DE19531566A1 - Appts. for determining biological oxygen demand and/or substances retarding nitrification - Google Patents
Appts. for determining biological oxygen demand and/or substances retarding nitrificationInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des BSB, nitrifikationshemmender Substanzen und zur Erfassung nitrifizierbarer Stickstoffverbindungen mittels eines Biosensors mit immobilisierten Mikroorganismen.The present invention relates to a method for determining the BOD, nitrification-inhibiting substances and for the detection of nitrifiable Nitrogen compounds using a biosensor with immobilized Microorganisms.
Im Rahmen der Abwasserreinigung ist es u. a. erforderlich, den Stickstoff aus den Abwässern weitgehend zu eliminieren. In der Regel wird dies durch Nitrifikation reduzierter Stickstoffverbindungen, beispielsweise durch Oxidation von Ammonium erreicht.In the context of wastewater treatment it is u. a. required the nitrogen from the To largely eliminate waste water. Usually this is done through nitrification reduced nitrogen compounds, for example by oxidation of ammonium reached.
In gewerblichen und industriellen Abwässern können jedoch auch Stoffe enthalten sein, die in der Lage sind, hemmend auf die nitrifizierenden Bakterien der Kläranlagen einzuwirken. Bei der gemeinsamen Behandlung gewerblicher und industrieller Abwässer mit Kommunalabwässern können daher Störungen der Nitrifikation auftreten. Deshalb ist es wichtig, durch frühzeitige Erkennung solcher toxischen Stoffe im Zulauf Störungen im Klärprozeß zu verhindern. Darüber hinaus sind Informationen über den Sauerstoffbedarf für die Nitrifikation zur Kontrolle und Steuerung der Kläranlagen von Interesse. D.h. neben dem Sauerstoffbedarf für den Abbau organischer Kohlenstoffverbindungen (G-BSB) wird eine entsprechende Aussage zum Sauerstoffbedarf für den Abbau von Stickstoffverbindungen benötigt (N-BSB). Schließlich werden auch Angaben zum Gehalt an Stickstoffverbindungen (Ammonium, Nitrit, Nitrat, Harnstoff) der Abwässer benötigt. Zur Ermittlung nitrifikationshemmender Stoffe in wäßrigen Proben sind für den Laborbetrieb konzipierte Meßsysteme bereits seit längerem etabliert. Diese Vorrichtungen sind apparativ aufwendig und ortsgebunden.However, substances can also be found in commercial and industrial waste water be able to inhibit the nitrifying bacteria of the Wastewater treatment plants. When treating commercial and industrial waste water with municipal waste water can therefore disrupt the Nitrification occur. That is why it is important to recognize such early to prevent toxic substances in the feed from disrupting the clarification process. Furthermore are information about the oxygen requirement for nitrification for control and Control of wastewater treatment plants of interest. I.e. in addition to the oxygen demand for the Degradation of organic carbon compounds (G-BOD) is a corresponding Statement on the oxygen demand required for the breakdown of nitrogen compounds (N-BSB). Finally, information on the content of nitrogen compounds (Ammonium, nitrite, nitrate, urea) of the waste water. For investigation Nitrification-inhibiting substances in aqueous samples are for laboratory use designed measuring systems have been established for a long time. These devices are expensive in terms of equipment and localized.
Zur Bestimmung nitrifizierbarer Stickstoffverbindungen sind photometrische, elektrochemische und naßchemische Methoden etabliert. Diese Methoden haben den Nachteil, daß sie sehr zeitaufwendig sind.For the determination of nitrifiable nitrogen compounds, photometric, electrochemical and wet chemical methods established. Have these methods the disadvantage that they are very time consuming.
In den letzten Jahren sind Biosensorsysteme zur Bestimmung von Ammonium entwickelt worden, um den Zeitaufwand für die Bestimmung zu verringern. Aus DD-2 25 715 ist beispielsweise ein Verfahren zur Bestimmung von Ammoniumionen mittels mikrobiologischer Sensoren bekannt. Hierbei wird ein mikrobiologischer Sensor in eine Pufferlösung getaucht, die eine Kohlenstoff und Energiequelle enthält. Anschließend wird eine ammoniumionenenthaltende Probe zugesetzt und die Stromänderung pro Zeiteinheit als Maß für die Ammoniumkonzentration erfaßt. Der Sensor besteht aus einer den Sauerstoffverbrauch messenden Elektrode und dem Bakterium Bacillus subtiles, das hinsichtlich der Kohlenstoff- und Stickstoff- Reservestoffe verarmt ist. In recent years, biosensor systems have been used to determine ammonium has been developed to reduce the time required for the determination. Out DD-2 25 715 is for example a method for the determination of ammonium ions known by means of microbiological sensors. This is a microbiological Sensor immersed in a buffer solution that is a carbon and energy source contains. Then a sample containing ammonium ions is added and the change in current per unit of time is recorded as a measure of the ammonium concentration. The sensor consists of an electrode measuring oxygen consumption and the bacterium Bacillus subtle, which is responsible for the carbon and nitrogen Reserve materials is depleted.
Aus Tanaka u. a. W. at Sci. Tech. Vol. 28 Nr. 11-12 S. 435-445, 1993 ist ein weiterer Biosensor zur Bestimmung von Ammonium bekannt. Hierbei wird eine spezielle Reinkultur des Bakteriums Nitrosomonas europaea zusammen mit einer Elektrode eingesetzt.From Tanaka u. a. W. at Sci. Tech. Vol. 28 No. 11-12 pp. 435-445, 1993 is another Biosensor for the determination of ammonium known. Here is a special Pure culture of the bacterium Nitrosomonas europaea together with an electrode used.
Weitere Biosensoren zur Bestimmung von Stickstoffverbindungen, z. B. von Ammonium, Nitrit, Nitrat und Harnstoff sind aus Karube I. Anal. Chem. 53 (1981) 1852, Karube I, EUOP. J. Abel. Mikrobiol. Biotechnol. 15 (1982) 127. Okada. T. 135 (1992) 159, EUOP. J. Appl. Mikrobiol. Biotechnol. 14 (1982) 149 bekannt.Other biosensors for the determination of nitrogen compounds, e.g. B. from Ammonium, nitrite, nitrate and urea are from Karube I. Anal. Chem. 53 (1981) 1852, Karube I, EUOP. J. Abel. Microbiol. Biotechnol. 15 (1982) 127. Okada. T. 135 (1992) 159, EUOP. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 14 (1982) 149.
Biosensoren für die Bestimmung des BSB sind ebenfalls aus zahlreichen Veröffentlichungen bekannt, z. B. GB 1586291, DD-2 53 045, Riedel vom Wasser 81 (1993) 243.Biosensors for determining the BOD are also numerous Publications known, e.g. B. GB 1586291, DD-2 53 045, Riedel vom Wasser 81 (1993) 243.
Der Nachteil der Systeme zur Bestimmung von nitrifizierenden Stickstoffverbindungen liegt darin, daß die quantitativen Ergebnisse nicht genau genug sind. Derartige Biosensoren erlauben deshalb lediglich eine orientierende Quantifizierung der Stickstoffspezies. Der Einsatz von Biosensoren zur Ermittlung nitrifikationshemmender Stoffe ist bisher nicht bekannt. Schließlich ist es bisher nicht möglich gewesen, einen Biosensor und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe die Bestimmung von nitrifikationshemmenden Stoffen, nitrifizierbaren Stickstoffverbindungen sowie des Biochemischen Sauerstoffbedarfs von organischen C-Verbindungen (C-BSB) und des Biochemischen Sauerstoffbedarfs von NH₄⁺, der zur Oxidation durch Nitrifikation (N-BSB) NO₃⁻ in NO₂ benötigt wird, in einem einzigen Gerät, das auch mobil vor Ort einsetzbar ist, durchgeführt werden können.The disadvantage of systems for the determination of nitrifying Nitrogen compounds is that the quantitative results are not accurate are enough. Such biosensors therefore only allow orientation Quantification of the nitrogen species. The use of biosensors for detection Nitrification-inhibiting substances are not yet known. After all, it is not so far has been possible to provide a biosensor and a method with the help of which is the determination of nitrification-inhibiting substances, nitrifiable Nitrogen compounds and the biochemical oxygen demand of organic carbon compounds (C-BOD) and the biochemical oxygen demand of NH₄⁺, which is required for oxidation by nitrification (N-BOD) NO₃⁻ in NO₂, in a single device that can also be used on site can.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein Sensor bestehend aus immobilisierten nitrifizierenden Bakterien und einer Vorrichtung zu Messung des Sauerstoffgehalts eingesetzt wird. This object is achieved in that a sensor consisting of immobilized nitrifying bacteria and a device for measuring the oxygen content is used.
Der erfindungsgemäße Biosensor besteht somit aus einer Biokomponente und einem physikalischen Transduktor. Derartige Sensoren vereinigen in sich die Spezifität biologischer Systeme mit der großen Nachweisempfindlichkeit physikalischer Methoden. Sie wandeln die biochemische Information eines Substrates in ein physikalisches, quantifizierbares Signal um, vorzugsweise in ein elektrisches Signal, das einer elektronischen Verstärkung zugänglich ist. D.h., zur Messung wird Substrat der Biokomponente zugeführt und umgewandelt. Die durch die Umwandlung ausgelösten Veränderungen werden durch den physikalischen Transduktor erfaßt.The biosensor according to the invention thus consists of a biocomponent and a physical transducer. Such sensors combine the Specificity of biological systems with great sensitivity physical methods. They change the biochemical information of one Substrate into a physical, quantifiable signal, preferably in a electrical signal accessible to electronic amplification. That is, for Measurement is fed to the substrate of the biocomponent and converted. By the transformation triggered by the physical changes Transducer detected.
Als Biokomponenten kommen erfindungsgemäß nitrifizierende Bakterien, vorzugsweise Nitrosomonas- und Nitrobacter-Arten in Betracht. Diese können als Rein- oder Mischkultur verwendet werden.According to the invention, nitrifying bacteria are used as biocomponents, preferably Nitrosomonas and Nitrobacter species. These can be as Pure or mixed culture can be used.
Vorzugsweise ist die Bakterienkultur durch einen Gehalt an terminal verzweigten, einfach ungesättigten unverzweigten, ungesättigten verzweigten, verzweigten gesättigten und unverzweigten gesättigten Fettsäuren gekennzeichnet.The bacterial culture is preferably characterized by a content of terminally branched, monounsaturated unbranched, unsaturated branched, branched labeled saturated and unbranched saturated fatty acids.
Diese durch eine Lipidanalytik charakterisierte Mischkultur kommt in immobilisierter Form in den Biosensoren zum Einsatz.This mixed culture characterized by lipid analysis comes in immobilized Form in the biosensors.
Das Lipidspektrum der Mischkultur ergibt vorzugsweise folgende Zusammen
setzung:
5 bis 1%, vorzugsweise ca. 3% terminal verzweigte Fettsäure, 75 bis 90%,
3 vorzugsweise ca. 80% einfach ungesättigte unverzweigte Fettsäure, 0 bis 1%,
vorzugsweise ca. 0,5% ungesättigte verzweigte Fettsäure, 0 bis 1%, vorzugsweise
ca. 0,5% verzweigte gesättigte Fettsäure und 20 bis 7%, vorzugsweise ca. 16%
unverzweigte gesättigte Fettsäure.
The lipid spectrum of the mixed culture preferably gives the following composition:
5 to 1%, preferably approx. 3% terminally branched fatty acid, 75 to 90%, 3 preferably approx. 80% monounsaturated unbranched fatty acid, 0 to 1%, preferably approx. 0.5% unsaturated branched fatty acid, 0 to 1% , preferably about 0.5% branched saturated fatty acid and 20 to 7%, preferably about 16% unbranched saturated fatty acid.
Die genannten Bakterienarten kommen bevorzugt im Gemisch mit weiteren Mikroorganismen zum Einsatz. Beispielsweise können aus Abwässern oder Belebtschlämmen stabile Mischkulturen gewonnen und in einer Chemostatenkultur gehalten werden und erfindungsgemäß zum Einsatz kommen, sofern diese einen ausreichenden Anteil an nitrifizierenden Bakterien, d. h. 70 bis 90%, vorzugsweise ca. 80%, aufweisen.The bacterial species mentioned preferably come in a mixture with others Microorganisms for use. For example, from wastewater or Activated sludges obtained stable mixed cultures and in a chemostat culture are kept and are used according to the invention, provided that these one sufficient nitrifying bacteria, d. H. 70 to 90%, preferably about 80%.
Als Transduktoren kommen erfindungsgemäß potentiometrische Elektroden (pH- Elektroden, ionenselektive Elektroden), Feldeffekttransistoren, amperemetrische Elektroden (Gelöstsauerstoff-Elektrode) sowie optoelektronisch Dedektoren und Termistoren in Frage.According to the invention, the transducers used are potentiometric electrodes (pH Electrodes, ion-selective electrodes), field effect transistors, amperometric Electrodes (dissolved oxygen electrode) as well as optoelectronic detectors and Termistors in question.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt wird die Glarksche Sauerstoffelektrode. Eine derartige Vorrichtung ist z. B. in Riedel K. Zentral Bl. Mikrobiol. 146. (1991) S. 425-434 beschrieben. Eine Übersicht über verschiedene spezifische mikrobiologische Sensoren ist darüber hinaus Riedel u. a. Chem.-Ing.-Tech. 64 (1992) 518-528 zu entnehmen.According to the invention, the Glark oxygen electrode is particularly preferred. A such device is such. B. in Riedel K. Zentral Bl. Mikrobiol. 146. (1991) pp. 425-434 described. An overview of various specific microbiological Sensors is also Riedel u. a. Chem.-Ing.-Tech. 64: 518-528 (1992) remove.
Die Mikroorganismen werden erfindungsgemäß auf einer Teflonmembran immobilisiert. Wesentlich ist, daß die Mikroorganismen so aufgebracht werden, daß sie bis zu ihrem Einsatz im Ruhezustand verharren. Aus diesem Grunde werden die Organismen unter Ausschluß von Substrat auf die Biosensormembran aufgebracht. Gleichzeitig muß dafür Sorge getragen werden, daß die Mikroorganismen sich nicht gegenseitig durch ihre unterschiedlichen physiologischen Reaktionen beeinflussen.According to the invention, the microorganisms are on a Teflon membrane immobilized. It is essential that the microorganisms are applied in such a way that they remain at rest until they are deployed. For this reason, the Organisms applied to the biosensor membrane in the absence of substrate. At the same time, care must be taken to ensure that the microorganisms do not separate influence each other through their different physiological reactions.
Eine optimales Verharren im Ruhezustand wird dadurch erreicht, daß um die einzelnen Zellen ein aus hydrophilen Polymeren bestehender Film gezogen wird. Hierdurch wird erreicht, daß die Organismen gegenseitig nicht in Beziehung treten können. Zugleich weisen die hydrophilen Polymere die Eigenschaft auf, daß sie bei Berührung mit Wasser sich sofort auflösen und die Organismen für die erforderlichen Reaktionen freigeben. Als besonders geeignet haben sich in diesem Zusammenhang Polyvinylalkohol und Polyurethane (PCS-Gele) erwiesen.An optimal persistence in the idle state is achieved in that the a film consisting of hydrophilic polymers is drawn from individual cells. This ensures that the organisms do not relate to each other can. At the same time, the hydrophilic polymers have the property that they are Contact with water dissolve immediately and the organisms for that release required reactions. Have been particularly suitable in this Connection between polyvinyl alcohol and polyurethanes (PCS gels) has been proven.
Dadurch das die Mikroorganismen unter Ausschluß von jeglichem Substrat und voneinander getrennten Einzelzellen in den genannten hydrophilen Polymeren aufbewahrt werden, ist eine besonders empfindliche Reaktion gewährleistet. Denn durch die plötzliche Berührung mit Substrat, beispielsweise mit Abwasser, kommt es zu einer explosionsartigen Aktivitätsentwicklung, so daß über den Transduktor sofort Signale aufgenommen werden.This means that the microorganisms are excluded from any substrate and separate cells in the hydrophilic polymers mentioned a particularly sensitive reaction is guaranteed. Because the sudden contact with substrate, for example with wastewater, causes it to an explosive development of activity, so that signals are immediately recorded via the transducer.
Mit den bisher nach dem Stand der Technik durchgeführten Immobilisierungen sind im Abwasser lediglich Standzeiten von etwa einem halben Tag zu erreichen, während in einer definierten ammoniumhaltigen Nährlösung bereits eine Langzeitstabilität von 8 Wochen erzielt werden konnte. Durch die erfindungsgemäße Verwendung von Polyvinylalkohol und Polyurethanen konnte der störende Einfluß der im Abwasser vorherrschende heterotrophen Fremdorganismen minimiert werden. Auf diese Art lassen sich erfindungsgemäß nunmehr Standzeiten von mindestens 4 Wochen verwirklichen.With the immobilizations previously carried out according to the prior art to only achieve a standing time of about half a day in the wastewater, while already in a defined nutrient solution containing ammonium Long-term stability of 8 weeks could be achieved. By the invention Use of polyvinyl alcohol and polyurethanes could be the disruptive influence minimizes the heterotrophic foreign organisms prevailing in the wastewater will. In this way, the service life of Realize at least 4 weeks.
Optimal sind erfindungsgemäß auch die Lagerbedingungen der beladenen Membranen. Bei in Polyvinylalkohol immobilisierten heterotrophen Mikroorganismen werden bei einer Temperatur von 4°C Lagerungszeiten von über einem halben Jahr erreicht. Der Einsatz von PGS-Gelen weist zudem den Vorteil auf, daß sie im Vergleich zu Polyvinylalkohol resistenter gegenüber mechanischen, chemischen und biologischen Vorgängen sind.According to the invention, the storage conditions of the loaded are also optimal Membranes. For heterotrophic microorganisms immobilized in polyvinyl alcohol are stored at a temperature of 4 ° C for over half a year reached. The use of PGS gels also has the advantage that they are in the Compared to polyvinyl alcohol more resistant to mechanical, chemical and biological processes.
Die Herstellung der Biokomponente des Biosensors geschieht in der Weise, daß zunächst in getrennten Gefäßen Reinkulturen der für den Einsatz gedachten Mikroorganismenarten gezüchtet werden. Dies geschieht regelmäßig in konventionellen Züchtungsverfahren. Geeignet sind natürlich auch alle anderen Methoden, die im Ergebnis zu entsprechenden Reinkulturen führen. So ist es insbesondere denkbar, auch die Methoden der Gentechnik einzusetzen.The biocomponent of the biosensor is produced in such a way that first pure cultures of the intended for use in separate vessels Microorganism species are grown. This happens regularly in conventional breeding methods. Of course, all others are also suitable Methods that result in corresponding pure cultures. That's the way it is especially conceivable to also use genetic engineering methods.
Die erhaltenen Reinkulturen werden in den hydrophilen Polymeren suspendiert. Anschließend wird eine der Suspensionen auf eine Membran aufgetragen. Sobald die Suspension mit der ersten Mikroorganismenkultur eingetrocknet ist, wird die andere Suspension mit der zweiten Mikroorganismenkultur aufgebracht, so daß getrennte Schichten mit jeweils einer Mikroorganismenart entstehen. Ggf. können auch noch mehr Filme mit anderen Mikroorganismenarten übereinander geschichtet werden.The pure cultures obtained are suspended in the hydrophilic polymers. Then one of the suspensions is applied to a membrane. As soon as the suspension with the first microorganism culture has dried up another suspension with the second microorganism culture applied so that separate layers are created, each with a type of microorganism. Possibly. can even more films with other types of microorganisms are layered on top of each other will.
Erfindungsgemäß ist es jedoch auch möglich, vor dem Auftragen auf die Membran eine homogene Mischung der verschiedenen Mikroorganismenarten mit dem hydrophilen Polymer herzustellen. Bei der Suspension muß nur dafür Sorge getragen werden, daß die Zellen möglichst vereinzelt in dem Polymer verteilt sind, so daß jede einzelne Zelle von einer Polymerschicht umschlossen ist. Die Polymerhülle muß so dicht sein, daß keine Wechselbeziehungen zwischen den einzelnen Zellen auftreten.According to the invention, however, it is also possible to apply it to the membrane a homogeneous mixture of the different types of microorganisms with the to produce hydrophilic polymer. With the suspension just care worn so that the cells are distributed as isolated as possible in the polymer, so that every single cell is enclosed by a polymer layer. The The polymer shell must be so dense that there are no interrelations between the individual cells occur.
Nachdem die Mikroorganismen auf die Membran, vorzugsweise eine Dialysemembran aufgetragen worden sind, wird diese auf die Sonde aufgebracht. Sofern eine Sauerstoffelektrode verwendet wird, bedeckt die Membran die Kathode, vorzugsweise eine Goldkathode. Die Bakterienschicht wird mit einer Kapillarporenmembran abgedeckt.After the microorganisms on the membrane, preferably one Dialysis membrane have been applied, this is applied to the probe. If an oxygen electrode is used, the membrane covers the cathode, preferably a gold cathode. The bacterial layer is covered with a Capillary pore membrane covered.
Das Detektionsprinzip des Sensors basiert darauf, daß die Mikroorganismen bei ungehemmten Stoffwechsel durch Oxidation von Ammonium Sauerstoff verbrauchen. Dieser Sauerstoffverbrauch kann an der zum Biosensor umgebauten Elektrode detektiert werden. Wirkt ein Inhibitor auf die immobilisierten Organismen ein, sinkt der bakterielle Sauerstoffverbrauch. The detection principle of the sensor is based on the fact that the microorganisms uninhibited metabolism through oxidation of ammonium oxygen consume. This oxygen consumption can be converted to the biosensor Electrode can be detected. An inhibitor acts on the immobilized organisms on, bacterial oxygen consumption drops.
In einer typischen On-line-Meßanordnung zur Detektion von Schadstoffeinleitungen im Abwasser wird ultrafiltriertes, mit Sauerstoff angereichertes und temperiertes Abwasser kontinuierlich in die Anlage geleitet. Vor dem Biosensor wird der pH-Wert des ankommenden Abwassers gemessen und auf neutralen pH-Wert reguliert. Die Kontrolle der Substratkonzentration erfolgt über eine ammoniumsensitive Elektrode.In a typical on-line measuring arrangement for the detection of pollutant discharges The wastewater is ultrafiltered, oxygenated and tempered Waste water continuously fed into the plant. The pH value is in front of the biosensor of the incoming wastewater measured and regulated to a neutral pH. The The substrate concentration is checked using an ammonium-sensitive electrode.
In einem typischen erfindungsgemäßen Verfahren wird der Biosensor in einer stickstoffhaltigen Nährlösung gehalten und die Nitrifikationshemmung anhand des Rückgangs der Atmung nach Zugabe der zu untersuchenden Probe als Stromanstieg erfaßt.In a typical method according to the invention, the biosensor is used in a nitrogenous nutrient solution and the nitrification inhibition based on the Decrease in breathing after adding the sample to be examined as Current rise detected.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Sensor zunächst in eine Pufferlösung gegeben. Nach Zusatz der Probe zur Pufferlösung wird eine Sauerstoffmessung durchgeführt. Diese ergibt sie Summe des C- und N-BSB. In einem weiteren Schritt werden nitrifikationshemmende Substanzen zugesetzt und nochmals eine Sauerstoffmessung durchgeführt. Der Wert für den C-BSB ergibt sich nun aus der Differenz des nach Zusatz der Nitrifikationshemmer ermittelten Sauerstoffwertes.In a variant of the method according to the invention, the sensor is first shown in given a buffer solution. After adding the sample to the buffer solution, a Oxygen measurement carried out. This gives the sum of the C and N BOD. In In a further step, nitrification-inhibiting substances are added and performed an oxygen measurement again. The value for the C-BSB results now from the difference of the determined after adding the nitrification inhibitor Oxygen levels.
Die Menge der biologisch oxidierbaren Stickstoffverbindungen läßt sich ebenfalls aus dem Differenzwert bestimmen. Beispielsweise können so die Gehalte an Harnstoff, Ammonium und Nitrit in Lösungen ermittelt werden.The amount of biologically oxidizable nitrogen compounds can also be determine from the difference value. For example, the levels can Urea, ammonium and nitrite can be determined in solutions.
In dem beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren werden als Nitrifikationshemmer vorzugsweise Thioharnstoffe eingesetzt.In the described method according to the invention, as Nitrification inhibitors are preferably used thioureas.
Die ersten Versuche mit den erfindungsgemäßen Biosensor haben eine lineare Abhängigkeit des Sauerstoffverbrauchs am Biosensor von der N-Ammonium- Konzentration im Bereich von 0 bis 2 mmg/l N-NH4+ ergeben, wobei die Ansprechzeit des Systems auf eine Substratzugabe deutlich unter 30 sek. liegt. Bei höheren Substratkonzentrationen kommt es in zunehmendem Maße zu einer Substratsättigung am Biosensor. Die Geschwindigkeit der Ammoniumoxidation läuft gegen einen Grenzwert und folgt damit einer Michaeles-Menten-Kinetik.The first experiments with the biosensor according to the invention have shown a linear dependence of the oxygen consumption on the biosensor on the N-ammonium concentration in the range from 0 to 2 mmg / l of N-NH 4+ , the response time of the system to adding a substrate being significantly less than 30 seconds . lies. At higher substrate concentrations there is increasing substrate saturation at the biosensor. The rate of ammonium oxidation runs against a limit value and thus follows a Michaeles-Menten kinetic.
Diese Tatsache begünstigt den Einsatz des erfindungsgemäßen Sensors in der Abwasseranalytik. Insbesondere ist es unwahrscheinlich, daß schwankende Ammoniumfrachten im Abwasser einen Hemmstoffeffekt am Biosensor vortäuschen.This fact favors the use of the sensor according to the invention in the Wastewater analysis. In particular, it is unlikely to fluctuate Ammonium loads in the wastewater simulate an inhibitor effect on the biosensor.
Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die anliegenden Figuren näher beschreiben:The invention will now be described with reference to the accompanying figures describe in more detail:
Fig. 1 zeigt ein Beispiel für die Herstellung der Mischkultur mit anschließender Beschichtung der Membran. Fig. 1 shows an example for the preparation of the mixed culture with subsequent coating of the membrane.
Fig. 2 zeigt den erfindungsgemäß verwendeten Elektrodengrundkörper. Fig. 2 shows the main electrode body used in the invention.
Fig. 3 gibt die die Biokomponente enthaltende Membrankappe wieder. Fig. 3 shows the biocomponent containing membrane cap.
Fig. 4 zeigt den aus Elektrodengrundkörper und Membrankappe zusammengesetzten Sensor. Fig. 4 shows the composite of electrode substrate and the diaphragm cap sensor.
Fig. 5 stellt in der vergrößerten Seitenansicht Biokomponente und Transduktor dar. Fig. 5 shows in enlarged side view and biocomponent transducer.
Fig. 6 zeigt den grundsätzlichen Wirkungsmechanismus des mikrobiologischen Sensors. Fig. 6 shows the basic mechanism of action of microbiological sensor.
Fig. 7 zeigt den Inhibitoreinfluß. Fig. 7 shows the inhibitory influence.
Fig. 8 zeigt eine bevorzugte Variante des Sensors gemäß Fig. 4. FIG. 8 shows a preferred variant of the sensor according to FIG. 4.
Für die Herstellung des erfindungsgemäßen mikrobiologischen Sensors werden die Mikroorganismen in einem Chemostaten (kontinuierliche Kultur) 9, der mit einer Nährlösung aus dem Behälter 7 gespeist wird, kultiviert und durch Zentrifugation die Zellen gewonnen. Die kontinuierliche Kulturführung erlaubt die Gewinnung einer konstanten Mischkultur an nitrifizierenden Bakterien. Die Zellen werden sodann zentrifugiert und zusammen mit dem Immobilisierungsmittel in das Reagenzglas 13a gegeben. For the production of the microbiological sensor according to the invention, the microorganisms are cultivated in a chemostat (continuous culture) 9 , which is fed with a nutrient solution from the container 7 , and the cells are obtained by centrifugation. The continuous culture management allows a constant mixed culture of nitrifying bacteria to be obtained. The cells are then centrifuged and placed in the test tube 13 a together with the immobilizing agent.
Mit der mit Mikroorganismen 2 beschichteten Membran 14 wird die Membrankappe 16 hergestellt. Dies geschieht dergestalt, daß über die gasdurchlässige Membran 15 die mit Mikroorganismen 2 beschichtete Dialysemembran 14 gezogen wird.The membrane cap 16 is produced with the membrane 14 coated with microorganisms 2 . This is done in such a way that the dialysis membrane 14 coated with microorganisms 2 is drawn over the gas-permeable membrane 15 .
Die so hergestellte Membrankappe 16 wird auf den Elektrodengrundkörper 17 befestigt. Dieser Grundkörper besteht aus einem Elektrodenmantel 18, in welchem eine Kathode 19 und eine Anode 20 angeordnet sind. Gefüllt ist der Eletrodengrundkörper mit einem Elektrolyten 21.The membrane cap 16 produced in this way is attached to the electrode base body 17 . This base body consists of an electrode jacket 18 , in which a cathode 19 and an anode 20 are arranged. The electrode base body is filled with an electrolyte 21 .
Die Membrankappe 16 wird auf den Elektrodengrundkörper 17 in der Weise aufgesetzt, daß die Membran 15 die Kathode 19 abdeckt.The membrane cap 16 is placed on the electrode base body 17 in such a way that the membrane 15 covers the cathode 19 .
Das Meßprinzip des erfindungsgemäßen Sensortyps ist schematisch in den Fig. 5 und 6 dargestellt. In dem Beispiel handelt es sich um eine sogenannte amperometrischen Sauerstoffelektrode, welche als physikalischer Transduktor dient.The measuring principle of the sensor type according to the invention is shown schematically in FIGS . 5 and 6. The example is a so-called amperometric oxygen electrode, which serves as a physical transducer.
Bei dem beschriebenen System diffundieren Sauerstoff 3 und Substrat 4 durch die Dialysemembran 15 in die die Mikroorganismen 2 enthaltene Schicht 1, die durch die Dialysemembran 14 und die gasdurchlässige Membran 15 begrenzt wird. Durch die Berührung mit Flüssigkeit löst sich augenblicklich die hydrophile Polymerhülle auf. Die Mikroorganismen 2 kommen mit dem Substrat in Berührung und beginnen sofort mit ihrer Stoffwechselaktivität. Aus der damit verbundenen Atmung resultiert eine Verminderung des Sauerstoffkonzentrationsgradienten. Dieser wird als Steady- State-Strom von der Sauerstoffelektrode gemessen.In the system described, oxygen 3 and substrate 4 diffuse through the dialysis membrane 15 into the layer 1 containing the microorganisms 2 , which is delimited by the dialysis membrane 14 and the gas-permeable membrane 15 . Touching the liquid instantly dissolves the hydrophilic polymer shell. The microorganisms 2 come into contact with the substrate and immediately begin their metabolic activity. The associated breathing results in a decrease in the oxygen concentration gradient. This is measured as a steady-state current from the oxygen electrode.
Wird ein assimilierbares Substrat oder Substratgemisch, beispielsweise eine Abwassersprobe mit dem Biosensor in Berührung gebracht, permeieren die Substrate 3 bzw. Inhibitoren 6 durch die Dialysemembran 16 in die Zelle 1 und werden dort durch die Mikroorganismen 2 aufgenommen. Hierdurch erhöht sich die Respirationsrate. Der Sauerstoffkonzentrationsgradient sinkt, was eine Verminderung des Stromes nach sich zieht. Der Strom fällt, bis sich ein neuer Steady-State eingestellt hat (vgl. zu den Fig. 6 und 7 gehörige Diagramme). Die Differenz zwischen dem Steady-State-Strom am Anfang und dem Strom nach der Substrataddition reflektiert die Respirationsrate RS für das Substrat.If an assimilable substrate or substrate mixture, for example a wastewater sample, is brought into contact with the biosensor, the substrates 3 or inhibitors 6 permeate through the dialysis membrane 16 into the cell 1 and are absorbed there by the microorganisms 2 . This increases the respiration rate. The oxygen concentration gradient decreases, which leads to a reduction in the current. The current drops until a new steady state has occurred (cf. diagrams belonging to FIGS. 6 and 7). The difference between the steady-state current at the beginning and the current after the substrate addition reflects the respiration rate RS for the substrate.
Wirkt ein Inhibitor auf die Zellen des Sensors ein, wird die Atmung drastisch reduziert und die der Kathode reduzierte O₂-Menge steigt.If an inhibitor acts on the cells of the sensor, breathing becomes drastic reduced and the amount of O₂ reduced the cathode increases.
Durch die spezielle erfindungsgemäße Konstruktion wird ein Biosensor zur Verfügung gestellt, der sich durch eine besonders kurze Meßzeit auszeichnet. Damit sind die erfindungsgemäßen Biosensoren auch für den Einsatz in der Regeltechnik zur Prozeßkontrolle und -steuerung geeignet.The special construction according to the invention makes a biosensor for Provided, which is characterized by a particularly short measurement time. The biosensors according to the invention are therefore also suitable for use in the Control technology suitable for process control and control.
Hinzu kommt, daß die beschriebenen Sensoren gemäß der vorliegenden Erfindung reproduzierbare Ergebnisse gewährleisten.In addition, the sensors described according to the present invention Ensure reproducible results.
In der Fig. 8 ist eine erfindungsgemäß bevorzugte Variation des erfindungsgemäßen Biosensors für die Bestimmung der Nitrifikationshemmung im schematischen Aufbau dargestellt. Hierbei ist die Sauerstoffsonde 22 in einer Durchflußzelle 23 aus Plexiglas angeordnet. Über einen Zufluß 24 wird Substrat in die Zelle gegeben. Durch die Kapillarmembran 27 diffundieren Substratbestandteile zu den immobilisierten Mikroorganismen 26. Über den Abfluß 25 wird das Restsubstrat abgeführt. FIG. 8 shows a variation of the biosensor according to the invention for the determination of the nitrification inhibition according to the invention in a schematic structure. Here, the oxygen probe 22 is arranged in a flow cell 23 made of plexiglass. Substrate is introduced into the cell via an inflow 24 . Substrate components diffuse through the capillary membrane 27 to the immobilized microorganisms 26 . The residual substrate is discharged via the drain 25 .
Auf der Basis der beschriebenen kontinuierlich arbeitenden Meßapparatur eröffnet sich ein überraschend gegenüber dem Stand der Technik erweiterter Anwendungsbereich. So kann das erfindungsgemäße System sowohl zur Bestimmung von Nitrifikationshemmstoffen, als auch zur Erfassung von nitrifizierbaren Stickstoffverbindungen verwendet werden. Darüber hinaus ist die Vorrichtung zur Bestimmung des C- und N-BSB einsetzbar. Damit können in einem einzigen Gerät im On-line-Verfahren die betreffenden Werte bestimmt werden. Als weiterer Vorteil kommt hinzu, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung einfach zu handhaben und sehr handlich ist. Im Gegensatz zu den herkömmlichen Laborgeräten ist die erfindungsgemäße Vorrichtung damit nicht ortsgebunden.Opened on the basis of the continuously working measuring apparatus described a surprisingly expanded compared to the prior art Scope of application. The system according to the invention can be used both for Determination of nitrification inhibitors, as well as for the detection of nitrifiable nitrogen compounds are used. In addition, the Device for determining the C and N BOD can be used. So that in one single device in the on-line method the relevant values can be determined. As Another advantage is that the device according to the invention is simple handle and is very handy. In contrast to the conventional ones The device according to the invention is thus not tied to laboratory equipment.
Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Beispiele näher beschrieben:In the following, the invention will be described with reference to the examples described:
Die Mikroorganismen wurden aus einer nitrifizierenden Belebtschlammanlage isoliert. Die Kultivierung erfolgte in einem kontinuierlich betriebenen Chemostaten.The microorganisms were extracted from a nitrifying activated sludge plant isolated. The cultivation was carried out in a continuously operated chemostat.
Der Reaktorinhalt wird mechanisch umgerührt. Der Sauerstoff wird durch eine Membranpumpe und eine Frittenstein in das Kulturgefäß eingebracht. Das Volumen V des Reaktors beträgt 10 l. Die Nährlösung fließt in einer konstanten Durchflußrate F von 0,33 l pro Std. zu. Daraus ergibt sich eine Verdünnungsrate Df/V von 0,033. Die Nährlösung für die nitrifizierenden Mikroorganismen setzt sich wie folgt zusammen:The reactor contents are stirred mechanically. The oxygen is through a Diaphragm pump and a frit stone placed in the culture vessel. The volume V of the reactor is 10 l. The nutrient solution flows at a constant flow rate F of 0.33 l per hour too. This results in a dilution rate Df / V of 0.033. The nutrient solution for the nitrifying microorganisms settles as follows together:
- a) Nährsubstrat: 400 mg pro l Harnstoff (185 mg pro l N-NH4+)a) Nutrient substrate: 400 mg per l urea (185 mg per l N-NH 4+ )
- b) Puffersystem: 1,2 g pro l Dinatriumhydrogenphosphat wasserfrei (Na₂HPO₄) 1,0 g pro l Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄)b) buffer system: 1.2 g per l disodium hydrogen phosphate anhydrous (Na₂HPO₄) 1.0 g per l potassium dihydrogen phosphate (KH₂PO₄)
- c) 1 l Leitungswasser.c) 1 liter of tap water.
Der pH-Wert dieser Lösung liegt bei 7,8. Als Spurenelemente werden zusätzlich noch Mg2+, Cu+2 und Mo+2 in geringen Mengen zugegeben. The pH of this solution is 7.8. Mg 2+ , Cu +2 and Mo +2 are also added in small quantities as trace elements.
Die so hergestellte Mikroorganismenpopulation wird mit Polyvinylalkohol (5%ige Lösung) vermischt und auf eine Kapillarporenmembran aufgetragen. Nach dem Eintrocknen wird die Bakterienschicht mit einer Teflonmembran abgedeckt und das so erhaltene Membransystem direkt auf eine Goldkathode einer Clarkelektrode gebracht, wobei sich die Teflonmembran elektrodenseitige befindet.The microorganism population produced in this way is treated with polyvinyl alcohol (5% Solution) mixed and applied to a capillary pore membrane. After this The bacterial layer dries up and is covered with a Teflon membrane membrane system thus obtained directly onto a gold cathode of a Clark electrode brought, with the Teflon membrane is on the electrode side.
Der Biosensor wird in eine stickstoffhaltige Nährlösung gestellt und die Abwasserprobe zugegeben. Anhand der Änderung der Sauerstoffkonzentration, die mittels des Biosensors ermittelt wird, können nitrifikationshemmende Verbindungen im Abwasser erfaßt werden. In diesem Fall steigt infolge des Rückgangs der NH ₄⁺-Oxidation die Sauerstoffkonzentration bzw. die Stromstärke.The biosensor is placed in a nitrogenous nutrient solution and the Waste water sample added. Based on the change in oxygen concentration, the by means of the biosensor, nitrification-inhibiting compounds can be determined be recorded in the wastewater. In this case the NH increases due to the decrease ₄⁺-Oxidation the oxygen concentration or the current strength.
Der Versuch gemäß Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird die Immobilisierung nicht mit Polyvinylalkohol, sondern mit Polyurethan(PCS)-Gel vorgenommen.The experiment according to Example 1 is repeated, but the immobilization not with polyvinyl alcohol, but with polyurethane (PCS) gel.
Der gemäß Beispiel 1 hergestellte Sensor wird in eine Pufferlösung gegeben. Durch Zusatz von Stickstoffverbindungen werden verschiedene Kalibrierungskurven erstellt. Die Ergebnisse sind den Abbildungen I bis III zu entnehmen:The sensor manufactured according to Example 1 is placed in a buffer solution. By Adding nitrogen compounds will result in different calibration curves created. The results can be seen in Figures I to III:
- I. HarnstoffkalibrierungskurveI. Urea calibration curve
- II. NitritkalibrierungskurveII. Nitrite calibration curve
- III. Ammoniumkalibrierungskurve.III. Ammonium calibration curve.
Der gemäß Beispiel 1 hergestellte Sensor wird in eine Pufferlösung gegeben. In einem zweiten Schritt wird eine Abwasserprobe der Pufferlösung zugesetzt. Im Anschluß hieran werden die Sauerstoffmeßdaten erfaßt. Diese geben den Gesamtwert für BSB (C- und N-BSB) wieder. Im Anschluß daran wird Allyltioharnstoff als Nitrifikationshemmer zugesetzt. Die erneute Messung mittels des Biosensors ergibt den Wert für N-BSB. Aus der Differenz für Gesamt-BSB und N- BSB läßt sich der G-BSB bestimmen. Anhand des N-BSB wird ferner stöchometrisch der Ammoniumgehalt errechnet. Die betreffenden Daten können der folgenden Tabelle 1 entnommen werden. In Abbildung IV sind die entsprechenden Kalibrierungskurven für Ammonium und N-BSB wiedergegeben.The sensor manufactured according to Example 1 is placed in a buffer solution. In in a second step, a wastewater sample is added to the buffer solution. in the Following this, the oxygen measurement data are recorded. These give the Total value for BOD (C and N BOD) again. Following that Allyltiourea added as a nitrification inhibitor. The renewed measurement using the Biosensor gives the value for N-BSB. From the difference for total BOD and N BSB the G-BSB can be determined. On the basis of the N-BSB, stoichometry is also used the ammonium content is calculated. The data in question can be the following Table 1 are taken. In Figure IV are the corresponding ones Calibration curves for ammonium and N-BOD shown.
Abbildung V zeigt die Abhängigkeit des Sauerstoffverbrauchs am Biosensor von der Inhibitorkonzentration.Figure V shows the dependence of the oxygen consumption on the biosensor on the Inhibitor concentration.
Insgesamt ergeben sich somit für das erfindungsgemäße Verfahren folgende Meßvarianten:Overall, the following thus result for the method according to the invention Measurement variants:
- 1. Variante: Vorlagepuffer1st variant: template buffer
- a) Dosierung der Probe = Stromabfall (Gesamtsignal)a) Dosage of the sample = current drop (overall signal)
- b) Nach Zugabe von nitrifikantem Hemmstoff = Stromanstieg (N-BSB)b) After adding nitrificant inhibitor = current increase (N-BOD)
-
c) Differenz a) minus b) = BSB.
Vorlage: N-Nährlösung Zudosierung der Probec) Difference a) minus b) = BOD.
Template: N nutrient solution, add the sample - a) Stromanstieg = Vorhandensein von Hemmstoffena) Current increase = presence of inhibitors
- b) Keine Stromveränderung = kein Vorhandensein von Hemmstoffen.b) No change in current = no presence of inhibitors.
- 2. Variante:2nd variant:
- a) Vorlagepuffer Dosierung der Probe = Stromabfall (Gesamtsignal)a) Template buffer Dosage of the sample = current drop (overall signal)
- b) Vorlagepuffer mit nitrifikantem Hemmstoff Dosierung der Probe = Stromabfall (BSB)b) template buffer with nitrificant inhibitor Dosage of the sample = current drop (BOD)
-
c) Differenz a) minus b) = N-BSB.
Vorlage: N-Nährmedium Dosierung der Probe = Stromanstieg (Hemmstoffe)c) Difference a) minus b) = N-BSB.
Template: N nutrient medium Dosage of the sample = current increase (inhibitors)
Claims (9)
5 bis 1% terminal verzweigte Fettsäuren,
75 bis 90% einfach ungesättigte unverzweigte Fettsäuren,
0 bis 1% ungesättigte verzweigte Fettsäuren,
0 bis 1% verzweigte gesättigte Fettsäuren und
7 bis 20% unverzweigte gesättigte Fettsäuren enthält.3. Device according to one of claims 1 or 2, characterized in that the bacterial population used
5 to 1% terminally branched fatty acids,
75 to 90% monounsaturated unbranched fatty acids,
0 to 1% unsaturated branched fatty acids,
0 to 1% branched saturated fatty acids and
Contains 7 to 20% unbranched saturated fatty acids.
ca. 3% terminal verzweigte Fettsäuren,
ca. 80% einfach ungesättige unverzweigte Fettsäuren,
ca. 0,5% ungesättigte verzweigte Fettsäuren,
ca. 0,5% verzweigte gesättigte Fettsäuren und
ca. 16% unverzweigte gesättigte Fettsäuren enthält. 4. The device according to claim 3, characterized in that the bacterial population used
approx. 3% terminally branched fatty acids,
approx. 80% monounsaturated unbranched fatty acids,
approx. 0.5% unsaturated branched fatty acids,
approx. 0.5% branched saturated fatty acids and
contains about 16% unbranched saturated fatty acids.
- a) der Sensor in eine Pufferlösung gegeben,
- b) die zu untersuchende Probe in die Pufferlösung eingeleitet,
- c) der Sauerstoffgehalt des Puffer-Proben-Gemisches gemessen,
- d) ein Nitrifikationshemmer zugegeben,
- e) eine weitere Sauerstoffmessung durchgeführt und
- f) durch Differenzbildung der Messergebnisse in Schritt c) und e) der biologische Sauerstoffbedarf bezüglich der oxidierbaren Kohlenstoffverbindungen in der Probe ermittelt wird.
- a) the sensor is placed in a buffer solution,
- b) the sample to be examined is introduced into the buffer solution,
- c) the oxygen content of the buffer-sample mixture is measured,
- d) a nitrification inhibitor is added,
- e) another oxygen measurement is carried out and
- f) the biological oxygen demand with regard to the oxidizable carbon compounds in the sample is determined by forming the difference between the measurement results in steps c) and e).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1995131566 DE19531566A1 (en) | 1995-08-28 | 1995-08-28 | Appts. for determining biological oxygen demand and/or substances retarding nitrification |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1995131566 DE19531566A1 (en) | 1995-08-28 | 1995-08-28 | Appts. for determining biological oxygen demand and/or substances retarding nitrification |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19531566A1 true DE19531566A1 (en) | 1997-03-06 |
Family
ID=7770555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1995131566 Ceased DE19531566A1 (en) | 1995-08-28 | 1995-08-28 | Appts. for determining biological oxygen demand and/or substances retarding nitrification |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19531566A1 (en) |
-
1995
- 1995-08-28 DE DE1995131566 patent/DE19531566A1/en not_active Ceased
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| Central Patents Index, Basic Abstracts Journal, D,Derwent Publications, London 1981, Nr. 50688 D/28, JP 56060342 * |
| Chemical Patents Index, Documentation Abstracts Journal, D, Derwent Publications, London 1990, Nr. 90-294143/39, JP 02206762 A * |
| Karube I. et al.: Anal. Chem. 53 (1981) 1852-1854 * |
| Karube I. et al.: European J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 15 (1982) 127-132 * |
| Okada T. et al.: European J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 14 (1982) 149-154 * |
| Riedel K.: Vom Wasser 81 (1993) 243-256 * |
| Riedel K.et al.: Chem.-Ing.-Tech.64 (1992)518-528 * |
| Tanaka H. et al.: Wat. Sci. Tech. 28(1994)435-445 * |
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| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8131 | Rejection |