DD253045A1 - PROCEDURE FOR THE IMMEDIATE DETERMINATION OF BIOCHEMICAL OXYGEN NEED (BOD) - Google Patents

PROCEDURE FOR THE IMMEDIATE DETERMINATION OF BIOCHEMICAL OXYGEN NEED (BOD) Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des "Biochemischen Sauerstoffverbrauchs" (BSB) von Abwassern mittels mikrobiologischer Sensoren. Sie hat das Ziel, eine sehr schnelle Erfassung aller organischen, durch Mikroorganismen assimilierbare Substanzen zu ermoeglichen. Erfindungsgemaess wird dies durch eine Anpassung der fuer den Sensor benutzten Mikroorganismen an das jeweilige Abwasser oder Fermentationsloesung und durch die Messung der Beschleunigung der Respirationsrate nach Dosierung von Abwasserproben bzw. Fermentationsloesung als Stromstaerkeaenderung pro Zeiteinheit erreicht. Anwendungsgebiet ist die Kontrolle und Steuerung biotechnologischer Prozesse, insbesondere der Abwasserbehandlung, Fermentation und des Umweltschutzes.The invention relates to a method for determining the "Biochemical Oxygen Consumption" (BOD) of wastewater by means of microbiological sensors. Its aim is to enable very rapid detection of all organic substances that can be assimilated by microorganisms. According to the invention, this is achieved by adapting the microorganisms used for the sensor to the respective wastewater or fermentation solution and by measuring the acceleration of the respiration rate after metering of wastewater samples or fermentation solution as a current change in the per unit time. The field of application is the control and control of biotechnological processes, in particular wastewater treatment, fermentation and environmental protection.

Description

Der Vorteil des Verfahrens besteht.darin, daß für die zu untersuchenden Medien ohne Verdünnung oder andere Aufschlüsse sofort eine für die Steuerung von Bioreaktoren oder die Verhinderung von Schadwirkungen bei Havarien notwendige Bestimmung aller von Mikroorganismen assimilierbaren organischen Bestandteile, die Kinetik deren Abbaus und/oder die Beschleunigung oder Verzögerung von Beimischungen auf die Stoffwechselaktivität von Mikroorganismen sowie gleichzeitig der qualitative Nachweis des Gehaltes an spezifischen organischen Substanzen möglich wird. Neben der optimalen Einflußnähme auf die Stoffwechselprozesse bei Bioreaktoren wird eine Verringerung des Energieaufwandes durch Steuerung der Sauerstoffzufuhr z. B. in Belebungsbecken von Kläranlagen erreichtThe advantage of the method consists in the fact that for the media to be tested without dilution or other digestions immediately necessary for the control of bioreactors or the prevention of damage in case of damage determination of all microorganisms assimilable organic components, the kinetics of their degradation and / or the Acceleration or delay of admixtures on the metabolic activity of microorganisms and at the same time the qualitative detection of the content of specific organic substances is possible. In addition to the optimal influence on the metabolic processes in bioreactors, a reduction of the energy expenditure by controlling the oxygen supply z. B. achieved in aeration tanks of sewage treatment plants

Die Erfindung wird nachstehend an Beispielen erläutert: The invention is explained below by way of examples:

Ausführungsbeispieleembodiments Beispiel 1example 1

Zur BSB-Bestimmung stärkehaltiger Abwasser werden B.subtilis-Zellen eingesetzt, die in einem stärkehaltigen Medium kultiviert werden (200 ml stärkehaltiges Abwasser, 5g Casamino acids, 5g Ammoniumchlorid ad 11 0,15 M Phosphatpuffer pH 6,0). Die Zellen werden nach 18-20stündiger Kultivierung auf Rotationsschüttlern bei 3O0C zu Beginn der stationären Phase geerntet, abzentrifugiert und im Phosphatpuffer pH 6,8 resuspendiert. 500 μΙ dieser 10 mg Trockengewicht enthaltenden Suspension werden mit 500μΙ einer 10%igen Polyvinylalkohollösung gemischt und zu einer Fläche ausgestrichen. Nach Immobilisierung bei 40C wird ein Stück Folie (2 χ 2 mm2) auf die Polyäthylenmembran einer Sauerstoffelektrode plaziert und durch eine Dialysemembran meßseitig abgeschlossen. In einer gerührten, bei 3O0C temperierten Meßzelle mit 2,5 ml 0,1 mol. Phosphatpuffer pH 6,8 werden die zu untersuchenden Proben gegeben. Mittels eines Meßverstärkers wird bei -60OmV die Änderung der Stromstärke pro Zeiteinheit nach Dosierung der Probe gemessen. Diese Änderungsgeschwindigkeit wird nach Eichung des Sensors mit einer Glukose- (150 mg/l)-Glutaminsäure-Lösung (150mg/l) als Maß für den BSB genutzt. Ein 2. Sensor wurde entsprechend obiger Beschreibung präpariert, aber mit B.subtilis-Zellen, die in einem Glukose enthaltenden Medium kultiviert wurden (gleiches Medium wie oben, aber anstelle des Stärkeabwassers mit 20g Glukose). Dieser Sensor wurde direkt und nach einer 2tägigen Inkubation mit dem o. g. stärkehaltigen Medium in der Meßzelle zur BSB-Bestimmung genutzt.B.subtilis cells cultivated in a starch-containing medium (200 ml of starch-containing wastewater, 5 g casamino acids, 5 g ammonium chloride ad 11 0.15 M phosphate buffer pH 6.0) are used to determine the BOD of starch-containing wastewater. The cells are harvested after 18-20 hours of culture on rotary shakers at 3O 0 C at the beginning of the stationary phase, centrifuged off and resuspended in the phosphate buffer pH 6.8. 500 μΙ of this suspension containing 10 mg dry weight are mixed with 500 μΙ of a 10% polyvinyl alcohol solution and spread to a surface. After immobilization at 4 0 C, a piece of film (2 χ 2 mm 2 ) placed on the polyethylene membrane of an oxygen electrode and completed by a dialysis membrane meßseitig. In a stirred, tempered at 3O 0 C measuring cell with 2.5 ml of 0.1 mol. Phosphate buffer pH 6.8 are added to the samples to be examined. By means of a measuring amplifier at -60OmV the change of the current intensity per unit time is measured after dosing of the sample. This rate of change is used after calibration of the sensor with a glucose (150 mg / l) -glutamic acid solution (150 mg / l) as a measure of the BOD. A second sensor was prepared as described above, but with B.subtilis cells cultured in a glucose containing medium (same medium as above, but replacing the starch waste with 20 g of glucose). This sensor was used directly and after a 2-day incubation with the above-mentioned starchy medium in the measuring cell for BOD determination.

In Tabelle 1 sind die mit den beschriebenen Sensorvarianten ermittelten BSB-Werte von stärkehaltigem Abwasser im Vergleich zum konventionellen BSB5-TeSt zusammengestellt:Table 1 summarizes the BOD values of starchy wastewater determined with the described sensor variants in comparison with the conventional BOD 5 -TeSt:

Tabelle 1Table 1

Bestimmung des BSB (mg/l) stärkehaltiger Abwasser mit B.subtilis-SensorenDetermination of BOD (mg / l) of starch-containing wastewater using B.subtilis sensors

Abwasserprobewastewater sample BSB5 mg/lBOD 5 mg / l Stärke-An zuchtStarch on BSB-SensorBOD sensor Glukose-An zucht+ Inku bation mit StärkeAdd glucose + incubate with starch 5 500 62005 500 6200 Glukose- AnzuchtGlucose cultivation 5400 60005400 6000 Probe 1 Probe 2Sample 1 Sample 2 5300 61005300 6100 2 500 2 8002 500 2 800

Beispiel 2Example 2

Zur Bestimmung des BSB von alkoholhaltigen Abwässern werden Sensoren mit Candida boidinii, die kultiviert wurden im folgenden Medium: Pepton 0,5%, Hefeextrakt 0,5% und Glukose 1 % genutzt.To determine the BOD of alcoholic effluents, sensors with Candida boidinii which were cultivated were used in the following medium: peptone 0.5%, yeast extract 0.5% and glucose 1%.

Die Immobilisierung der Hefen und die Präparation der Sensoren sowie die Meßprocedure entsprechen der im Beispiel 1 beschriebenen Art und Weise.The immobilization of the yeasts and the preparation of the sensors and the Meßprocedure correspond to the manner described in Example 1.

Tabelle 2 gibt die mit den verschiedenen Sensortypen ermittelten BSB-Werte der untersuchten alkoholhaltigen Abwasserproben wieder.Table 2 shows the determined with the different sensor types BOD values of the investigated alcoholic wastewater samples.

Tabelle 2Table 2

Bestimmung des BSB (mg/l) alkoholhaltiger Abwasser mit Candida-boidinii-SensorenDetermination of BOD (mg / l) of alcoholic waste water using Candida boidinii sensors

Abwasserprobewastewater sample BSB5 BOD 5 Alkohol-An zuchtAlcohol to breed BSB-SensorBOD sensor Glukose-An zucht+ Inku bation mit Al koholGlucose add + incubate with alcohol 9750 88009750 8800 Glukose-An zuchtGlucose on 9300 8 5009300 8 500 1 21 2 9800 8 6009800 8 600 500 450500 450

Beispiel 3Example 3

Trichosporon culaneum-Zellen werden 36 h in einem Peptonmedium (Pepton 0,5%, Malzextrakt 0,5%, Hefeextrakt 0,5%, Glukose 1 %) kultiviert. Die Immobilisierung und die Präparation der Sensoren werden, wie im Beispiel 1 beschrieben, vorgenommen. Zur BSB-Bestimmung verschiedener Abwasser werden folgende, durch Vorinkubation modifizierte Trichosporon culaneum-Sensoren eingesetzt:Trichosporon culaneum cells are cultured for 36 hours in a peptone medium (peptone 0.5%, malt extract 0.5%, yeast extract 0.5%, glucose 1%). The immobilization and the preparation of the sensors are carried out as described in Example 1. For BOD determination of various wastewater, the following pre-incubation modified Trichosporon culaneum sensors are used:

• unbehandelt;• untreated;

• 24h mit stärkehaltigem Abwasser in der Meßzelle inkubiert;• incubated with starchy waste water in the measuring cell for 24 hours;

• 24h mit alkoholhaltigem Abwasser in der Meßzelle inkubiert.• Incubated with alcoholic waste water in the measuring cell for 24 hours.

Tabelle 3 demonstriert die mit den modifizierten BSB-Sensoren ermittelten BSB-Werte.Table 3 demonstrates the BOD values determined with the modified BOD sensors.

Tabelle 3Table 3

Bestimmung des BSB (mg/l) verschiedener Abwasser mit unterschiedlich vorbehandelten Trichosporon-culaneum-SensorenDetermination of the BOD (mg / l) of different wastewater using different pretreated Trichosporon culaneum sensors

Abwassersewage BSB6 BOD 6 unbehandeltuntreated Trichosporon-culaneum-SensorTrichosporon culaneum sensor 500 8500500,800 770 470770 470 Vorbehandlung mit Vorbehandlung stärkehaltigem mitalkoholhal- Abwasser tigern AbwasserPretreatment with pretreatment starchy mitalkohalhal- wastewater tiger wastewater stärkehaltiges Abwasser alkoholhaltiges Abwasserstarchy wastewater alcoholic wastewater 6100 86006100 8600 6200 5006200 500

Beispiel 4Example 4

Der im Beispiel 1 beschriebene Sensor mit B. subtilis wird zur Untersuchung toxischer Abwasser genutzt. Hierzu wurden Modellsysteme eingesetzt, in denen zu einer Glukose-Glutaminsäuremischung (150 mg Glukose und 150mg Glutaminsäure pro I), die international als BSB-Standard Verwendung findet, Dinitrophenol bzw. Chlormercuribenzoat addiert wurde, wonach die Verminderung der Beschleunigung der Respiration im Vergleich zur Kontrolle erfaßt wurde. Der Hemmeffekt der gewählten Inhibitoren ist aus Tabelle 4 ersichtlich.The B. subtilis sensor described in Example 1 is used to study toxic wastewater. For this purpose, model systems were used in which dinitrophenol or chlormercuribenzoate was added to a glucose-glutamic acid mixture (150 mg glucose and 150 mg glutamic acid per liter) which is used internationally as a BOD standard, after which the acceleration of the respiration was reduced compared to the control was detected. The inhibitory effect of the selected inhibitors is shown in Table 4.

Tabelle 4Table 4

Untersuchung der toxischen Wirkung von Abwassern am Beispiel eines ModellsystemsInvestigation of the toxic effects of wastewater using the example of a model system

BSB (mg/l) Hemmung (%)BOD (mg / L) inhibition (%)

Glukose-Glutaminsäure-Mischung (Kontrolle) toxisches Abwasser (Glukose-Glutaminsäure-Mischung+ Dinitrophenol (0,05 mM) 270 toxisches Abwasser (Glukose-Glutaminsäure-Mischung + Chlormercuribenzoat 0,1 mM 200 64 . _Glucose-glutamic acid mixture (control) toxic waste water (glucose-glutamic acid mixture + dinitrophenol (0.05 mM) 270 toxic wastewater (glucose-glutamic acid mixture + chloromercuribenzoate 0.1 mM 200 64. _

Claims (1)

Erfindungsanspruch:Invention claim: Verfahren zur Sofortbestimmung des „Biochemischen Sauerstoffbedarfs (BSB)" von komplex zusammengesetzten Medien mittels mikrobiologischer Sensoren durch Messung der Stromänderung pro Zeiteinheit, gekennzeichnet dadurch, daß die für den Sensor benutzten Mikroorganismen durch einmalige Inkubation des gesamten Sensors in dem zu untersuchenden Medium adaptiert werden, dieser für wiederholte Bestimmung des Wertes der ersten Ableitung der Funktion der Respirationskurve durch die Messung der Beschleunigung der Respirationsrate als Stromänderung pro Zeiteinheit in einem Zeitraum von weniger als 2 min nach Dosierung des zu untersuchenden Mediums eingesetzt und der vollständige BSB-Wert und/oder gleichzeitig der qualitative Nachweis des Gehaltes an spezifischen organischen Substraten und/oder die Hemmwirkung von Beimischungen auf die Stoffwechselaktivität von Mikroorganismen durch Vergleich mit Eichkurven ermittelt werden.Method for the immediate determination of the "Biochemical oxygen demand (BOD)" of complex composed media by microbiological sensors by measuring the change in current per unit time, characterized in that the microorganisms used for the sensor are adapted by a single incubation of the entire sensor in the medium to be examined, this for repeated determination of the value of the first derivative of the function of the respiration curve by the measurement of the acceleration of the respiration rate as a change in current per unit time in a period of less than 2 min after dosing of the medium to be examined and the full BOD value and / or at the same time the qualitative Detection of the content of specific organic substrates and / or the inhibitory effect of admixtures on the metabolic activity of microorganisms can be determined by comparison with calibration curves. Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kurzzeitbestimmung des BSB und der Respirationsrate von Mikroorganismen, zur Bestimmung der Summenkonzentration biologisch abbaubarer organischer Substanzen sowie zur Ermittlung des Gehaltes von spezifischen organischen Inhaltsstoffen von Stoffgemischen in wäßriger Phase und zur Ermittlung der Hemmwirkung von Beimischungen auf die Stoffwechselaktivität von Mikroorganismen. Anwendungsgebiet ist die Kontrolle und Steuerung biotechnologischer Prozesse, insbesondere der Abwasserbehandlung, Fermentation und des Umweltschutzes.The invention relates to a method for the short-term determination of the BOD and the respiration rate of microorganisms, for determining the cumulative concentration of biodegradable organic substances and for determining the content of specific organic ingredients of mixtures in the aqueous phase and for determining the inhibitory effect of admixtures on the metabolic activity of microorganisms. The field of application is the control and control of biotechnological processes, in particular wastewater treatment, fermentation and environmental protection. Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions Der „Biochemische Sauerstoffbedarf" (BSB; engl. BOD = biochemical oxygen demand) ist einer der meist benutzten Teste zur Kontrolle der Abwasserqualität und gibt die für den Abbau organischen Materials durch Mikroorganismen verbrauchte Sauerstoffmenge an.Biochemical oxygen demand (BOD) is one of the most commonly used tests to control effluent quality and indicates the amount of oxygen consumed by microorganisms for degradation of organic matter. Der konventionelle Test benötigt einen Zeitaufwand von 5 Tagen (BSB5) und ist damit für eine Kontrolle und Steuerung von Abwasserreinigungsprozessen nicht geeignet. Der Einsatz von Biosensoren, die eine Kombination von fixierten Mikroorganismen mit einer Sauerstoffelektrode darstellen, brachte einen wesentlichen Fortschritt in der BSB-Bestimmung (GB 1586291). Die Bestimmungszeit liegt zwischen 5-20 min.The conventional test takes 5 days to complete (BOD 5 ), making it unsuitable for controlling and controlling wastewater treatment processes. The use of biosensors representing a combination of fixed microorganisms with an oxygen electrode has brought about a significant advance in BSB determination (GB 1586291). The determination time is between 5-20 min. Geeignet für einen mikrobiologischen BSB-Sensor sind alle Mikroorganismen, die organisches Material unter Sauerstoffverbrauch abbauen. Die für den BSB-Sensor ausgewählten Mikroorganismen werden in der üblichen Weise kultiviert und nach Immobilisierung zur Präparation des Sensors eingesetzt.Suitable microorganisms for a microbial sensor are all microorganisms that degrade organic material under oxygen consumption. The microorganisms selected for the BOD sensor are cultivated in the usual way and used after immobilization for the preparation of the sensor. Die Wirksamkeit und Genauigkeit des Sensors hängt von der Potenz der eingesetzten Mikroorganismen ab, die im Abwasser vorhandenen organischen Verbindungen oxydativ abzubauen. Im Allgemeinen nutzen aber Mikroorganismen nur die Substrate, die sie unbedingt zur Aufrechterhaltung des Metabolismus benötigen. Die Voraussetzungen hierfür werden in der Anzucht der Zellen gelegt. Die bisher entwickelten mikrobiologischen Sensoren zur BSB-Bestimmung berücksichtigen diesen Aspekt nicht, d. h. es werden die für den Sensor eingesetzten Mikroorganismen in Grundmedien, die Peptone, Glukose und einige Salze enthalten, angezogen. Die mit diesen Mikroorganismen präparierten Sensoren reagieren im wesentlichen nur auf die während der Anzucht vorhandenen Substrate. Andere werden nicht oder kaum angezeigt, da die entsprechenden Transport- und Abbausysteme fehlen. Es können also nicht alle im Abwasser enthaltenen organischen Substrate erfaßt werden. Voraussetzung für eine hohe Genauigkeit des BSB-Sensors ist aber die Erfassung aller organischen Bestandteile des Abwassers, die biologisch abgebaut werden können.The effectiveness and accuracy of the sensor depends on the potency of the microorganisms used to oxidatively degrade the organic compounds present in the wastewater. In general, however, microorganisms only use the substrates they absolutely need to maintain their metabolism. The prerequisites for this are laid in the cultivation of the cells. The previously developed microbiological sensors for BOD determination do not take this aspect into consideration, i. H. The microorganisms used for the sensor are attracted to base media containing peptones, glucose and some salts. The sensors prepared with these microorganisms react essentially only on the substrates present during cultivation. Others are not or hardly displayed because the appropriate transport and dismantling systems are missing. Thus, not all organic substrates contained in the wastewater can be detected. However, a prerequisite for a high accuracy of the BOD sensor is the detection of all organic components of the wastewater, which can be biodegraded. Ziel der ErfindungObject of the invention Die Erfindung hat das Ziel, biotechnologische Prozesse durch kurzfristige Bestimmung des biochemischen Sauerstoffbedarfs und der Respirationsrate von Mikroorganismen effektiver zu gestalten, Elektroenergie zum Sauerstoffeintrag einzusparen und die Wirkung toxischer Stoffe in Havariefällen zu begrenzen.The aim of the invention is to make biotechnological processes more effective by short-term determination of the biochemical oxygen demand and the respiration rate of microorganisms, to save electrical energy for oxygen input and to limit the effect of toxic substances in case of emergency. Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, mittels eines mikrobiologischen Sensors den vollständigen biochemischen Sauerstoffbedarf für unterschiedliche, komplex zusammengesetzte wäßrige Medien, wie z. B. verschiedene Abwässer oder Fermentationslösungen, in einer Zeitspanne von weniger als 2 min durch die Messung der Beschleunigung der Respirationsrate zu bestimmen, den qualitativen Nachweis des Gehaltes an spezifischen organischen Substraten zu ermöglichen sowie die Hemmwirkung von Beimischungen auf die Stoffwechselaktivität von Mikroorganismen zu ermitteln. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß ein mikrobiologischer Sensor mit dem jeweils zu bestimmenden Medium 1-2 Tage inkubiert wird. Die damit erreichte Adaption der Mikroorganismen führt dazu, daß die für die Aufnahme der organischen Bestandteile des wäßrigen Mediums notwendigen Transportsysteme und die für den oxydativen Abbau der zu untersuchenden Substrate benötigten Enzymgarnituren optimal ausgeprägt werden. In Verbindung mit einer schonenden Immobilisierung der Mikroorganismen wird dadurch die Voraussetzung für eine hohe Reaktivität des mikrobiologischen Sensors für das adaptierte Medium geschaffen, wodurch es möglich wird, diesen für wiederholte Bestimmung des Wertes der ersten Ableitung der Funktion der Respirationskurve durch die Messung der Beschleunigung der Respirationsrate nach Dosierung des zu bestimmenden Mediums als Stromänderung pro Zeiteinheit anzuwenden und damit sofort eine Meßgröße für den vollständigen BSB zu erhalten und/oder gleichzeitig durch Vergleich mit Eichkurven den qualitativen Nachweis des Gehaltes an spezifischen organischen Substraten und/oder die Hemmwirkung von Beimischungen auf die Stoffwechselaktivität von Mikroorganismen zu ermitteln.The object of the invention is, by means of a microbiological sensor, the complete biochemical oxygen demand for different, complex composite aqueous media, such as. B. different wastewater or fermentation solutions to be determined in a period of less than 2 min by measuring the acceleration of the respiration rate, to allow the qualitative detection of the content of specific organic substrates and to determine the inhibitory effect of admixtures on the metabolic activity of microorganisms. According to the invention the object is achieved in that a microbiological sensor is incubated with the respective medium to be determined for 1-2 days. The adaptation of the microorganisms achieved in this way means that the necessary for the absorption of the organic components of the aqueous medium transport systems and the required for the oxidative degradation of the substrates to be examined enzyme sets are optimally developed. In conjunction with gentle immobilization of the microorganisms, this creates the prerequisite for a high reactivity of the microbiological sensor for the adapted medium, which makes it possible for it to repeatedly determine the value of the first derivative of the function of the respiration curve by measuring the acceleration of the respiration rate apply after metering of the medium to be determined as a current change per unit time and thus immediately obtain a measure for the complete BOD and / or simultaneously by comparing with calibration curves the qualitative detection of the content of specific organic substrates and / or the inhibitory effect of admixtures on the metabolic activity of To detect microorganisms.
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