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Verfahren zur Steigerung des Stoffaustausches durch semipermeable
Zellmembranen von Mikroorganismen und zur Biosynthese Die Erfindung bezieht sich
auf ein Verfahren zur Steigerung des Stoffaustausches durch semipermeable Zellmembranen
von Mikroorganismen und zur Biosynthese.
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Mikroorganismen, wie Schimmelpilze, Hefepilze und Bakterien, werden
für viele unterschiedliche Zwecke gezüchtet und/oder zum Erzeugen von Enzymen, Vitaminen
sowie antibiotischen und anderen Wirkstoffen ausgenutzt; in vielen Fällen ist die
Gewinnung ihrer Stoffwechselprodllkte - wie bei der Gärung - von Bedeuturig.
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Eine wirtschaftliche Gewinnung der Mikroorganismen selbst, ihrer
Enzyme oder ihrer Stoffwechsel- und anderen Produkte bedingt eine besonders günstige
Gestaltung der Lebens- wld/oder Wachstums- und Vermehrungsbedingungen der bestimmten
Organismen.
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Dies bedeutet nicht nur ein Darbieten von genügenden Mengen an geeigneten
Nähr- und Wuchsstoffen sowie günstige Bedingungen in bezug auf Temperatur, pH- und
rH-Wert, es muß auch der Stoffaustausch durch die semipermeablen Zellmembranen der
Organismen durch geeignete Maßnahmen gefördert werden, um die gewünschten Vorgänge
im Rahmen des Möglichen und Zulässigen zu beschleunigen.
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Ganz unabhängig davon, ob man eine Züchtung der Mikroorganismen nur
zum Erzeugen großer Organismenmengen bezweckt - etwa zur Verwendung als Nahrungs-
oder Futtermittel - oder ob man spezifische Enzyme, Stoffwechselprodukte oder Wirkstoffe
gewinnen will, kann man durch eine Steigerung des Stoffaustausches durch die Zellwände
der Mikroorganismen eine Beschleunigung der Produktion erreichen. Außerdem kann
man dadurch auch eine Verkleinerung der Abmessungen der Produktionseinrichtungen
und damit eine wesentliche Verringerung der Kosten erzielen.
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Es ist bekannt, Mikroorganismen, beispielsweise Hefen, in flüssigem
Nährsubstrat zu vermehren und zur Beschleunigung der Entwicklung der Hefe die Flüssigkeit
in Bewegung zu halten; die - wenn auch nur geringen - Relativbewegungen zwischen
Flüssigkeit und Mikroorganismen begünstigen das Zuführen von Nähr- und Wuchsstoffen
und das Abführen der Stoffwechselprodukte an der äußeren Zellwand der Organismen.
Es ist auch auf dem Gebiet der kontinuierlichen Gärung zwecks Biergewinnung nicht
mehr neu, ein Nährsubstrat in Form von Bierwürze durch Ansammlungen suspendierter
Hefezellen hindurchströmen zu lassen, die innerhalb einer aufwärts gerichteten Strömung
des Substrats im Schwebezustand gehalten werden.
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Aufgrund von zahlreichen Versuchen und Vergleichen zwischen unterschiedlichen
Arbeitsweisen wurde gefunden, daß man ganz allgemein den Stoffaustausch durch semipermeable
Zellmembranen von Mikroorganismen, die sich innerhalb eines flüssigen Substrats
befinden, ganz wesentlich vergrößern oder steigern kann, wenn man durch eine Mikroorganismen
enthaltende Schicht, die von einem die Organismen nicht hindurchlassenden porösen
Träger gehalten wird, das Substrat mit einem Differenzdruck zwischen und etwa 4
bis 5 at hindurchtreibt.
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Die ersten günstigen Ergebnisse einer derartigen Verfahrensweise
konnten auf dem Gebiet der Gärungstechnik, insbesondere der Vergärung von Bierwürze
zu Bier, erzielt werden.
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Weiterc Untersuchungen haben nun ergeben, daß man eine etltsprechende
Verfahrensmaßnahme auch bei zahlreichen anderen Arbeiten mit Mikroorganismen anwenden
kann, bei denen es um die Gewinnung anderer Produkte als Bier geht.
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Bei der Anwendung des erfindungsgemaßen Verfahrens soll das zugeführte
Substrat - gegebenenfalls nur in bestimmten periodischen Intervallen - zumindest
diejenigen Stoffe enthalten, die den Mikroorganismen zur Erhaltung ihres Lebens
und gegebenenfalls zu ihrer Vermehrung zugeführt werden müssen; darüber hinaus kann
man dem Substrat auch solche Stoffe beigeben, die von den Endo- oder Ecto-Enzymen
der Organismen oder den von ihnen ausgeschiedenen Wirkstoffen umgewandelt oder zumindest
beeinflußt werden sollen, und schließlich solche Stoffe, die Ecto-Enzyme> Stoffwechsel-
und andere Produkte der Mikroorganismen aufnehmen, um ein Zersetzen dieser Produkte
zu unterbinden und/oder ihr Abtrennen aus der ablaufenden Flüssigkeit zu erleichtern.
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Die Durchströmungsgeschwindigkeit des Substrats durch die Mikroorganismenschicht
kann durch Anwendung von an einer oberen Grenze von etwa 4 bis 5 at liegenden Differenzdrücken
erhöht werden, eine hohe Relativgeschwindigkeit zwischen Substrat und Zellwand ist
günstig für den Stoffaustausch, u.a. wegen der '!Saugwirkung" der Strömung. Auf
der Abströmseite der FlUssigkeit können auch Unterdrücke angewendet werden.
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In vielen Fällen ist es vorteilhaft, den Stoffaustausch durch eine
"Pumpwirkung" pulsierende Druckänderungen weiter zu steigern; die dabei anzuwendenden
Pulszahlen können - vor allem bei einzelligen Mikroorganismen - bis in den Tonfrequenzbereich
kommen. Bei Substraten, die nicht nur reine Lösungen, sondern auch koagulierbare
Stoffe enthalten, und bei größeren vielzelligen Organismen muß man in einer gegebenenfalls
wesentlich tieferen Pulsationsfrequenz bleiben oder ganz auf Druckpulsationen verzichten.
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Selbstverständlich wird die Temperatur zur Unterstützung des Stoffaustausohs
bis in den Bereich des Optimums in der Wirksamkeit des angestrebten Vorganges gebracht;
aerobe oder anaerobe Bedingungen werden durch Einfahren von Sauerstoff oder von
Stickstoff eingehalten. Wuchsstoff- und Reizstoff-Zugaben erfolgen jeweils spezifisch,
d.h. der Art der betreffenden Mikroorganismen und den zu gewinnenden Produkten angepaßte
Abgesehen von der "Ziiehtung", d.h. der möglichst wirtschaftlichen Vermehrung bestimmter
Mikroorganismen, wie beispielsweise Vermehrung von Reinhefen in größeren Mengen,
ferner Züchtungen zur Gewinnung von EiweiB, Enzymen und Vitaminen, läßt sich das
erfindungsgemäße Verfahren auch bei der Gewinnung
von durch Mikroorganismen
erzeugten Spalt- oder Umwandlungsprodukten anwenden, wie etwa von Glycerin aus Hexose
durch anoxydative Gärung mittels Hefen in alkalischem Substrat, weiter von Essigsäure,
Zitronensäure, Oxalsäure durch oxydative Gärung, und ähnlich auch von Fumar und
Gluconsäure, Schließlich bringt das erfindungsgemäße Verfahren auch Vorteile bei
der Mikroorganismen-Behandlung von Milch, beispielsweise als Vorstufe zur Käsebereitung
oder zur Herstellung von speziellen Sauermilchprodukten.
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Der Druck, der in allen diesen Fällen auf die Mikroorganismen huber
das die Schicht dieser Organismen durchströmende Substrat ausgeübt wird, fördert
wohl nicht nur den äußeren Stoffaustausch durch die'Zellwand und die Cytoplasmamembran
hindurch, er sdllte auch den Stoffaustausch innerhalb der Zelle zwischen dem Cytoplasma
und dem Vakuolen-Inhalt, gegebenenfalls auch dem Inhalt der Zellkerne, vorteilhaft
begünstigen.
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Jedenfalls konnte eine Verbesserung der RNS-Austauschverhältnisse
innerhalb der Zelle erzielt werden.
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Bei Anwenden des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es jedenfalls möglich,
die Zellteilungsvorgänge zu beschleunigen und damit die Vermehrungsrate der Mikroorganismen
in der Zeiteinheit zu erhöhen; man kann auch - etwa durch verringerte Nährstoffzufuhr
und/oder höhere Sauerstoffzufuhr - die Bildung von haploiden, zur geschlechtlichen
Vermehrung geeigneten Individuen begünstigen und/oder zur Sporenbildung anregen.
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Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine Vorrichtung
geeignet, die es gestattet, innerhalb eines abgeschlossenen Raumes auf Trägern mit
sehr feinen Poren, die ein Hindurchtreten der Mikroorganismen Verhindern, ber ein
Substrat, insbesondere Nährsubstrat, hindurchtlieken lassen, Mikroorganismenschichten
anz uordnen, dl e von dem 5 ubstrat
mit einem nennenswerten Differenzdruck
durchströmt werden.
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Zur näheren Erläuterung der Erfindung wird als Ausführungsbeispiel
das Züchten oder Vermehren von Futterhefe nach dem neuen Verfahren geschildert;
es sei jedoch ausdrücklich darauf hingewiesen, daß das Verfahren auch für viele
andere gewerbliche Anwendungen von Mikroorganismen geeignet ist, insbesondere zur
Gewinnung von Endo-Enzymen der Mikroorganismen, die nach dem Vermehren etwa durch
Autolyse oder eine besondere Maßnahme die Enzyme freigeben, so daß diese auch außerhalb
der Zellen - gegebenenfalls nach Konzentration - ausgenutzt werden können.
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Zum Züchten von Futterhefe geht man unter Anwenden des erCindungsgemäßen
Verfahrens derart vor, daß man zunächst den Hefeansatz, beispielsweise Tarulopsis
utilis, in einer wässrigen Aufschlämmung in eine Vermehrungskammer einbringt, in
der die Hefezellen auf einem porösen Träger, wie beispiplsweise einer feinporigen
Filterplatte aus Sintermetall mit ganz dünner, mikroporöser Deckschicht, als etwa
gleichmäßige Schicht zurückgehalten werden. Die Aufschlämmflüssigkeit tritt durch
den Schichtträger hindurch, dessen Poren in der Deckschicht mittlere Durchmesser
von etwa 1 /u haben, in dem Hauptteil der Träger platte jedoch wesentlich größer
sein können, um den Druckverlust klein zu halten.
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Dann leitet man eine geeignete Nährlösung an sich bekannter Zusammensetzung
aus Melasselosung, Sulfitlauge oder Molke und einem anorganischen Stickstoffträger,
wie Ammoniumsulfat sowie etwas Kampfer, mit einem Differenzdruck von etwa 1,0 at
durch die zunächst dünne Mikroorganismenschicht hindurch. Bei einer Temperatur von
ungefähr 55 bis 400C und Sauerstofrzugabe
zur Nährlösung vermehren
sich die Mikroorganismen schnell, so daß der Differenzdruck etwa in dem Maße, in
dem die Schichtdicke zunimmt, gesteigert werden kann. Nach etwa?O bis 40 Minuten
werden bei einem Differenzdruck von fast 5 at die weitere Nährlösungszufuhr eingestellt,
der Druck beseitigt und die Mikroorganismenschicht, deren Dicke auf mehrere Zentimeter
angewachsen ist, abgenommen. Diese Schicht kann auch durch Rückspülen unter Uberdruck
von der Deckschicht des porösen Trägers abgedrUckt werden. Die Vermehrung der Mikroorganismen
ist innerhalb einer gegebenen Zeitspanne ganz wesentlich größer als bei den bekannten
Verfahren ohne Druckdifferenzanwendung, d.h. ohne die dadurch erzwungene Steigerung
des Stoffaustausches durch die semipermeablen Zellmembranen.
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Anstelle von fest in ein Vermehrungsgefäß eingebauten feinporösen
Schichtträgern könnte man auch in Form eines prismatischen Drehfilters ausgebildete
Träger verwenden, die nach ihrem Austausch mechanisch von der starken Mikroorganismenschicht
befreit und mit einer dünnen Schicht belegt wieder in die Arbeitsstellung gebracht
werden.
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Um eine gute Ausnutzung der Nährlösung zu erzielen, ist es vorteilhaft,
sie durch zwei oder mehrere hintereinander geschaltete Schichtträger mit Je einer
Mikroorganismenschicht hindurchzuleiten; dabei erfolgt die Ausnutzung in jeweils
kleineren Teilschritten; man kann dann auch in den aufeinanderfolgenden Stufen eine
Zugabe von schnell verbrauchten Komponenten der Nährlösung oder von Wuchs- und Reizstoffen
vorsehen. Ein mehrstufiges Arbeiten mit zwei oder mehreren hintereinander geschalteten
Schichtträgern macht es möglich, zwecks voller Ausnutzung der Shrstoffe die Nährlösung
nacheinander durch
Schichten unterschiedlicher Hefearten hindurchzuleiten,
die z.B. in der Lage sind, diejenigen Anteile der Nährlösung auszunutzen, die von
der Hefeart der ersten Schicht nicht oder nur unvollkommen ausgenutzt werden.
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Eine für das Durchführen des soeben geschilderten Verfahrens konstruierte
erfindungsgemäße Vorrichtung ist in der Zeichnung veranschaulicht. Die Figur 1 zeigt
in der Hauptsache ein Mikroorganismen-Vermehrungsgerät mit einem porösen Schichtträger;
die an sich bekannten zusätzlichen Einrichtungen sind nur symbolisch dargestellt;
die Fig. 2 zeigt die Anordnung mehrerer übereinanderliegender Vermehrungsräume,
die je nach Bedarf parallel zueinander als eine Stufe mit entsprechend großem Nährlösungs-Durchsatz
oder hintereinander in mehrstufiger Arbeitsweise benutzt werden können.
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Das in Fig. 1 dargestellte Vermehrungsgerät 1 hat ein etwa zylindrisches,
druckfestes Gehäuse 2, in dem ein scheibenförmiger, feinporöser Schichtträger 3
senkrecht zur Achse 4 des Gehäuses 2 dichtend eingebaut ist. Dieser Schicht'träger
3 trennt einen EinlaBraum 5, der durch den Deckel 6 abgeschlossen ist, von dem Auslaßraum
7, den der andere Deckel 8 abschließt.
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In den Einlaßraum 5 mündet die Nährlösungszuleitung 9, die von der
Pumpe 1G - gegebenenfalls über einen als Kühler oder Vorwärmer dienenden Wärmetauscher
11 - mit vorgefilterter Nährlösung unter einem zwischen etwa 0,3 und 5 at einstellbaren
Überdruck gespeist wird, wobei die Temperatur der Lösung zwischen etwa 30 und 400
liegen kann. Der scheibenförmige Schichtträger 3 nimmt an seiner dem Einlaßraum
zugewandten Seite eine vorzugsweise durch Anschwemmen aufgebrachte Mikroorganismenschicht
12 von gleichmäßiger Stärke auf, die von Auflockerungsmitteln durchsetzt sein kann.
Innerhalb dieser
Schicht von beispielsweise zunächst 10 mm Stärke
werden der Nährlösung die Nähr-, Wuchs- und Reizstoffe entzogen, während sie durch
diese Schicht in etwa einer bis zwei Minuten hindurchströmt.
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Der Durchsatz kann etwa auf 50 1 je m2 der Mikroorganismenschicht
und Stunde gehalten werden, indem man den Einspeisedruck der Nährlösung entsprechend
regelt. Die aus dem Auslaßraum 7 über die Auslaßleitung 17 abfließende Flüssigkeit
kann gegebenenfalls zur Ausnutzung von nützlichen Nebenprodukten, etwa Ecto-Enzymen
der Mikroorganismen, weiterverwendet werden.
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Das während des Vermehrungsvorganges in der Organismenschicht durch
Dissimilation freiwerdende Kohlendioxyd wird in Form feiner Bläschen von der Nährlösungsflüssigkeit
mitgerissen und kann sich im Auslaßraum 7 von der Flüssigkeit trennen, ehe diese
abfließt oder abgezogen wird. Das Kohlendioxyd wird über den im Raum 7 oben liegenden
Leitungsanschluß zur beliebigen Verwendung abgeführt.
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Zum Einbringen einer Suspension von zur Bildung einer zunächst dünnen
Organismenschicht bestimmten Organismen und gegebenenfalls Auflockerungsmitteln
ist mit dem Einlaßraum 5 ein Mischgefäß 13 verbindbar, in dem die Suspension hergestellt
werden kann; die Suspensionsflüssigkeit läßt sich dann durch den porösen Schichtträger
3 hindurchdrUcken, der die suspendierten Partikel als Anschwemmschicht zurückhglte
Man könnte aber auch in der Nährlösungszuleitung 9 eine Einschleusvorrichtung 14
(die in Fig. 1 nur gestrichelt angedeutet ist) für die Partikel der zunächst anzuschwebmenden
Ausgangsschicht vorsehen und diese Partikel zu Beginn des Arbeitens der Vorrichtung
von den ersten Nährlösungsmengen an den Schichtträger 3 anschwemmen lassen.
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Zum Ablösen der zu genügender Stärke angewachsenen Organismenschicht
ist ein von Anschwemmfiltern bekanntes Rückspülen zweckmäßig, vorzugsweise unter
Anwenden stoßartiger Rückspüldrücke, die über eine besondere Rückspüldruckleitung
15 auf die Rückseite des porösen Schichtträgers 3 gegeben werden. Die dabei von
der Vorderseite dieses Trägers gelösten Fragmente der Organismenschicht '2 können
dann huber den mit einer zentralen Auflockerungsdüse versehenen Abführstutzen J6
abgezogen werden.
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Die Vermehrungsvorrichtung nach Fig. 52 kann sowohl mit waagerechter
Achse 4 als auch mit stehender Achse, also mit waagerechter oder nur schwach geneigter
Mikroorganismenschicht 12 betrieben werden. Das Arbeiten mit etwa waagerechter Organismenschicht
hat den Vorteil, daß auch bei Unterbrechung des Nährlösungsstromes die Mikroorganismenschicht
ungestört bleibt, ein Nachteil könnte darin liegen, daß das Ausspülen der Teile
einer zu beseitigenden Schicht eine stärkere Spulung erfordert.
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Bei der nur schematisch skizzierten Anordnung nach Fig. 2 sind vier
Vermehrungskammern 20, 21., 22 und 25 übereinander angeordnet und über Nährlösungs-ZuSuhr-
und Verbindungsleitungen 24 mit Abzweigventilen 24a, 2Xb, 24c, 24d und Abflußleitungen
25 mit Abzweigventilen 25a, 25b, 25c, 25d parallel schaltbar und einzeln - z.B.
zum Rückspülen - absperrbar. Außerdem sind auch Leitungen 26, 27 und 28 zwischen
je zwei übereinanderliegenden Kammern vorgesehen, die nach Öffnen ihrer Ventile
26a, 27a und 28a die Kammern hintereinanderschalten, so daß die Nährlösung die vier
Kammern nacheinander durchströmt.
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Um ein Abblasen von Kohlendioxyd aus den Auslaßräumen der
Kammern
zu gestatten, sind jeweils an den höchsten Stellen dieser Auslaßräume einstellbare
Druckbegrenzungsventile 29, 30, 3, 32 angeschlossen, deren Öffnen und Schließen
in Abhangigkeit von der Standhöhe der Flüssigkeit in den'Auslaßräumen gesteuert
werden kann.