiche Assay-Grundtypen, die bei Immunoassays unter Ausnutzung einer Antikörper/Antigen-Bindung zur Verfügung stehen, für die Durchführung von Rezeptorbin dungsassays in der Praxis nicht genutzt werden können.

In dem Patent DE 43 28 070 C1 ist ein Typ eines Rezeptorbin dungsassays, der nach der Coated-Tube-Technik arbeitet, beschrieben, bei dem die Schwierigkeit der Herstellung von markierten bzw. immobilisierten funktionalen Rezeptorpräpara tionen dadurch umgangen wird, daß man an die Festphase Bestandteile eines kompetitierenden Reaktionssystems bindet, das gewissermaßen einen "Schatten" der eigentlichen Rezeptorbin dungsreaktion darstellt. Für die Schaffung von Assays für die klinische Routinediagnostik hat sich das offenbarte Verfahrens prinzip jedoch als zu kompliziert und daher wenig praktikabel erwiesen. Auf die allgemeinen Ausführungen in der genannten Patentschrift zur Problematik von Rezeptorbindungsassays im allgemeinen und von solchen zur Bestimmung von TSH-Rezeptor- Autoantikörpern im speziellen wird ergänzend ausdrücklich Bezug genommen.

Aus der EP-B-0 488 170 sind ferner zellfreie Rezeptorbindungs tests bekannt, bei denen rekombinante Fusionsrezeptoren aus einem aminoterminalen Rezeptorprotein und einem Trägerprotein, insbesondere dem konstanten Teil (Fc) der schweren Kette eines Immunglobulins, eingesetzt werden, die mittels eines Antiserums oder eines monoklonalen Antikörpers an eine feste Phase gekoppelt sind. Die diskutierten Rezeptoren gehören nicht zur Klasse der hochmolekularen G-Protein gekoppelten Glykoprotein- Rezeptoren. Ferner ist eine Immobilisierung durch Bindung eines Trägerproteins, das der Fc-Teil eines Immunglobulins ist, für Rezeptorbindungsassays, mit deren Hilfe Autoantikörper bestimmt werden sollen, wenig geeignet, da die Autoantikörper selbst zu den Immunglobulinen gehören und mit dem Immobilisierungssystem wechselwirken können.

Zu den Rezeptoren, die bisher beim Versuch ihrer Immobilisie rung und/oder Markierung in ihrer Funktionalität so beein trächtigt wurden, daß sie bisher weder in immobilisierter noch in direkt markiert er Form für Bestimmungsverfahren vom Rezeptorbindungsassay-Typ verwendet werden konnten, gehört insbesondere auch der TSH-Rezeptor.

Rezeptorbindungsassays, bei denen als spezifischer Binder TSH-Rezep tor-Präparationen verwendet werden, bilden den eigentli chen Schwerpunkt der vorliegenden Erfindung. Das schließt es jedoch nicht aus, daß die nachfolgend präsentierten Erkennt nisse und vorteilhaften Ergebnisse, die mit modifizierten TSH-Rezep toren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, auf andere Fälle direkt übertragen werden können, insbesondere auf solche Fälle, bei denen Rezeptoren verwendet werden, die dem gleichen Substanztyp angehören wie der TSH-Rezeptor.

Der TSH-Rezeptor ist ein in der Schilddrüsenmembran lokalisier ter Rezeptor, an den das von der Hypophyse ausgeschüttete Hormon TSH (Thyroid-stimulierendes Hormon oder Thyreotropin) bindet und dadurch die Ausschüttung der eigentlichen Schild drüsenhormone, insbesondere des Thyroxins, auslöst. Der TSH-Rezep tor gehört zur Rezeptor-Familie der G-Protein-gekoppelten Glykoprotein-Rezeptoren mit einer großen aminoterminalen extra zellulären Domäne, zu der auch der LH/CG- und der FSH-Rezeptor gehören. Eine Aufklärung der chemischen Struktur des TSH-Rezep tors, d. h. der Sequenz der für ihn codierenden DNA sowie der daraus ableitbaren Aminosäuresequenz des Rezeptors selbst, gelang Ende 1989 (vgl. Libert F. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1250-1255; Nagayama Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1184-1190; vgl. auch EP-A-0433509 bzw. WO-A-91/09121; sowie WO-A-91/09137; WO-A-91/10735 und WO-A-91/03483; ferner Yuji Nagayama & Basil Rapoport, in: Molecular Endocrino logy, Vol. 6 No. 2, S. 145-156 und die darin zitierte Litera tur). Mit der Verfügbarkeit der für den humanen TSH-Rezeptor codierenden cDNA gelang die Expression des rekombinanten humanen TSH-Rezeptors in einer Vielzahl verschiedener Ex pressionssysteme. Dabei zeigte es sich, daß ein funktionaler humaner TSH-Rezeptor voller Länge anscheinend nur in Säuge tierzellen exprimiert werden kann, und zwar sowohl transient als auch in Form stabiler Zellinien (vgl. z. B. Loos, U. et al. in: Eur. J. Biochem. 232, S. 62-65 (1995); oder Matsuba T. et al., J. Biochem. 118, S. 265-270 (1995) und darin zitierte Literatur).

In den Veröffentlichungen von Basil Rapoport et al. in J Clin Endocrinol Metab, Vol. 81, S. 2525-2533, 1996 und der darin erwähnten früheren Veröffentlichung der gleichen Arbeitsgruppe in J Biol Chem 270, S. 1543-1549, 1995 werden Versuche be schrieben, die extrazelluläre Domäne des TSH-Rezeptors (TSHR-ECD), verlängert um einen 6His-Rest, der die Isolierung des Expressionsprodukts erleichtern sollte, in CHO-Zellen oder im Bacuolvirus/Insektenzellen-System zu erreichen. In CHO-Zellen wurde ein exprimiertes Protein in der löslichen Fraktion der Zellen gefunden, wobei jedoch nur sehr geringe Mengen dieses Proteins funktional waren, d. h. im Sinne einer Autoantikörper bindung wirksam waren. Eine Reinigung des exprimierten Proteins über den 6His-Rest erwies sich als nicht möglich. Im Baculovi rus/Insektenzellen-Expressionssystem waren ähnliche unbefriedi gende Ergebnisse erhalten worden.

Gegen den TSH-Rezeptor können Autoantikörper gebildet werden, die für verschiedene Autoimmunerkrankungen verantwortlich sind, wobei sogenannte stimulierende Autoantikörper, die zu einer als Morbus Basedow (englisch: Graves' disease) bekannten Schild drüsenüberfunktion führen, für die klinische Diagnostik besonders wichtig sind. Ein zur Bestimmung derartiger Autoanti körper im Handel befindlicher bekannter Assay ist der TRAK-Assay® der Firma B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH.

Zur Bestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern wird nach dem herkömmlichen Verfahren so vorgegangen, daß man die zu bestimmenden Autoantikörper aus einer Serumprobe in flüssiger Phase mit einem radioaktiv markierten bovinen TSH-Kompetitor um die Bindungsstellen eines Detergens-solubilisierten porcinen TSH-Rezeptors konkurrieren läßt (vgl. Southgate, K. et al., Clin. Endocrinol. (Oxford) 20, 539-541 (1984); Matsuba T. et al., a.a.O.; Produktinformation zum TRAK-Assay® der Firma B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH). Um das an die Rezeptor-Präpara tion gebundene markierte TSH zu bestimmen, wird nach Abschluß der Inkubation der TSH-Rezeptor mit einem Fällungsreagens und einem anschließenden Zentrifugierschritt von der flüssigen Phase abgetrennt. Die Bestimmung des Rezeptor-gebundenen markierten TSH erfolgt durch Messung der im Sediment gebundenen Radioaktivität.

Durch die Verfügbarkeit von rekombinanten humanen TSH-Rezeptor- Präparationen hat sich an diesem Assay-Design nichts geändert. Soweit die in den verschiedenen Expressionssystemen erhaltenen rekombinanten humanen TSH-Rezeptoren überhaupt funktionale Rezeptoren waren, wurden die daraus gewonnenen TSH-Rezeptor- Präparationen in ähnlicher Weise in solubilisierter Form eingesetzt wie eine herkömmliche porcine TSH-Rezeptor-Präpara tion. Außerdem wurde zu wissenschaftlichen Zwecken die Funktionalität der exprimierten Rezeptoren auch an den ganzen transformierten Zellen gemessen.

Die Freisetzung der rekombinanten humanen TSH-Rezeptoren aus den Wirtszellen, z. B. CHO- oder COS-Zellen, mit Hilfe von Detergenzien erwies sich aufgrund der Wachstumseigenschaften derartiger Zellen als schwierig und war von einer teilweisen proteolytischen Spaltung des rekombinanten Rezeptors begleitet, und die erhaltenen Präparationen waren ebensowenig ohne Funktionalitätsverlust immobilisierbar oder markierbar wie die bisherigen, aus biologischem Material gewonnenen TSH-Rezeptor- Präparationen, so daß durch die Verwendung rekombinanter TSH-Rezep tor-Präparationen keine Änderungen des traditionellen Bestimmungsverfahrens ermöglicht wurden. Die Notwendigkeit, bei allen bisher bekannten Verfahren einen Fällungs- und Zen trifugationsschritt durchzuführen, belastet jedoch die Routinebestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern im klini schen Laboralltag, und außerdem ist sie ein Hindernis für eine Automatisierung derartiger Bestimmungen, z. B. unter Verwendung von an sich bekannten automatischen Meßsystemen.

Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird unter einem "funktio nalen Rezeptor" ein Rezeptor verstanden, der die für die Durchführung eines Rezeptorbindungsassays erforderliche Funktionalität aufweist, d. h. die Eigenschaft, sowohl den Kompetitor, in der Regel TSH, als auch die gesuchten Auto antikörper zu binden. Die Fähigkeit zur cAMP-Stimulation ist demgegenüber ohne größere Bedeutung. Wenn ferner davon gesprochen wird, daß die Funktionalität des TSH-Rezeptors durch einen zusätzlichen Peptidrest und/oder durch Immobilisierung bzw. Markierung nicht beeinträchtigt ist, bedeutet das nicht, daß Eigenschaften wie z. B. Bindungsaffinitäten in jeder Hinsicht, insbesondere in quantitativer Hinsicht, mit den entsprechenden Eigenschaften von Vergleichsrezeptoren natürli chen oder rekombinanten Ursprungs identisch sein müssen. Abweichungen bei Eigenschaften, die sich nicht entscheidend auf das für die Praxis wichtige Verhalten der Rezeptorpräparation in einem der nachfolgend geschilderten Rezeptorbindungsassay auswirken, sind nicht als "Beeinträchtigung" anzusehen.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Rezeptor bindungsassay, insbesondere einen Rezeptorbindungsassay zur Bestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern, zu schaffen, bei dem mit einem funktionalen Rezeptor, insbesondere TSH-Rezeptor, gearbeitet werden kann, der immobilisierbar und/oder markierbar ist, so daß Verfahrens-Grundtypen, bei denen mit immobilisier ten oder markierten spezifischen Bindern gearbeitet wird, auch für Rezeptorbindungsassays zur Anwendung gelangen können.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die dafür erforderlichen funktionalen Rezeptorpräparationen und die Mittel zu deren Herstellung zu schaffen.

Schließlich ist es auch Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Reagenziensätze (Kits) zu schaffen, die die für Rezeptorbin dungsassays neuartigen Bestimmungsverfahren verkörpern, insbesondere solche, bei denen die Coated Tube-Technik bzw. Mikrotiterplatten-Technik für den Bereich der Rezeptorbindungs assays zur Anwendung kommt.

Diese Aufgaben werden bei einem Rezeptorbindungsassay zur Bestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern in einer biologi schen Probe, insbesondere einem Humanserum, und zwar ent sprechend einer allgemeinen Definition derartiger Rezeptor bindungsassays im weitesten Sinne gemäß Oberbegriff von Patentanspruch 1, dadurch gelöst, daß man als TSH-Rezeptor- Präparation eine Präparation eines rekombinanten TSH-Fusions rezeptors, insbesondere eines rekombinanten humanen TSH-Fu sionsrezeptors, verwendet, der gegenüber dem entsprechenden natürlich vorkommenden funktionalen TSH-Rezeptor, insbesondere gegenüber dem natürlich vorkommenden funktionalen TSH-Rezeptor voller Länge, um einen endständigen oder als Einschub vorhande nen Peptidrest verlängert ist, wobei dieser Peptidrest (i) eine Markierung aufweist oder selektiv markierbar ist und/oder (ii) durch Bindung an einen immobilisierten selektiven Bindungs partner immobilisiert oder immobilisierbar ist, ohne daß die Funktionalität des TSH-Rezeptors beeinträchtigt ist.

Vorteilhafte Ausgestaltungen eines derartigen Rezeptorbindungs assays sind den Unteransprüchen 2 bis 10 zu entnehmen bzw. ergeben sich für den Fachmann aus den nachfolgenden Erläuterun gen.

Die Erfindung betrifft ferner für derartige erfindungsgemäße Rezeptorbindungsassays erforderliche rekombinante TSH-Fusions rezeptoren gemäß Anspruch 11 bzw. den Unteransprüchen 12 und 13 und einen für die Herstellung eines solchen rekombinanten TSH-Fusionsrezeptors in Warmblüterzellen geeigneten Vacciniavi rus-Vektor gemäß den Ansprüchen 14 und 15.

Die Erfindung betrifft ferner in verallgemeinerter Form auch Rezeptorbindungsassays nach Anspruch 16 und den Unteransprüchen 17 und 18.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Reagen ziensatz (Kit) gemäß Anspruch 19, der als einen Bestandteil eine Festphase, insbesondere Coated Tubes, mit einem daran immobilisierten funktionalen Fusionsrezeptor enthält.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß es möglich ist, ohne Funktionalitätsverlust am C-Terminus um einen Peptidrest verlängerte funktionale Rezeptoren vom Typ des TSH-Rezeptors herzustellen und daß derartige Fusionsrezeptoren ohne Funktio nalitätsverlust an spezifische Binder für den Peptidrest gebunden werden können, die immobilisiert oder immobilisierbar oder markiert oder markierbar sind.

Die im Rahmen der vorliegenden Anmeldung als "Peptidrest" bezeichnete Aminosäuresequenz, die einen natürlich vorkommenden funktionalen Rezeptor, insbesondere einen Rezeptor voller Länge, in seiner Sequenz oder insbesondere an seinem C-Terminus verlängert, ist vorranging dadurch gekennzeichnet, daß zu dieser Sequenz ein selektiver Bindungspartner verfügbar ist, der an die genannte Sequenz bindet, ohne einerseits die Rezeptorfunktionalität zu beeinträchtigen und ohne andererseits mit den restlichen Komponenten eines Rezeptorbindungsassays, d. h. im Falle eines Rezeptorbindungsassays zur Bestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern mit den zu bestimmenden Auto antikörpern und/oder dem Kompetitor, z. B. ¹²⁵TSH, störende Wechselwirkungen einzugehen.

"Peptidrest" ist dabei in einem weiten Sinne ohne Einschränkung auf kurzkettige typische "Peptide" zu verstehen und umfaßt auch Aminosäureketten mit Peptidbindung, die dem Bereich der Oligopeptide oder Polypeptide bzw. sogar Proteine zugeordnet werden können. So soll die Definition z. B. noch einen Avidin rest (512 Aminosäuren, Molekulargewicht 66 000) und einen Streptavidinrest (Molekulargewicht ca. 60 000) umfassen, die selektive sehr feste Bindungen zu Biotin als selektiven Bindungspartner eingehen, d. h. Peptide mit bis zu etwa 600 Aminosäureresten. Die bevorzugten Peptidreste sind jedoch kürzer, wobei diese Peptidreste, gegebenenfalls neben zusätzli chen, auch als Spacer zum eigentlichen Rezeptormolekül dienenden Aminosäuresequenzen, das sogenannte FLAG-Epitop und/oder einen Peptidrest aus sechs Histidinresten (6His-Rest) umfassen können. Das sogenannte FLAG-Epitop ist ein Markerpep tid der Struktur N-Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys-C. Ein für die Expression dieses Markerpeptids verwendbarer Expressions vektor sowie monoklonale Antikörper, die das genannte FLAG-Epi top erkennen, sind kommerziell erhältlich (für Deutschland von der Firma Integra Biosciences GmbH). Auf das Prospektmate rial zum IBI-FLAG®-System wird ergänzend Bezug genommen.

Der als weiterer Rest erwähnte 6His-Peptidrest (auch als "6His affinity tag" bekannt) ist ebenfalls Teil eines bekannten kommerziellen Peptid-Marker- und Reinigungssystems. Der 6His- Peptidrest geht eine sehr feste Komplexbindung mit Metall atomen, insbesondere Nickelatomen, ein, wobei dann, wenn diese Nickelatome durch Chelatisierung fest an ein Trägerharz gebunden sind, eine sehr feste Bindung eines Proteins oder Peptids mit dem 6His-Peptidrest an das entsprechende Trägerharz erhalten wird. Ein bevorzugtes Trägerharz ist dabei das sogenannte Ni-NTA-Harz, das (für Deutschland) vertrieben wird von der Qiagen GmbH und dessen Struktur und Verwendung be schrieben wird in der Patentschrift EP-B-0 253 303. NTA steht dabei für ein an eine Trägerharzmatrix bindbares Nitrilotries sigsäurederivat. Die Verwendung von Metallchelatharzen in der Immundiagnostik zur Herstellung von Festphasen wie z. B. beschichteten Teströhrchen (Coated Tubes) gehört nicht zu den üblichen Verwendungen derartiger Harze.

Wie nachfolgend und insbesondere im experimentellen Teil beschrieben ist, zeigte es sich, daß es in einem geeigneten Expressionssystem möglich ist, einen rekombinanten TSH-Rezeptor herzustellen, der an seinem C-Terminus um einen Peptidrest, in speziellen Falle ein FLAG-Epitop und einen endständigen 6His- Rest, verlängert ist, ohne daß durch die genannte endständige Verlängerung des TSH-Rezeptors zu einem TSH-Fusionsrezeptor seine Funktionalität beeinträchtigt wird.

Als Expressionssystem hat sich ein Expressionssystem als geeignet erwiesen, bei dem rekombinante Vacciniaviren in Warmblüterzellen zur Expression des TSH-Fusionsrezeptors verwendet werden. Die Verwendung von Vacciniaviren als Vektoren ist lange bekannt (vgl. z. B. J.D. Watson et al., Rekombinierte DNA, 2. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, S. 206; D.R. Glick et al., Molekulare Biotechnologie, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, S. 234f.; Kieny M.P. et al., Nature, Vol. 312, S. 163-166, 1984; Moss B., Science 252, S. 1662-1667, 1991). Die Einführung von DNA-Sequenzen, die für ein gewünsch tes Peptid oder Protein kodieren, in das Genom des Vacciniavi rus mittels geeigneter Plasmide ist ebenfalls grundsätzlich bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde ein Vacciniavirus-Vektor jedoch erstmals dazu verwendet, ein Protein aus der Familie der G-Protein-gekoppelten Glycosidre zeptoren mit einer großen N-terminalen extrazellulären Domäne In tierischen Zellen zu exprimieren. Als tierische Zellen wurden HeLa-Zellen verwendet, die große Mengen des humanen TSH-Fu sionsrezeptors erzeugten. HeLa-Zellen weisen gegenüber den In der Literatur beschriebenen COS7-Zellen oder CHO-Zellen den Vorteil auf, daß sie schnell in hoher Dichte sowohl in einer Trägerkultur als auch in einer Suspensionskultur gezüchtet werden können.

Die im experimentellen Teil näher beschriebene Herstellung des rekombinanten TSH-Fusionsrezeptors läßt sich kurz wie folgt zusammenfassen: Die TSH-Rezeptor-cDNA wurde in die DNA des Genoms des Vacciniavirus in Analogie zu einer vorbekannten Arbeitsweise (Kieny, M.P. et al., Nature, 312, S. 163-166 1984)) eingeführt. Die Fremdgene benötigen für eine wirksame Transkription virale Promotoren. Das verwendete Rekombinations- Plasmid p7.5K131 enthält den Early/Late-Promotor 7.5K des Vacciniavirus, flankiert von den Vacciniavirus-Thymidin kinase(TK)-Sequenzen, um die Rekombination in den TK-Ort des viralen Genoms zu dirigieren. Das Rekombinations-Plasmid wurde so konstruiert, daß in den erhaltenen rekombinanten Viren das TSH-Rezeptor-cDNA-Segment strangabwärts von der 5'-untrans latierten Leadersequenz des Encephalomyocarditis-Virus (EMCV) flankiert ist. Diese Sequenz stammte aus dem pTM1-Vektor und erhöht die Wirksamkeit der mRNA-Translation in Zellen, die mit dem Vacciniavirus infiziert waren (Moss, B. et al., Nature, 348, S. 19-92, (1990)). Rekombinante Virusklone mit der EMCV-Leader- Sequenz erzeugten sehr viel mehr TSH-Rezeptor als solche ohne diese Sequenz (Daten nicht gezeigt). Der rekombinante TSH-Rezep tor enthielt ferner das FLAG-Oktapeptid-Epitop, das von kommerziell erhältlichen monoklonalen Antikörpern erkannt wird, sowie ein 6His-Peptid an seinem Carboxyl-Terminus.

Das obengenannte Rekombinations-Plasmid p7.5K131 ist unter der Bezeichnung pAvB2 beschrieben in einer Doktorarbeit (Ruprecht- Karls-Universität Heidelberg) von Herrn Albrecht von Brunn aus dem Jahre 1989 mit dem Titel "Das Oberflächenantigen des Hepatitis B Virus als Trägersystem von Epitopen eines Merozoi ten-Oberflächenmoleküls des Malaria-Erregers Plasmodium falciparum - eine neue Möglichkeit der Impfstoffentwicklung?". Die Verwendung des konkreten Plasmids ist nicht kritisch, und es kann statt dessen auch mit einem anderen Vektor gearbeitet werden, der ein Thymidinkinase-Gen und den sog. 7.5K-Promotor enthält, z. B. mit dem Vektor pZVneo5529, der beschrieben ist in C. Bouvier et al., European Journal of Pharmacology, Molecular Pharmacology Section 290 (1995), S. 11-17.

Rekombinante Virus-Klone wurden durch Western-Blot-Analyse des TSH-Rezeptors, der in infizierten HeLa-Zellen exprimiert wurde, identifiziert.

Der mit Hilfe des Vacciniavirus-Vektors in HeLa-Zellen hergestellte TSH-Fusionsrezeptor erwies sich als vollständig funktional im Hinblick auf die TSH-Bindung. Infizierte HeLa- Zellen wiesen hochaffine TSH-Bindungsstellen auf, wobei die Bindungsaffinität derjenigen des nicht-rekombinanten TSH-Rezep tors in humanen Schilddrüsenzellen sowie in FRTL5-Zellen bemerkenswert ähnlich ist. Es erwies sich ferner, daß der TSH-Rezep tor aus infizierten HeLa-Zellen durch das nicht-ionische Detergens Triton® X100 in wirksamer Weise extrahiert werden kann. Die durch Extraktion erhaltene Fusionsrezeptor-Präpara tion ist sowohl im Hinblick auf die Bindung von TSH als auch von Morbus Basedow-Autoantikörpern aktiv. Die Verlängerung des natürlich vorkommenden funktionalen TSH-Rezeptors um einen Peptidrest, im vorliegenden Falle das FLAG-Epitop und den 6His- Peptidrest, beeinträchtigte weder die Fähigkeit zur Bindung des TSH-Hormons noch zur Bindung von Autoantikörpern, und der TSH-Fusions rezeptor war auch im Hinblick auf die TSH-stimulierte cAMP-Produktion voll funktionsfähig.

Mit dem rekombinanten Vacciniavirus infizierte HeLa-Zellen produzierten erhebliche Mengen an humanem TSH-Fusionsrezeptor, und zwar in einer Größenordnung von 150 000 funktionellen Rezeptormolekülen pro Zelle. Dieser Wert ist höher als die für die meisten vorbekannten Expressionssysteme beschriebenen Werte und vergleichbar mit dem, der von Matsuba et al., J. Biochim. 118, S. 265-270 (1995) beschrieben wird.

Der in den folgenden Beispielen an den TSH-Rezeptor angefügte Peptidrest kann als Modell für einen markierbaren und immobili sierbaren Peptidrest angesehen werden, ohne daß die Erfindung auf den genannten konkreten Rest beschränkt sein soll. Über das FLAG-Epitop kann der rekombinante TSH-Fusionsrezeptor unter Verwendung von spezifischen verfügbaren monoklonalen Antikör pern immobilisiert, jedoch auch spezifisch markiert werden. Über den 6His-Peptidrest kann der TSH-Fusionsrezeptor ebenfalls ohne Verlust seiner Funktionalität an einer Festphase immobili siert werden und steht damit für Rezeptorbindungsassays zu Verfügung, die Verfahrensvarianten verwirklichen, die für solche Assays bisher nicht genutzt werden konnten.

So ergeben sich aufgrund der Verfügbarkeit eines immobilisier baren und/oder markierbaren funktionalen TSH-Rezeptors sowie unter Berücksichtigung der Konkurrenz und damit bis zu einem gewissen Grad auch gegenseitigen Ersetzbarkeit von TSH und TSH-Rezep tor-Antikörpern beispielsweise die folgenden Verwirkli chungsmöglichkeiten für einen erfindungsgemäßen Rezeptor bindungsassay.

1. Der Fusionsrezeptor wird über seinen Peptidrest und einen spezifischen immobilisierten Bindungspartner an einer Festphase, z. B. den Wänden von Coated Tubes, immobili siert, und die Bestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern erfolgt analog zum vorbekannten Verfahren durch deren Konkurrenz mit markiertem TSH um die Bindungsstellen des Rezeptors.
2. Dieses Reaktionsschema kann jedoch auch umgekehrt werden, indem man TSH an einer Festphase immobilisiert und das immobilisierte TSH mit den zu bestimmenden Autoantikörpern um einen über den Peptidrest markierten TSH-Fusions rezeptor konkurrieren läßt. Die Markierung kann beispiels weise mit Hilfe eines markierten monoklonalen Antikörpers erfolgen, der spezifisch an den Peptidrest bindet. Die Menge der über das immobilisierte TSH an die Festphase gebundenen Markierung ist hierbei umgekehrt proportional zur Konzentration der Autoantikörper in der Probe.
3. Wie oben unter 1. wird mit einem immobilisierten TSH-Rezep tor gearbeitet, wobei man als Kompetitor jedoch nicht markiertes TSH verwendet, sondern markierte monoklonale oder polyklonale TSH-Rezeptor-Antikörper, die mit den zu bestimmenden Autoantikörpern um die Bindungsstellen des immobilisierten Rezeptors konkurrieren.
4. Analog zu der unter 2. beschriebenen Verfahrensvariante kann anstelle von TSH auch ein TSH-Rezeptor-Antikörper immobilisiert werden.
5. Ein an einer Festphase immobilisierter TSH-Rezeptor kann dazu verwendet werden, die in einer Probe vorhandenen TSH-Rezep tor-Autoantikörper vollständig zu binden, die dann anschließend durch ein geeignetes Markierungsreagens, das auf Antikörper anspricht, z. B. ein Antiserum oder Protein A in markierter Form, markiert werden können.
6. Eine weitere Verfahrensvariante stellt die Umkehrung der unter 5. beschriebenen Verfahrensvariante dar, indem zuerst mit Hilfe geeigneter spezifischer oder auch unspezifischer Binder die Autoantikörper in der Probe an eine Festphase gebunden und anschließend mit Hilfe eines markierten TSH-Rezeptors markiert werden.
7. Ferner kann das Bestimmungsverfahren auch zur Bestimmung spezieller, zwei Rezeptor-bindende Epitope aufweisender Autoantikörper dienen, indem man mit einem an einer Festphase immobilisierten Rezeptor und einem löslichen markierten Rezeptor arbeitet und die Menge an Markierung an der Festphase bestimmt, die auf eine Bindung der zu bestimmenden Autoantikörper sowohl durch den immobilisier ten als auch den markierten Rezeptor zurückgeht.

Weitere an sich bekannte Assaydesigns, z. B. solche mit einer stufenweisen Inkubation und einer Differenzmessung, sind dem Fachmann ohne weiteres bekannt.

Als Antikörper können bei diesen Assaydesigns geeignete monoklonale und polyklonale Antikörper, insbesondere auch humane monoklonale und humane polyklonale Antikörper, sowie rekombinante Antikörperkonstrukte, z. B. sogenannte Single- Chain-Antikörper, verwendet werden. Es ist ferner möglich, auch geeignete Antikörperfragmente einzusetzen, insbesondere auch zur Rezeptormarkierung.

Die Verfügbarkeit der erfindungsgemäßen funktionalen Fusions rezeptoren macht es auch möglich, neue definierte monoklonale Antikörper gegen den rekombinanten funktionalen TSH-Fusions rezeptor zu erzeugen, die gegen Teile der Rezeptorsequenz und angrenzende Teile des angehängten Peptidrests, z. B. das FLAG-Epi top und/oder einen Teil des 6His-Peptids, gerichtet sind, und die aufgrund ihrer Spezifität weitere neue Anwendungs möglichkeiten und Vorteile für die Assaygestaltung erschließen.

Weitere Informationen zur Durchführung und zu den Vorteilen der vorliegenden Erfindung ergeben sich für den Fachmann aus dem nachfolgenden experimentellen Teil unter Bezugnahme auf die Figuren. In den Figuren zeigen:

Fig. 1 den zeitlichen Verlauf der TSH-Rezeptor-Expression in HeLa-Zellen. In Mikrotiterplatten mit 24 Ver tiefungen wurden HeLa-Monolayer-Zellen mit einer Plaque-bildenden Einheit des rekombinanten Vaccinia virus pro Zelle infiziert. 0, 2, 4, 6, 8, 14 und 24 h nach der Infektion wurden die Zellen entnommen, mittels SDS-Page aufgetrennt, und der TSH-Rezeptor wurde durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Die Molekülgrößenmarker sind in kDa angegeben.

Fig. 2 die Bindung von ¹²⁵I-TSH an Extrakte von infizierten HeLa-Zellen als Funktion der Infektionszeit. Die Bestimmung erfolgte unter Verwendung der Bestand teile des TRAK-Assays® in einem Gesamtvolumen von 100 µl gemäß Gebrauchsanweisung.

Fig. 3 die Verteilung des rekombinanten TSH-Fusionsrezep tors auf unterschiedliche Zellfraktionen, die aus infizierten HeLa-Zellen erhalten wurden. In der Dar stellung stellt Bande 1 einen Markerextrakt von HeLa-Zellen dar, Bande 2 repräsentiert die wasser lösliche Cytoplasmafraktion, Bande 3 den unter Verwendung von Triton® X100 erhaltenen Membran extrakt, Bande 4 das verbleibende, mit Triton® X100 nicht extrahierbare unlösliche Protein. Die Molekül größenmarker sind wiederum in kDa angegeben.

Fig. 4 eine Scatchard-Darstellung der ¹²⁵I-TSH-Bindung an mit dem rekombinanten Vacciniavirus infizierten HeLa- Zellen.

Fig. 5 die Analyse von Autoantikörpern in unfraktionierten Seren von Morbus Basedow-Patienten im Vergleich mit Kontrollseren von Normalpatienten. Die Wirkung von sechs Kontrollseren und 13 Seren von Morbus Basedow- Patienten auf die Bindung von ¹²⁵I-TSH an den rekom binanten TSH-Rezeptor im Extrakt aus infizierten HeLa-Zellen wurde im Vergleich mit dem porcinen TSH-Rezep tor (aus dem TRAK-Assay® Kit) untersucht. Die Ergebnisse sind angegeben als Prozentsatz der Gesamtbindung, wobei eine 100%ige Bindung für die ¹²⁵I-TSH-Bindung in Gegenwart eines Nullstandard- Serums steht. Die Ergebnisse sind als Durchschnitts werte von Doppelbestimmungen angegeben.

Fig. 6 eine Standardkurve, wie sie unter Verwendung des an Ni-NTA-Agarose gekoppelten TSH-Fusionsrezeptors und TRAK-Assay® Standards erhalten wird.

Fig. 7 die Meßergebnisse für die Bestimmung der TSHr-Auto antikörper-Titer von Morbus Basedow-Patienten und einer Kontrollgruppe unter Verwendung von an Ni-NTA-Aga rose gekoppeltem rekombinantem TSH-Fusionsrezep tor; und

Fig. 8 die für Normalpatienten und Morbus Basedow-Patienten erhaltenen Meßergebnisse in einer vergleichenden graphischen Gegenüberstellung.

Experimenteller Teil Materialien

Bovines¹²⁵I-TSH (56 µCi/µg), unmarkiertes TSH sowie der TRAK-Assay®- Kit wurden von der Fa. B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH zur Verfügung gestellt. Der pTM1-Vektor wurde von den Doktoren R.E. Rhoads und B. Joshi (Louisiana State University Medical Center, Shreveport, USA) bezogen, der p7.5K131-Rekombinationsvektor wurde von Dr. T. Mertens (Universität Ulm, Deutschland) zur Verfügung gestellt. Der BIOTRAK® cAMP [¹²⁵I]-Assay-Kit und der ECL®-Western-Blot-Nachweis-Kit wurden von der Fa. Amersham bezogen. Die monoklonalen Mäuse-Antikörper NCL-TSHR gegen die extrazelluläre Domäne des TSH-Rezeptors wurden von der Fa. Novocastra Laboratories Ltd. bezogen. Proteaseninhibitorcock tail-Tabletten wurden von der Fa. Boehringer Mannheim bezogen. Die DNA-Primer P1 bis P5 wurden von der Fa. Eurogentec bezogen. Sie wiesen die folgenden Nucleotidsequenzen auf:

Soweit für einzelne Reagenzien keine Bezugsquellen angegeben werden, wurden allgemein frei erhältliche Handelsprodukte verwendet, bei denen die Bezugsquellen für die Nacharbeit barkeit keine Bedeutung haben. Soweit ferner nachfolgend für einzelne Reaktionsschritte keine speziellen Reaktionsbedingun gen angegeben sind, wurde unter den fachnotorisch bekannten Bedingungen gearbeitet, z. B. bei den für die jeweiligen Restriktionsenzyme angebenen optimalen Temperaturen und Reak tionszeiten.

Zellkultur

HeLa-Zellen wurden in Eagle's-Medium modifiziert nach Dulbecco) gezüchtet, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt war, das 50 U/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin enthielt. Die Zellen wurden bei 37°C unter einer 5%igen CO₂-Atmosphäre kultiviert.

Herstellung eines um das FLAG-Octapeptid-Epitop sowie eine 6His-Peptidsequenz verlängerten TSH-Rezeptors 1. Insertion von Sequenzen für das FLAG-Epitop sowie eine His-Peptid-Sequenz in eine TSH-Rezeptor-cDNA-Sequenz

Eine vollständige humane TSH-Rezeptor-cDNA (Libert et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1250-1255, (1989)) wurde nach einer vorbeschrieben Technik im pSVL-Vektor subkloniert (pSVL-TSHR-Plasmid). P1- und P2-Primer wurden dazu verwendet, das von kommerziell erhältlichen Antikörpern erkannte FLAG-Octa peptid-Epitop (N-Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys-C; vgl. Prospekt IBI FLAG® SYSTEM der Fa. INTEGRA Biosciences) am C-Ter minus des TSH-Rezeptors einzuführen. Das 0,5 kb Bgl II-Bam HI-Fragment der TSH-Rezeptor-cDNA wurde auf herkömmliche Weise durch PCR (Polymerase Chain Reaction) unter Verwendung von thermostabiler Taq-DNA-Polymerase vervielfältigt. Der P1-Primer enthält eine Bgl II-Restriktionsstelle, der P2-Primer enthält die FLAG-Epitop-Sequenz (unterstrichen), gefolgt von einem Stopcodon und einer Bam HI-Restriktionsstelle. Das PCR-Fragment wurde mit Bgl II und Bam HI geschnitten und dazu verwendet, das gleiche Fragment in der TSH-Rezeptor-cDNA in dem pSVL-TSH-Plas mid zu ersetzen. Das erhaltene Konstrukt erhielt die Bezeichnung pSVL-TSHR-FLAG.

P1- und P3-Primer wurden dann verwendet, um das 6His-Peptid direkt nach der FLAG-Epitop-Sequenz am C-Terminus des TSH-Rezep tors einzuführen. Das 0,5 kb Bgl II-Bam HI-Fragment der TSH-Rezeptor-cDNA in dem pSVL-TSHR-FLAG-Plasmid wurde nach der PCR-Technik vervielfältigt. Der P1-Primer enthält eine Bgl II-Restrik tionsstelle, der P3-Primer enthält die Sequenz für das 6His-Peptid, gefolgt von einem Stopcodon und einer Bam HI-Restrik tionsstelle. Das PCR-Fragment wurde mit Bgl II und Bam HI geschnitten und dazu verwendet, das entsprechende Fragment In der TSH-Rezeptor-cDNA im pSVL-TSHR-FLAG-Plasmid zu ersetzen. Der erhaltene Vektor erhielt die Bezeichnung pSVL-TSHR-FLAG-6His. Die Nukleotidsequenz der verlängerten cDNA wurde nach dem Sanger-Verfahren bestätigt.

2. Konstruktion eines pTM1-TSHR-FLAG-6His-Expressionsplasmids

Das TSHR-FLAG-6His-DNA-Segment wurde in den pTM1-Vektor (vgl. Moss et al., Nature, 348, S. 19-92, (1990)) strangabwärts von der nicht translatierten Encephalomyocarditisvirus (EMCV)-Lea dersequenz, die den Wirkungsgrad der mRNA-Translation er höht, inseriert. Die Nco I-Schnittstelle im pTM1-Vektor enthält das Translations-Initiations-Codon, das für die Insertion des 5'-Endes der für das Protein codierenden cDNA genutzt werden sollte.

P4- und P5-Primer wurden dazu verwendet, eine Schnittstelle für die Rca I-Restriktase im Startcodon-Bereich der TSH-Rezeptor cDNA im pSVL-TSHR-FLAG-Plasmid zu erzeugen. Diese Schnittstelle ist mit der Nco I-Restriktionsstelle im pTM1-Plasmid kom patibel. Das 0,7 kb Ava I-Afl III-Fragment der TSH-Rezeptor cDNA wurde durch PCR vervielfältigt, wobei das pSVL-TSHR-FLAG-6His- Plasmid als Matrize diente. Der P4-Primer enthält Ava I- und Rca I-Restriktionsstellen, der P5-Primer enthält die Afl III-Restriktionsstelle. Das PCR-Fragment wurde mit Ava I und Afl III geschnitten und dazu verwendet, das gleiche Fragment in der TSH-Rezeptor-cDNA im pSVL-TSHR-FLAG-6His-Plasmid zu ersetzen. Aus diesem Plasmid wurde die verlängerte 2,3 kb TSH-Rezep tor-cDNA mit den Sequenzen für das FLAG-Epitop und das 6His-Peptid mit Rca I und Bam HI freigesetzt und im pTM1-Plas mid an den Nco I- und Bam HI-Schnittstellen strangabwärts von der EMCV-Leader-Sequenz subkloniert. Das erhaltene Konstrukt erhielt die Bezeichnung pTM1-TSHR-FLAG-6His. Die Nukleotidsequenz wurde nach dem Sanger-Verfahren bestätigt.

3. Konstruktion eines Vaccinia-Rekombinations-Plasmids p7.5K131-TSHR-FLAG-6His

Das pTM1-TSHR-FLAG-6His-Plasmid wurde durch Schneiden mit der Cla I-Restriktase linearisiert und zur Ausbildung stumpfer Enden mit Klenow-Fragment aufgefüllt. Nach einer Bam HI-Spal tung wurde das TSHR-FLAG-6His-DNA-Segment, das strangauf wärts von der untranslatierten EMCV-Leadersequenz flankiert wurde, isoliert und an Hind II- und Bam HI-Schnittstellen in den Vaccinia-Rekombinationsvektor p7.5K131 subkloniert. Das erhaltene Konstrukt erhielt die Bezeichnung p7.5K131-TSHR-FLAG-6His.

4. Erzeugung von Vacciniavirus-Rekombinanten

Die TSH-Rezeptor-cDNA unter Kontrolle des 7.5K-Early/Late- Promotors wurde durch homologe Rekombination in das Thymidinki nase (TK)-Gen des Genoms des Wildtyp-Vacciniavirus-Stamms Copenhagen inkorporiert (vgl. Kieny, M.P. et al., Nature 312, S. 163-166, (1984)). Kurz gesagt, wurden zu diesem Zwecke konfluente CV1-Zellen mit dem temperaturempfindlichen Vaccinia virus ts7 infiziert und mit Vacciniavirus-DNA (Stamm Copenha gen) und dem p7.5K131-TSHR-FLAG-6His-Konstrukt nach der Calciumphosphat-Methode transfiziert. Die Viren wurden zwei Tage später geerntet, die TK-negativen Rekombinanten wurden aus dem Virusabkömmling in zwei Durchgängen einer Plaque-Reinigung über TK⁻ 143B-Zellen in Gegenwart von 0,1 mg/ml Bromdesoxyuri din selektiert. Rekombinante Virus-Plaques wurden isoliert, und positive Klone wurden nach Expression in infizierten HeLa- Zellen durch Western-Blot-Analyse auf TSH-Rezeptor identifi ziert.

Die Proteine wurden dazu einer SDS-Gelelektrophorese auf einem 8% Auflösungs-Polyacrylamidgel (PAG) unterzogen (vgl. Laemmli, U.K., Nature, 227, S. 680-685 (1970)). Die aufgetrennten Proteine wurden auf eine Nitrozellulosemembran übertragen, unspezifische Bindungsstellen wurden innerhalb 1 h durch Inkubation mit TBS/5% Trockenmilch/0,02% Tween® 20-Lösung abgesättigt. Die Membran wurde über Nacht bei 4°C durch Umsetzung mit dem monoklonalen NCL-TSHR-Antikörper als Sonde für den TSH-Rezeptor behandelt, der 1 : 20 verdünnt war. Gebundene Antikörper wurden unter Verwendung des ECL® Western- Blot-Nachweis-Kits nachgewiesen.

Eine größere Vorratsmenge des rekombinanten Virus wurde in HeLa-Zellen hergestellt.

5. Expression des verlängerten TSH-Rezeptor-Polypeptids in HeLa-Zellen und Erzeugung von Zellfraktionen

HeLa-Monolayer-Zellen in 75 cm²-Schalen (etwa 15.10⁶ Zellen) wurden mit einer Plaque-bildenden Einheit von rekombinantem Vacciniavirus pro Zelle infiziert und 24 h bei 37°C inkubiert. Infizierte Zellen wurden mit PBS gewaschen, geerntet und bei 1200 U/min pelletiert. Das erhaltene Zellpellet wurde in 0,3 ml eines Puffers resuspendiert, der 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 50 mM NaCl, 10% Glycerol sowie eine Proteaseinhibitoren-Mischung enthielt. Die Suspension wurde durch 20 Takte in einem Glas- Teflon-Homogenisator weiter homogenisiert und dann 15 min bei 800 g und 1 h bei 30 000 g zentrifugiert. Der Überstand (wasserlösliche Cytoplasmafraktion) wurde gesammelt. Das Membran-Pellet wurde mit 0,3 ml 1% Triton® X100 im gleichen Puffer extrahiert und bei 30 000 g 1 h ultrazentrifugiert. Der Überstand (Triton® X100-Membranextrakt) wurde gesammelt, das Pellet (unlösliches Protein) wurde in 0,3 ml eines SDS Elektrophoreseproben-Puffers resuspendiert. Die Menge des TSH-Rezep tors in 10 µl einer jeden Fraktion wurde durch Western- Blot-Analyse abgeschätzt.

Die Kinetik der TSH-Rezeptor-Produktion in HeLa-Zellen nach Infektion mit dem rekombinanten Vacciniavirus bei einer Multiplizität der Infektion von 1 ist in Fig. 1 gezeigt. Die Zellen wurden zu Zeitpunkten zwischen 0 und 24 h nach der Infektion gesammelt, durch SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und mit kommerziell erhältlichen monoklonalen NCL-TSHR-Anti körpern gegen den TSH-Rezeptor markiert. Das rekombinante Protein erschien 6 h nach der Infektion, und die Menge des Proteins erhöhte sich bis zu einem Zeitpunkt von 24 h nach der Infektion, wobei zu diesem Zeitpunkt die Zellen noch relativ gesund sind. Eine Inkubation für einen längeren Zeitraum führte zu einer Zellablösung und ihrem Tod. Eine Western-Blot-Analyse der infizierten Zellen zeigt verschiedene Formen des Rezeptors mit Molmassen von 230 bis 50 kDa, wobei die Hauptfraktion eine Molmasse von etwa 95 kDa aufwies. Das Ergebnis entspricht den aus der Literatur bekannten Daten (Ban T. et al., Endocrinology 131, S. 815-829 (1992)). Im Falle der Infektion von HeLa-Zellen mit dem Wildtyp-Vacciniavirus war keinerlei Signal nachweisbar (Ergebnisse nicht gezeigt).

Die Verteilung des erzeugten TSH-Rezeptors auf unterschiedliche Fraktionen, die aus infizierten HeLa-Zellen erhalten wurden, ist in Fig. 3 gezeigt. In der wasserlöslichen Cytoplasma- Fraktion (Bande 2) ist nur eine geringe Menge des Rezeptors nachweisbar. Der Hauptteil des TSH-Rezeptors liegt in der Membran-Fraktion vor, aus der er mit Triton® X100 in wirksamer Weise extrahiert werden kann (Bande 3). Ein Teil des Rezeptors in der Membran-Fraktion wurde nur durch SDS solubilisiert (Bande 4). Dabei kann es sich um einen nicht extrahierbaren TSH-Rezeptor handeln, der fest in die Membranstruktur inte griert ist.

Um zu testen, ob eine Abhängigkeit der Ausbeute des TSH-Rezep tors von der Intensität der Infektion besteht, wurde die TSH-bindende Aktivität von Zellen, die mit einer Infektions- Multiplizität von 1 sowie von 10 infiziert wurden, gemessen. Eine Erhöhung der Infektions-Multiplizität von 1 auf 10 erhöhte die Endausbeute des funktionalen TSH-Rezeptors bis zu 24 h nach der Infektion nicht.

Bindungsassay für ¹²⁵I-TSH und Morbus Basedow-Autoantikörper

HeLa-Zellen in einer 75 cm²-Schale (etwa 15.10⁶ Zellen) wurden mit 1 bzw. 10 Plaque-bildenden Einheit(en) des rekombinanten Vacciniavirus pro Zelle infiziert und 24 h bei 37°C inkubiert. Infizierte Zellen wurden mit PBS gewaschen, geerntet und bei 1200 U/min pelletiert. Die erhaltenen Zellen wurden in 0,3 ml Puffer A (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 50 mM NaCl, 1% Triton® X100, 10% Glycerol), der mit Proteaseinhibitoren versetzt war, lysiert. Die Suspension wurde bei 30 000 g 1 h zentrifugiert, und der Überstand lieferte die TSH-Rezeptor-Präparation.

Der Assay wurde unter Verwendung von Komponenten des TRAK-Assay®- Kits in einem Gesamtvolumen von 100 µl durchgeführt, das sich aus 25 µl Lösung des rekombinanten TSH-Rezeptors (etwa 200 µg Gesamtprotein), 25 µl entweder Nullstandard-Serum oder Test- Serum sowie 50 µl einer ¹²⁵I-TSH-Lösung (20 000 cpm) zusammen setzte. Im Einklang mit den Herstelleranweisungen wurde 2 h inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 1 ml eines Fällungsmittels gemäß Gebrauchsanweisung gestoppt. Die Röhrchen wurden bei 2000 g 10 min zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Die Gammastrahlung im Pellet wurde gemessen.

Ergebnisse werden entweder ausgedrückt als gebundene Radio aktivität (in cpm - counts per minute) oder als Prozentsatz der Gesamtbindung, und zwar berechnet nach [(counts in Gegenwart des Test-Serums)/(counts in Gegenwart des Nullstandard- Serums)].100%. Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 10⁻⁷ M TSH bestimmt und betrug etwa 10% der Gesamtbindung.

Der in den HeLa-Zellen erzeugte TSH-Rezeptor erwies sich im Hinblick auf der Bindung von TSH als voll funktionsfähig. Fig. 2 zeigt die Bindung von ¹²⁵I-markiertem TSH mit Extrakte von infizierten HeLa-Zellen als Funktion der Zeit der Infektion. Es besteht ein klarer Zusammenhang zwischen der TSH-Rezeptor- Expression in HeLa-Zellen und der TSH-bindenden Aktivität der Zellextrakte (Fig. 1 und 2).

Scatchard-Analyse der TSH-Bindung an infizierte HeLa-Zellen

HeLa-Zellen in Mikrotiterplatten mit 24 Vertiefungen (etwa 300 000 Zellen/Vertiefung) wurden mit einer Plaque-bildenden Einheit pro Zelle entweder des rekombinanten Vacciniavirus oder des Wildtyp-Vacciniavirus infiziert und 24 h bei 37°C inku biert. Infizierte Zellen wurden 3 h bei 37°C in 0,2 ml modifiziertem Hank's-Puffer ohne NaCl inkubiert, wobei die Isotonie der Lösung durch 280 mM Saccharose, die mit 0,25% Kälberserumalbumin ergänzt war, gewährleistet wurde. Unter schiedliche Mengen von (a) ¹²⁵I-markiertem TSH oder (b) einer Mischung von ¹²⁵I-TSH (25 000 cpm) mit variierenden Konzen trationen von unmarkiertem TSH wurden diesem Puffer zugegeben. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Zellen schnell mit 1 ml des gleichen Puffers gewaschen und mit 1 ml 1N NaOH solubilisiert, und die Radioaktivität wurde in einem Gamma- Counter gemessen. Die spezifische TSH-Bindung wurde definiert als Unterschied zwischen der Gesamtbindung von ¹²⁵I-TSH in Abwesenheit sowie in Gegenwart von 10⁻⁷ M TSH. Die unspezifische Bindung betrug etwa 2% der Gesamtbindung. Die Dissoziations konstante für die TSH-Bindung wurde nach dem Scatchard- Verfahren errechnet (Scatchard, G., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51, 600-672, (1949)). Kontrolluntersuchungen betrafen die Bindung von ¹²⁵I-TSH an HeLa-Zellen, die mit dem Vacciniavirus vom Wildtyp infiziert waren.

Die Wechselwirkung von mit dem rekombinanten Virus infizierten HeLa-Zellen mit ¹²⁵I-markiertem TSH führte zu einer spezifischen und sättigbaren Bindung des Hormons. Die nach dem Scatchard- Verfahren erhaltenen Daten sind in Fig. 4 aufgetragen. Die Tatsache, daß die Scatchard-Kurve in Fig. 4 eine gerade Linie ist, weist auf die Existenz von nur einem Typ von Bindungs stellen hin. Aus der Steigung der Kurve kann eine Dissozia tionskonstante von etwa 2.10^-10 M errechnet werden. HeLa-Zellen, die mit dem Wildtyp-Vacciniavirus infiziert worden waren, zeigten keinerlei nachweisbare spezifische TSH-Bindung (Daten nicht gezeigt). Unter Zugrundelegung der Avogadro-Zahl errechnet sich eine Anzahl von etwa 150 000 hochaffinen TSH-Rezep toren pro Zelle.

Wechselwirkung des TSH-Rezeptors mit Morbus Basedow-Autoanti körpern

Der durch Expression des rekombinanten Vacciniavirus erhaltene rekombinante TSH-Rezeptor wurde auch auf seine Fähigkeit untersucht, in Seren von Patienten mit Morbus Basedow mit TSH-Rezep tor-Autoantikörpern zu wechselwirken. Die Anwesenheit derartiger Autoantikörper läßt sich anhand ihrer Fähigkeit nachweisen, die Bindung von ¹²⁵I-TSH an den TSH-Rezeptor zu inhibieren. Dabei ist die Menge der Autoantikörper in dem untersuchten Serum der gemessenen gebundenen Radioaktivität umgekehrt proportional. Mit dem TRAK-Assay®-Kit wurden Seren von sechs gesunden Individuen sowie von 13 Morbus Basedow- Patienten mit unterschiedlichen Autoantikörper-Spiegeln gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Sie zeigen, daß der durch Expression des rekombinanten Vacciniavi rus in HeLa-Zellen erhaltene verlängerte TSH-Fusionsrezeptor von Morbus Basedow-Autoantikörpern spezifisch erkannt wird. So wurde bei den Autoantikörper-freien Kontrollseren eine 95-106%ige Bindung von ¹²⁵I-TSH erhalten, während bei der Messung von Seren von Morbus Basedow-Patienten nur eine 30-75%ige entsprechende Bindung erhalten wurde. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante positive Korrelation zu den mit dem TRAK-Assay® Kit erhaltenen Werten.

Intrazellulare cAMP-Messungen

HeLa Monolayer-Schichten in Mikrotiterplatten mit 24 Ver tiefungen wurden mit einer Plaque-bildenden Einheit pro Zelle von entweder dem rekombinanten Vacciniavirus oder dem Wildtyp- Vacciniavirus infiziert und 24 h bei 37°C inkubiert. Infizierte Zellen wurde 1 h in modifiziertem Hank's-Puffer ohne NaCl (vgl. oben) inkubiert und dann eine weitere Stunde im gleichen Puffer, der 1 mM Isobutylmethylxanthin sowie vorgegebene Konzentrationen an TSH enthielt. Zellulares cAMP wurde mit 65% Ethanol extrahiert und unter Verwendung des BIOTRAK® cAMP-Assay- Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Kontrolluntersuchungen betrafen die Messungen der TSH-ab hängigen cAMP-Produktion in HeLa-Zellen, die mit dem Wildtyp- Vacciniavirus infiziert waren. Es zeigte sich, daß die Einwirkung von TSH eine maximal ca. 6fache dosisabhängige Erhöhung der cAMP-Produktion bewirkte. Mit dem Wildtyp- Vacciniavirus infizierte HeLa-Zellen reagierten nicht. Somit erwies sich der rekombinante TSH-Fusionsrezeptor auch als funktional im Hinblick auf die Stimulation der intrazellulären cAMP-Produktion.

Herstellung eines immobilisierten funktionalen rekombinanten TSH-Fusionsrezeptors

Mit dem rekombinanten Vacciniavirus infizierte HeLa-Zellen wurden nach einer 24stündigen Inkubation bei 37°C wie weiter oben beschrieben geerntet. Das erhaltene Zellpellet (etwa 2.10⁸ Zellen) wurden anschließend in 3 ml Puffer (10 mM Tris pH 7,6; 50 mM NaCl; 1% Triton® X-100; 10% Glycerol) resuspendiert und bei -80°C eingefroren. Nach dem Auftauen wurde die solubili sierte Membranfraktion durch Zentrifugation (15 min bei 1000 g und 30 min bei 30 000 g) angereichert und von unlöslichen Bestandteilen abgetrennt.

Parallel dazu wurden 200 µl Ni-NTA-Agarose (bezogen von der Fa. Qiagen GmbH) mit 200 µl des gleichen Puffers versetzt und in eine kleine offene Säule gepackt.

Der von unlöslichen Bestandteilen befreite Zentrifugationsüber stand wurde auf die Säule aufgetragen und über Nacht bei 4°C rezirkuliert, um den TSH-Fusionsrezeptor über seinen terminalen 6His-Peptidrest an die Ni-NTA-Agarose zu koppeln.

Die beladene Ni-NTA-Agarose wurde anschließend mit 3 ml Vollblut abgesättigt (Hämoglobin bindet unspezifisch an Ni-NTA-Aga rose), um die verbliebenen Ni-NTA-Bindungsstellen ab zusättigen. Nach Entfernen des Säulenüberstands wurde die so behandelte Ni-NTA-Agarose mit dem beschriebenen Puffer auf ein Gesamtvolumen von 1,5 ml gebracht und in Portionen von 25 µl auf Eppendorf-Teströhrchen verteilt.

Bestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern unter Verwendung des immobilisierten TSH-Fusionsrezeptors

In die vorausgehend beschriebenen Eppendorf-Teströhrchen mit je 25 µl Ni-NTA-Agarose mit dem daran gebundenen TSH-Fusions rezeptor wurden zu Meßzwecken jeweils 25 µl eines Serums bzw. 25 µl der Standardlösungen aus dem TRAK-Assay® zugegeben, mit dem Inhalt des Teströhrchens vermischt und anschließend 20 min bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln inkubiert. Anschließend wurden pro Teströhrchen 50 µl Tracer (¹²⁵-TSH aus dem TRAK-Assay®) zugegeben, und unter ständigem Schütteln wurde über Nacht bei 4°C weiter inkubiert.

Anschließend wurden die Röhrchen kurz bei Raumtemperatur zentrifugiert (1 min), 80 µl des Überstands wurden entfernt, und das Zentrifugationspellet wurde in 350 µl Puffer resuspen diert. Nach einer erneuten Zentrifugation wurden 320 µl des Überstands wiederum abpipettiert, und das erhaltene gewaschene Pellet wurde direkt in einem Gammacounter gemessen.

Bei der Messung der Standards aus dem TRAK-Assay® wurden die in Tabelle 1 wiedergegebenen Ergebnisse erhalten. Die zu gehörige Standardkurve ist in Fig. 6 gezeigt.

Die Patientenseren wurden jeweils in Doppelbestimmungen gemessen, wobei aus den Einzelmeßwerten Mittelwerte gebildet wurden, die in Tabelle 2 eingegangen sind. Zum Vergleich wurden die gleichen Seren mit dem herkömmlichen TRAK-Assay® gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 2 aufge führt. Fig. 7 zeigt die Korrelation der nach dem herkömmlichen TRAK-Assay® erhaltenen Meßwerte zu den Meßwerten, die unter Verwendung des immobilisierten rekombinanten TSH-Fusions rezeptors erhalten wurden.

Fig. 8 zeigt die Ergebnisse der Messungen von Seren von Normalpatienten und Morbus Basedow-Patienten in einer graphi schen Darstellung. Die Gruppe der Morbus Basedow-Patienten läßt sich klar von der Gruppe der Normalpatienten unterscheiden.

Es zeigt sich somit, daß es erstmals gelungen ist, die Bestimmung von TSH-Rezeptor Autoantikörpern, wie sie für den Morbus Basedow charakteristisch sind, und unter Verwendung eines funktionalen immobilisierten TSH-Rezeptors durchzuführen.

Standardkurve unter Verwendung eines Ni-NTA-Agarose-gekoppelten rekombinanten TSH-Fusionsrezeptors

Vergleichende Bestimmung von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern unter Verwendung des TRAK-Assay® sowie unter Verwendung des immobilisierten rekombinanten TSH-Fusionsrezeptors

Claims

1. Rezeptorbindungsassay zur Bestimmung von TSH-Rezeptor- Autoantikörpern in einer biologischen Probe, bei dem man die Probe in einer Reaktionsmischung gleichzeitig oder nacheinander mit einer TSH-Rezeptor-Präparation sowie wenigstens einem von (i) einem Kompetitor und (ii) einem Mittel für die Abtrennung des TSH-Rezeptors und der daran gebundenen Bestandteile der Reaktionsmischung von der flüssi gen Phase umsetzt, wobei einer der genannten Bestandteile der Reaktionsmischung markiert oder selektiv markierbar ist, und bei dem man den durch Bindung der zu bestimmenden Autoantikör per und/oder des Kompetitors an die TSH-Rezeptor-Präparation gebildeten Komplex von der flüssigen Reaktionsmischung ab trennt und aus der Menge der Markierung in dem genannten Komplex auf die Anwesenheit und/oder Menge der zu bestimmenden Autoantikörper zurückrechnet, dadurch gekennzeichnet, daß man als TSH-Rezeptor-Präparation eine Präparation eines rekombinanten TSH-Fusionsrezeptors verwendet, der gegenüber einem funktionalen TSH-Rezeptor um einen Peptidrest verlängert ist, wobei dieser Peptidrest (i) eine Markierung aufweist oder selektiv markierbar ist und/oder (ii) durch Bindung an einen selektiven Bindungspartner immobi lisiert oder immobilisierbar ist, ohne daß die für den Rezep torbindungsassay erforderliche Funktionalität des TSH-Rezep tors signifikant beeinträchtigt ist.

2. Rezeptorbindungsassay nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß der Peptidrest eine Länge von bis zu 600 Amino säuren, inbesondere von 6 bis 200 Aminosäuren, aufweist.

3. Rezeptorbindungsassay nach Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß der Peptidrest ein C-terminaler Peptidrest ist.

4. Rezeptorbindungsassay nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der selektive Bindungspartner ein Metallchelatharz, ein Antikörper oder Biotin ist oder enthält.

5. Rezeptorbindungsassay nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Peptidrest wenigstens einen Pepti drestabschnitt enthält, der ausgewählt ist aus dem sogenannten FLAG-Oktapeptid und einem 6His-Peptid, und daß der immobili sierte selektive Bindungspartner ein selektiver Antikörper gegen das FLAG-Oktapeptid oder ein mit dem 6His-Peptid reagie rendes Metallchelatharz ist.

6. Rezeptorbindungsassay nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet, daß das Metallchelatharz Ni-NTA-Agarose ist.

7. Rezeptorbindungsassay nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der selektive Bindungspartner an eine Mikrofestphase gebunden oder als Beschichtung eines Teströhrchens oder einer Mikrotiterplatte vorliegt.

8. Rezeptorbindungsassay nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der rekombinante TSH-Fusionsrezep tor durch Expression der cDNA eines funktionalen humanen TSH-Rezep tors, die um eine für den Peptidrest codierende DNA-Se quenz verlängert und in das Genom eines rekombinanten Vacci niavirus inseriert war, in mit dem rekombinanten Vacciniavirus infizierten Warmblüterzellen hergestellt wurde.

9. Rezeptorbindungsassay nach Anspruch 8, dadurch gekenn zeichnet, daß die Warmblüterzellen HeLa-Zellen sind.

10. Rezeptorbindungsassay nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmenden Autoantikörper rezeptorstimulierende Autoantikörper sind, deren Auftreten in einem Humanserum für den Morbus Basedow charakteristisch ist.

11. Rekombinanter TSH-Fusionsrezeptor, der die Aminosäurese quenz eines funktionalen humanen TSH-Rezeptors aufweist, die um einen Peptidrest verlängert ist, der markiert oder markier bar und/oder immobilisiert oder immobilisierbar ist, ohne daß die Bindungsfähigkeit des TSH-Rezeptors gegenüber TSH oder TSH-Rezeptor-Autoantikörpern beeinträchtigt ist, und der durch Expression der cDNA eines funktionalen humanen TSH-Rezeptors, die um eine für den Peptidrest codierende DNA-Sequenz ver längert ist und in das Genom eines rekombinanten Vacciniavirus inseriert ist, in mit dem rekombinanten Vacciniavirus infi zierten Warmblüterzellen, insbesondere HeLa-Zellen, herge stellt wurde.

12. Rekombinanter TSH-Fusionsrezeptor nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er an seinem C-Terminus einen Peptidrest aufweist, der wenigstens das FLAG-Oktapeptid und/oder einen 6His-Peptidrest enthält.

13. Rekombinanter TSH-Fusionsrezeptor nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß er an seinem C-Terminus nur um das FLAG-Oktapeptid und einen benachbarten endständigen 6His-Pep tidrest verlängert ist.

14. Vacciniavirus, in dessen Genom am Ort des Thymidinkinase gens eine DNA-Sequenz exprimierbar inseriert ist, die für den humanen TSH-Rezeptor sowie einen diesen verlängernden Peptid rest codiert.

15. Vacciniavirus nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die für den Peptidrest codierende DNA für das FLAG-Okta peptid sowie einen C-terminalen 6His-Peptidrest codiert.

16. Rezeptorbindungsassay zur Bestimmung von physiologisch wirksamen Analyten in Form von Hormonen oder Autoantikörpern, die in einem Organismus durch Wechselwirkung mit einem zell membranständigen G-Protein-gekoppelten Glykoproteinrezeptor die normalen physiologischen Hormonwirkungen auslösen oder diese blockieren, in einer biologischen Probe, bei dem man die Probe, die den zu bestimmenden Analyten ent hält, in einer Reaktionsmischung gleichzeitig oder nachein ander mit einer Präparation des betreffenden Rezeptors sowie wenigstens einem von (i) einem Kompetitor und (ii) einem Binder für den Analyten oder den Rezeptor umsetzt, wobei einer der genannten Bestandteile der Reaktionsmischung markiert oder selektiv markierbar ist, und bei dem man die durch Bindung des Analyten und/oder des Kompetitors an die Rezeptorpräparation gebildeten Komplexe vom Rest der Reaktionsmischung abtrennt und aus der Menge der Markierung in dem genannten Komplex auf die Anwesenheit und/oder Menge des zu bestimmenden Analyten in der Probe zurückrechnet, dadurch gekennzeichnet, daß man als Rezeptorpräparation eine durch Rekombinationsverfahren hergestellte funktionale Fu sionsrezeptor-Präparation verwendet, die aus einem Fusions rezeptor besteht oder einen solchen Fusionsrezeptor enthält, der gegenüber dem natürlich vorkommenden Rezeptor um einen C-ter minalen Peptidrest verlängert ist, wobei der Peptidrest (i) eine Markierung aufweist oder selektiv markierbar ist und/oder (ii) durch Bindung an einen immobilisierten selektiven Bin dungspartner immobilisiert oder immobilisierbar ist, ohne daß die für den Rezeptorbindungsassay wesentliche Rezeptorfunktio nalität beeinträchtigt ist.

17. Rezeptorbindungsassay nach Anspruch 16, dadurch gekenn zeichnet, daß der Rezeptor ausgewählt ist aus rekombinanten FSH- oder LH/CG-Rezeptoren und der Peptidrest bis zu etwa 60 Aminosäuren umfaßt.

18. Rezeptorbindungsassay nach Anspruch 17, daß der Peptid rest wenigstens einen Peptidrestabschnitt enthält, der ausge wählt ist aus dem FLAG-Oktapeptid und einem 6His-Peptid, und daß der immobilisierte selektive Bindungspartner ein selekti ver Antikörper gegen das FLAG-Oktapeptid oder ein mit dem 6His-Peptid reagierendes Metallchelatharz, insbesondere Ni- NTA-Agarose, ist.

19. Reagenziensatz zur Durchführung eines Rezeptorbindungs assays nach einem der Ansprüche 1 bis 10 bzw. 16 bis 18, da durch gekennzeichnet, daß er, neben weiteren üblichen Kom ponenten eines entsprechenden Reagenziensatzes, Teströhrchen umfaßt, deren Wände mit einem Metallchelatharz beschichtet sind, an das über einen geeigneten Peptidrest ein funktionaler rekombinanter Fusionsrezeptor, insbesondere ein rekombinanter TSH-Fusions-Rezeptor nach einem der Ansprüche 11 bis 13, gebunden ist.

20. Reagenziensatz nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet daß das Metallchelatharz Ni-NTA-Agarose ist und der Peptidrest einen endständigen 6His-Peptidrest enthält.