DE19920244C2 - Method and device for determining the inhibitory effect of a sample on microbial nitrification - Google Patents

Method and device for determining the inhibitory effect of a sample on microbial nitrification

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestim­ mung der Hemmwirkung einer Probe auf die mikrobielle Ni­ trifikation gemäß Anspruch 1.The invention relates to a method for determining measurement of the inhibitory effect of a sample on the microbial Ni trification according to claim 1.

Aus stickstoffhaltigen organischen Substanzen wird Stick­ stoff im Zuge aerober und anaerober Zersetzungsprozesse zunächst in Form von Ammonium freigesetzt. Die biologi­ sche Oxidation von Ammoniak über Nitrit zu Nitrat wird Nitrifikation genannt. Die Nitrifikation kann sowohl im Boden als auch im Wasser durch nitrifizierende Bakterien erfolgen. Dies macht man sich im Bereich der Abwasserbe­ handlung in Kläranlagen zunutze.Organic substances containing nitrogen become stick substance in the course of aerobic and anaerobic decomposition processes initially released in the form of ammonium. The biologi oxidation of ammonia via nitrite to nitrate Called nitrification. The nitrification can be carried out in Soil and water due to nitrifying bacteria respectively. This is done in the wastewater sector action in sewage treatment plants.

Die Nitrifikation stellt einen wichtigen Teilprozeß der Abwasserreinigung dar. Sie ist notwendig, um die Konzen­ tration an Ammoniumionen im Ablauf der Kläranlagen so ge­ ring wie möglich zu halten. Ein verstärkter Eintrag von Ammonium im Vorfluter einer Kläranlage kann infolge dort einsetzender Nitrifikation und des damit einhergehenden hohen Sauerstoffverbrauchs zu einer erheblichen Belastung des Sauerstoffhaushaltes des Gewässers führen. Darüber hinaus wirken Ammoniak, dessen Freisetzung aus Ammonium von dem pH-Wert und der Temperatur des Gewässers abhängig ist, und Nitrit toxisch auf Fische, Fischbrut und andere Wasserorganismen. Ammonium stellt für viele Gewässer auch im Hinblick auf die Eutrophierung ein großes Problem dar. Nicht zuletzt ist die Nitrifikation auch die notwendige Vorstufe zur Denitrifikation im Zuge der vollständigen Stickstoffeliminierung.Nitrification is an important part of the process Waste water purification. It is necessary to the conc tration of ammonium ions in the effluent of the sewage treatment plants keep ring as possible. An increased entry from Ammonium in the drainage of a wastewater treatment plant can result there beginning nitrification and the associated high oxygen consumption at a considerable burden  of the water's oxygen balance. About that ammonia, whose release from ammonium, also has an effect depends on the pH value and the temperature of the water is, and nitrite toxic to fish, fry and others Aquatic organisms. Ammonium provides for many waters too a big problem with regard to eutrophication. Last but not least, nitrification is also necessary Precursor to denitrification in the course of the complete Nitrogen elimination.

Nitrifikanten oder nitrifizierende Bakterien gehören zu den gram-negativen, chemolithotrophen, aeroben Bakterien. Es wird zwischen der Gruppe der Ammoniak-Oxidierer und der Gruppe der Nitrit-Oxidierer unterschieden (E. Spieck und E. Bock: "Taxonomische, physiologische und ökologi­ sche Vielfalt nitrifizierender Bakterien." Biospektrum, 4, 25-31, 1998). Zu den Ammoniak-Oxidierern gehören die Gattungen Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Ni­ trosolobus und Nitrosovibrio, welche im ersten Teil­ schritt des Nitrifikationsprozesses Ammonium in Gegenwart von Sauerstoff zu Nitrit oxidieren. Anschließend erfolgt durch die Nitrit-Oxidierer mit den Gattungen Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus und Nitrospira der zweite Schritt mit der Umsetzung des Nitrits zum Nitrat in Gegenwart von Sauerstoff.Nitrifiers or nitrifying bacteria are among them the gram-negative, chemolithotrophic, aerobic bacteria. It is between the group of ammonia oxidizers and the group of nitrite oxidizers (E. Spieck and E. Bock: "Taxonomic, physiological and ecological variety of nitrifying bacteria. "Biospectrum, 4, 25-31, 1998). The ammonia oxidizers include Genera Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Ni trosolobus and Nitrosovibrio, which in the first part step of the nitrification process ammonium in the presence oxidize from oxygen to nitrite. Then follows through the nitrite oxidizers with the genera Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus and Nitrospira the second step with the conversion of the nitrite to the nitrate in the presence of Oxygen.

Nitrifizierende Bakterien reagieren auf bestimmte Um­ welteinflüsse sehr empfindlich. Da sie durch eine relativ geringe Energieausbeute eine weitaus geringere Wachstums­ geschwindigkeit und eine geringere Artendiversität als heterotrophe Bakterien aufweisen, wirken sich Schädigun­ gen der nitrifizierenden Teilbiozönose besonders nachhal­ tig aus. Seit langem sind eine ganze Reihe von Stoffen bekannt, die selektiv hemmend auf die Nitrifikation wir­ ken, ohne die Stoffwechselaktivität der heterotrophen Bakterien signifikant zu beeinträchtigen (M. Richardson: "British Library cataloguing in Publication Data: Nitri­ fication Inhibition in the Treatment of Sewage." Thames Water Authority, Nugent House, Reading, RG1 8DB, 1985; B. Sharma und R. C. Ahlert: "Nitrification and Nitrogen Removal.", Water Research, 13, Pergamon Press, 897-925, 1977; A. B. Hooper und K. R. Terry: "Specific Inhibitors of ammonia oxidation in Nitrosomonas.", J. Bacteriol., 115, 480-485, 1973).Nitrifying bacteria react to certain um world influences very sensitive. Since they are relative low energy yield a much lower growth speed and a lower species diversity than  heterotrophic bacteria have an effect against the nitrifying partial biocenosis out. There have been a whole range of fabrics for a long time known that we selectively inhibit nitrification ken, without the metabolic activity of the heterotrophic Significantly affect bacteria (M. Richardson: "British Library cataloging in Publication Data: Nitri fication inhibition in the treatment of sewage. "Thames Water Authority, Nugent House, Reading, RG1 8DB, 1985; B. Sharma and R. C. Ahlert: "Nitrification and Nitrogen Removal. ", Water Research, 13, Pergamon Press, 897-925, 1977; A. B. Hooper and K. R. Terry: "Specific Inhibitors of ammonia oxidation in Nitrosomonas. ", J. Bacteriol., 115, 480-485, 1973).

Nitrifikanten zeigen zum Beispiel eine ausgeprägte Sensi­ tivität gegenüber Verbindungen wie N-Allylthioharnstoff, Thioharnstoff oder auch 2-Chlor-6-trimethylpyridin (N-serve), die bereits in sehr geringen Konzentrationen (Mikromolarbereich) die Nitrifikation hemmen (R. Wagner und G. Kayser: "Laboruntersuchungen zur Hemmung der Ni­ trifikation durch spezielle Inhaltsstoffe industrieller und gewerblicher Abwässer.", GWF Wasser-Abwasser, 131, 165-177, 1990).For example, nitrifying bacteria show a pronounced sensitivity activity towards compounds such as N-allylthiourea, Thiourea or 2-chloro-6-trimethylpyridine (N-serve) already in very low concentrations (Micromolar range) inhibit nitrification (R. Wagner and G. Kayser: "Laboratory studies to inhibit Ni trification by special ingredients of industrial and commercial waste water. ", GWF Wasser-Abwasser, 131, 165-177, 1990).

Diese und eine Reihe anderer nitrifikationshemmender Stoffe aus den verschiedensten Quellen gelangen über das Abwasser in die Kläranlagen und können so zu einer signi­ fikanten, z. T. irreversiblen Schädigung der überaus emp­ findlichen und nur einen geringen Anteil an der Schlammtrockensubstanz ausmachenden, nitrifizierenden Bakterien­ flora des Belebtschlammes führen. Dies stellt die betrof­ fenen Betriebe vor erhebliche Probleme und verursacht enorm hohe, zusätzliche Kosten. Die Bedeutung einer sol­ chen Problematik drückt sich auch dadurch aus, daß in Deutschland seit April 1995 eine DIN-Norm zur Ermittlung der nitrifikationshemmenden Wirkung von Wässern und Che­ mikalien existiert (DIN EN ISO 9509-L38: "Verfahren zur Bestimmung der Nitrifikations-Hemmung von Mikroorganismen im Belebtschlamm durch Stoffe und Abwasser."). Als Bio­ masse wird nitrifizierender Belebtschlamm mit nicht defi­ nierter Mikroorganismenzusammensetzung aus Kläranlagen mit überwiegend kommunalem Abwasser eingesetzt. Die Test­ dauer beträgt 4 Stunden. Meßgrößen und Bewertungsgrundla­ gen für die Nitrifikationshemmung sind die Konzentratio­ nen der Stickstoffparameter Ammonium-N, Nitrit-N und Ni­ trat-N in mg/l im Probenansatz im Vergleich zu einem par­ allel angesetzten, ungehemmten Kontrollansatz. Belüften und Schütteln der Testansätze ist während der Inkubation unerläßliche Voraussetzung.This and a number of other nitrification inhibitors Substances from a wide variety of sources arrive through the Wastewater in the sewage treatment plants and can thus become a signi fictional, e.g. T. irreversible damage to the extremely emp sensitive and only a small proportion of the sludge dry substance  essential, nitrifying bacteria flora of the activated sludge. This represents the affected open companies face significant problems and causes enormously high, additional costs. The importance of a sol Chen problematic is also expressed in that in Germany since April 1995 to determine a DIN standard the nitrification-inhibiting effect of water and Che mikalien exists (DIN EN ISO 9509-L38: "Process for Determination of nitrification inhibition of microorganisms in the activated sludge through substances and waste water. "). As organic mass becomes nitrifying activated sludge with undefi nated microorganism composition from sewage treatment plants used mainly with municipal wastewater. The test duration is 4 hours. Measured variables and basis for evaluation Concentrations are used to inhibit nitrification the nitrogen parameters ammonium-N, nitrite-N and Ni step-N in mg / l in the sample mixture compared to a par all-set, uninhibited control approach. ventilate and shaking the test batches is during the incubation indispensable requirement.

Wesentlicher Nachteil des DIN-Verfahrens ist die ungenü­ gende Reproduzierbarkeit und damit auch Standardisierbar­ keit der Ergebnisse aufgrund der Verwendung eines von der Art- und Mengenzusammensetzung an nitrifizierenden Bakte­ rien völlig undefinierten Belebtschlammes als Biomasse. Weiterhin sehr negativ ist der hohe Zeit- und Arbeitsauf­ wand bei der Aufbereitung und Bereitstellung der als Bio­ masse einzusetzenden Belebtschlammprobe sowie die eigent­ liche Inkubationszeit der Testansätze von 4 Stunden. The main disadvantage of the DIN process is the inaccuracy reproducibility and therefore also standardizable results due to the use of one of the Type and quantity composition of nitrifying bacteria completely undefined activated sludge as biomass. The high time and workload is still very negative involved in the preparation and preparation of the as organic activated sludge sample to be used as well as the actual Incubation time of the test batches of 4 hours.  

Ebenfalls arbeits- und zeitintensiv ist die abschließende Bestimmung der Konzentrationen der Stickstoffparameter Ammonium-N, Nitrit-N und Nitrat-N in den einzelnen Testansätzen durch z. B. photometrische Verfahren. Für die Durchführung eines DIN-Testes muß somit mit einem Zeitaufwand von 1 Arbeitstag gerechnet werden.The final one is also labor and time intensive Determination of concentrations of nitrogen parameters Ammonium-N, Nitrite-N and Nitrate-N in each Test approaches by e.g. B. photometric method. For a DIN test must therefore be carried out with a Time expenditure of 1 working day can be expected.

In der Vergangenheit sind neben dem DIN-Verfahren mehrere davon unabhängige Verfahren beschrieben worden, um die Nitrifikationsleistung zu messen. Eine Möglichkeit ist die zeitabhängige Bestimmung des Ammoniumverbrauchs oder der Nitrit- und Nitratbildung über zeitaufwendige, ar­ beitsintensive kolorimetrische und photometrische Verfah­ ren. Eine andere Möglichkeit zur Messung der Nitrifikati­ on ist die Bestimmung der Salpetersäure-(Nitrit-)Bildung über Messung des pH-Wertes. Weitere Alternativen zur Be­ stimmung der Hemmwirkung auf nitrifizierende Bakterien bieten Zellzahlmessungen oder der Einsatz spezifischer Gensonden für ammoniakoxidierende Bakterien (EP 045 6047). All diesen Methoden ist gemeinsam, daß sie sehr arbeits- und zeitintensiv sind, sowie z. T. nur unzurei­ chend reproduzierbar sind aufgrund der unheitlich, nicht exakt definierten eingesetzten Nitrifikanten- Mischkulturen.In the past there were several in addition to the DIN method independent methods have been described to the Measure nitrification performance. One possibility is the time-dependent determination of the ammonium consumption or the nitrite and nitrate formation via time-consuming, ar labor-intensive colorimetric and photometric processes ren. Another way of measuring the nitrification on is the determination of the formation of nitric acid (nitrite) by measuring the pH. Other alternatives to the Be the inhibitory effect on nitrifying bacteria offer cell count measurements or the use of specific Gene probes for ammonia-oxidizing bacteria (EP 045 6047). All of these methods have in common that they are very are labor and time intensive, and z. T. only inadequate are not reproducible due to the unevenness exactly defined used nitrification Mixed cultures.

Eine weitere, weit verbreitete Entwicklungsrichtung der letzten Jahre sind verschiedenste Biosensorsysteme zur Bestimmung von Stickstoffverbindungen wie Ammonium, Ni­ trit, Nitrat und Harnstoff (z. B. M. Hikuma et al.: "Ammonia electrode with immobilized nitrifying bacteria.", Anal. Chem., 52, 1020-1024, 1980; I. Karube et al.: "Amperometric determination of sodium nitrite by a microbial sensor.", Eur. J. Appl. Biotechnol., 15, 127-­ 132, 1982; H. Tanaka et al.: "Development of the ammonia biosensor monitoring system.", Water Sci. Technol., 28, 435-445, 1993). Gemeinsam ist diesen Biosensoren, daß sie physikochemisch auf der Messung des Sauerstoffverbrauchs mit Hilfe einer integrierten Sauerstoffelektrode basie­ ren. Unterschiede bestehen hauptsächlich in der einge­ setzten, immobilisierten Biologie, bei der mit Reinkultu­ ren oder auch definierten Mischkulturen verschiedenster Bakterienarten gearbeitet wird.Another widespread direction of development of the Various biosensor systems have been used in recent years Determination of nitrogen compounds such as ammonium, Ni trit, nitrate and urea (e.g. M. Hikuma et al .: "Ammonia electrode with immobilized nitrifying bacteria.",  Anal. Chem., 52, 1020-1024, 1980; I. Karube et al .: "Amperometric determination of sodium nitrite by a microbial sensor. ", Eur. J. Appl. Biotechnol., 15, 127- 132, 1982; H. Tanaka et al .: "Development of the ammonia biosensor monitoring system. ", Water Sci. Technol., 28, 435-445, 1993). What these biosensors have in common is that they physicochemically on the measurement of oxygen consumption with the help of an integrated oxygen electrode The main differences are in the individual set, immobilized biology, in which with pure culture mixed or defined mixed cultures of different Bacterial species is being worked on.

Eine andere Biosensor-Entwicklung ist aus der DE 195 31 566 A1 bekannt, wobei mit immobilisierten Anreicherungs­ kulturen nitrifizierender Bakterien aus Belebtschlammpro­ ben gearbeitet wird. Hier werden zur Bestimmung nitrifi­ kationshemmender Substanzen aus Belebtschlämmen gezielt nitrifizierende Bakterien angereichert, immobilisiert und in einer Vorrichtung zur Messung des Sauerstoffgehaltes eingesetzt. Die verwendeten Bakterienkulturen sind durch ihr Lipidspektrum anhand ihres Gehaltes an gesättig­ ten/ungesättigten bzw. verzweigten/unverzweigten Fettsäu­ ren charakterisiert. Aufgrund ihrer Herkunft und Charak­ terisierung sind diese Mischkulturen sehr heterogen, schwierig zu reproduzieren und können ferner einen größe­ ren Anteil an nicht-nitrifizierenden, heterotrophen Mi­ kroorganismen enthalten. Another biosensor development is from DE 195 31 566 A1 known, with immobilized enrichment cultures of nitrifying bacteria from activated sludge pro ben is being worked on. Here nitrifi targeted cation-inhibiting substances from activated sludge nitrifying bacteria enriched, immobilized and in a device for measuring the oxygen content used. The bacterial cultures used are through their lipid spectrum based on their content of saturated ten / unsaturated or branched / unbranched fatty acid characterized. Because of their origin and character terization these mixed cultures are very heterogeneous, difficult to reproduce and can also be a size ren share of non-nitrifying, heterotrophic Mi contain microorganisms.  

Biosensoren haben vor allem den Nachteil eines verhält­ nismäßig hohen apparativen Aufwandes und verursachen dem­ zufolge hohe Anschaffungskosten. In den meisten Fällen sind die biologischen Elemente der Biosensoren auch sehr wartungsintensiv und von meist nur stark beschränkter Haltbarkeit. Für gelegentliche oder auch regelmäßige Ein­ zelmessungen im Rahmen der Betriebseigenkontrolle sind sie aus den genannten Gründen deshalb nicht geeignet.Above all, biosensors have one disadvantage high equipment expenditure and cause due to high acquisition costs. In most cases the biological elements of the biosensors are also very maintenance-intensive and usually only very limited Durability. For occasional or regular a individual measurements as part of the company's own control they are therefore unsuitable for the reasons mentioned.

Zur Detektion nitrifikationshemmender Substanzen ist fer­ ner der Einsatz lumineszenter nitrifizierender Mikroorga­ nismen (DE 44 31 964 A1) bekannt, wobei die Erbinformati­ on für die Biolumineszenz mit gentechnologischen Methoden auf obligat chemolithoautotrophe nitrifizierende Mikroor­ ganismen übertragen wurde. Als Bewertungsgrundlage zur Abschätzung der nitrifikationshemmenden Wirkung einer Probe dient hier die Vitalität dieser Mikroorganismen durch Messung der Abnahme der Lumineszenz. Neben der An­ wendung gentechnologischer Verfahren bedarf es bei diesem Verfahren ebenfalls eines teuren apparativen Aufwandes in Form eines Luminometers zur Messung des biologischen Leuchtens, was dieses Verfahren als reines Routineelement im Rahmen der Eigenüberwachung uninteressant macht.For the detection of nitrification-inhibiting substances, fer The use of luminescent nitrifying microorganisms nisms (DE 44 31 964 A1) known, the Erbinformati on for bioluminescence with genetic engineering methods on obligatory chemolithoautotrophic nitrifying microor organisms was transmitted. As a basis for the evaluation of Estimation of the nitrification inhibiting effect of a The vitality of these microorganisms serves as a test here by measuring the decrease in luminescence. In addition to the An This requires the use of genetic engineering methods Process also an expensive equipment in Form of a luminometer for measuring the biological Illuminated, what this procedure as a purely routine element makes it uninteresting as part of self-monitoring.

Ferner sind eine Reihe von Produkten zur on-line Analytik nitrifikationshemmender Stoffe - primär in Kläranlagen - auf dem Markt erhältlich. Genannt seien in diesem Zusam­ menhang, z. B. das Toximeter "STIPTOX-adapt (B)" der Fir­ ma STIP Siepmann und Teuscher GmbH, der "Nitritox- Monitor" von der Firma LAR und der "Amtox Nitrifikationshemmungs-Monitor" von der Firma Water Technology. Die Verfahren beruhen prinzipiell auf einer Art Fermentation­ stechnologie mit in erster Linie Belebtschlamm als Bio­ masse. Aufgrund der Schaffung eines optimalen Milieus für Nitrifikanten innerhalb der Bioreaktoren durch Verwendung eines geeigneten Nährmediums bei optimaler Inkubation­ stemperatur und pH-Wert, geeignete Aufwuchsflächen usw. entwickelt sich eine Mikroflora mit einem erhöhten Gehalt an nitrifizierenden Bakterien. Über das Meßprinzip Sauer­ stoffbestimmung werden zunächst mit Hilfe einer gerätein­ tegrierten Sauerstoffelektrode der biochemische Sauer­ stoffbedarf (BSB) - mit Unterteilung in C-BSB und N-BSB - sowie die endogene Atmung des Belebtschlammes bestimmt. Anhand dieser Parameter können dann mit Hilfe einer gerä­ teintegrierten Software nitrifikationshemmende Störungen detektiert werden. Unterschiede zwischen den verschiede­ nen on-line Geräten beruhen in erster Linie auf diversen verfahrenstechnischen Details bezüglich der Reaktorbiolo­ gie und Testdurchführung. Allen on-line Systemen gemein­ sam ist die Verursachung extrem hoher Anschaffungskosten, sowie eine hohe Wartungsintensität, weshalb solche Geräte für die punktuelle Eigenüberwachung nicht geeignet, aber von vorneherein auch nicht vorgesehen sind.There are also a number of products for online analysis nitrification-inhibiting substances - primarily in sewage treatment plants - available on the market. May be mentioned in this together menhang, z. B. the toximeter "STIPTOX-adapt (B)" from Fir ma STIP Siepmann and Teuscher GmbH, the "Nitritox- Monitor "from LAR and the" Amtox Nitrification Inhibition Monitor "  from the company Water Technology. The In principle, processes are based on a type of fermentation technology with primarily activated sludge as organic Dimensions. Because of the creation of an optimal environment for Nitrificants within the bioreactors through use a suitable nutrient medium with optimal incubation temperature and pH value, suitable growth areas etc. a microflora with an increased content develops on nitrifying bacteria. About the Sauer measuring principle substance determination are first carried out with the help of a device tegrated oxygen electrode of the biochemical acid material requirements (BOD) - with division into C-BOD and N-BOD - as well as the endogenous respiration of the activated sludge. Based on these parameters, a device can then be used Integrated software nitrification-inhibiting disorders can be detected. Differences between the different ones On-line devices are primarily based on various procedural details regarding the reactor biolo gy and test execution. Common to all online systems sam is the cause of extremely high acquisition costs, as well as a high maintenance intensity, which is why such devices not suitable for selective self-monitoring, but are also not provided from the outset.

Die US 5 160 604 offenbart eine Vorrichtung und ein Ver­ fahren zur Detektion toxischer Substanzen, wobei die ni­ trifizierenden Bakterien auf einer Membran fixiert sind und so einen Mikroorganismus-Sensor darstellen. Die Vor­ richtung stellt eine Kombination einer Durchflusszelle mit einer O2-Elektrode dar. Über entsprechende Steuereinheiten werden Reinigungslösung, Puffer, Standardlösung zur Kalibrierung des Mikroorganismus-Sensors sowie das zu überprüfende Wasser an den fixierten Bakterien vorbeige­ führt.US 5 160 604 discloses an apparatus and a method for the detection of toxic substances, the nitrifying bacteria being fixed on a membrane and thus representing a microorganism sensor. The device represents a combination of a flow cell with an O 2 electrode. Cleaning solutions, buffers, standard solutions for calibrating the microorganism sensor and the water to be checked bypass the fixed bacteria via appropriate control units.

Es besteht somit ein Bedürfnis für ein einfaches, schnel­ les, standardisiertes Verfahren, um reproduzierbar die Hemmung der mikrobiellen Nitrifikation ortsunabhängig feststellen zu können. Eine weitere Aufgabe der vorlie­ genden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens, das ohne teure Spezial­ geräte durchgeführt werden kann.There is therefore a need for a simple, quick les, standardized procedure to reproducibly the Inhibition of microbial nitrification regardless of location to be able to determine. Another task of the present Invention consists in  Providing a process without expensive special devices can be performed.

Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß durch das Verfahren nach Anspruch 1 gelöst, welches durch den Einsatz einer konservierten Reinkultur eines definierten nitrifizieren­ den Bakterienstammes oder einer konservierten Mischkultur von definierten nitrifizierenden Bakterienstämmen als Testorganismen, wobei der oder die Bakterienstämme zu der Gruppe der Ammoniak-Oxidierer und/oder der Nitrit- Oxidierer gehören, und durch eine Messung des Sauerstoff­ verbrauches der Testorganismen in Abwesenheit und in Ge­ genwart der Probe in einem Testansatz, wobei die Messung des Sauerstoffverbrauches mit einer Vorrichtung erfolgt, die eine Sauerstoffelektrode, ein Testansatzgefäß mit passendem Deckel, der mindestens eine Bohrung, um die Sauerstoffelektrode luftdicht im Deckel zu fixieren, und Dichtmaterial auf der Deckelunterseite aufweist, gekenn­ zeichnet ist. Vorteilhafte Ausführungsformen des Verfah­ rens nach der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 18.According to the invention, these tasks are achieved by the method solved according to claim 1, which by using a preserved pure culture of a defined nitrify the bacterial strain or a preserved mixed culture of defined nitrifying bacterial strains as Test organisms, the or the bacterial strains to the Group of ammonia oxidizers and / or nitrite Oxidizers belong, and by measuring oxygen consumption of test organisms in the absence and in Ge presence of the sample in a test run, taking the measurement the oxygen consumption takes place with a device, which an oxygen electrode, a test batch vessel with Matching cover that has at least one hole to the To fix the oxygen electrode airtight in the lid, and Has sealing material on the underside of the lid is drawing. Advantageous embodiments of the method rens according to the invention result from the features of claims 2 to 18.

Die Testorganismen werden bei dem Verfahren nach der Er­ findung in definierter Zusammensetzung, sowohl hinsicht­ lich des genauen Bakterienstammes als auch hinsichtlich ihrer Konzentration, getrennt als Reinkulturen oder auch zusammen als Mischkulturen als Inokulum im Testansatz eingesetzt. Die Messung der Stoffwechselaktivität der Testorganismen erfolgt unter Zuhilfenahme einer Vorrichtung zur Messung des Sauerstoffgehalts mit Hilfe einer handelsüblichen Sauerstoffelektrode.The test organisms are in the method according to the Er invention in a defined composition, both with regard to Lich the exact bacterial strain as well their concentration, separately as pure cultures or also together as mixed cultures as an inoculum in the test approach used. Measuring the metabolic activity of the Test organisms are carried out with the help of a device  to measure the oxygen content using a commercially available oxygen electrode.

Als typischer ubiquitär verbreiteter und dominanter Ver­ treter der Gruppe der Ammoniak-Oxidierer werden erfin­ dungsgemäß vorzugsweise Bakterien der Gattung Nitrosomo­ nas und insbesondere der Art Nitrosomonas eutropha einge­ setzt. Solche Bakterien können aus Kläranlagen isoliert werden oder liegen bereits in entsprechenden Sammlungen vor.As a typical ubiquitous and dominant ver The ammonia oxidizer group is invented According to the invention, bacteria of the genus Nitrosomo are preferred nas and especially the species Nitrosomonas eutropha puts. Such bacteria can be isolated from sewage treatment plants are or are already in corresponding collections in front.

Als repräsentativer, ebenfalls weit verbreiteter Vertre­ ter der Gruppe der Nitrit-Oxidierer kann ein Stamm aus der Gattung Nitrobacter und hier von der Art Nitrobacter winogradskyi verwendet werden. Solche Bakterien können aus Kläranlagen isoliert werden oder liegen bereits in entsprechenden Sammlungen vor. As a representative, also widespread distributor A strain can be selected from the group of nitrite oxidizers of the genus Nitrobacter and here of the species Nitrobacter winogradskyi can be used. Such bacteria can are isolated from sewage treatment plants or are already in corresponding collections.  

Die Bedeutung der beiden oben beschriebenen Arten als re­ präsentative und dominant vorkommende nitrifizierende Bakterien vor allem kommunaler Abwässer wurde in einer Reihe von Veröffentlichungen bereits beschrieben (H. P. Koops et al.: "Classification of eight new species of am­ monia-oxidizing bacteria.", J. Gen. Microbiol., 137, 1689-1699, 1991; S. W. Watson und M. Mandel: "Comparison of the morphology and desoxyribonucleic acids composition of 27 strains of nitrifying bacteria.", Journal of Bacte­ riology, 107, 563-569, 1971). Aus diesen Druckschriften können ebenfalls Angaben zu geeigneten Kulturmedien und Anzuchtbedingungen entnommen werden.The meaning of the two types described above as re presentative and dominant nitrifying Bacteria, especially municipal wastewater, were found in one A number of publications have already been described (H. P. Koops et al .: "Classification of eight new species of am monia-oxidizing bacteria. ", J. Gen. Microbiol., 137, 1689-1699, 1991; S. W. Watson and M. Mandel: "Comparison of the morphology and deoxyribonucleic acids composition of 27 strains of nitrifying bacteria. ", Journal of Bacte riology, 107, 563-569, 1971). From these publications can also provide information on suitable culture media and Cultivation conditions are taken.

Die zum Einsatz im Testsystem vorgesehenen nitrifizieren­ den Bakterienkulturen werden mit den für Nitrifikanten bekannten, herkömmlichen Anzuchtmethoden kultiviert und anschließend mit ebenfalls herkömmlichen verfahrenstech­ nischen Methoden angereichert und aufbereitet. Die test­ fertige Bereitstellung der Nitrifikanten in konservier­ ter, lagerfähiger Form kann erfindungsgemäß mit einer Reihe verschiedener Methoden erfolgen, wie z. B. Gefrier­ trocknung, Flüssigtrocknung, Einfrieren, Lagerung in de­ finierten Flüssigmedien, Lufttrocknung. Bevorzugt erfolgt die Konservierung und Lagerung der Ammoniak-Oxidierer in sterilisiertem Leitungswasser bei Kühlschranktemperaturen von 0°C bis +8°C, während die Lagerung der hinsicht­ lich ihrer Anzucht und Konservierung empfindlicheren Ni­ trit-Oxidierer vorzugsweise in Gegenwart eines Gefrier­ schutzpuffers bei -15°C bis -20°C erfolgt. Nitrify those intended for use in the test system the bacterial cultures are combined with those for nitrifying bacteria known, conventional cultivation methods and then with conventional process technology African methods enriched and processed. The test ready provision of the nitrifiers in conserved ter, storable form can according to the invention with a A number of different methods are used, such as. B. Freezer drying, liquid drying, freezing, storage in de Finished liquid media, air drying. Preferably done the preservation and storage of the ammonia oxidizers in sterilized tap water at refrigerator temperatures from 0 ° C to + 8 ° C, while the storage of the view sensitive to their cultivation and preservation trite oxidizer preferably in the presence of a freezer protection buffer at -15 ° C to -20 ° C.  

Das Verfahren nach der Erfindung hat mehrere Vorteile ge­ genüber den bisher zur Verfügung stehenden Methoden zur Bestimmung der nitrifikationshemmenden Wirkung von Pro­ ben.The method according to the invention has several advantages compared to the previously available methods for Determination of the nitrification-inhibiting effect of Pro ben.

Zunächst einmal gewährleistet der Einsatz definierter Bakterienstämme und definierter Konzentrationen an nitri­ fizierenden Bakterien ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit der Ergebnisse als auch ein eben so hohes Maß der Ver­ gleichbarkeit von Ergebnissen verschiedener Kläranlagen. Dies ist vor allem bei Benutzung von Klär- oder Belebt­ schlamm als Biomasse nicht gewährleistet, da dessen Zu­ sammensetzung je nach Herkunft aber auch je nach Jahres­ zeit extrem unterschiedlich sein kann (G. Rheinheimer (Ed.): "Mikrobiologie der Gewässer", 5. Auflage, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart 1991, S. 179 ff. Die Bereit­ stellung der eingesetzten Bakterienstämme in konservier­ ter, sofort einsatzbereiter Form erlaubt zudem einen höchst variablen, ortsunabhängigen Einsatz. Zum Beispiel kann durch eine definierte Mischung ausgewählter nitrifi­ zierender Bakterienstämme in einem Ansatz überprüft wer­ den, ob die Nitrifikation generell gehemmt wird. Wahlwei­ se können die testfertig konservierten Bakterien auch ge­ trennt zur Testung eingesetzt werden und erlauben so eine differenzierte Beurteilung, ob die erste Stufe der Nitri­ fikation (Ammoniakoxidation) oder die zweite Stufe (Nitritoxidation) gehemmt wird. First of all, the use guarantees more defined Bacterial strains and defined concentrations of nitri bacteria that produce feces a high degree of reproducibility the results as well as an equally high level of ver Comparability of results from different wastewater treatment plants. This is especially true when using clarifying or vitalizing Sludge is not guaranteed as biomass because composition depending on origin but also depending on the year time can be extremely different (G. Rheinheimer (Ed.): "Microbiology of the Waters", 5th edition, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart 1991, pp. 179 ff. Die Ready position of the bacterial strains used in conserved The ready-to-use shape also allows one highly variable, location-independent use. For example can by a defined mixture of selected nitrifi ornamental bacterial strains in one approach who checked whether nitrification is generally inhibited. alterna The preserved bacteria can also be tested can be used for testing and thus allow one differentiated assessment of whether the first stage of nitri fication (ammonia oxidation) or the second stage (Nitrite oxidation) is inhibited.  

Gegenüber Biosensoren mit immobilisierten Nitrifikanten hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß die Biomasse sofort einsatzbereit ist, ohne eine je nach Bio­ sensor zum Teil aufwendige Vorbehandlung/Aktivierung der biologischen Einheit. Desweiteren weisen die einmal er­ findungsgemäß testfertig konservierten Bakterien mit min­ destens einem Jahr eine wesentlich längere Haltbarkeit als die entsprechenden biologischen Komponenten der Bio­ sensoren auf, wobei dies insbesondere gültig ist, wenn diese einmal auf dem physikochemischen Teil des Sensors installiert wurden und zwecks Messung aktiviert wurden. Die Haltbarkeit einmal aktivierter Biosensoreinheiten be­ trägt im besten Falle 1-2 Monate. Schon aus wirtschaft­ lichen Gründen sind deshalb Biosensoren für den Einsatz von gelegentlichen Messungen bzw. regelmäßigen Einzelmes­ sungen im Rahmen der Betriebskontrolle und Eigenüberwa­ chung ungeeignet.Compared to biosensors with immobilized nitrificants The process according to the invention has the advantage that the Biomass is ready for immediate use without one depending on the bio sensor partially complex pretreatment / activation of the biological unit. Furthermore, the one time he According to the invention, ready-to-test preserved bacteria with min at least one year a much longer shelf life as the corresponding biological components of the bio sensors, and this is particularly true if this once on the physicochemical part of the sensor installed and activated for measurement. The durability of activated biosensor units bears at best 1-2 months. For economic reasons alone reasons are therefore biosensors for use of occasional measurements or regular single measurements solutions as part of operational control and self-monitoring unsuitable.

Generell ist ein wichtiger Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens der geringe Kostenfaktor. Denn außer einer kleinen Menge konservierter nitrifizierender Bakterien, der Substratlösung sowie einer in den meisten Labors be­ reits vorhandenen Sauerstoffelektrode ist kein weiteres kostenintensives Zubehör nötig. Dies gilt auch für die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach der Er­ findung, wie dies weiter unten dargestellt werden wird. Bei Verwendung von Biosensoren entstehen dagegen allein schon bei der Anschaffung der entsprechenden Gerätschaft enorme Kosten, ohne die ohnehin permanent anfallenden Wartungskosten und Kosten für die eigentlichen Testrea­ genzien.In general, an important advantage of the invention Procedure the low cost factor. Because except for one small amount of preserved nitrifying bacteria, the substrate solution as well as one in most laboratories Existing oxygen electrode is not another costly accessories necessary. This also applies to the Device for performing the method according to the Er finding how this will be presented below. In contrast, when using biosensors arise alone already with the purchase of the appropriate equipment enormous costs, without the permanently incurred anyway  Maintenance costs and costs for the actual test area genzien.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ge­ genüber anderen herkömmlichen Testmethoden zur Bestimmung nitrifikationshemmender Substanzen, wie zum Beispiel die oben beschriebenen, kolorimetrischen und photometrischen Verfahren, liegt in der Schnelligkeit der Testdurchfüh­ rung. Die Ergebnisse liegen bereits nach wenigen Minuten vor. Der Arbeitsaufwand ist entsprechend gering.Another advantage of the method according to the invention compared to other conventional test methods for determination nitrification-inhibiting substances, such as colorimetric and photometric described above Procedure, lies in the speed of the test execution tion. The results are there after a few minutes in front. The workload is correspondingly low.

Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber ande­ ren Meßprinzipien, wie der Verwendung lumineszierender Nitrifikanten, liegt in der Tatsache, daß das Verfahren nach der Erfindung auch von ungeschultem Personal pro­ blemlos durchführbar ist, und kein kostenintensives gerä­ tetechnisches Zubehör, wie z. B. in Form eines Luminome­ ters notwendig ist.Advantages of the method according to the invention over others Ren measuring principles, such as the use of luminescent Nitrifiers, lies in the fact that the process according to the invention also by untrained personnel per is feasible without any problems and is not a costly device technical accessories such. B. in the form of a luminome ters is necessary.

Die Beschreibung einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im folgenden zur besse­ ren Erläuterung mit Hilfe der beiliegenden Abbildungen näher beschrieben.The description of a device for performing the The method according to the invention is shown below for the better Ren explanation with the help of the enclosed illustrations described in more detail.

Abb. 1 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Vorrichtung zur Durchführung des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens. Fig. 1 shows a preferred embodiment of the device for performing the inventive method.

Abb. 2 zeigt eine Aufsicht des Deckels der Ausführungsform nach Abb. 1. Fig. 2 shows a top view of the cover of the embodiment according to Fig. 1.

Abb. 3 zeigt Seitenansichten des Deckels der Ausführungsform nach Abb. 1. Fig. 3 shows side views of the lid of the embodiment of Fig. 1.

Gemäß Abb. 1 weist die Vorrichtung eine an einem Stativ befestigte, handelsübliche Sauerstoffelektrode (1) auf. Auf diese Sauerstoffelektrode wird bis zu einer de­ finierten Einkerbung ein speziell angefertigter Testge­ fäßdeckel (2) mit einer Dichtung (3) auf der Deckelunter­ seite aufgesteckt. Neben der zentralen Bohrung (4), durch die die Sauerstoffelektrode hindurchgesteckt wird, be­ sitzt der Deckel zwei weitere, kleinere Bohrungen. Eine Bohrung dient als Einstichloch (5) für die als Dosierin­ strument im Rahmen der Nitrifikanten- und Substratzugabe dienende Mikroliterspritze (10). Die andere Bohrung dient als Überdruckventil (6), da im Rahmen der Testdurchfüh­ rung durch Zugabe der Nitrifikantenkulturen und Substrat­ lösungen in das luftblasenfrei gefüllte und luftdicht verschlossene Testgefäß (7) Überdruck entstehen kann. Das Testgefäß (7) ist vorzugsweise aus durchsichtigem Polye­ thylen, weist ein Innenvolumen von ca. 5 bis 6 ml auf und ist mit einem Magnet-Rührfisch (8) versehen. Der Magnet- Rührfisch dient zur homogenen Verteilung der im Rahmen der Testdurchführung zudosierten Nitrifikanten und Substratlösungen. Die Vorrichtung wird auf einem geeigne­ ten, handelsüblichen Magnetrührer (9) angeordnet.According to Fig. 1, the device has a commercially available oxygen electrode ( 1 ) attached to a tripod. A specially prepared test vessel lid ( 2 ) with a seal ( 3 ) is placed on this underside of the oxygen electrode up to a defined notch. In addition to the central hole ( 4 ) through which the oxygen electrode is inserted, the lid has two other, smaller holes. A hole serves as a puncture hole ( 5 ) for the microliter syringe ( 10 ) serving as a metering instrument as part of the nitrification and substrate addition. The other hole serves as an overpressure valve ( 6 ), since the test can be carried out by adding nitrifying cultures and substrate solutions to the test vessel ( 7 ), which is filled with air bubbles and is sealed so that it is airtight. The test vessel ( 7 ) is preferably made of transparent polyethylene, has an internal volume of about 5 to 6 ml and is provided with a magnetic stirring fish ( 8 ). The magnetic stirring fish is used for the homogeneous distribution of the nitrificants and substrate solutions added during the test. The device is arranged on a suitable, commercially available magnetic stirrer ( 9 ).

Die Abb. 2 (Aufsicht) und 3 (Seitenansicht) zeigen nochmals zwei verschiedene Perspektiven auf den erfindungsgemäß speziell konzipierten Testgefäßdeckel. Es sind deutlich hervorgehoben die zentrale Bohrung (4) für die Sauerstoffelektrode sowie die beiden kleinen Bohrungen zur Dosierung (5) bzw. zum Druckausgleich (Überdruckventil 6). In der Abb. 3 ist die auf die Deckelunterseite aufgebrachte Dichtung (3) zum luftdich­ ten Abschluß des gesamten Testgefäßes nach dem luftbla­ senfreien Einstecken der Sauerstoffelektrode zu erkennen. Fig. 2 (top view) and 3 (side view) again show two different perspectives on the test vessel lid specially designed according to the invention. The central hole ( 4 ) for the oxygen electrode and the two small holes for metering ( 5 ) and for pressure compensation (pressure relief valve 6 ) are clearly highlighted. Fig. 3 shows the seal ( 3 ) on the underside of the lid for the airtight closure of the entire test vessel after the air bladder-free insertion of the oxygen electrode.

Die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung ist somit einfach und schnell herzustellen und dies bei einem geringen Kostenaufwand. Die Vorrichtung ist ferner einfach zu bedienen, ohne daß eine langwierige Einarbeitungszeit notwendig ist.The device for performing the method according to the Invention is thus simple and quick to manufacture and this at a low cost. The device is also easy to use without a lengthy Training period is necessary.

Im folgenden werden zur weiteren Erläuterung der Erfin­ dung und der damit verbundenen Vorteile Beispiele aus­ führlich beschrieben werden.In the following, the Erfin and the associated advantages be described in detail.

Beispiel 1example 1

Vergleichmessungen zur Bestimmung der Am­ moniakoxidation zwischen dem Verfahren nach DIN EN ISO 9509 mit Belebtschlamm und dem Verfahren nach der Erfin­ dung:
Als Testsubstanz (Probe) wurde N-Allylthioharnstoff (NATH), ein spezifischer Hemmstoff der Ammoniakoxidati­ onsstufe der Nitrifikation eingesetzt.Comparative measurements to determine the ammonia oxidation between the process according to DIN EN ISO 9509 with activated sludge and the process according to the invention:
N-allylthiourea (NATH), a specific inhibitor of the ammonia oxidation stage of nitrification, was used as the test substance (sample).

Der im Rahmen des DIN-Verfahrens eingesetzte Belebt­ schlamm stammte aus der Nitrifikationsstufe einer kommunalen Kläranlage. Die Aufbereitung des Schlammes und die Durchführung des Testes erfolgte gemäß den Vorschriften der DIN EN ISO 9509. Es wurden folgende Konzentrationen von NATH getestet: 0 (Kontrolle)/10/50/100/200 µM NATH. Bestimmt wurde die Menge an gebildetem Nitrat nach 4-stündiger Inkubation. Die Angabe der Ergebnisse erfolgt als prozentuale Hemmung der Nitratbildung in der Probe im Vergleich zu der ungehemmten Kontrolle.The revitalized used in the DIN process sludge came from the nitrification stage of a municipal  Wastewater treatment plant. The treatment of the sludge and the The test was carried out in accordance with the regulations of DIN EN ISO 9509. The following concentrations were found Tested by NATH: 0 (control) / 10/50/100/200 µM NATH. The amount of nitrate formed was determined 4 hour incubation. The results are given as a percentage inhibition of nitrate formation in the sample in Comparison to the uninhibited control.

Zur Bestimmung der Hemmung der Ammoniakoxidation mit dem Verfahren nach der Erfindung wurde Nitrosomonas eutropha MN 78, ein Isolat aus dem Belebtschlamm einer kommunalen Kläranlage, verwendet. Es wurden folgende Konzentrationen von NATH getestet: 0 (Kontrolle)/1/2/3/4/5/10 µM NATH. Mit der Vorrichtung nach der Erfindung gemäß den Abbil­ dungen wurde die Menge an verbrauchtem Sauerstoff nach 4- minütiger Inkubation gemessen. Die Angabe der Ergebnisse erfolgt als prozentuale Hemmung des Sauer­ stoffverbrauches in der Probe im Vergleich zu der unge­ hemmten Kontrolle.To determine the inhibition of ammonia oxidation with the Process according to the invention was Nitrosomonas eutropha MN 78, an isolate from the activated sludge of a municipal WWTP, used. The following concentrations were found tested by NATH: 0 (control) / 1/2/3/4/5/10 µM NATH. With the device according to the invention according to the fig the amount of oxygen consumed after 4- minute incubation measured. The indication of the Results are expressed as a percentage inhibition of acid substance consumption in the sample compared to the uncons inhibited control.

VersuchsdurchführungExperimental Procedure a) Kontrollmessunga) Control measurement

Das Testansatzgefäß wurde bis zum Überlauf mit substratfreiem Medium gefüllt und mit einem Rührstäbchen auf einen Magnetrührer gesetzt. Der Deckel wurde auf die Sauerstoffelektrode gesteckt und die Elek­ trode wurde anschließend luftdicht und luftblasenfrei in das Testansatzgefäß eingetaucht. Nach 2 Minuten wurden mit einer Mikroliterspritze Nitrosomonas eutropha MN 78- Zellen bis zu einer Konzentration von 6,0 × 108 Zellen/ml Testansatz zugegeben. Nach einer weiteren Minute wurde die angezeigte Sauerstoffkonzentration notiert (OK0) und sofort anschließend erfolgte die Zugabe einer Ammonium­ chlorid-Substratlösung mit einer Pipette bis zu einer Konzentration im Testansatz von 10 mM. 4 Minuten später wurde die Sauerstoffkonzentration wieder abgelesen, no­ tiert (OK4) und der Sauerstoffverbrauch in der Kontroll­ messung ermittelt (OK = OK0 - OK4).The test batch vessel was filled with substrate-free medium up to the overflow and placed on a magnetic stirrer with a stirring stick. The lid was placed on the oxygen electrode and the electrode was then immersed in the test batch vessel in an airtight and bubble-free manner. After 2 minutes, Nitrosomonas eutropha MN 78 cells were added with a microliter syringe to a concentration of 6.0 × 10 8 cells / ml of test batch. After a further minute, the indicated oxygen concentration was noted (O K0 ) and immediately followed by the addition of an ammonium chloride substrate solution with a pipette to a concentration in the test mixture of 10 mM. 4 minutes later, the oxygen concentration was read again, noted (O K4 ) and the oxygen consumption was determined in the control measurement (O K = O K0 - O K4 ).

b) Probenmessungb) Sample measurement

Das Testansatzgefäß wurde bis zum Über­ lauf mit der Probenlösung gefüllt und mit einem Rühr­ stäbchen auf einen Magnetrührer gesetzt. Der Deckel wurde auf die Sauerstoffelektrode gesteckt und die Elektrode wurde anschließend luftdicht und luftblasenfrei in das Testansatzgefäß eingetaucht. Nach 2 Minuten wurden mit einer Mikroliterspritze Nitrosomonas eutropha MN 78- Zellen bis zu einer Konzentration von 6,0 × 108 Zellen/ml Testansatz zugegeben. Nach einer weiteren Minute wurde die angezeigte Sauerstoffkonzentration notiert (OP0) und sofort anschließend erfolgte die Zugabe einer Ammonium­ chlorid-Substratlösung mit einer Pipette bis zu einer Konzentration im Testansatz von 10 mM. 4 Minuten später wurde die Sauerstoffkonzentration wieder abgelesen, no­ tiert (OP4) und der Sauerstoffverbrauch in der Proben­ messung ermittelt (OP = OP0 - OP4).The test batch vessel was filled with the sample solution up to the overflow and placed on a magnetic stirrer with a stirring stick. The lid was placed on the oxygen electrode and the electrode was then immersed in the test batch vessel in an airtight and bubble-free manner. After 2 minutes, Nitrosomonas eutropha MN 78 cells were added with a microliter syringe to a concentration of 6.0 × 10 8 cells / ml of test batch. After a further minute, the indicated oxygen concentration was noted (O P0 ) and immediately followed by the addition of an ammonium chloride substrate solution with a pipette to a concentration of 10 mM in the test mixture. 4 minutes later, the oxygen concentration was read again, noted (O P4 ) and the oxygen consumption in the sample measurement determined (O P = O P0 - O P4 ).

c) Auswertungc) evaluation Hemmung der Ammoniakoxidation (%) = [(OK - OP):OK] × 100Inhibition of ammonia oxidation (%) = [(O K - O P ): O K ] × 100

Tabelle 1 Table 1

Ergebnisse der Versuche zur Hemmung der Nitri­ fikation durch N-Allylthioharnstoff (NATH) Results of experiments to inhibit nitrification by N-allylthiourea (NATH)

Beispiel 2Example 2

Vergleichmessungen zur Bestimmung der Nitri­ toxidation zwischen dem Verfahren nach DIN EN ISO 9509 mit Belebtschlamm und dem Verfahren nach der Erfindung:
Als Testsubstanz (Probe) wurde Palegal SF, ein spezifi­ scher Hemmstoff der Nitritoxidationsstufe der Nitrifika­ tion eingesetzt.Comparative measurements to determine the nitridoxidation between the process according to DIN EN ISO 9509 with activated sludge and the process according to the invention:
Palegal SF, a specific inhibitor of the nitrite oxidation level of nitrification, was used as the test substance (sample).

Der im Rahmen des DIN-Verfahrens eingesetzte Belebt­ schlamm stammte aus der Nitrifikationsstufe einer kommu­ nalen Kläranlage. Die Aufbereitung des Schlammes und die Durchführung des Testes erfolgte gemäß den Vorschriften der DIN EN ISO 9509. Es wurden folgende Konzentrationen von Palegal SF getestet: 0 (Kontrolle)/0,5/1,0/2,0 µl/ml. Bestimmt wurde die Menge an gebildetem Nitrat nach 4- stündiger Inkubation. Die Angabe der Ergebnisse erfolgt als prozentuale Hemmung der Nitratbildung in der Probe im Vergleich zu der ungehemmten Kontrolle.The revitalized used in the DIN process sludge came from the nitrification level of a commu nal wastewater treatment plant. The treatment of the sludge and the The test was carried out in accordance with the regulations of DIN EN ISO 9509. The following concentrations were found Tested by Palegal SF: 0 (control) / 0.5 / 1.0 / 2.0 µl / ml. The amount of nitrate formed was determined after 4- hourly incubation. The results are given as a percentage inhibition of nitrate formation in the sample in Comparison to the uninhibited control.

Zur Bestimmung der Hemmung der Nitritoxidation mit dem Verfahren nach der Erfindung wurde Nitrobacter winograds­ kyi MN 118, ein Isolat aus dem Belebtschlamm einer kommu­ nalen Kläranlage, verwendet. Es wurden folgende Konzen­ trationen von Palegal SF getestet:
0 (Kontrolle)/0,025/0,075/0,1/0,2/0,5 µl/ml. Mit der Vor­ richtung nach der Erfindung gemäß den Abbildungen wurde die Menge an verbrauchtem Sauerstoff nach 4-minütiger In­ kubation gemessen. Die Angabe der Ergebnisse erfolgt als prozentuale Hemmung des Sauerstoffverbrauches in der Pro­ be im Vergleich zu der ungehemmten Kontrolle. To determine the inhibition of nitrite oxidation by the method according to the invention, Nitrobacter winograds kyi MN 118, an isolate from the activated sludge of a municipal sewage treatment plant, was used. The following concentrations of Palegal SF were tested:
0 (control) / 0.025 / 0.075 / 0.1 / 0.2 / 0.5 µl / ml. With the device according to the invention according to the figures, the amount of oxygen consumed after 4 minutes of incubation was measured. The results are given as a percentage inhibition of oxygen consumption in the sample compared to the uninhibited control.

VersuchsdurchführungExperimental Procedure a) Kontrollmessunga) Control measurement

Das Testansatzgefäß wurde bis zum Überlauf mit substratfreiem Medium gefüllt und mit einem Rührstäbchen auf einen Magnetrührer gesetzt. Der Deckel wurde auf die Sauerstoffelektrode gesteckt und die Elek­ trode wurde anschließend luftdicht und luftblasenfrei in das Testansatzgefäß eingetaucht. Nach 2 Minuten wurden mit einer Mikroliterspritze Nitrobacter winogradskyi MN 118-Zellen bis zu einer Konzentration von 6,0 × 108 Zellen/ml Testansatz zugegeben. Nach einer weiteren Minu­ te wurde die angezeigte Sauerstoffkonzentration notiert (OK0) und sofort anschließend erfolgte die Zugabe einer Natriumnitrit-Substratlösung mit einer Pipette bis zu ei­ ner Konzentration im Testansatz von 2 mM. 4 Minuten spä­ ter wurde die Sauerstoffkonzentration wieder abgelesen, notiert (OK4) und der Sauerstoffverbrauch in der Kon­ trollmessung ermittelt (OK = OK0 - OK4).The test batch vessel was filled with substrate-free medium up to the overflow and placed on a magnetic stirrer with a stirring stick. The lid was placed on the oxygen electrode and the electrode was then immersed in the test batch vessel in an airtight and bubble-free manner. After 2 minutes, Nitrobacter winogradskyi MN 118 cells were added to a concentration of 6.0 × 10 8 cells / ml of test batch using a microliter syringe. After a further minute the indicated oxygen concentration was noted (O K0 ) and immediately afterwards a sodium nitrite substrate solution was added with a pipette up to a concentration in the test mixture of 2 mM. 4 minutes later the oxygen concentration was read again, noted (O K4 ) and the oxygen consumption determined in the control measurement (O K = O K0 - O K4 ).

b) Probenmessungb) Sample measurement

Das Testansatzgefäß wurde bis zum Über­ lauf mit der Probenlösung gefüllt und mit einem Rühr­ stäbchen auf einen Magnetrührer gesetzt. Der Deckel wurde auf die Sauerstoffelektrode gesteckt und die Elektrode wurde anschließend luftdicht und luftblasenfrei in das Testansatzgefäß eingetaucht. Nach 2 Minuten wurden mit einer Mikroliterspritze Nitrobacter winogradskyi MN 118- Zellen bis zu einer Konzentration von 6,0 × 108 Zellen/ml Testansatz zugegeben. Nach einer weiteren Minute wurde die angezeigte Sauerstoffkonzentration notiert (OP0) und sofort anschließend erfolgte die Zugabe einer Natriumni­ trit-Substratlösung mit einer Pipette bis zu einer Kon­ zentration im Testansatz von 2 mM. 4 Minuten später wurde die Sauerstoffkonzentration wieder abgelesen, notiert (O P4) und der Sauerstoffverbrauch in der Probenmessung er­ mittelt (OP = OP0 - OP4).The test batch vessel was filled with the sample solution up to the overflow and placed on a magnetic stirrer with a stirring stick. The lid was placed on the oxygen electrode and the electrode was then immersed in the test batch vessel in an airtight and bubble-free manner. After 2 minutes, Nitrobacter winogradskyi MN 118 cells were added with a microliter syringe to a concentration of 6.0 × 10 8 cells / ml of test batch. After a further minute, the indicated oxygen concentration was noted (O P0 ) and immediately afterwards a sodium nitrite substrate solution was added with a pipette up to a concentration in the test mixture of 2 mM. 4 minutes later, the oxygen concentration was read again, noted (O P4 ) and the oxygen consumption in the sample measurement was determined (O P = O P0 - O P4 ).

c) Auswertungc) evaluation Hemmung der Nitritoxidation (%) = [(OK - OP) : OK) × 100Inhibition of nitrite oxidation (%) = [(O K - O P ): O K ) × 100

Tabelle 2 Table 2

Ergebnisse der Versuche zur Hemmung der Nitri­ fikation durch Palegal SF Results of attempts to inhibit nitrification by Palegal SF

Die obigen Beispiele 1 und 2 zeigen eindeutig, daß aussa­ gekräftige Ergebnisse mit den eingesetzten Reinkulturen einfach und schnell innerhalb von wenigen Minuten vorlie­ gen, während die Ergebnisse nach dem DIN-Verfahren erst nach mehreren Stunden erzielt werden können. Die einge­ setzten Reinkulturen, Nitrosomonas eutropha MN 78 und Ni­ trobacter winogradskyi MN 118, reagieren auf deutlich ge­ ringere Hemmstoffkonzentrationen als die undefinierte Mischpopulation aus dem Belebtschlamm einer kommunalen Kläranlage. Damit weist das Verfahren nach der Erfindung eine höhere Empfindlichkeit gegenüber nitrifikationshem­ menden Substanzen als das DIN-Verfahren auf. Bei den ein­ gesetzten Reinkulturen ist eine Abhängigkeit zwischen der Hemmstoffkonzentration und daraus resultierender Hemmwir­ kung deutlich gegeben. Eine solche Abhängigkeit ist aus den Ergebnissen nach dem DIN-Verfahren nur bedingt zu er­ kennen.Examples 1 and 2 above clearly show that powerful results with the pure cultures used available quickly and easily within a few minutes gene, while the results according to the DIN method can be achieved after several hours. The turned set pure cultures, Nitrosomonas eutropha MN 78 and Ni trobacter winogradskyi MN 118, react to clearly ge lower inhibitor concentrations than the undefined Mixed population from the activated sludge of a municipal Wastewater treatment plant. The method according to the invention thus has a higher sensitivity to nitrification inhibitors substances as the DIN method. With the one pure cultures is a dependency between the Inhibitor concentration and resulting inhibitor given clearly. Such a dependency is over the results according to the DIN method are only conditional know.

Claims (18)

1. Verfahren zur Bestimmung der Hemmwirkung einer Probe auf die mikrobielle Nitrifikation, gekennzeichnet durch den Einsatz einer konservierten Reinkultur ei­ nes definierten nitrifizierenden Bakterienstammes oder einer konservierten Mischkultur von definierten nitrifizierenden Bakterienstämmen als Testorganismen, wobei der oder die Bakterienstämme zu der Gruppe der Ammoniak-Oxidierer und/oder der Nitrit-Oxidierer ge­ hören, und durch eine Messung des Sauerstoffverbrau­ ches der Testorganismen in Abwesenheit und in Gegen­ wart der Probe in einem Testansatz, wobei die Messung des Sauerstoffverbrauches mit einer Vorrichtung er­ folgt, die eine Sauerstoffelektrode, ein Testansatz­ gefäß mit passendem Deckel, der mindestens eine Boh­ rung, um die Sauerstoffelektrode luftdicht im Deckel zu fixieren, und Dichtmaterial auf der Deckelunter­ seite aufweist, umfasst.1. A method for determining the inhibitory effect of a sample on microbial nitrification, characterized by the use of a conserved pure culture of a defined nitrifying bacterial strain or a preserved mixed culture of defined nitrifying bacterial strains as test organisms, the bacterial strain or strains belonging to the group of ammonia oxidizers and / or the nitrite oxidizer is heard, and by measuring the oxygen consumption of the test organisms in the absence and in the presence of the sample in a test batch, the measurement of the oxygen consumption being carried out with a device which has an oxygen electrode, a test batch with a suitable one Cover, which has at least one hole to fix the oxygen electrode in an airtight manner in the cover and has sealing material on the underside of the cover. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Bakterienstamm zu den Ammoniak- Oxidierern gehört und aus den Gattungen Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus oder Nitro­ sovibrio ausgewählt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that that at least one bacterial strain belongs to the ammonia Belongs to oxidizers and from the genera Nitrosomonas,  Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus or Nitro sovibrio is selected. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienstamm zu der Gattung Nitrosomonas und insbesondere zu der Art Nitrosomonas eutropha ge­ hört.3. The method according to claim 2, characterized in that that the bacterial strain belongs to the genus Nitrosomonas and particularly to the species Nitrosomonas eutropha ge hear. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Bakterienstamm zu den Nitrit-Oxidierern gehört und aus den Gattungen Gattungen Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus oder Nitrospira ausgewählt wird.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized characterized in that at least one bacterial strain belongs to the nitrite oxidizers and from the genera Genera Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus or Nitrospira is selected. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienstamm zu der Gattung Nitrobacter und insbesondere zu der Art Nitrobacter winogradskyi ge­ hört.5. The method according to claim 4, characterized in that the bacterial strain belongs to the genus Nitrobacter and especially to the species Nitrobacter winogradskyi ge hear. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Mischkulturen definierter Zusam­ mensetzung mit zwei oder mehr der in den Ansprüchen 2 bis 5 definierten Bakterienstämmen eingesetzt werden.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized characterized that mixed cultures defined together setting with two or more of those in claims 2 up to 5 defined bacterial strains can be used. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konservierung der konservier­ ten, nitrifizierenden Bakterienstämme in Form einer Gefriertrocknung, Flüssigtrocknung, Lufttrocknung oder in definierten Flüssigkeiten erfolgt. 7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized characterized that the preservation of the conserv nitrifying bacterial strains in the form of a Freeze drying, liquid drying, air drying or in defined liquids.   8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Ammoniak-Oxidierer in definierten Flüssigme­ dien, insbesondere in sterilem Leitungswasser, kon­ serviert werden.8. The method according to claim 7, characterized in that that the ammonia oxidizer in defined liquids dien, especially in sterile tap water, kon be served. 9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nitrit-Oxidierer in definierten Flüssigmedi­ en, insbesondere in einem Flüssigmedium mit Gefrier­ schutzpuffer bestehend aus Tris-(hydroxymethyl)- aminomethan, Saccharose und Histidin, konserviert werden.9. The method according to claim 7, characterized in that the nitrite oxidizers in defined liquid media s, especially in a liquid medium with freezer protective buffer consisting of tris (hydroxymethyl) - aminomethane, sucrose and histidine become. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Lagerung der konservierten Bakterienstämme bei Temperaturen zwischen +15°C und -70°C erfolgt.10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized characterized that the storage of the preserved Bacterial strains at temperatures between + 15 ° C and -70 ° C. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Lagerung der Ammoniak-Oxidierer bei +2°C bis +8°C und die Lagerung der Nitrit-Oxidierer bei -5°C bis -25°C erfolgt.11. The method according to claim 10, characterized in that the storage of the ammonia oxidizer at + 2 ° C to + 8 ° C and storage of the nitrite oxidizers at -5 ° C down to -25 ° C. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, ferner gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
  • a) Durchführung einer Kontrollmessung zur Bestimmung des ungehemmten Sauerstoffverbrauchs der einge­ setzten Ammoniak-Oxidierer und/oder Nitrit- Oxidierer, wobei ein substratfreies, gepuffertes Medium mit einer definierten Menge der Bakterien gemischt und anschließend die Sauerstoffkonzentra­ tion in diesem Testansatz gemessen wird, gefolgt von einer Zugabe von einer ammonium- und/oder ni­ trithaltigen Substratlösung, einer Inkubation die­ ser Mischung unter Luftabschluß und Rühren für ei­ ne definierte Zeit und einer Messung der Sauer­ stoffkonzentration nach Inkubationsende sowie der Berechnung des Sauerstoffverbrauchs;
  • b) Durchführung einer Probenmessung zur Bestimmung einer möglichen Hemmwirkung einer Probe über die Ermittlung des Sauerstoffverbrauchs der eingesetz­ ten Ammoniak-Oxidierer und/oder Nitrit-Oxidierer, wobei die Probe vorzugsweise sterilfiltriert wird, die Probe mit substratfreiem, gepuffertem Medium und mit einer definierten Menge der Bakterien ge­ mischt und anschließend die Sauerstoffkonzentrati­ on in diesem Testansatz gemessen wird, gefolgt von einer Zugabe einer ammonium- und/oder nitrithalti­ gen Substratlösung, einer Inkubation dieser Mi­ schung unter Luftabschluß und Rühren für eine de­ finierte Zeit und einer Messung der Sauerstoffkon­ zentration nach Inkubationsende sowie der Berech­ nung des Sauerstoffverbrauches;
  • c) Vergleich des Sauerstoffverbrauchs der Kontroll­ messung mit dem Sauerstoffverbrauch der Probenmes­ sung.
12. The method according to any one of claims 1 to 11, further characterized by the following steps:
  • a) Carrying out a control measurement to determine the uninhibited oxygen consumption of the ammonia oxidizer and / or nitrite oxidizer used, a substrate-free, buffered medium being mixed with a defined amount of the bacteria and then the oxygen concentration being measured in this test batch, followed by one Addition of an ammonium- and / or nitrite-containing substrate solution, an incubation of this mixture with exclusion of air and stirring for a defined time and a measurement of the oxygen concentration after the end of the incubation and the calculation of the oxygen consumption;
  • b) Carrying out a sample measurement to determine a possible inhibitory effect of a sample by determining the oxygen consumption of the ammonia oxidizers and / or nitrite oxidizers used, the sample preferably being sterile filtered, the sample using substrate-free, buffered medium and with a defined amount of Bacteria are mixed and then the oxygen concentration is measured in this test batch, followed by the addition of an ammonium- and / or nitrite-containing substrate solution, an incubation of this mixture with exclusion of air and stirring for a defined time and a measurement of the oxygen concentration after the end of the incubation and the calculation of oxygen consumption;
  • c) Comparison of the oxygen consumption of the control measurement with the oxygen consumption of the sample measurement.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der Testorganismen zwi­ schen 1,0 × 104 und 1,0 × 1014 Zellen pro ml Testan­ satz, insbesondere 6,0 × 108 Zellen pro ml Testan­ satz, beträgt.13. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized in that the amount of the test organisms between 1.0 × 10 4 and 1.0 × 10 14 cells per ml test batch, in particular 6.0 × 10 8 cells per ml Test approach, is. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Testansätze bei Raumtempera­ tur über einen bestimmten Zeitraum inkubiert werden, insbesondere für 1 bis 60 Minuten, vorzugsweise von 2 bis 10 Minuten.14. The method according to any one of claims 1 to 13, characterized characterized that the test approaches at room tempera be incubated for a certain period of time, especially for 1 to 60 minutes, preferably from 2 up to 10 minutes. 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Deckel eine zum Durchmesser der Sauerstoffelektrode passende zentrale Bohrung aufweist, mit der die Sauerstoffelektrode luftdicht im Deckel fixiert ist.15. The method according to any one of claims 1 to 14, characterized characterized in that the lid one to the diameter central hole matching the oxygen electrode with which the oxygen electrode is airtight is fixed in the lid. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Deckel ferner eine Bohrung als Injektionsboh­ rung für die Zugabe der Bakterien- und Substratlösun­ gen sowie vorzugsweise eine weitere Bohrung umfaßt, die als Überdruckventil dient.16. The method according to claim 15, characterized in that the lid also has a hole as an injection hole tion for the addition of the bacteria and substrate solution gene and preferably includes a further hole, which serves as a pressure relief valve. 17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Testansatzgefäß durchsichtig ist und ein Volumen von weniger als 100 ml, vorzugsweise ein Volumen von 5 bis 6 ml mit einem Außendurchmesser von 26 mm und einer Höhe 17 mm, aufweist. 17. The method according to claim 15 or 16, characterized indicates that the test tube is transparent and a volume of less than 100 ml, preferably a volume of 5 to 6 ml with an outer diameter of 26 mm and a height of 17 mm.   18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung als Zubehör einen Magnetrührer und Injektions-/Mikroliterspritzen um­ fasst.18. The method according to any one of claims 15 to 17, characterized characterized in that the device as an accessory Magnetic stirrers and injection / microliter syringes summarizes.
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