DE19640556A1

DE19640556A1 - Verwendung von Xanthinderivaten zur Modulation der Apoptose

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Publication number: DE19640556A1
Application number: DE19640556A
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr Muellner; Claudia Dax
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1996-10-01
Filing date: 1996-10-01
Publication date: 1998-04-02

Description

Bei der Apoptose handelt es sich im Gegensatz zur Nekrose um einen genetisch kontrolliert verlaufenden (programmierten) Zelltod, der essentieller Bestandteil des Lebens mehrzelliger Organismen ist.

Im Gegensatz zu diesem normalen und lebensnotwendigen Apoptoseprozeß sind zahlreiche Krankheitsformen oder deren Symptome Ausdruck einer abnormalen, d. h. a) ausufernden oder b) unterdrückten Apoptose [a): Infarkt, Stroke oder Neurodegeneration, b) hypertrophische Erkrankungen]. Heilungsvorgänge von Krankheiten können somit durch Unterdrückung oder Aktivierung der Apoptose möglich sein (z. B. Querschnittslähmung, Immunabwehr usw.). Apoptose verläuft nach Induktion definierter Todessignale, beispielsweise durch Stimulation bestimmter Rezeptoren (z. B. Fas-Rezeptor), über eine sekundär induzierte komplexe Kaskade von ineinandergreifenden biochemischen Ereignissen, an deren Ende die Auflösung der intakten Zelle zu Membran-abgepackten Einheiten steht, die vom Körper ohne oder nur mit geringem Schaden für die umliegenden Zellen (Gegensatz zur Nekrose) entsorgt werden können. Dabei sind in manchen Fällen die Übergänge zwischen Nekrose und Apoptose fließend; so gibt es Fälle, in denen Nekrose zur Apoptose (oder umgekehrt) führt (z. B. Infarkt, Stroke etc.).

Cofilin, ein 19 kDa großes aktinbindendes Protein, spielt als costimulatorischer Faktor in T-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Immunreaktion. Cofilin liegt im Cytosol phosphoryliert vor und wird nach Dephosphorylierung in den Zellkern transportiert. Hierbei dient es offenbar als Schleppermolekül für das Protein Aktin, welches keine nukleare Erkennungssequenz besitzt und als DNAse-I-Inhibitor bekannt ist. Durch diesen Mechanismus kann der Phosphorylierungsgrad des cytosolischen Cofilins einen regulierenden und modulierenden Einfluß auf die Apoptose von Zellen nehmen.

Es wurde nun gefunden, daß bestimmte Xanthinderivate geeignet sind, die Dephosphorylierung von Cofilin zu hemmen und damit haben sie einen modulierenden Einfluß auf die Apoptose.

Die Erfindung betrifft daher die Verwendung von mindestens einem Xanthinderivat der Formel I

und/der einer gegebenenfalls stereoisomeren Form des Xanthinderivats der Formel I,
wobei R² für (C₁-C₄)-Alkyl steht,
einer der Reste R¹ oder R³ für einen Rest der Formel 11 steht,

-(CH₂)_n-R-CH₃ (II)

worin R für

a) eine kovalente Einfachbindung steht und worin n die ganze Zahl Null, 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 bedeutet,
b) einen Rest -CO- steht und worin n die ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bedeutet, oder
c) einen Rest -C(R⁴)(OH)- steht und worin n die ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bedeutet und

R⁴ für

a) ein Wasserstoffatom oder
b) (C₁-C₃)-Alkyl steht, und

der andere Rest R³ oder R¹ für

a) ein Wasserstoffatom,
b) (C₁-C₇)-Alkyl,
c) (C₄-C₈)-Cycloalkyl-alkyl oder
d) Alkyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen steht, worin die Kohlenstoffkette mit einem Sauerstoffatom unterbrochen ist,

zur Herstellung von Arzneimitteln zur Modulation der Apoptose.

Bevorzugt werden Xanthinderivate der Formel I eingesetzt, wobei R² für (C₁-C₄)-Alkyl steht und
einer der Reste R¹ oder R³ für einen Rest der Formel II steht, worin R für

a) einen Rest -CO- oder
b) einen Rest -C(R⁴)(OH)- steht, und n die ganze Zahl 3, 4, 5 oder 6 bedeutet und

R⁴ für ein Wasserstoffatom oder C₁-C₃-Cycloalkyl-alkyl steht und
der andere Rest R³ oder R¹ für (C₁-C₇)-Alkyl oder (C₄-C₈)-Cycloalkyl-alkyl steht.

Besonders bevorzugt werden Xanthinderivate der Formel I eingesetzt, wobei
R² für (C₁-C₂)-Alkyl steht,
R¹ für den Rest der Formel II steht, worin R für

R⁴ für ein Wasserstoffatom oder (C₁-C₂)-Alkyl steht und
R³ für (C₁-C₇)-Alkyl oder (C₄-C₈)-Cycloalkyl-alkyl steht.

Insbesondere bevorzugt werden Xanthinderivate der Formel I eingesetzt, wobei
R² für (C₁-C₂)-Alkyl steht,
R¹ für einen Rest der Formel II steht, worin R für

R⁴ für ein Wasserstoffatom oder (C₁-C₂)-Alkyl steht und
R³ für (C₂-C₅)-Alkyl oder (C₄-C₆)-Cycloalkyl-alkyl steht.

Ganz besonders bevorzugt wird 1-(5-Hydroxy-5-methylhexyl)-3-methyl-7- propylxanthin verwendet.

Die Alkylreste der Formel I sind geradkettig oder verzweigt. Der Ausdruck "(C₄-C₈)- Cycloalkyl-alkyl" definiert solche Alkylreste, die mit (C₃-C₆)-Cycloalkyl substituiert sind, wobei die Summe aller C-Atome kleiner oder gleich 8 ist. Dazu gehören beispielsweise der Cyclopropyl-methyl bis -pentyl-, Cyclobutyl-methyl- bis -butyl-, Cyclopentyl-methyl- bis -propyl- sowie Cyclohexyl-methyl- und -ethyl-Rest. Der Rest "(O)" steht für Sauerstoffatom. Unter "Modulation der Apoptose" wird die Inhibierung oder Induktion der Apoptose verstanden.

Die Xanthinderivate der Formel I werden nach bekannten Verfahren hergestellt (US 3,737,433; US 4,108,995; US 4,833,146).

Eine Verfahrensweise besteht beispielsweise darin, daß man ein 3-Alkylxanthin der Formel II,

in der
R² eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen darstellt,
A für ein Wasserstoffatom, (C₄-C₈)-Cycloalkyl-alkyl, (C₂-C₆)-Alkoxyalkyl oder den Rest der Formel II steht und
B für ein Wasserstoffatom, (C₄-C₈)-Cycloalkyl-alkyl, (C₂-C₆)-Alkoxyalkyl, den Rest der Formel II, Benzyl- oder Diphenylrest steht, wobei aber mindestens einer dieser Reste A und B Wasserstoffatom bedeutet,
direkt oder in Gegenwart eines basischen Kondensationsmittels oder in Form eines seiner Salze in 1- oder/und 7-Position einstufig oder stufenweise mit entsprechenden Alkylierungsmitteln der allgemeinen Formel III

X-Q (III)
in der
Halogenatom oder eine Sulfonsäureester- oder Phosphorsäureestergruppierung und
Q (C₄-C₈)-Cycloalkyl-alkyl, (C₂-C₆)-Alkoxyalkyl oder Rest der Formel II bedeutet,
unter nachträglicher reduktiver Abspaltung des Restes B, wenn dieser eine Benzyl- oder Diphenylmethylgruppe darstellt, oder gegebenenfalls hydrolytischer Eliminierung eines Alkoxymethylrestes aus der Position des Restes B und/oder Reduktion der Ketogruppe zur Alkoholfunktion, wenn A oder B einen Oxoalkylrest bedeutet, bei einer Reaktionstemperatur zwischen 0°C und dem Siedepunkt des jeweils verwendeten Reaktionsmediums alkyliert.

Die Ausgangsstoffe der Umsetzungen sind bekannt oder lassen sich nach literaturbekannten Methoden leicht herstellen.

Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel zur Modulation der Apoptose, die mindestens eine wirksame Menge eines Xanthinderivats der Formel I, neben pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Trägerstoffen, Verdünnungsmitteln und/oder anderen Wirk- und Hilfsstoffen enthalten.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation der Apoptose, die dadurch gekennzeichnet sind, daß man mindestens ein Xanthinderivat der Formel I mit einem physiologisch annehmbaren Träger und weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen in eine geeignete Darreichungsform bringt.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden parenteral, oral, rektal oder gegebenenfalls auch topisch appliziert.

Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro)Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder injizierbare Lösungen sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel, wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel oder Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als häufig verwendete Hilfsstoffe seien z. B. Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Cellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle, Polyethylenglykole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, z. B. Glycerin, genannt.

Aufgrund der pharmakologischen Eigenschaften der Xanthinderivate der Formel I können diese Verbindungen zur gezielten Modulation der Apoptose eingesetzt werden. Daher können Erkrankungen mit ausufernder Apoptose wie Infarkt, Myome, Muskelatrophie, Muskeldystrophie, Kachexie, Systemic Inflammation Response Syndrome (SIRS), Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS), zerebrale Malaria, chronische Lungenentzündung, Lungensarkosidose, Reperfusionsschäden, Narben bildung, Darmentzündungen, Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), Krebs, Erkrankungen mit erhöhten Proteinverlust, Stroke, Neurodegeneration, chronische Niereninsuffizienz, Verbrennungsschäden oder hypertrophische Erkrankungen behandelt werden.

Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Präparate in Dosierungseinheiten hergestellt und verabreicht, wobei jede Einheit als aktiven Bestandteil eine bestimmte Dosis mindestens eines Xanthinderivates der Formel I enthält. Bei festen Dosierungseinheiten wie Tabletten, Kapseln, Dragees oder Suppositorien beträgt diese Dosis bis zu etwa 1000 mg, bevorzugt jedoch etwa 100-600 mg, und bei Injektionslösungen in Ampullenform bis zu 300 mg, vorzugsweise 20-200 mg. Für die Behandlung eines Patienten (70 kg) ist in frühen Phasen eine intravenöse Infusionsbehandlung von 100-2000 mg pro Tag indiziert. In der späteren Rehabilitationsphase ist eine orale Verabreichung von 3 mal 400 mg pro Tag insbesondere von 1-(5-Hydroxy-5-methylhexyl)-3-methyl-7-propylxanthin indiziert. Unter Umständen sind jedoch auch höhere oder niedrigere Dosen angebracht. Die Verabreichung der Dosis kann sowohl durch Einmalgabe in Form einer einzelnen Dosierungseinheit oder aber mehrerer kleinerer Dosierungseinheiten als auch durch Mehrfachgabe unterteilter Dosen in bestimmten Intervallen erfolgen.

Schließlich können Xanthinderivate der Formel I und/oder gegebenenfalls deren entsprechende Salze bei der Herstellung der vorgenannten galenischen Zubereitungsformen auch zusammen mit anderen geeigneten Wirkstoffen, beispielsweise Wirkstoffen, die freie Sauerstoffradikale abfangen, z. B. 1,5-Hydro- 4H-pyrazolo(3,4-d)pyrimidin-4-on, Superoxiddismutase, Dimethylsulfoxid oder Mannitol, Heparin, Ascorbinsäure oder Deferoxamin, formuliert werden.

Ferner zeigt ein Kombinationspräparat, enthaltend ein Xanthinderivat der Formel I und eine Verbindung der Formel IV oder V einen überadditiven Hemmeffekt auf die Dephosphorylierung von Cofilin und damit auf die Aktivierung von Cofilin, die zu einer Modulation der Apoptose führt. Aufgrund des Ausmaßes dieses Effekts läßt sich die Anwendung dieses Kombinationspräparats auf Bereiche ausdehnen, die beispielsweise einer immunsuppressiven Therapie durch die Einzelkomponenten bislang verschlossen waren.

Die Erfindung betrifft daher ferner ein Kombinationspräparat, enthaltend

1) mindestens ein wie oben definiertes Xanthinderivat der Formel I,
2) eine Verbindung der Formel IV und/oder V, und/oder eine gegebenenfalls stereoisomere Form der Verbindung der Formel IV oder V und/oder ein physiologisch verträgliches Salz der Verbindung der Formel V, wobei
R¹ für a) (C₁-C₄)-Alkyl,
b) (C₃-C₅)-Cycloalkyl,
c) (C₂-C₆)-Alkenyl oder
d) (C₂-C₆)-Alkinyl, steht,
R² für a) -CF₃,
b) -O-CF₃,
c) -S-CF₃,
d) -OH,
e) -NO₂,
f) Halogen,
g) Benzyl,
h) Phenyl,
i) -O-Phenyl,
k) -CN oder
l) -O-Phenyl, ein oder mehrfach substituiert mit
1) (C₁-C₄)-Alkyl,
2) Halogen,
3) -O-CF₃ oder
4) -O-CH₃, steht,
R³ für a) (C₁-C₄)-Alkyl,
b) Halogen, oder
c) ein Wasserstoffatom steht, und
X für a) eine -CH-Gruppe oder
b) ein Stickstoffatom, steht, und
3) einen pharmazeutischen Träger

zur Modulation der Apoptose.

Bevorzugt ist der Einsatz einer Verbindung der Formel IV und/oder V und/oder eine gegebenenfalls stereoisomeren Form der Verbindung der Formel IV oder V und/oder ein Salz der Verbindung der Formel V, wobei
R¹ für a) Methyl,
b) Cyclopropyl oder
c) (C₃-C₅)-Alkinyl steht,
R² für -CF₃ oder -CN steht,
R³ für ein Wasserstoffatom oder Methyl steht, und
X für eine -CH- Gruppe steht, in Kombination mit Xanthinderivaten der Formel I, wobei
R² für (C₁-C₂)-Alkyl steht,
R¹ für einen Rest der Formel II steht, worin R für
a) einen Rest -CO- oder
b) einen Rest -C(R⁴)(OH)- steht,
und n die ganze Zahl 3, 4, 5 oder 6 bedeutet und
R⁴ für ein Wasserstoffatom oder (C₁-C₂)-Alkyl steht und
R³ für (C₂-C₅)-Alkyl oder (C₄-C₆)-Cycloalkyl-alkyl steht.

Insbesondere bevorzugt ist die Verwendung von N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-cyan- 3-hydroxy-crotonsäureamid, 2-Cyano-3-cyclopropyl-3-hydroxy-acrylsäure-(4- cyanophenyl)-amid oder N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-cyan-3-hydroxy-hept-2-en-6- in-carbonsäureamid in Kombination mit 1 -(5-Hydroxy-5-methylhexyl)-3-methyl-7- propylxanth in.

Die Herstellung der Verbindung der Formel IV oder V erfolgt nach bekannten Verfahren wie sie in EP 484223; EP 529 500; US 4 061 767; EP 538 783 oder EP 551 230 beschrieben werden. Die Ausgangsstoffe der chemischen Umsetzungen sind bekannt oder lassen sich nach literaturbekannten Methoden leicht herstellen.

Unter dem Begriff Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl werden Reste verstanden, deren Kohlenstoffkette geradkettig oder verzweigt sein kann. Ferner können die Alkenyl- oder Alkinyl-Reste auch mehrere Doppelbindungen beziehungsweise mehrere Dreifachbindungen enthalten. Cyclische Alkylreste sind beispielsweise 3- bis 5- gliedrige Monocyclen wie Cyclopropyl, Cyclobutyl oder Cyclopentyl. Unter dem Begriff "überadditiv" werden Wirkungen verstanden, die größer als die Summe der Einzelwirkungen sind.

Das erfindungsgemäße Kombinationspräparat eignet sich beispielsweise zur Behandlung von Transplantationen, Autoimmunerkrankungen, Infarkt, Stroke, Entzündungen, Neurodegeneration Myome, Muskelatrophie, Muskeldystrophie, Kachexie, Systemic Inflammation Response Syndrome (SIRS), Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS), zerebrale Malaria, chronische Lungenentzündung, Lungensarkosidose, Reperfusionsschäden, Narbenbildung, Darmentzündungen, Verbrennungsschäden, Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), Krebs, Erkrankungen mit erhöhten Proteinverlust, Neurodegeneration, chronische Niereninsuffizienz oder hypertrophischen Erkrankungen.

Das erfindungsgemäße Kombinationspräparat kann auch Kompositionen oder Kombinationspackungen umfassen, in denen die Bestandteile nebeneinander gestellt sind und deshalb gleichzeitig, getrennt oder zeitlich abgestuft an ein und denselben menschlichen oder tierischen Körper angewendet werden können.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines Kombinationspräparats zur Modulation der Apoptose, die dadurch gekennzeichnet sind, daß man mindestens ein Xanthinderivat der Formel I und eine Verbindung der Formel IV oder V mit einem physiologisch annehmbaren Träger und weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen in eine geeignete Darreichungsform bringt.

Das erfindungsgemäße Kombinationspräparat kann als Dosiereinheit in Form von Arzneiformen wie Kapseln (einschließlich Mikrokapseln, die im allgemeinen keine pharmazeutischen Träger enthalten), Tabletten einschließlich Dragees und Pillen) oder Zäpfchen vorliegen, wobei bei Verwendung von Kapseln das Kapselmaterial die Funktion des Trägers wahrnehmen und der Inhalt z. B. als Pulver, Gel, Lösung Emulsion oder Dispersion vorliegen kann. Besonders vorteilhaft und einfach ist es jedoch, orale (perorale Formulierungen mit den beiden Wirkstoffkomponenten 1) und 2) herzustellen, die die berechneten Mengen der Wirkstoffe zusammen mit jedem gewünschten pharmazeutischen Träger enthalten. Auch eine entsprechende Formulierung (Zäpfchen) für die rektale Therapie kann angewandt werden. Ebenso ist die transdermale Applikation in Form von Salben oder Cremes, parenterale (intraperitoneale, subkutane, intramuskuläre) Injektion oder orale Applikation von Lösungen, die die erfindungsgemäßen Kombinationen enthalten, möglich. Salben, Pasten, Cremes und Puder können neben den Wirkstoffe die üblichen Trägerstoffe enthalten, z. B. tierische und pflanzliche Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglykole, Silicone, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Talkum, Zinkoxid, Milchzucker, Bentite, Calciumsilikat und Polyamidpulver oder Gemische dieser Stoffe. Die Tabletten, Pillen oder Granulatkörper können nach Verfahren wie Preß-, Tauch- oder Wirbelbettverfahren oder Kesseldragierung hergestellt werden und enthalten Trägermittel und andere übliche Hilfsstoffe wie Gelatine, Agarose, Stärke (z. B. Kartoffel-, Mais- oder Weizenstärke), Cellulose wie Ethylcellulose, Siliziumdioxid, Magnesiumcarbonat, verschiedene Zucker wie Milchzucker und/oder Calciumphosphate. Die Dragierlösung besteht gewöhnlich aus Zucker und/oder Stärkesirup und enthält meistens noch Gelatine, synthetische Celluloseester, Gummi arabicum, Polyvinylpyrrolidon, Pigmente, oberflächenaktive Substanzen, Weichmacher und ähnliche Zusätze entsprechend dem Stand der Technik. Zur Herstellung der Zubereitungsformen kann jedes übliche Fließ regulierungs-, Schmier- oder Gleitmittel wie Magnesiumstearat und Trennmittel verwendet werden. Bevorzugt haben die Zubereitungen die Form von Mantel-/Kern- Tabletten oder Mehrschichttabletten, wobei sich die Wirkkomponente 2 im Mantel bzw. im Kern bzw. in einer Schicht befindet, während sich die Wirkkomponente 1 im Kern, im Mantel oder in einer anderen Schicht befindet. Die Wirkstoffkomponenten können auch in retardierter Form vorliegen oder an Retardierungsmaterial adsorbiert bzw. im Retardierungsmaterial (z. B. Cellulose- oder Polystyrolharzbasis, z. B. Hydroxyethylcellulose) eingeschlossen sein. Eine verzögerte Freisetzung der Wirkstoffe kann auch erreicht werden, indem die betreffende Schicht bzw. das Kompartiment mit üblichen magensaftunlöslichen Überzügen versehen wird. Die anzuwendende Dosierung ist selbstverständlich abhängig von verschiedenen Faktoren wie dem zu behandelnden Lebewesen (d. h. Mensch oder Tier), Alter, Gewicht, allgemeiner Gesundheitszustand, dem Schweregrad der Symptome, der zu behandelnden Erkrankung, eventuellen Begleiterkrankungen, (falls vorhanden) der Art der begleitenden Behandlung mit anderen Arzneimitteln, oder Häufigkeit der Behandlung. Die Dosierungen werden im allgemeinen mehrfach pro Tag und vorzugsweise einmal bis dreimal pro Tag verabreicht. Die verwendeten Mengen an Einzelwirkstoff orientieren sich hierbei an der empfohlenen Tagesdosis des jeweiligen Einzelwirkstoffs und sollen im allgemeinen im Kombinationspräparat von 10% bis 100% der empfohlenen Tagesdosis liegen, bevorzugt von 20% bis 80%, insbesondere bei 50%. Die geeignete Therapie mit den erfindungsgemäßen Kombinationen besteht somit z. B. in der Verabreichung von einer, zwei oder 3 Einzeldosierungen der Zubereitung bestehend aus N-4-(Trifluormethylphenyl-2- cyan-3-hydroxy-crotonsäureamid-Natriumsalz in einer Menge von 2 mg bis 250 mg, bevorzugt 5 mg bis 150 mg, insbesondere 10 mg bis 50 mg, insbesondere bevorzugt 10 mg bis 20 mg und 1-(5-Hydroxy-5-methylhexyl)-3-methyl-7- propylxanthin in einer Menge von 100 bis 600 mg, insbesondere von 150 bis 300 mg, vorzugsweise von 20 bis 200 mg.

Beispiel 1 Herstellung von 1-(5-Hydroxy-5-methylhexyl)-3-methyl-7-propylxanthin

Zu einer Suspension von 61,3 g (0,2 Mol) 3-Methyl-1-(5-oxohexyl)-7-propylxanthin in 2 l wasserfreien Ethers fügt man unter kräftigem Rühren bei Raumtemperatur 22,4 g (0,3 Mol) Methylmagnesiumchlorid in Form einer 20%igen Lösung in Tetrahydrofuran tropfenweise hinzu, wobei die Innentemperatur bis auf etwa 30°C ansteigt. Anschließend wird 2 Stunden unter Rühren und Rückfluß erwärmt, zur Zerlegung des gebildeten Alkanolats mit gesättigter wäßriger Ammoniumchlorid- Lösung versetzt, die organische Phase abgetrennt und zweimal mit je 500 ml Wasser gewaschen. Die gesammelten Wasserphasen werden nochmals gründlich mit Dichlormethan extrahiert. Man vereinigt den Dichlormethan-Extrakt mit der etherischen Phase, trocknet über Natriumsulfat, filtriert und dampft unter vermindertem Druck ein, wobei 59,0 g Rohprodukt (91,5% der Theorie) erhalten werden, die man durch Umkristallisation aus Diisopropylether reinigt.
Ausbeute: 49,8 g (77,2% der Theorie); Schmelzpunkt: 81-82°C
C₁₆H₂₆N₄O₃ (MG = 322,4)
Analyse: Berechnet: C 59,61% H 8,13% N 17,38%
Gefunden: C59,72% H8,09% N17,44%.

Beispiel 2 Pharmakologische Prüfung 2.1 Zellkultur

Die murine Makrophagenzellinie RAW 264.7 wurde von ATCC (Rockville, MD) bezogen und in DMEM (Sigma, St. Louis, MO) mit 4.5 g Glucose/I, 110 mg Natriumpyruvat/I, 10% Hitze inaktiviertem FCS (Gibco, Grand Island, NY) und Penicillin/Streptomycin (50 U/50 mg/ml) kultiviert.

Die Makrophagen wurden alle 2-3 Tage passagiert und einen Tag vor Beginn des Experiments zu 2 10⁶ Zellen in Gewebekulturflaschen (75 cm², Falcon, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland) ausgebracht. Die Zellen wurden mit frischem Medium versorgt und die Präparate in den entsprechenden Konzentrationen zugesetzt. 1-(5-Hydroxy-5-methylhexyl)-3-methyl-7-propylxanthin (Verbindung 1) wurde 20 mM in Zellmedium gelöst. Davon wurden 100 µl (100 µM) und 50 µl (50 µM) zu 20 ml Medium pipettiert. N-4-(Trifluormethylphenyl-2-cyan-3- hydroxy-crotonsäureamid-Natriumsalz (Verbindung 2) wurde 12 mM in Zellmedium gelöst. Davon wurden je 100 µl (60 PM Endkonzentration), 33 µl (20 µM Endkonzentration) und 16,7 µl (10 µM Endkonzentration) zu 20 ml Medium pipettiert. Die Stimulation mit Lipopolysacchariden (LPS; E. coli, Serotype 0127: B 8 Sigma, St. Louis, MO) in einer Konzentration von 10 ng/ml wurde 1 Stunde nach der Vorinkubation mit dem Präparat durchgeführt. Aliquotes einer Stammlösung von Lipopolysacchariden (LPS 1 mg/ml in 10% Dimethylsulfoxid (DMSO)) wurden mit Medium auf eine Konzentration von 1 µg/ml verdünnt und bei -20°C gelagert. Die Zellen wurden für 24 Stunden (h) bei 37°C in 10% CO₂ inkubiert.

2.2 Probenvorbereitung

Alle verwendeten Chemikalien waren analytisch rein oder in Elektrophoresequalität und wurden von Millipore Co. (Bedford, MA) oder Sigma (St. Louis, MO) bezogen, wenn nicht gesondert auf andere Bezugsquellen hingewiesen wird.

Die 2-D-Elektrophorese (2-DE) wurde mit dem Investigator Systeme (Millipore) durchgeführt, und die Proben wurden nach der Vorschrift des Herstellers mit kleinen Veränderungen aufgearbeitet. Die adhärenten murinen Makrophagen wurden auf Eis stehend dreimal je 60 Sekunden mit 10 ml eiskaltem PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 1 ml kochendem Lysispuffer, bestehend aus 0,3 g SDS, 3,088 g DTT, 0,444 g TrisHCl und 0,266 g Tris Base, in 100 ml lysiert. Das Zellysat wurde abgeschabt und in einem 2 ml Probengefäß für 10 Minuten (min) in kochendem Wasser erhitzt.

Polynucleotide wurden durch Zusatz von Benzonas® (Merck, Darmstadt, Deutschland) in 30 min bei 37°C gespalten.

An dieser Stelle der Probenvorbereitung wurde ein Aliquot entnommen, und der Proteingehalt nach der Methode von Popov bestimmt.

Für die 2-DE wurden die Proteine der Probe durch tropfenweise Zugabe zu eiskaltem Aceton (80% v/v) ausgefällt. Die Probe wurde für 20 min auf Eis gekühlt und anschließend bei 240 g 10 min zentrifugiert. Das angetrocknete Pellet wurde in einem Teil Lysispuffer und vier Teilen eines Probenpuffers zu einem Proteingehalt von 5 mg/ml aufgenommen. Der Probenpuffer besteht aus 59,7 g Harnstoff, 4,0 ml NP-40, 1,54g DTT, 5,5 ml Trägerampholyten (pH 3-10, 2-DE optimiert) in 100 ml. Ungelöstes Material wurde vor der Elektrophorese durch Zentrifugation der Proben bei 16000 × g abgetrennt.

2.3 2-DE Gel-Elektrophorese

Die hochauflösende Zwei-Dimensionale Gel-Elektrophorese wurde nach der Methode von O′Farrell mit Modifikationen, wie sie von Garrels beschrieben wurden, durchgeführt. Dazu wurde das Millipore Investigator® 2-D Elektrophorese System (Millipore Co., Bedford, MA) eingesetzt.

Die isoelektrische Fokussierung wurde in Glaskapillaren (1 mm im Durchmesser) mit einem 0,08 mm dicken Faden, der ein Dehnen und Reißen des Stäbchens verhindert, durchgeführt.

Das IEF-Gel besteht aus einer 4,1% T, 2,4% C Polyacrylamidmatrix, die aus einer 30,8% T, 2,6% C Stammlösung hergestellt wurde, 9,5 M Harnstoff, 2,0% (v/v) NP-40, 10 mM Chaps und 2% (v/v) Trägerampholyten (pH 3-10, 2-DE optimiert).

Als Anodenpuffer wurde 0,01 M H₃PO₄, als Kathodenpuffer 0,1 M NaOH benutzt. Vor der Vorfokussierung zur Ausbildung des pH-Gradienten wurden 15 µl eines Probenüberschichtungspuffers, bestehend aus 0,5 M Harnstoff, 0,2% (v/v) NP-40, 0,1% (v/v) Trägerampholyten und 50 mM DTT, appliziert. Das Spannungsmaximum von 1500 Volt wurde innerhalb von 90 Minuten bei einem maximalen Strom von 110 µA/Gel erreicht. Nach der Vorfokussierung wurden 20 µl der Probe (100 µg Protein) und weitere 15 µl Überschichtungspuffer aufgetragen.

Die isoelektrische Fokussierung der Proteine erfolgte innerhalb von 18000 Vh. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die Stäbchen auf Eis gekühlt und in einem Puffer, bestehend aus 0,3 M Tris Base, 0,075 M Tris HCl, 6% SDS, 50 mM DU und 0,01% Bromphenolblau, äquilibriert. Die Stäbchengele wurden direkt auf die Oberfläche des Vertikalgels der zweiten Dimension überführt oder bis zum Gebrauch bei -20 °C gelagert. Die zweite Dimension wurde in einem SDS- Gradientengel (10-17%) ohne Sammelgel durchgeführt. Der Gradient wurde durch Mischen zweier Gellösungen hergestellt.

A:100 ml Acrylamid (30,5% T, 1,64% C), 73 ml Tris (1,5 M, pH 8,8), 123 ml H₂O, 3 ml SDS (10%), 150 µl TEMED und 750 µl Ammoniumperoxodisulfat (10%).

B: 170 ml Acrylamid, 73 ml Tris, 66,78 g Glycerin, 3 ml SDS, 150 µl TEMED, 750 µl Ammoniumperoxodisulfat.

Die Elektrophorese wurde über Nacht bei konstanter Temperatur in einem Laufpuffer, bestehend aus 25 mM Tris-Base, 192 mM Glyzin und 0,1% SDS, durchgeführt bis die Bromphenolblaufront etwa 1 cm vom Ende des Gels entfernt war. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die Proteine im Gel nach Heukeshoven und Dernick mit Silberreagenz angefärbt.

Die Analyse der 2-D-Gele und die Herstellung synthetischer Bilder wurde mit dem Biolmage System (Biolmage Systems Co.) durchgeführt. Das erhaltene Proteinmuster wurde von einer Kodak Megaplus Camera Model 1,4 gescannt und die Daten wurden von einer HAM-Station prozessiert.

2.4 Ergebnisse

Die Ergebnisse der unstimulierten Kontrolle wurden gleich 100% gesetzt. Die Zugabe von LPS (10 ng/ml führte zu einer 50% Dephosphorylierung von Cofilin. Die gleichzeitige Applikation von LPS (10 ng/ml) und Verbindung 1 (100 µM) führt zu einer 10%igen Dephosphorylierung von Cofilin. Daher ist die Hemmung der Dephosphorylierung 80% im Vergleich mit den nur mit LPS behandelten Makrophagen.

Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Im Gegensatz zu 100 µM Endkonzentration sind 50 µM Endkonzentration der Verbindung 1 unwirksam. Die Verbindung 2 ist bis 20 µM Endkonzentration ebenfalls ohne Wirkung, bei 60 µM allein ist sie wirksam. Kombiniert man Verbindung 1 und Verbindung 2 in einem Konzentrationsbereich in dem jede einzelne Verbindung unwirksam ist, ergibt sich überraschender Weise eine überadditive Wirkung.

Tabelle 1

Claims

1. Verwendung der Verbindung der Formel I und/oder eine gegebenenfalls stereoisomere Form der Verbindung der Formel I,
wobei R² für (C₁-C₄)-Alkyl steht,
einer der Reste R¹ oder R³ für einen Rest der Formel II steht,(CH₂)_n-R-CH₃ (II)worin R für

a) eine kovalente Einfachbindung steht und worin n die ganze Zahl Null, 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 bedeutet,
b) einen Rest -CO- steht und worin n die ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bedeutet, oder
c) einen Rest -C(R⁴)(OH)- steht und worin n die ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bedeutet und R⁴für
a) ein Wasserstoffatom oder
b) (C₁-C₃)-Alkyl steht, und

der andere Rest R³ oder R¹ für

zur Herstellung von Arzneimitteln zur Modulation der Apoptose.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel I einsetzt, wobei
R² für (C₁-C₄)-Alkyl steht und
einer der Reste R¹ oder R³ für einen Rest der Formel II steht, worin R für

R⁴ für ein Wasserstoffatom oder (C₁-C₃)-Alkyl steht und
der andere Rest R³ oder R¹ für (C₁-C₇)-Alkyl oder (C₄-C₈)-Cycloalkyl-alkyl steht.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Xanthinderivat der Formel I einsetzt, wobei
R² für (C₁-C₂)-Alkyl steht,
R¹ für den Rest der Formel II steht, worin R für

a) einen Rest -CO- oder
b) einen Rest -C(R⁴)(OH)- steht,

und n die ganze Zahl 3, 4, 5 oder 6 bedeutet und
R⁴ für ein Wasserstoffatom oder (C₁-C₂)-Alkyl steht und
R³ für (C₁-C₇)-Alkyl oder (C₄-C₈)-Cycloalkyl-alkyl steht.

4. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Xanthinderivat der Formel I einsetzt, wobei
R² für (C₁-C₂)-Alkyl steht,
R¹ für einen Rest der Formel II steht, worin R für

5. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man 1 (5-Hydroxy-5-methylhexyl)-3-methyl-7- propylxanthin einsetzt.

6. Kombinationspräparat, enthaltend

1) ein Xanthinderivat der Formel I gemäß den Ansprüchen 1 bis 5,
2) eine Verbindung der Formel IV und/oder V, und/oder eine gegebenenfalls stereoisomere Form der Verbindung der Formel IV oder V und/oder ein physiologisch verträgliches Salz der Verbindung der Formel V, wobei
R¹ für a) (C₁-C₄)-Alkyl,
b) (C₃-C₅)-Cycloalkyl,
c) (C₂-C₆)-Alkenyl oder
d) (C₂-C₆)-Alkinyl, steht,
R²für a) -CF₃,
b) -O-CF₃,
c) -S-CF₃,
d) -OH,
e) -NO₂,
f) Halogen,
g) Benzyl,
h) Phenyl,
i) -O-Phenyl,
k) -CN oder
l) -O-Phenyl, ein oder mehrfach substituiert mit
1) (C₁-C₄)-Alkyl,
2) Halogen,
3) -O-CF₃ oder
4) -O-CH₃, steht,
R³ für a) (C₁-C₄)-Alkyl,
b) Halogen, oder
c) ein Wasserstoffatom steht, und
X für a) eine -CH-Gruppe oder
b) ein Stickstoffatom, steht, und
3) einen pharmazeutischen Träger.

7. Kombinationspräparat gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel IV und/oder V, wobei
R¹ für a) Methyl,
b) Cyclopropyl oder
c) (C₃-C₅)-Alkinyl steht,
R² für -CF₃ oder -CN steht,
R³ für Wasserstoffatom oder Methyl steht, und
X für eine -CH- Gruppe steht in Kombination mit Xanthinderivate der Formel I einsetzt, wobei R² für (C₁-C₂)-Alkyl steht,
R¹ für einen Rest der Formel II steht, worin R für

a) einen Rest -CO- oder
b) einen Rest -C(R⁴)(OH)- steht,

und n die ganze Zahl 3, 4, 5 oder 6 bedeutet und
R⁴ für ein Wasserstoffatom oder (C₁-C₂)-Alkyl steht und
R³ für (C₂-C₅)-Alkyl oder (C₄-C₆)-Cycloalkyl-alkyl steht.

8. Kombinationspräparat gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung V N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-cyan-3-hydroxy crotonsäureamid, 2-Cyano-3-cyclopropyl-3-hydroxy-acrylsäure-(4- cyanophenyl)-amid oder N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-cyan-3-hydroxy-hept-2- en-6-in-carbonsäureamid und als Xanthinderivat 1-(5-Hydroxy-5- methylhexyl)-3-methyl-7-propylxanthin einsetzt.

9. Kombinationspräparat gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-cyan-3-hydroxy crotonsäureamid und 1-(5-Hydroxy-5-methylhexyl)-3-methyl-7-propylxanthin einsetzt.

10. Verwendung von einer Verbindung der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 und einer Verbindung der Formel IV und/oder V gemäß der Definition in einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation der Apoptose.

11. Verwendung gemäß Anspruch 10 zur Behandlung von Transplantationen, Autoimmunerkrankungen, Infarkt, Stroke, Entzündungen, Neurodegeneration Myome, Muskelatrophie, Muskeldystrophie, Kachexie, Systemic Inflammation Response Syndrome (SIRS), Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS), zerebrale Malaria, chronische Lungenentzündung, Lungensarkosidose, Reperfusionsschäden, Narbenbildung, Darmentzündungen, Verbrennungsschäden, Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), Krebs, Erkrankungen mit erhöhten Proteinverlust, Neurodegeneration chronische Niereninsuffizienz oder hypertrophischen Erkrankungen.