DE1806625A1

DE1806625A1 - Process for the production of chymotrypsin B

Info

Publication number: DE1806625A1
Application number: DE19681806625
Authority: DE
Inventors: Jean Boige
Original assignee: OPOCHIMIE IMMEUBLE IND L HERCU
Current assignee: OPOCHIMIE IMMEUBLE IND L HERCU
Priority date: 1967-11-03
Filing date: 1968-11-02
Publication date: 1969-12-11
Also published as: GB1223763A; BE722896A; IE32447L; FR1552038A; IE32447B1; DK122818B; NL6815600A; CH491967A

Description

Immeuble Industriel l'Hercule
rue de 1·IndustrieImmeuble Industriel l'Hercule
rue de 1 · Industry

MONACOMONACO

Our reference: 0 505

Verfahren zur Herstellung von Chymotrypsin BProcess for the production of chymotrypsin B

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Chymotrypsin B genannten Enzyms.The invention relates to a method for producing the enzyme called chymotrypsin B.

In der Bauchspeicheldrüse finden sich verschiedene niohtaktivierte eiweißartige Enzyme, sum Beispiel dit Chyaotrypsinogene Alpha und B. Ausgehend von diesen Sneymvorstufen konnte man je nach den angewendeten Aktivierungen methoden Chymotrypsin Alpha, Beta, Gamma oder Delta und das Chymotrypsin B erzeugen. Laakowaki und Mac Carthy haben als erste und am vollständigsten das Chymotrypsinogen B und das Chymotrypsin B untersucht. 1949 haben diese Forscher die elektrophoretischen Beweglichkeiten dieser Enzyme bestimmt. Sie fanden einen ieoelektrischen pH-Wert ( oder isoelektrischen Punkt) von 5>2 für die Vorstufe und von 4,7 für das aktive Enzym. 1951 stellten sie mit Smith und Brown die ersten Zonstanten des Chymotrypsinogens B genau fest.Various non-activated ones can be found in the pancreas Protein-like enzymes, for example chyaotrypsinogens Alpha and B. Based on these Sneym precursors Depending on the activations used, one could use methods Chymotrypsin Alpha, Beta, Gamma or Delta and produce the chymotrypsin B. Laakowaki and Mac Carthy studied chymotrypsinogen B and chymotrypsin B as the first and most completely. 1949 did this Researchers determined the electrophoretic mobilities of these enzymes. They found an electrical pH (or isoelectric point) of 5> 2 for the precursor and 4.7 for the active enzyme. In 1951 they took part Smith and Brown the first chymotrypsinogen zonstants B exactly fixed.

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Verschiedene Autoren haben anschliessend diese Stoffe untersucht, zum Beispiel Hirs, der die Existenz von zwei Chymotrypsinogenen in der Bauchspeicheldrüse von Ochsen bestätigt hat, oder kürzlich Greene und Charles vom Laboratorium des Professors Desnuelle in Marseille. Schliesslich hat Fräulein Guy aus dem gleichen Laboratorium am 18.Oktober 1966 eine These veröffentlicht, welche Klarheit über die tatsächlichen Kenntnisse bezügl. dieser Frage verschafft. Diese These enthält insbesondere eine Studie der Aüsfällungskurven der in einem Schwefelsäureextrakt von Pankreas enthaltenen ejjzymati sehen Proteine mit Ammoniumaulfat. Die Ausfällungskurven des Chymotrypsinogens Alpha, des Trypsins und des Chymotrypsinogens B zeigen, dass die Niederschläge, welche die gleichzeitig an allen diesen drei Proteinen reichsten sind, mit Ammoniumsulfatmengen nahe dem Sättigungsgrad 0,5 des flüssigen Extrakts erhalten werden und dass bei diesem Viert der Gehalt an Chymotrypslnogen B maximal ist.Various authors then investigated these substances, for example hirs, who discovered the existence of confirmed two chymotrypsinogens in ox pancreas, or recently Greene and Charles from the laboratory of Professor Desnuelle in Marseille. After all, Miss Guy has from the same laboratory published a thesis on October 18, 1966, which clarity about the actual knowledge regarding this question provides. This thesis contains in particular a study of the precipitation curves of the in a sulfuric acid extract of pancreas contained ejjzymati see proteins with ammonium sulfate. The precipitation curves of the chymotrypsinogen alpha, trypsin and the chymotrypsinogen B show that the precipitates that occur simultaneously on all of these three Proteins are richest, with ammonium sulfate levels close at hand the saturation level 0.5 of the liquid extract obtained and that in this fourth the content of chymotrypsinogen B is maximal.

Die bekannten verschiedenen Chymotrypaine aeigen praktisch das gleiche Verhalten auf den synthetischen Substraten; das Chymotrypsin B unterscheidet sich jedoch von den anderen Chymotrypsinen Alpha, Beta, Gamma und Delta deutlich durch seine Konstitution» was Unterschiede in den jeweiligen physikalischen Eigenschaften bedingt.The well-known different Chymotrypaine aeigen practically the same behavior on the synthetic Substrates; however, the chymotrypsin B differs from the other chymotrypsins alpha, beta, gamma and Delta clearly through its constitution »which causes differences in the respective physical properties.

Der isoelektrische Punkt von Chymotrypsin Alpha, Beta, Gamma und Delta liegt über 8. Hingegen ist dieser Wert bei Chymotrypsin B niedriger und liegt nach Mteraturangaben zwischen 4,7 und 5,2.The isoelectric point of chymotrypsin alpha, beta, gamma and delta is above 8. This value is, however lower for chymotrypsin B and according to the Matura data between 4.7 and 5.2.

Ebenso sind die optischen Faktoren, das heisst die Absorption im Spektrophotometer, verschieden. Nach ProfessorThe same applies to the optical factors, i.e. the absorption in the spectrophotometer, different. According to professor

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Desnuelle beträgt die Absorption einer Lösung von 100 Gamma/ccm Chymotrypein Alpha im auf 280 Millimikron eingestellten Spektrophotometer 215, während eine Lösung von Chymotrypsin B mit der gleichen Konzentration eine Absorption von 180 zeigt.Desnuelle is the absorption of a solution of 100 gamma / ccm Chymotrypein Alpha im to 280 millimicrons set spectrophotometer 215 while a solution of chymotrypsin B at the same concentration shows an absorbance of 180.

Diese Eigenschaftsunterschiede, insbesondere der Wert des isoelektrischen Punkts, welcher für die Verwendung der Enzyme von grundlegender Wichtigkeit ist, zeigen, dass die Herstellung des Chymotrypsin B von Interesse ist.These differences in properties, in particular the value of the isoelectric point, which is of fundamental importance for the use of the enzymes, show that the production of chymotrypsin B is of interest.

Dieses letztere Enzym ist ebenso wie seine Vorstufe im Forschungslaboratorium stecken geblieben. Andererseits haben die durchgeführten Versuche zu kleinen Mengen dieser Stoffe geführt., welche getrennt nach mehrfachen Reinigungsoperationen und in sehr geringen Ausbeuten erhalten wurden.This latter enzyme, like its precursor, got stuck in the research laboratory. on the other hand the experiments carried out have led to small amounts of these substances, which are separated after multiple cleaning operations and were obtained in very low yields.

Die vorliege!..:^? Erfindung ermöglicht nun die Herstellung · von Chymotrypsin V in verhältnismässig großen Mengen und mit verbesserter Ausbeute.The present! ..: ^? The invention now enables the production of chymotrypsin V in relatively large quantities and with an improved yield.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Erzielung von Chymotrypsin B, welches die fraktionierte Ausfällung bekannter Proteine in der breiförmigen Pankreasmischung, gefolgt von einer AufIosung des endgültigen Filterkuchens in kaltem V/asser im Hinblick auf seine spätere Aktivierung umfasst, kennzeichnet sich dadurch, dass die den endgültigen Filterkuchen darstellende Proteinmischung etwa 20$ des Gesamtbetrags der ausfällbaren Proteine in dem wässrigen Extrakt ausmacht, welcher der letzten Ausfällung unterworfen wird.The inventive method for obtaining chymotrypsin B, which the fractional precipitation known proteins in the pulpy pancreas mixture, followed by a dissolution of the final filter cake in cold water with a view to its subsequent activation, is characterized by the fact that the final Protein mixture representing filter cake about $ 20 of the total amount of precipitable proteins in the constitutes aqueous extract, which is subjected to the final precipitation.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird als According to a preferred embodiment, as

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Pällungs- oder Ausflockungsmittel das chemisch reine Ammoniumsulfat des Handels verwendet. The chemically pure ammonium sulphate commercially available is used as a coagulant or flocculant.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die breiartige Pankreasmischung nacheinander zwei . fraktionierten Ausfällungen unterworfen. Die erste Ausfällung ermöglicht die Entfernung von Proteinen mit sehr hohem Molekulargewicht und von Verunreinigungen. Die zweite Ausfällung ergibt die Extraktion einer rohen Proteinmischung, die besonders reich an Chymotrypsinogen B ist, und ausgehend von welcher dann anschliessend in wässriger lösung die Aktivierung erfolgt.According to a preferred embodiment of the invention the mushy pancreas mixture becomes two in a row . subjected to fractional precipitation. The first precipitation allows the removal of proteins with very high molecular weight and impurities. The second precipitation gives the extraction of a crude Protein mixture that is particularly rich in chymotrypsinogen B, and based on which then subsequently in aqueous solution the activation takes place.

Diese Ausfällüngen, die mittels Ammoniumsulfat in verschiedenen Konzentrationen erfolgen, ermöglichen eine Unterteilung der ausgefällten Proteine in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht . Eine solche Unterteilung wird durch die Beschaffenheit des jeweiligen Pankreas beeinflusst. Nach langwierigen Versuchen hat man jedoch festgestellt, dass man etwa 20$ der ausfällbaren Proteine des schon durch eine erste Ausfällung gereinigten wässrigen Extrakts ausfällen muss, um eine das höchstmögliche Maximum an Chymotrypsinogen.B enthaltende rohe Fraktion zu erhalten. Dieses Resultat wird erzielt, wenn das Ammoniumsulfat in Mengen zugesetzt wird, welche einem Sättigungsgrad des Extrakts zwischen etwa 0,4 und 0,5 entsprechen.These precipitates, which are produced by means of ammonium sulfate in various Concentrations made allow a subdivision of the precipitated proteins depending on their molecular weight. Such a subdivision is influenced by the nature of the respective pancreas. However, after lengthy experimentation, it has been found that you can get about $ 20 of the precipitable proteins of the aqueous extract, which has already been purified by a first precipitation, has to precipitate in order to achieve the highest possible Obtain the maximum crude fraction containing chymotrypsinogen.B. This result is achieved when that Ammonium sulfate is added in amounts which have a degree of saturation of the extract between about 0.4 and 0.5 correspond.

Nach der Aktivierung wird die rohe Lösung von Proteinen, welche verschiedene Enzyme und insbesondere das Chymotrypsin B enthält, das aus seiner Vorstufe, dem Chymotrypsinogen B gebildet wurde, chromatographiert. Das Chymotrypsin BAfter activation, the raw solution of proteins, which contains various enzymes and in particular chymotrypsin B, which was formed from its precursor, chymotrypsinogen B, is chromatographed. The chymotrypsin B

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wird dann aus der Säule mit einer väeirigen Hatriumoitrat lösung in Anwesenheit einer kleinen Menge Natriumchlorid eluiert.is then removed from the column with a acidic sodium nitrate solution in the presence of a small amount of sodium chloride eluted.

Naohetehend werden die beBonderen Binitlheiten einer ersten Aueführungeform der Erfindung aueführlicher be-In the same way, the particular binaryities become one first embodiment of the invention more detailed

1) Bauchspeicheldrüsen (inabesondere von Ochsen), die in einem kalten Raum gelagert oder gefroren waren, werden in einer 0,25 η Schwefelsäurelösung bei einer !Temperatur zwischen 0 und 5° 0 eingeweicht und anschließend gemahlen. Die so gemahlenen Drüsen werden dann unter Rühren mit etwa dem zweifachen ihres Volumens an 0,25 η Schwefelsäurelösung gemischt; die Temperatur wird zwischen 0 und 5° G gehalten. .1) pancreas (in particular from ox), the stored in a cold room or frozen, in a 0.25 η sulfuric acid solution at a ! Soaked in a temperature between 0 and 5 ° 0 and then ground. The glands thus ground are then mixed with about twice its volume of 0.25 η sulfuric acid solution with stirring; the temperature will held between 0 and 5 ° G. .

2) Man stellt dann einen wässrigen Extrakt her, indem2) An aqueous extract is then prepared by

man die vorhergehende Mischung eine Stunde durohrührt, j worauf man, immer unter Rühren langsam, pulverförmiges Ammoniumsulfat bis zu einer Menge von etwa 0,2 S zugibt ( S bezeichnet die Sulfatmenge, welche die Schwefelsäure- f.< lösung lösen kann); es sind dies etwa 100 bis 120 g dieses' ; Salsee px|j Liter Flüssigkeit} alsdann wird die wässrige - .; Mischung filtert? De,r Niederschlag wird verworfen . i und der 31üssigkeiteextrakt wird auf der gleichen Temperatur, nämlich ewisehen Q und 5° O, gehalten. !the previous mixture is stirred for one hour, after which, while stirring slowly, powdered ammonium sulphate is added up to an amount of about 0.2 S (S denotes the amount of sulphate which the sulfuric acid solution can dissolve); this is about 100 to 120 g of this'; Salsee px | j liter of liquid} then the watery -.; Mixture filters? The precipitate is discarded. i and the liquid extract are kept at the same temperature, namely white and 5 ° O. !

Der Zusatz von Ammonlum8ulfat in einer Menge bie iu 0,2 S bewirkt die Ausflockung der Protein« mit sehr hohem Molekulargewicht und der daran gebundenen unreinigungen.The addition of ammonium sulfate in an amount equal to 0.2 S causes the flocculation of the protein «with a lot high molecular weight and the impurities attached to it.

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I8Q06I5 II8Q06I5 I.

3) Dem vorstehend erhaltenen Plüeslgkeittextrakt \ gibt man eint zusätzlicheAmmoniumeulfatmenge zu, um etwa 20^ der Proteine auaaufallen, liaoh einer Durohrührung läset man die Miachnng 4 bit 6 Stunden bei + 5⁰C ruhen, worauf man filtriert. Die aufgefangene Flüssigkeit wird bei niedriger Temperatur-für andere Verwendungs- ' zwecke, die nicht in den Rahmen der Erfindung fallen, gelagert.3) The Plüeslgkeittextrakt \ obtained above are one to one zusätzlicheAmmoniumeulfatmenge to about 20 ^ auaaufallen the proteins liaoh a Durohrührung läset to the Miachnng 4 bit 6 hours at + 5 ⁰ C to rest, after which it is filtered. The collected liquid is stored at a low temperature for other uses which do not fall within the scope of the invention.

Sie zusätzliche Ammoniumsulfatmenge wird zweokmässig im Laboratorium an einer Probe des nach, der ersten Ausfällung erhaltenen Flüssigkeitsextrakts bestimmt· An dieser vorher abgetrennten Probe führt man getrennt zwei Ausfällungen mit Ammoniumsulfat durch, die eine beim Sättigungsgrad 0,8 S, die andere beim Sättigungsgrad 0,4 S.. Die nach der Filtration erhaltenen Kuchen werden getrennt wieder in wässrige Lösung gegeben und ihre Gesamtproteinkonzentration wird im Spektrophotometer geraessen, zum Beispiel im Spektrophotometer SB, welcher vorher für die Wellenlänge von 282 Millimikron auf 0 eingestellt wurde. Sie Ablesungen der Resultate ermöglichen, ausgehend von der Gesamtmenge an ausfällbaren Proteinen bei 0,8 3 die Bestimmung der zur Ausfällung 4er Traktion von 20# erforderliohen Ammoniumsulfatmenge. ^The additional amount of ammonium sulfate is twofold in the Laboratory on a sample of the after, the first precipitation obtained liquid extract determined · on this beforehand separated sample, two precipitations with ammonium sulphate are carried out separately, one with a degree of saturation 0.8 S, the other at a saturation level of 0.4 S .. The cakes obtained after filtration are separated again into aqueous ones Solution given and its total protein concentration is in the spectrophotometer, for example in the spectrophotometer SB, which was previously set to 0 for the wavelength of 282 millimicrons. You readings of the results allow, based on the total amount of precipitable proteins at 0.8 3, the determination of the precipitate 4th traction of 20 # required amount of ammonium sulfate. ^

Der nach der Filtration des durch die zusätzliche Ammoniumeulfatmenge behandelten Extrakts erhaltene Filter- ; kuchen wird in kaltem Wasser gelöst. Die so erhaltene · Lösung wird filtriert, dann zur Entfernung des darin enthaltenen Ammoniumsulfate dialy eiert,The filter obtained after filtration of the extract treated by the additional amount of ammonium sulfate; cake is dissolved in cold water. The thus obtained Solution is filtered, then to remove what is contained in it Ammonium sulfate dialyzed,

4) In diesem Stadium wird die gereinigte Lösung des Filterkuchens durch Zugabe von Natriumhydroxyd auf einen4) At this stage, the purified solution of the filter cake is added to a

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pH-Wert von 7,6 gebraoht, worauf man zur ""cfclvierung eine Trypsinmenge von etwa 1/40 der durt apektrophotometerablesung bestimmte!Menge an in der LOs^: ,j; fmthaltenen Proteinen zusetzt. Zweckmässig lässt man dann 24 Stunden "bei 0° ruhen.pH value of 7.6 brewed, whereupon "" cfclvierung an amount of trypsin about 1/40 of the durt apektrophotometer reading certain! amount of in the LOs ^:, j; retained proteins clogs. It is then expedient to let it rest for 24 hours at 0 °.

Die in der Lösung enthaltenen verschiedenen ,Vorstufen sind dann aktiviert und ergeben eine Mischung von Trypsin, Chymotrypsin Alpha und hauptsächlich von Chymotrypsin B.The various precursors contained in the solution are then activated and result in a mixture of trypsin, chymotrypsin alpha and mainly chymotrypsin B.

5) Der pH-Wert der aktivierten Lösung wird durch Zugabe von Zitronensäure auf 3,9 gebracht; dann wird diese Lösung in einer mit Carboxymethylcellulose gefüllten Chromatographiersäule adsorbiert; die Carboxymethylcellulose war ausgehend von Whatman-Cellulose nach der Methode von Professor Desnuelle hergestellt worden.5) The pH of the activated solution is brought to 3.9 by adding citric acid; then this will Solution in a filled with carboxymethyl cellulose Adsorbed chromatography column; the carboxymethyl cellulose was method based on Whatman cellulose made by Professor Desnuelle.

Das Gewicht der Carboxymethylcellulose beträgt zweckmässig das 6 bis 7-fache des Gewichts der insgesamt einzuführenden Proteine.The weight of the carboxymethyl cellulose is expediently 6 to 7 times the weight of the total to be introduced Proteins.

Die Säule wird mit einer 0,05 molaren, auf einen pH-Wert von 3,8 eingestellten Matriumcitratlösung zur Entfernung der inaktiven Proteine und der abgebauten Proteine gewaschen. Diese Waschung wird zweckmässig so lange durchgeführt, bis der Ablauf keine Proteine mehr enthält. Vorsichtshalber wird die spezifische Aktivität der enzymatischen Proteine des Abflusses gemessen: Diese : gegen Acetyl-L-tyrosin-aethylester titrierte Aktivität zeigt, dass das gesamte aktivierte Produkt offensichtlich in der Säule geblieben ist.The column is adjusted to a 0.05 molar pH of 3.8 adjusted sodium citrate solution for removal washed the inactive proteins and the degraded proteins. This washing is expediently carried out for as long as until the process runs out of proteins. As a precaution, the specific activity of the enzymatic proteins of the runoff measured: These: Activity titrated against acetyl L-tyrosine ethyl ester shows that all of the activated product apparently remained in the column.

Die Abtrennung des Chymotrypsins B von den anderen inThe separation of the chymotrypsin B from the others in

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der Säule gebliebenen ,Enzymen erfolgt dann duroh eine Eluierung mit einer auf einen pH-Wert von 4,85 eingestellten ' Lösung, die 0,05 molar an Natriumeitrat und 0,05 molar anThe enzymes remaining on the column are then eluted with a solution which has been adjusted to a pH of 4.85 and which contains 0.05 molar sodium citrate and 0.05 molar

• Natriumchlorid ist.• Is sodium chloride.

• 6) Das Chymotrypsin B wird aus dem Eluat durch Zusatz von Ammonumsulfat ausgefällt und dann abfiltriert. Der erhaltene Filterkuchen wird in dem 11/2-fachen Volumen j^ Schwefelsäurelösung gelöst, dialyslert und dann lyophili-• 6) The chymotrypsin B is made from the eluate by adding Precipitated ammonium sulfate and then filtered off. The received Filter cake is in 11/2 times the volume j ^ Sulfuric acid solution dissolved, dialyzed and then lyophilized

f siert. - f sated. -

Die praktische Anwendung der vorstehenden Verfahrensregeln wird durch die nachstehenden nicht beschränkenden Zahlenbeispiele erläutert.The practical application of the above procedural rules is illustrated by the following non-limiting numerical examples explained.

example 1

100 kg gefrorene Bauchspeicheldrüsen von Ochsen werden in eine 0,25 η wässrige Schwefelsäurelösung mit 0° C eingebracht. Nach dem Einweichen werden die Drüsen zerkleinert.100 kg of frozen pancreas of steers are introduced into a 0.25 η aqueous sulfuric acid solution of 0 ° C. After soaking, the glands are crushed.

Dem erhaltenen Zerkleinerungsgut gibt man 200 1 einer geeisten Lösung von 0,25 η Schwefelsäure zu. Die Mischung wird eine Stunde durchgerührt, worauf man sie unter ständigem Rühren zur Vermeidung von Spitzenausfällungen langsam mit 36 kg pulverförmiger! Ammoniumsulfat vermischt. Diese Mischung wird dann in die Filterpresse gegeben.200 liters of one are added to the material to be comminuted iced solution of 0.25 η sulfuric acid. The mixture is stirred for an hour, after which it is under constant stirring to avoid tip precipitation slowly with 36 kg powdery! Ammonium sulfate mixed. This mixture is then placed in the filter press.

Die Filterpresse und die darin zurückgehaltenen unlös-* liehen Teile werden mit 25 Liter 0,25 η geeister Schwefelsäurelösung durchgespült, welche dem vorher erhaltenen Filtrat zugesetzt werden. Man erhält so 260 Liter einerThe filter press and the insoluble * Borrowed parts are with 25 liters of 0.25 η iced sulfuric acid solution flushed through, which are added to the filtrate obtained previously. You get 260 liters of one

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SA0SA0

klaren. Löaung, die auf einer Temperatur zwischen O und 5° C ge
-worfen.clear up. Solution which is at a temperature between 0 and 5 ° C
-thrown.

5° C gehalten wird. Die unlöalichen Anteile werden ver-5 ° C is maintained. The unholy shares are sold

Dieser Lösung von 260 Litern gi"bt man langsam und unter Rühren 46,8 kg pulverförmigea Ammoniumsulfat zu, worauf raari 4 Stunden bei + 5⁰O ruhen läaat. Die Ammoniumaulfatmenge war vorher durch Laboratoriumaverauche beatimmt worden. Nach der erforderlichen Zeit filtriert man im Vakuum durch einen Büchnertrichter.To this solution of 260 liters is added slowly and with stirring 46.8 kg of powdered ammonium sulfate, whereupon it is left to rest for 4 hours at + 5 ⁰ O. The amount of ammonium sulfate had previously been controlled by laboratory smoke. After the required time, it is filtered in vacuo through a Büchner funnel.

Das Filtrat wird für andere Verarbeitungszwecke beiseite gestellt. Der auf dem Filter erhaltene Kuchen wird in etwa dem 2-fachen Volumen kaltem Wasser, d.h. in etwa zwei Liter in Lösung gebracht. Das Gewicht der in dieser Lösung enthaltenen Proteine wird spektrophotometrisch bestimmt: Gefundenes Gewicht: 150 g. Dann wird das durch den Filterkuchen eingebrachte Ammoniumsulfat durch 48-Btündige Dialyse der Lösung entfernt.The filtrate is set aside for other processing purposes posed. The cake obtained on the filter becomes about 2 times the volume of cold water, i.e. about two liters brought into solution. The weight of this The proteins contained in the solution are determined spectrophotometrically: Weight found: 150 g. Then that will Ammonium sulfate introduced through the filter cake was removed by dialysis of the solution for 48 hours.

Zur Aktivierung wird der pH-Wert der so gereinigten Lösung auf 7,6 gebracht und man gibt 3 g Trypsin zu.. Die Aktivierung erfolgt während 24 Stunden bei 0° C, worauf die enzymatische Aktivität der Lösung gegen Aoetyl-L-tyrosinaethylester titriert wird. Man findet eine auf die Proteine bezogene spezifische Aktivität von 180.The pH value of the solution purified in this way is used for activation brought to 7.6 and 3 g of trypsin are added .. Activation takes place for 24 hours at 0 ° C, followed by the enzymatic activity of the solution against aoetyl-L-tyrosine ethyl ester is titrated. A protein-related specific activity of 180 is found.

Darauf wird die Lösung, deren pH-Wert durch Zugabe von Zitronensäure auf 3,9 gebracht wurde, langsam durch eine Carboxymethylcellulosesäule gegeben, welche etwa die zur Zurückhaltung der Proteine erforderliche Menge enthält,The solution is then adjusted to its pH value by adding Citric acid was brought to 3.9, slowly passed through a column of carboxymethyl cellulose, which is approximately the same as that used for Retention of proteins contains the required amount,

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SADSAD

Die Säule wird mit einer 10,5 g Natriumeitrat (0,05 molar) enthaltenden Pufferlösung mit einem pH-Wert von 3,8 gewaschen» Diese Waschung wird abgebrochen, sobald praktisch keine Proteine mehr austreten. Die spezifische Aktivität der aufgefangenen Waschwässer wird kontrolliert: Man erhält mit Acetyl-L-tyrosin-aethylester eine Aktivität unter 30; daa bedeutet, dass praktisch das gesamte aktivierte Produkt in der Säule adsorbiert geblieben ist.The column is filled with a 10.5 g sodium citrate (0.05 molar) containing buffer solution with a pH value of 3.8 washed »This washing is stopped as soon as practical no more proteins leak out. The specific activity of the collected washing water is checked: Acetyl L-tyrosine ethyl ester gives activity under 30; daa means that practically all of the activated product has remained adsorbed in the column.

Die Eluierung des in der Säule adsorbierten Chymotrypeins B erfolgt mittels einer Natriumeitrat und Natriumchlorid in gleicher Konzentration, d.h. 0,05 molar, enthaltenden Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,8. Diese Eluierung wird abgebrochen, wenn praktisch keine Proteine mehr aus~ treten. Das in den Eluaten aufgefangene Chymotrypsin B wird quantitativ bestimmt: Man findet 60 g und seine spezifische Aktivität auf Acetyl-L-tyrosin-aethylester beträgt 300. ■The elution of the chymotrypin adsorbed in the column B takes place by means of a sodium citrate and sodium chloride in the same concentration, i.e. 0.05 molar Buffer solution with a pH of 4.8. This elution is stopped when there are practically no proteins left ~ step. The chymotrypsin B caught in the eluates is determined quantitatively: one finds 60 g and its specific activity on acetyl-L-tyrosine-ethyl ester is 300. ■

Das in den Eluaten enthaltene Chymotrypsin B wird durch Zugabe von 23,1 g Ammoniumsulfat auf 100 ecm lösung ausgefällt. Man filtriert, und bringt die Ausfällung in dem li/2~fachen Volumen j^q Schwefelsäurelösung in Lösung. Dann dialysiert man 48 Stunden zur Entfernung des Ammoniumsulfats, filtriert zur Abtrennung der mit ausgefällten restlichen Verunreinigungen und entwässert dann die Endlösung durch Lyophilisierung. (Gefriertrocknung)The chymotrypsin B contained in the eluates is through Addition of 23.1 g of ammonium sulfate to 100 ecm solution precipitated. It is filtered and the precipitate is dissolved in one half the volume of sulfuric acid solution. Then dialyze for 48 hours to remove the ammonium sulfate, filtered to separate the remaining impurities which have precipitated out and then dehydrated the Final solution by lyophilization. (Freeze drying)

Schliesslich erhält man 25 g pulverförmiges Chymotrypsin B, mit einer spezifischen Aktivität von 390 gegenüber Acety-L-tyrosin-aethyleater und einem durch Elektrophorese bestimmten isoelektrischen Punkt bei einem pH-Wert von etwa 5.Finally, 25 g of chymotrypsin B in powder form are obtained, with a specific activity of 390 against acetyl-L-tyrosine-ethyl ether and an isoelectric point at a pH of about 5 as determined by electrophoresis.

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^B*D ORIGINAL ^B * D ORIGINAL

Die vorstehend beschriebene Methode ist gegenüber den - bekannten Iaboratoriumsmethoden vorteilhaft vereinfacht, indem die Aktivierung in einer rohen enzymatisehen Mischung und die Abtrennung des Chyraotrypsins B durch eine einzige Chromatographie erfolgen. Diese erfindungsgemässe Methode bedingt eine gute Ausbeute.The method described above is advantageously simplified compared to the known laboratory methods, in that the activation takes place in a crude enzymatic mixture and the separation of the chyraotrypsin B by a single chromatography. This method according to the invention requires a good yield.

Das Chymotrypsin B besitzt die gleichen enzymatisehen Eigenschaften wie die anderen Chymotrypsine; insbesondere kann es die aromatischen Bindungen hydrolysieren. Infolge seines anderen isoelektrischen Punktes kann das Chymotrypsin B jedoch in einem Milieu wirksam werden, in welchem die anderen Chymotrypsine inaktiv sind; infolgedessen kann es zur technischen Herstellung bestimmter chemischer Produkte dienen.Chymotrypsin B has the same enzymatic properties Properties like the other chymotrypsins; in particular, it can hydrolyze the aromatic bonds. As a result At its other isoelectric point, however, chymotrypsin B can act in a milieu in which the other chymotrypsins are inactive; as a result, it can be used for the technical manufacture of certain chemical products to serve.

Die Fällung des· Pankreasextrakts mit Ammoniumsulfat bei einer Konzentration von 0,4 bis 0,5 S nach der vorstehend beschriebenen Methode nimmt das gesamte Chymotrypsinogen B mit, jedoch ausserdem noch etwa 20$ des in der Ausgangslösung befindlichen Chymotrypsinogens A. Zur Erhöhung der Reinheit des Ghymotrypsinogens B kann zweckmässig die folgende Methode angewandt werden: Man führt eine erste Ausfällung bei 0,5 S durch, durch welche etwas mehr als 20$ der Proteine ( 25 bis 30 % etwa) unlöslich werden. Der erhaltene Filterkuchen wird erneut in zwei Volumina kaltem Wasser gelöst und bei 0,4 - 0,5 S wieder gefällt, was die erneute Ausfällung des gesamten Chymotrypsinogens B ermöglicht und den Hauptteil des in dem ersten Filterkuchen enthaltenen Chymotrypsinogens A in Lösung lässt. Die Reinheit des Chymotrypsinogens B wird somit durch diese Ausführungsform des erfindungegemässen Verfahrens wesentlich verbessert.The precipitation of the pancreatic extract with ammonium sulfate at a concentration of 0.4 to 0.5 S by the method described above takes all of the chymotrypsinogen B with it, but also about 20% of the chymotrypsinogen A in the starting solution Ghymotrypsinogens B can expediently be used the following method: A first precipitation is carried out at 0.5 S, as a result of which a little more than 20 % of the proteins (25 to 30% approximately) become insoluble. The filter cake obtained is redissolved in two volumes of cold water and reprecipitated at 0.4-0.5 S, which enables the reprecipitation of all of the chymotrypsinogen B and leaves most of the chymotrypsinogen A contained in the first filter cake in solution. The purity of the chymotrypsinogen B is thus significantly improved by this embodiment of the method according to the invention.

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Example 2 ''

Wie bei dem vorhergehenden Beispiel wird das aus 100 kg tiefgefrorener Ochsen-Bauchspeicheldrüsen erhaltene zerkleinerte Produkt in 200 1 geeister 0,25 η Schwefelsäurelösung aufgenommen. Nach einstündigem Rühren gibt man 36 kg pulverförmiges Ammoniumsuliat zu und rührt bis zur vollständigen Auflösung des Salzes. Diese Mischung wird in die Filterpresse gegeben. Man erhält 260 1 einer klären Lösung, die auf 0 bis 5° 0 gehalten wird* Biese Lösung versetzt man langsam und unter Rühren mit 55 kg pulverförmigen Ammoniumsulfat, worauf man 4 Stunden bei 5° 0 ruhen lässt. Man filtriert durch einen Büchnertrichter, und nimmt den Filterkuchen in 2 Volumina kaltem Wasser, d.h. in etwa 2,5 Liter auf. Bas Gewicht der in dieser Lösung enthaltenen Proteine wird spektrophotometrisch bestimmt: Gefundenes Gewicht 220 g. Bann gibt man unter Rühren 700 g Ammoniumsulfat zu (280 g/l)· Man lässt die Ausfällung 4 Stunden vor sich gehen, worauf man den Niederschlag im Vakuum abfiltriert. Er wird In. 2 Tolumlna kaltem Wasser ( 2 Liter) gelöst, worauf man die Proteine spektrophotometrisch bestimmt: Gefundenes Göwlcht 150 g.As in the previous example, this becomes 100 kg crushed product obtained from frozen ox pancreas in 200 liters of iced 0.25 η sulfuric acid solution recorded. After stirring for one hour, 36 kg of pulverulent ammonium sulate are added and the mixture is stirred until it is complete Dissolution of the salt. This mixture is placed in the filter press. You get 260 1 clear Solution that is kept at 0 to 5 ° 0 * This solution are added slowly and with stirring with 55 kg of powdery Ammonium sulfate, whereupon it is left to rest at 5 ° 0 for 4 hours. It is filtered through a Buchner funnel, and absorbs the filter cake in 2 volumes of cold water, i.e. in about 2.5 liters. Bas weight of the in this solution contained proteins is determined spectrophotometrically: Weight found 220 g. Bans are given while stirring 700 g of ammonium sulphate to (280 g / l) · The precipitation is allowed to proceed for 4 hours, after which the precipitate is formed filtered off in vacuo. He will be in. 2 Tolumlna dissolved in cold water (2 liters), whereupon the proteins are determined spectrophotometrically: Göwlcht found 150 g.

Die Lösung wird dann wie in dem vorhergehenden Beispiel behandelt, d.h. sie wird aktiviert¹ und man lässt sie durch die Ohromatographiesäule laufen- SchliesslicJi er- I hält man nach Lyophilisierung 28 g Chymotrypsin B mit einer spezifischen Aktivität von 400 auf Acetyl-L-^tyrosiniaethylester. Durch Elektrophorese ermittelt mam, dass offenbar ein wesentlicher Anteil seinen isoelektrischen Punkt bei einem pH-Wert von etwa 5 besitzt»The solution is then treated as in the previous example, it means ¹ is activated and allowed by the Ohromatographiesäule ongoing SchliesslicJi ER- I tyrosiniaethylester is maintained after lyophilization 28 g chymotrypsin with a specific activity of 400 to acetyl-L- ^ . By electrophoresis, mam determined that a significant proportion apparently has its isoelectric point at a pH of about 5 »

PatentansprüchefClaims

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Claims

Claims. .

1. Process for the production of chymotrypsin B, wherein in a pulpy pancreatic mixture, fractional protein precipitation followed by dissolution of the final filter cake to be carried out in cold water for activation, characterized in that that a protein mixture forming the final filter cake is used which is about 20 # that in that of the The aqueous extract subjected to the last precipitation contains a total of precipitable proteins contained.

2. The method according to claim 1, characterized in that chemically pure ammonium sulfate is used as a precipitant.

3. The method according to claim 2, characterized in that the amount of ammonium sulfate added to the extract eiriem The degree of saturation of the extract corresponds to between approximately 0.4 and 0.5.

4. The method according to claim 1, characterized in that the aqueous solution of the filter cake from raw, precipitated Proteins dialyzed to remove ammonium sulfate and then activated by adding trypsin -

will.

5. The method according to claim 4ι characterized in that the added amount of trypsin about one fortieth of that

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corresponds to precipitated amounts of protein.

6. The method according to claim 4, characterized in that the chymotrypsin B contained in the activated solution of the other enzymes and proteins by chromatography on a single one with carboxymethyl cellulose filled column is separated.

7t method according to claim 6, characterized in that the activated solution by adding citric acid before its adsorption in the column to a pH of 3.9 is set.

8, the method according to claim 6, characterized in that the chromatography column then with a a pH of 3.8 adjusted 0.05 molar sodium citrate solution is washed out.

9 »The method according to claim 6, characterized in that the chymotrypsin B with an 0.05 molar sodium citrate solution is eluted in the presence of sodium chloride, "whereby the ρΉ value of the solution is adjusted to 4.35.

10, the method according to claim 1, characterized in that after precipitation of the protein cake by adding aramonium sulfate, this cake by adding cold Water is brought into solution again and then precipitated again with ammonium sulfate.

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