DE1815862B2

DE1815862B2 - Verfahren zur gewinnung einer schwach alkalischen protease von aspergillus melleus

Info

Publication number: DE1815862B2
Application number: DE19681815862
Authority: DE
Inventors: Mamoru.Konan; Ito Manzo Aichi; Takagi Osamu Gifu; Kato Seiko Aichi; Sugiura (Japan)
Original assignee: Amano-Seiyaku KJC., Nagoya, Aichi (Japan)
Priority date: 1968-12-19
Filing date: 1968-12-19
Publication date: 1976-09-30
Also published as: DE1815862A1

Description

Zur Reinigung von Enzymen sind bereits verschiedene Verfahren, wie das Aussalzen, die Dialyse, die Adsorption, die Chromatografie, die Elektrophorese, die Gel-Filtration und die Ausfällung mit einem Lösungsmittel oder einem spezifischen Reagens, sowie Kombinationen dieser Maßnahmen bekannt.

Diese Reinigungsverfahren bereiten jedoch große Schwierigkeiten, wenn man sie im technischen Maßstab durchführen will. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die gerannter. Verfahren aufwendig sind, die Ausbeute der Protease verringern und lange Betriebszeiten erfordern. So wird ein typisches Verfahren zur Kristallisierung einer schwach alkalischen Protease nach dem Dialyseverfahren folgendermaßen durchgeführt:

Die Taka-Diastase, die ein Stoffwechselprodukt von Aspergillus oryzae darstellt, wird zur Ausfällung der Verunreinigungen mit einer 1O°/oigen Calciumacetatlösung behandelt. Daran schließt sich eine weitere stufenweise Behandlung mit Aceton, Ammomiumsulfat und eine Dialyse an. Am Schluß wird das vorgereinigte Produkt zur Entfernung weiterer Verunreinigungen, wie unerwünschter Protease und Amylase, mit einer 2%igen Acrinol- (oder 2-Äthoxy-6,9-diamino-acridinlaktat)-lösung behandelt.

Ein anderes bekanntes Dialyseverfahren zur Kristallisierung einer schwach alkalischen Protease geht folgendermaßen vonstatten:

Die Taka-Diastase wird mit einer Bleiacetatlösung behandelt und hierauf mit Ammoniumsulfat ausgesalzt. Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung des Ammoniumsulfats dialysiert, worauf die Verunreinigungen mit Acrinol ausgefällt werden. Hierauf schließt sich eine Adsorptionsreinigung mit Stärke in 40%igem Alkohol zur Entfernung weiterer Verunreinigungen an, worauf die Protease mit Alkohol und Aceton ausgefällt wird.

Zur Reinigung und Kristallisierung verschiedener Enzymarten wurde auch schon die Adsorption dieser Enzyme an anorganischen Adsorbentien, wie Bentonit, Kaolin, saurem Ton und Aktivkohle, vorgeschlagen. Hierzu wurden Tone eingesetzt, deren Hauptkomponente Aluminiumsilikat ist und deren Acidität und Adsorptionsfähigkeit für die Proteinsubstanz entsprechend variiert wurde. Diese Tone können die Enzyme im sauren Zustand adsorbieren und setzen sie im neutralen oder schwach basischen Zustand wieder freu Die Reinigung kann chargenweise unter Verwendung der pulverförmigen Adsorbentien durchgeführt werden. Es wurde auch schon ein Calciumphosphatgel als anorganisches Absorbens eingesetzt, doch besitzt es keine selektive Adsorptionsfähigkeit für das Enzym und ist daher nicht wirksam.

Es wurde auch schon vorgeschlagen, Protease durch Adsorption der Protease auf einem organischen Adsorbens, wie einem Ionenaustauscher, insbesondere einem Kationenaustauscher, zu reinigen. So wird zur Reinigung und Kristallisierung der durch Züchten der Stämme Aspergillus sojae gebildeten alkalischen Protease Kationenaustauscher verwendet. Ein Beispiel hierfür ist ein Copolymeres aus Methacrylsäure und Divinylbenzol. Dieses Reinigungsverfahren ist jedoch nicht großtechnisch durchführbar, da es aufwendig ist, große Pufferlösungen benötigt und den Durchsatz großer Mengen der rohen Protease nicht gestattet.

In der DT-AS 10 36192 wird ein Verfahren zur Entfärbung von verunreinigter Taka-Diastase-Lösung beschrieben, wobei eine Reinigung der in der Diastase enthaltenen Protease erzielt wird. Bei diesem bekannten Verfahren wird die Lösung über eine Säule mit dem Anionenaustausch^ Duolite A-2 in der Acetatform geleitet. Bei Verwendung eines solchen Anionenaustauschers ist zwar eine Entfärbung erzielbar, doch ist die Auskristallisation des angestrebten Enzyms nur mit geringerer Geschwindigkeit erzielbar so daß dieses Verfahren für die technische Herstellung nicht anwendbar ist. Durch Zugabe eines geeigneten organischen Lösungsmittels kann nur eine geringe Vergrößerung der Kristallkaiir ^geschwindigkeit erzielt werden.

Weiterhin wird bei dem bekannten Verfahren der DT-AS 10 36 192 keine Protease verwendet, die durch Züchten von Aspergillus melleus-Stämmen hergestellt worden ist.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, eine durch Züchten von Aspergillus melleus-Stämmen hergestellte, rohe, schwach alkalische Protease in der Weise zu reinigen, daß eine Aktivitätserhöhung stattfindet, und daß das Enzym im kristallinen Zustand erhalten werden kann.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Gegenstand der Erfindung ist der im Anspruch definierte Gegenstand.

Diese Anionenaustauscher-Harze in der Acetatform können die schwach alkalische Protease nicht absorbieren. Vielmehr werden an ihnen die in dem rohen Enzym vorliegenden Verunreinigungen absorbiert. Aus der Lösung der gereinigten Protease von Aspergillus meileus kann dann die schwach alkalische Protease kristallisiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren bringt verschiedene Vorteile mit sich. So kann die kristallisierte, schwach alkalische Protease im großen Maßstab hergestellt werden. Die Aktivität der erhaltenen Protease wird nicht verringert. Weiterhin können auch andere Verunreinigungen als diejenigen, die durch die übliche Lösungsmittelbehandlung entfernt werden können, sowie weitere Enzyme, sowie die alkalische Phosphatase, die saure Protease usw., herausgereinigt werden. Schließlich kann auf die Anwendung technischer Verfahren, wie des Aussalzens, der Dialyse, der Absorption der Chromatografie und der Ausfällung mit Acrinol, die bei der herkömmlichen Kristallisation der Enzyme unerläßliche Verfahrensschritte darstellen, verzichtet werden.

Die Erfindung wird in dem Beispiel erläutert Herstellung der rohen Enzyme

Die in der Tabelle I angegebenen Stämme wurden in 4 kg eines Weizenkleie-Mediums, das 50 % Wasser enthielt, inkubiert Die einzelnen Stämme wurden 5 Tage bei 25° C kultiviert Die erhaltene fermentierte Kleie wurde mit Wasser im Gegenstrom ausgewaschen, bis ein Extrakt von 0,81 erhalten wurde. Nach Einstellen des pH-Wertes des Extraktes auf 8,5 durch Zugabe von pulverisiertem gelöschten Kalk, wurde kaltes Äthanol (-10° C) zu dem Extrakt in der gleichen Volumenmenge zugesetzt, wodurch ein Niederschlag gebildet wurde. Der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt Der resultierende Extrakt wurde mit kalt2m Äthanol in der zweifachen Volumenmenge des Extraktes vermischt, wodurch ein Niederschlag erhalten wurde. Dieser Niederschlag wurde von der Mutterlauge abgetrennt und im Vakuum zu einem rohen Enzymprodukt getrocknet.

Beispiel
und Vergleichsbeispiel (nachgereicht)

Reinigung der rohen Enzyme und deren Kristallisation

5 g der auf diese Weise erhaltenen rohen Enzyme wurden in 100 ml gereinigtem Wasser aufgelöst, wodurch die entsprechenden Lösungen des rohen Enzyms erhalten wurden. Die rohen Enzymlösungen wurden durch eine 100-ml-Säule geleitet, welche ein Anionenaustauscher-Harz gemäß der Erfinclungsdefir.ition in der Acetatform enthielt. Das Durchleiten der Enzymlösung erfolgte mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/min. Sodann wurde gereinigtes Wasser durch die Säule geleitet und es wurde ein Eluat mit einer Protease-Aktivität in einer Menge von 200 ml erhalten. Dieses Eluat wurde jeweils mit 600 ml kaltem Äthanol vermischt, wodurch ein Enzymniederschlag erhalten wurde. Der Enzymniederschlag wurde abzentrifugiert und das abgetrennte Enzym wurde in 50 ml gereinigtem Wasser zu einer wäßrigen Enzymlösung aufgelöst In identischer Weise wurde sodann mit Aceton eine Kristallisation der Proteasen aus diesen Lösungen versucht Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt

Daraus wird ersichtlich, daß nur 3 Stämme, nämlich

Aspergillus melleus Amano Nr. 35, -ATCC 1032 und

-ATCC 16889 eine alkalische Protease bilden können,

ίο die kristallisierbar war. Die anderen rohen Enzyme

können zwar — wie aus der Tabelle ersichtlich wird —

gereinigt und hinsichtlich ihrer spezifischen Aktivität

erhöht werden, doch können sie nicht wie die 3

alkalischen Proteasen der 3 Aspergillus melleus-Stäm-

• 5 me kristallisiert werden.

Die Aktivität der alkalischen Protease wurde nach der Anson-Hagihara-Methode bestimmt; hierzu wurde im Einzelnen so vorgegangen:

1 ml der Enzymlösung, deren Aktivität bestimmt wero ι sollte, wurde zu 5 ml einer 0,1 m Na₂HPO₄-KH₂PO₄-Pufferlösung (pH = 8,0) gegeben, welche 0,6% Casein (Merck nach Hammarsten) enthielt. Das Enzym wurde 10 Minuten bei 37° C inkubiert. Die resultierende Lösung wurde mit 5 ml einer Lösung ²S vermischt, Jie Trichloressigsäure in einer Konzentration von 0,11 Mol, Natriumacetat in einer Konzentration von 0,22 Mol und Essigsäure in einer Konzentration von 0,33 Mol enthielt, um das nicht umgesetzte Casein zu koagulieren. Sodann wurde die Lösung filtriert, 2 ml des erhaltenen Filtrats wurden zu 5 ml einer Lösung gegeben, welche Natriumcarbonat in einer Konzentration von 0,55 Mol enthielt Hierzu wurde 1 ml Folin-Reagens, das zuvor mit Wasser auf das dreifache Volumen verdünnt worden war, zugegeben und das resultierende Gemisch wurde 30 Minuten auf 37° C erhitzt Sodann wurde die Adsorption des resultierenden Gemisches bei einer Wellenlänge von 660 ιημ bestimmt Die Enzymmenge, die zur Bildung von 10 μg Tyrosin je Minute erforderlich ist, wird als eine Proteaseeinheit(l PE) bezeichnet.

Tabelle

Stamm

Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus

melleus Amano Nr. 35

melleus ATCC 1032

melleus ATCC 16889

oryzae IAM 2686

oryzae var microsporus IAM 2750

oryzae var magnasporus IAM 2660

aureus var aeidus IAM 2281

aureus var brevis IAM 2396

awamori IAM 2299

awamori var minimus IAM 2349

candidus IAM 2015

chevalerie IAM 2001

deflectus IAM 2010

fisheri IAM 2033

flavus IAM 2007

fumigatus IAM 2004

PE/g Kleie	: Aktivität des	Menge Kristallisation	.. .	Aktivität des
	rohen Enzyms	des rohen	41 + Nadeln	kristallinen
		Enzyms	21 + Nadeln	Enzyms
	(PE/g Roh	(8)	22 + Nadeln	(PE/g)
	produkt)	21
9800	144 500	18	225 000
2100	81600	20	225 000
2450	95 200	25	225 000
768	27 200	23
382	12 300	25
269	9 800	21
91	3000	22
106	2940	19
30	800	21
83	2810	18
366	11540	18
400	13 800	18
394	12610
256	7 320
419	14 360
382	14 187

¹I

Fortsetzung

Stamm

Aspergillus giganteus IAM 2047 Aspergillus inui IAM 2255 Aspergillus nidulans IAM 2067 Aspergillus niger IAM 2020 Aspergillus sojae IAM 2631 Aspergillus tamarii IAM 2137

⁵Eg Kleie	Aktivität des	Menge Kristallisation	Aktivität des
	rohen Enzyms	des rohen	kristallinen
		Enzyms	Enzyms
	(PE/g Roh	(g>	(PE/g)
	produkt)
189	6 143	22
141	5 089	18
289	9 134	21
113	3 341	22
Γ)	6 579	21
264	8 500	18

Das Zeichen + bedeutet, daß die rohen Enzyme kristallisiert werden konnten. Das Zeichen - bedeutet, daß die rohen Enzyme nicht kristallisiert werden konnten.

Die Aktivität (PE/g) der kristallinen Enzyme wurde nach der »Anson-Hagihara-Methode« bestimmt.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Gewinnung einer schwach alkalischen Protease, die durch Züchten eines Aspergillus meileus in einem flüssigen oder festen Medium s hergestellt worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man die Protease durch Leiten einer wäßrigen Lösung der rohen Protease durch einen tertiäre Amingruppen enthaltenden Anionenaustauscher, der dadurch erhalten worden ist, daß man durch Umsetzung eines Copolymeren von Styrol und Vinylbenzol mit einem chlorierten Methyläther einen Methylenchloridrest in das Copolymere eingeführt und dieses Reaktionsprodukt mit einem sekundären Amin umgesetzt hat, und der in der Acetatform vorliegt, Ausfällen der Protease aus dem Eluat mit einem Lösungsmittel und anschließendes Umkristallisieren der ausgefällten Protease aus ihrer Lösung reinigt.

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