DE2154556C3 - Process for the preparation of crystalline kallidinogenase (kallikrein) components A and B and medicaments containing one of these components - Google Patents
Process for the preparation of crystalline kallidinogenase (kallikrein) components A and B and medicaments containing one of these componentsInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von kristallinen (Kallikrein)-Komponenten A und B und Arzneimitteln mit einem Gehalt an einer dieser Komponenten.The present invention relates to a process for the production of crystalline (kallikrein) components A and B and medicinal products containing one of these components.
Bei Einwirkung auf körpereigenes Kininogen setzt Kallikrein die kreislaufwirksamen Kinine frei. KaIIikrein-Präparate werden daher zur Therapie verschiedener Durchblutungsstörungen therapeutisch verwendet (E. K. Frey, H. Kraut, E. Werle, Das Kalükrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, F. Enke, Stuttgart 1968, S. 15Of.).When it acts on the body's own kininogen, kallikrein releases the circulatory kinins. Kalikrein preparations are therefore used therapeutically for the therapy of various circulatory disorders (E. K. Frey, H. Kraut, E. Werle, The Kalükrein-Kinin-System and its inhibitors, F. Enke, Stuttgart 1968, p. 150f.).
Bisher verwendete man dazu teilweise gereinigte Präparate des Kailikrein aus Pankreas, Submaxillaris oder Harn.So far, partially purified preparations of Kailikrein from the pancreas, submaxillaris have been used for this purpose or urine.
Es ist bereits bekanntgeworden, daß man Präparate des Kallikrein aus Pankreas, Submaxillaris oder Harn gewinnen kann.It has already become known that preparations of kallikrein can be obtained from the pancreas, submaxillary or urine can win.
Zur Gewinnung von teilweise gereinigtem Kallikrein sind verschiedene Verfahren bekanntgeworden, ζ. B. können nach DE-PS 890857 kallikreinhaltige Drüsen in wäßriger Suspension bei Temperaturen zwischen 38 und 65° C thermolysiert und die kallikreinhaltigen wäßrigen Phasen von unlöslichen Anteilen abgetrennt werden. Zur Gewinnung von teilweise gereinigtem Kallikrein können auch nach DE-PS 910580 Harn sowie Autolysate von Pankreas oder Submaxillaris mit wäßrigen Lösungen von Bleioder Zinksalzen gefällt, die Fällungen abgetrennt in Phosphatpufferlösungen, vornehmlich in Diamoniumhydrogenphosphat-Lösungen, gelöst, die Lösungen dialysiert, die Dialysate konzentriert und der Wirkstoff aus den Konzentraten mit organischen Lösungsmitteln, z. B. mit Äthanol oder Aceton, gefällt werden. Die noch unreinen Kallikrein-Präparate können z. B. nach DE-PS 1102973 so weiter gereinigt werden, daß Kallikrein bei pH-Werten von 3 bis 10, vornehmlich bei pH 6,0 bis 7,5, an basisch substituierte Zellulose adsorbiert wird, die basisch substituierten Zellulosen abgetrennt und unwirksame Begleitstoffe mit einer stark verdünnten Pufferlösung ausgewaschen werden. Der Wirkstoff kann von den basisch substituierten Zellulosen mit 1- bis 5%igen Elektrolyt-Lösungen desorbiert werden. Es werden Präparate mit ungefähr 50 bis 100 KE/mg Protein (KE = Kallikrein-Einheit; Bestimmung der KaIIikrein-Einheit durch Messung der BlutdrucKsenkung am Hund [E. Frey, H. Kraut, E. Werle, Das KaIIikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, F. Enke Verlag, Stuttgart 1968, S. H]) erhalten. Noch sehr unreine Kallikrein-Präparate können auch nach DE-PS 1124187 zur weiteren Reinigung einer Elektrodialyse unter Verwendung von Austauschermembranen unterworfen werden. Es werden so Präparate mit 50 KE/mg gewonnen. So gereinigte Kallikrein-Präparate eignen sich nur bedingt zur parenteralen Anwendung. Einmal kann der Gehalt an Fremdproteinen zur immunologischen Sensibilisierung und bei mehrmaliger Anwendung dann zum lebensgefährlichen anaphylaktischen Schock führen. Zum anderen war es mit den bisherigen Reinigungsverfahren schwierig, Präparate zu erhalten, die ausreichend frei von pyrogenen Stoffen waren. Es war auch nicht möglich, Pyrogene durch Filtration durch Klär- und Steril-Filterschichten zu entfernen, da Kallikrein von diesen Materialien in hohem Maße selbst adsorbiert wird.Various processes have become known for obtaining partially purified kallikrein, ζ. B. can according to DE-PS 890857 kallikreinhaltige glands in aqueous suspension at temperatures thermolysed between 38 and 65 ° C and those containing kallikrein aqueous phases are separated from insoluble components. For the extraction of partially Purified kallikrein can also be used according to DE-PS 910580 urine and autolysates of pancreas or the submaxillary is precipitated with aqueous solutions of lead or zinc salts, the precipitates separated in Phosphate buffer solutions, primarily dissolved in diamonium hydrogen phosphate solutions, the solutions dialyzed, the dialysates concentrated and the active ingredient from the concentrates with organic solvents, z. B. with ethanol or acetone, are precipitated. The still impure kallikrein preparations can z. B. according to DE-PS 1102973 so further cleaned that kallikrein at pH values of 3 to 10, mainly at pH 6.0 to 7.5, is adsorbed on base-substituted cellulose which is base-substituted Separated celluloses and ineffective accompanying substances with a very diluted buffer solution be washed out. The active ingredient can be from the basic substituted celluloses with 1 to 5% strength Electrolyte solutions are desorbed. The result is preparations with approximately 50 to 100 KE / mg protein (KE = kallikrein unit; determination of the kallikrein unit by measuring the reduction in blood pressure on the dog [E. Frey, H. Kraut, E. Werle, The Kalikrein-Kinin-System and its Inhibitors, F. Enke Verlag, Stuttgart 1968, S. H]) received. Kallikrein preparations that are still very impure can also be used according to DE-PS 1124187 for further cleaning of an electrodialysis using exchange membranes. So there are preparations with 50 KE / mg gained. Kallikrein preparations cleaned in this way are only conditionally suitable for parenteral use. Once, the content of foreign proteins can lead to immunological sensitization and when repeated several times Use then lead to life-threatening anaphylactic shock. For another, it was With the previous cleaning methods, it was difficult to obtain preparations that were sufficiently free of pyrogens Fabrics were. It was also not possible to remove pyrogens by filtering them through clear and sterile filter sheets as kallikrein is highly self-adsorbed by these materials.
Es ist weiterhin bereits bekanntgeworden, daß man kleinere Mengen von hochgereinigtem Kallikrein nach verschiedenen Verfahren gewinnen kann. Nach H. Fritz et al. (Hoppe Syler's Z. Physiol. Chem. 348, 1120 bis 1134 [1967]) erhält man ein Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 1516 KE/mg Protein, indem man ein nach DE-PS 910580 vorgereinigtes Produkt 1- bis 3mal an Hydroxylapatit-Zellulose Chromatographien. Es ist dabei jedoch erforderlich, die optimale Konzentration des Elutionspuffers für jede Kallikrein-Probe und jede neue Charge der Hydroxylapatit-Zellulose in Vorversuchen neu zu bestimmen. Diese Methode ist deshalb verfahrenstechnisch nicht realisierbar.It has also become known that smaller amounts of highly purified kallikrein can be used can win by various methods. According to H. Fritz et al. (Hoppe Syler's Z. Physiol. Chem. 348, 1120 to 1134 [1967]) one obtains a preparation with a specific activity of 1516 KE / mg protein, by placing a product pre-purified according to DE-PS 910580 1 to 3 times on hydroxylapatite cellulose Chromatographies. However, it is necessary to find the optimal concentration of the elution buffer for every kallikrein sample and every new batch of hydroxyapatite cellulose to be redefined in preliminary tests. This method is therefore not process-technically feasible.
Nach einem anderen Vorschlag (H. Moriya et al., Biochem. Pheramcol. 18, 549 bis 552 [1968]) erhält man elektrophoretisch reines Kallikrein in 6 bis 9°Λ Ausbeute, ausgehend von autolysiertem Pankreasbrei durch aufeinanderfolgende Anwendung von Diäthylamir.oäthylgruppenhaltiger Zellulose, Fällung mit 2-Äthoxy-6,9-diaminoacridinium-lactat, Extraktion des Niederschlages mit Ammoniumsulfatlösung, Fällung mit Aceton, Chromatographie an Hydroxylapatit und Chromatographie an quervernetztem PoIydextrangel mit einem Ausschlußvolumen für Molekulargewichte größer als 150000. Auch dieses Verfahren ist wegen der geringen Ausbeute und der Vielzahl der Schritte technisch unbrauchbar.According to another proposal (H. Moriya et al., Biochem. Pheramcol. 18, 549 to 552 [1968]), electrophoretically pure kallikrein is obtained in 6 to 9% yield, starting from autolyzed pancreatic pulp by successive application of diethylamine, ethyl group-containing cellulose , Precipitation with 2-ethoxy-6,9-diaminoacridinium lactate, extraction of the precipitate with ammonium sulfate solution, precipitation with acetone, chromatography on hydroxylapatite and chromatography on cross-linked polydextrangel with an exclusion volume for molecular weights greater than 150,000. This process is also because of the low yield and the multitude of steps technically useless.
Nach diesem Verfahren im Laboratoriums-Maßstab gewonnenes Kallikrein ist ein Gemisch von zwei Isoenzymen. Durch Elektrophorese oder durch Chromatographie an Anionenaustauschern läßt sich Kallikrein in zwei Komponenten, Kallikrein-Komponente A und Kallikrein-Komponente B auftrennen (E. Habermann, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chemie 328, 15 bis 23; F. Fiedler und E. Werle, ibid. 348,1097 bis 1089 [1967]). Es ist noch nicht bekannt, ob der geringe Strukturunterschied in der Aminosäuresequenzoder im Kohlenhydratanteil des Glykoproteins Kallikrein liegt. Die beiden Komponenten lassen sich in ihrer biologischen Wirksamkeit nicht unterscheiden. Laboratory-scale kallikrein obtained by this procedure is a mixture of two Isoenzymes. By electrophoresis or by chromatography on anion exchangers, kallikrein can be Separate into two components, kallikrein component A and kallikrein component B. (E. Habermann, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chemie 328, 15 to 23; F. Fiedler and E. Werle, ibid. 348, 1097-1089 [1967]). It is not yet known whether the slight structural difference in the amino acid sequence or lies in the carbohydrate portion of the glycoprotein kallikrein. Let the two components do not differ in their biological effectiveness.
Die vorliegende Erfindung behandelt ein einfaches verfahren zur Gewinnung der reinen, kristallinen Kallikrcin-Komponenten Λ und H in hoher Aus-The present invention deals with a simple one process for obtaining the pure, crystalline kallikrcin components Λ and H in high
beute.prey.
Die gemäß vorliegenden Verfahren erhältlichen and gegebenenfalls kristallinen Kallidinogenase-(Kallikrein)-Komponenten A und B besitzen überraschenderweise eine wesentlich höhere Reinheit als die gemäß DE-OS 1617476 erhältliche Kallidinogenase, wobei bei der Injektion der gebrauchsfertigen Lösungen das Risiko von Nebenwirkungen und Schock wesentlich vermindert wird.The optionally crystalline kallidinogenase (kallikrein) components obtainable according to the present process A and B surprisingly have a much higher purity than the kallidinogenase obtainable according to DE-OS 1617476, the risk of side effects and shock when injecting the ready-to-use solutions is decreased.
Es wurde gefunden, daß reine Kallikrein-Komponenten A und B gewonnen werden können, indem man ein nach DE-PS 910580 aus dem Niederschlag der Blei- oder Zinksalz-Fällung gewonnenes Eluat entsalzt, die entsalzte Lösung an einem geeigneten, basisch substituierten, makroporösen Anionenaustauscher, z. B. Diäthylaminoäthylgruppen-haltige Zellulose oder Diäthylaminoäthylgruppen-haltiges quervernetztes Polydextrangel Chromatographien, die so gewonnene Lösung des teilweise gereinigten Kallikrein mit einem geeigneten sauer substituierten makroporösen Kationenaustauscher, z. B. Carboxymethylgruppen-haltiges quervernetztes Polydextrangel oder Sulfoäthylgruppen-haltiges quervernetztes Polydextrangel behandelt, das Kallikrein nach bekannten Verfahren in die Komponenten A und B trennt und diese durch Zusatz von Ammoniumsulfat kristallisiert. Die so kristallisierten Kallikrein-Komponenten übertreffen in der spezifischen Aktivität alle bisher bekanntgewordenen Präparate und sind mit Sicherheit frei von antigen wirksamen Fremdproteinen und Pyrogenen.It has been found that pure kallikrein components A and B can be obtained by desalinating an eluate obtained from the lead or zinc salt precipitation according to DE-PS 910580 and desalinating the desalinated solution on a suitable, basic-substituted, macroporous anion exchanger , e.g. B. Diethylaminoäthylgruppen-containing cellulose or diethylaminoäthylgruppen-containing cross-linked Polydextrangel chromatographies, the solution of the partially purified kallikrein obtained in this way with a suitable acid-substituted macroporous cation exchanger, z. B. carboxymethyl-containing cross-linked polydextrangel or sulfoethyl-containing crosslinked polydextrangel treated, the kallikrein separates according to known methods into components A and B and these crystallized by adding ammonium sulfate. The specific activity of the kallikrein components crystallized in this way surpasses all previously known preparations and is definitely free from antigenic foreign proteins and pyrogens.
Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Kallikrein erfolgt durch Messung der Hydrolyse von N-Benzoyl-L-arginin-äthylester (E. Werle und B. Kauf mann-Bretsch, Naturwissenschaften 46, 559 [1959]) in der von der F. 1. P. (Federation internationale Pharmaceutique) standardisierten Ausführungsform als tirimetrischer Test (Publikation 1972 in J. mond. Pharm.). Für die Umrechnung der enzymatischen Einheiten in die durch Messung der Blutdrucksenkung am Hund bestimmten biologischen KaIIikrein-Einheiten (KE) (E. Frey, H. Kraut, E. Werle, Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, F. Enke, Stuttgart 1968, S. 11) wird der Faktor 1 KE = 6,37 F.l.P.-Einheiten benutzt. Der Protein-Gehalt von Lösungen des reinen Kallikrein wird aus der Extinktion bei 280 mm bestimmt, wobei ein Extinktionskoeffizient von E^0= 19,3 (= Extinktion einer l%igen Lösung von Kallikrein bei pH 7,0) zugrunde gelegt wird.The enzymatic activity of kallikrein is determined by measuring the hydrolysis of N-benzoyl-L-arginine ethyl ester (E. Werle and B. Kaufmann-Bretsch, Naturwissenschaften 46, 559 [1959]) in the method described by F. 1. P. (Federation Internationale Pharmaceutique) standardized embodiment as a tirimetric test (publication 1972 in J. Mond. Pharm.). For the conversion of the enzymatic units into the biological kallikrein units (KE) determined by measuring the lowering of blood pressure in dogs (E. Frey, H. Kraut, E. Werle, Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, F. Enke, Stuttgart 1968, p. 11) the factor 1 KE = 6.37 FP units is used. The protein content of solutions of pure kallikrein is determined from the extinction at 280 mm, based on an extinction coefficient of E ^ 0 = 19.3 (= extinction of a 1% solution of kallikrein at pH 7.0).
Es wurde gefunden, daß die Entsalzung des nach DE-PS 910580 gewonnenen Eluats durch Dialyse oder durch Gelfiltration erfolgen kann. Für die darauffolgende Chromatogrpahie an basisch substituierten makroporösen Anionenaustauschern werden erfindungsgemäß insbesondere basisch substituierte Zellulosen oder basisch substituierte Gele mit genügender Porenweite verwendet. Bevorzugt wird dieser Reinigungsschritt an Säulen von Diäthylaminoäthylgruppen-haltigem quervernetztem Polydextrangel durchgeführt. Die Adsorption erfolgt bei einem pH von 4,0 bis 8,0, bevorzugt K< > pH 4,5 bis 5,0. Die niution erfolgt durch Erhöhung der Salzkonzentration bei konstantem pH oder Senkung des pH-Wertes bei konstanter Salzkonzentration oder eine Kombination beider Verfahren. Die Veränderug von pH und Salzkonzentration kann kontinuierlich als Gradientenelution oder stufenweise erfolgen. Hs können alle bekannten Puffersalze verwendet werden; bevorzugt werden flüchtige Puffersalze, z. B. Ammoniumformiat, Ammoniumacetat, Ammoniumpropionat oder die entsprechenden Alkylammoniumsalze, z. B. Triäthylammoniumformiat. In einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Kallikrein aus 0,2 M Ammoniumacetat pH 5,0 an Diäthylaminoäthylgruppen-haltigen quervernetzten Polydextrangel in Form einer Säule adsorbiert, inakti-It has been found that the eluate obtained according to DE-PS 910580 can be desalted by dialysis or by gel filtration. For the subsequent chromatography on basic-substituted macroporous anion exchangers, in particular basic-substituted celluloses or basic-substituted gels with sufficient pore size are used according to the invention. This purification step is preferably carried out on columns of crosslinked polydextrangel containing diethylaminoethyl groups. Adsorption takes place at a pH of 4.0 to 8.0, preferably K <> pH 4.5 to 5.0. The niution takes place by increasing the salt concentration at constant pH or lowering the pH value at constant salt concentration or a combination of both methods. The change in pH and salt concentration can be carried out continuously as gradient elution or in stages. All known buffer salts can be used; volatile buffer salts, e.g. B. ammonium formate, ammonium acetate, ammonium propionate or the corresponding alkylammonium salts, e.g. B. triethylammonium formate. In a preferred embodiment of the process according to the invention, kallikrein is adsorbed from 0.2 M ammonium acetate pH 5.0 on cross-linked polydextrangel containing diethylaminoethyl groups in the form of a column, inactive
I» ves Protein mit 0,25 M Ammoniumacetat pH 5,0 ausgewaschen und anschließend angereichertes Kallikrein mit 0,3 M Ammoniumacetat pH 4,5 eluiert. Die Chromatographie an basisch substituierten makroporösen Anionenaustauschern stellt eine we-'> sentliche Verbesserung des Verfahrens nach DE-OS 1102973 dar, das an Ausbeute und Einfachheit der Durchführung im technischen Maßstab entscheidend übertroffen wird.Ive protein washed out with 0.25 M ammonium acetate pH 5.0 and then enriched kallikrein eluted with 0.3 M ammonium acetate pH 4.5. The chromatography on basic substituted macroporous anion exchangers represents a we - '> significant improvement of the process according to DE-OS 1102973, the yield and simplicity of the Implementation on an industrial scale is decisively exceeded.
Das so angereicherte Kallikrein wird erfindungsge-The so enriched kallikrein is invented
-'" maß durch Behandlung mit sauer substituierten makroporösen Kationenaustauschern weiter gereinigt. Es werden dadurch Präparate von etwa 90% Reinheit erhalten. Als makroporöse Kationenaustauscher können insbesondere sauer substituierte Zellulosen oder- '"measured by treatment with acid-substituted macroporous Cation exchangers further purified. This results in preparations of around 90% purity obtain. As macroporous cation exchangers, in particular acid-substituted celluloses or
2'' sauer substituierte Gele, z. B. aus quervernetzten Dextranen oder Polyacrylamid, mit genügender Porenweite verwendet werden. Die Behandlung der Lösung des angereicherten Kallikrein mit dem Kationenaustauscher kann erfolgen, indem man die Lösung 2 '' acidic substituted gels, e.g. B. made of cross-linked dextrans or polyacrylamide, can be used with sufficient pore size. The treatment of the solution of the enriched kallikrein with the cation exchanger can be done by adding the solution
in mit dem Austauscher ausrührt oder indem man die Lösung durch Schichten des Austauschers filtriert. Verwendet man Säulen, so ist es zweckmäßig, die Lösung des angereicherten Kallikrein aus der vorherigen Stufe zu konzentrieren und zu entsalzen. Während desin with the exchanger or by adding the Solution filtered through layers of exchanger. If columns are used, it is advisable to use the solution concentrate and desalinate the enriched kallikrein from the previous stage. During the
i> Ausrührens oder während des Filtrationsvorganges werden von den Gelen Begleitstoffe zurückgehalten, während Kallikrein ungehindert durch die Filterschicht läuft.i> stirring or during the filtration process Accompanying substances are retained by the gels, while kallikrein is unhindered by the filter layer runs.
Die zur Filtration oder zum Ausrühren verwendein ten sauer substituierten makroporösen Kationenaustauscher werden in bekannter Weise vorbehandelt. Zur Filtration werden sie mit verdünnten Pufferlösungen angerührt und z. B. in Säulen eingeschlämmt. Das Verhältnis Säulenlänge/Säulendurchmesser ist für denThe acid-substituted macroporous cation exchangers used for filtration or stirring are pretreated in a known manner. They are filtered with dilute buffer solutions touched and z. B. slurried in columns. The column length / column diameter ratio is for the
ι, Filtrationsvorgang von sekundärer Bedeutung. Bevorzugt werden Säulen mit großem Säulendurchmesser. Zur Herstellung der Pufferlösungen werden die bekannten Puffersalze, vornehmlich aber flüchtige Puffersalze, z. B. Ammoniumformait, Ammonium-ι, filtration process of secondary importance. Columns with a large column diameter are preferred. The known buffer salts, but mainly volatile ones, are used to prepare the buffer solutions Buffer salts, e.g. B. ammonium formaite, ammonium
,Ii acetat, Ammoniumpropionat oder die entsprechenden Alkylammoniumsalze, z. B. Triäthylammoniumformiat, verwendet. Der pH-Wert der Pufferlösungen kann zwischen 4,5 und 8,5, vornehmlich zwischen 5,0 und 7,0 gewählt werden., Ii acetate, ammonium propionate or the equivalent Alkylammonium salts, e.g. B. triethylammonium formate is used. The pH of the buffer solutions can be selected between 4.5 and 8.5, primarily between 5.0 and 7.0.
-.-, Das so erhaltene hochgereinigte Kallikrein wird nach bekannten Verfahren durch Chromatographie an Diäthylaminoäthylgruppen-haltiger Zellulose oder Diäthylaminoäthylgruppen-haltiges quervernetztes Polydextrangel in die Komponenten A und B aufge--.-, The highly purified kallikrein thus obtained is by known methods by chromatography on cellulose containing diethylaminoethyl groups or Cross-linked polydextrangel containing diethylaminoethyl groups in components A and B
Ii trennt.Ii separates.
Die hochgereinigten Kallikrein-Komponenten werden erfindungsgemäß getrennt durch Zusatz von Ammoniumsulfat in fester Form oder als konzentrierte Lösung bei einem pH-Wert von 4,0 bis 8,0 kri-, stallisiert. Die Kristallisation setzt bei einer Ammoniumsulfat-Sättigung von etwa 45°/r innerhalb weniger Tage ein, vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 25" C. Die Kristalle haben die Form dünner Na-According to the invention, the highly purified kallikrein components are separately crystallized by adding ammonium sulfate in solid form or as a concentrated solution at a pH of 4.0 to 8.0. At an ammonium sulfate saturation of about 45 ° / r, crystallization begins within a few days, preferably at a temperature of 15 to 25 "C. The crystals are in the form of thin sodium
dein, die sich in Büscheln zusammenlagern. Die Kristalle können von der Mutterlauge durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt, mit 50% gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung gewaschen und in verdünnter Salzlösung oder Wasser gelöst werden. >yours, gathered in tufts. The crystals can be separated from the mother liquor by centrifugation or filtration, with 50% saturated Ammonium sulfate solution can be washed and dissolved in dilute saline or water. >
Die Kristalle bestehen aus reinem elektrophoretisch einheitlichem Kallikrein A bzw. Kallikrein B. Fig. 2 zeigt das Ergebnis eines Elektrophoreseversuchs. Gearbeitet wurde mit Veronal-Na-Puffer (pH 8,6). Die Ionenstärke betrug 0,075; Spannung: i" 100 V; Laufdauer: 20 Minuten. Zum Zeitpunkt 0 wurde in Höhe der gestrichelten Linie aufgetragen. Bei 1 wurde Kallikrein, bei 2 wurde die Kallikrein-Komponente A und bei 3 wurde die Kallikrein-Komponente B eingesetzt. Die spezifische Aktivität von ι ϊ ca. 1600 KE/mg Protein läßt sich auch durch mehrmaliges Umkristallisieren nicht weiter steigern.The crystals consist of pure electrophoretically uniform kallikrein A or kallikrein B. Fig. 2 shows the result of an electrophoresis experiment. Work was carried out with veronal Na buffer (pH 8.6). The ionic strength was 0.075; Voltage: i "100 V; running time: 20 minutes. At time 0 was plotted at the level of the dashed line. At 1 it became kallikrein, at 2 it became the kallikrein component A and for 3 the kallikrein component B was used. The specific activity of ι ϊ 1600 KE / mg protein cannot be increased any further even by repeated recrystallization.
Überraschenderweise gelingt es mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren, teilweise gereinigtes Kallikrein von seinen Begleitstoffen und von Fremdenzy- -1» men äußerst einfach und ohne Anwendung umständlicher Elutions-Methoden abzutrennen. Es war nicht vorauszusehen, daß die Begleitstoffe und die Fremdenzyme, nicht aber Kallikrein von den makroporösen Kationenaustauschern festgehalten werden und das in r> Lösung bleibende Kallikrein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in sehr guten Ausbeuten und in hoher Reinheit erhalten wird. Durch die Kristallisation der beiden Kallikreinkomponenten A und B werden auch schwer zu entfernende pyrogene Substanzen fast j» vollständig abgetrennt. Die Einfachheit des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt die Durchführung auch im technischen Maßstab. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit eine Bereicherung der Technik dar. j-,It is surprisingly possible with this novel process, partially purified kallikrein of its accompanying substances and Fremdenzy- - 1 "men extremely simple and complicated without the use of separate elution methods. It was not foreseeable that the accompanying substances and the foreign enzymes, but not kallikrein, would be retained by the macroporous cation exchangers and that the kallikrein remaining in solution would be obtained in very good yields and in high purity by the process according to the invention. As a result of the crystallization of the two kallikrein components A and B, pyrogenic substances that are difficult to remove are almost completely separated off. The simplicity of the process according to the invention also allows it to be carried out on an industrial scale. The method according to the invention thus represents an enrichment of the technology.
Die Lösung der Kristalle ist charakterisiert durch ein UV-Spektrum bei pH 7 mit einem Maximum bei 282 nm, einem Minimum bei 251 nm, 2 Schultern bei 277 und 290 nm und einem Verhältnis der Extinktionen bei 280 und 260 nm von 1,78. In 0,1 η NaOH w zeigt das UV-Spektrum zwei Maxima bei 280 und 289 nm (Fig. 1).The solution of the crystals is characterized by a UV spectrum at pH 7 with a maximum at 282 nm, a minimum at 251 nm, 2 shoulders at 277 and 290 nm and a ratio of the extinctions at 280 and 260 nm of 1.78. In 0.1 η NaOH w , the UV spectrum shows two maxima at 280 and 289 nm (FIG. 1).
Die erfindungsgemäß hergestellten kristallinen Kallikrein-Komponenten A und B können als wirksame Bestandteile von Arzneimitteln verwendet wer- 4-, den. Infolge ihrer gefäßerweiternden Wirkung können Kallikrein-Komponente A bzw. Kallikrein-Komponente B enthaltende Arzneimittel, insbesondere bei peripheren Durchblutungsstörungen, z. B. Endangitis OtMiicrans, Arteriosclerosis obliierans, Morbus Ray- ><> naud, bei gestörter Fraktur- und Wundheilung, z. B. Sudecksches Syndrom, Verbrennungen, und bei Zirkulationsstörungen des Alters mit Erfolg verwendet werden.The crystalline kallikrein components A and B prepared according to the invention can be used as effective Components of medicinal products are used 4-, the. As a result of their vasodilating effect, kallikrein component A or kallikrein component B-containing drugs, especially for peripheral circulatory disorders, e.g. B. Endangitis OtMiicrans, Arteriosclerosis obliierans, Ray's disease > <> naud, with impaired fracture and wound healing, e.g. B. Sudeck's syndrome, burns, and circulatory disorders of age can be used with success.
Die Anwendung kann oral in Form von Tabletten ή oder Dragees, die die kristalline Kallikrein-Komponente A bzw. Ka'Iikrein-Komponente B in Mischung mit inerten nichttoxischen pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen enthalten, oder parenteral als intramuskuläre oder auch intravenöse Injektion einer wäßrigen bo Lösung der kristallinen Kallikrein-Komponente A oder B erfolgen. Insbesondere für die parenterale Anwendung bieten die kristallinen Kallikrein-Komponenten gegenüber wenigen reinen Präparaten den Vorteil der weit geringeren Gefahr unerwünschter b5 Nebenwirkungen und allergischer Reaktionen.It can be used orally in the form of tablets ή or coated tablets containing the crystalline kallikrein component A or kallikrein component B in a mixture with inert non-toxic pharmaceutically acceptable carriers, or parenterally as intramuscular or also intravenous injection of an aqueous bo solution of the crystalline kallikrein component A. or B. Especially for parenteral use offer the crystalline kallikrein components compared to a few pure preparations Advantage of the far lower risk of unwanted b5 side effects and allergic reactions.
Durch Zusatz von hochmolekularen Kolloiden nach DE-PS 941685, z. B. Polyvinylpyrrolidon oder Dextran, oder durch Bildung des Komplexes mit dem Kallikrein-Inhibitor Aprotinin nach DE-PS 1 000566 können aus den kristallinen Kallikrein-Komponenten A oder B verzögert wirkende Injektionspräparatc hergestellt werden. Kallikrein für Injektionszwecke kann sowohl als gebrauchsfertige isotonische Lösung hergestellt werden, als auch in fester Form durch Gefriertrocknen einer Mischung von kristallinen KaIIikrein-Komponenten A bzw. B mit geeigneten Trägerstoffen, z. B. Dextran, Mannit, Lactose, Gelatine, woraus durch Auflösen in einem geeigneten Lösungsmittel die gebrauchsfertige Lösung unmittelbar vor der Anwendung hergestellt wird.By adding high molecular weight colloids according to DE-PS 941685, z. B. polyvinylpyrrolidone or Dextran, or by forming the complex with the kallikrein inhibitor aprotinin according to DE-PS 1 000566 Delayed injection preparations can be made from the crystalline kallikrein components A or B getting produced. Kallikrein for injections can be used both as a ready-to-use isotonic solution as well as in solid form by freeze-drying a mixture of crystalline Kalikrein components A or B with suitable carriers, e.g. B. dextran, mannitol, lactose, gelatin, from which by dissolving in a suitable solvent the ready-to-use solution immediately before the application is established.
a) 200 I eines nach DE-PS 910580 aus Schweinepankreas gewonnenen und dialysierten Eluats einer Bleisalz-Fällung, enthaltend 10,8 Mio KE, wurden im Dünnschichtverdampfer auf 15 I eingeengt und dann durch Gelfiltration über eine Säule von quervernetztem Polydextrangel mit einem Ausschlußvolumen für Molekulargewichte größer als 5000 entsalzt. Die entsalzte Lösung wurde mit Essigsäure auf pH 5,0 eingestellt und eine dabei entstandene geringe Fällung abfiltriert. Sodann wurde festes Ammoniumacetat bis zur spezifischen Leitfähigkeit 12 mS zugesetzt. Diese Lösung wurde über eine 20 x 65 cm große Säule (20 1) von diäthylaminoäthylgruppenhaltigem quervernetzten Polydextrangel, äquilibriert mit 0,2 M Ammoniumacetat pH 5,0, gegeben, wobei Kallikrein adsorbiert wird. Die Säule wurde anschließend zuerst mit ca. 40 I 0,25 M Ammoniumacetat pH 5,0 und dann mit 0,3 M Ammoniumacetat pH 4,5 eluiert. Kallikrein erscheint im Eluat kurz nachdem der pH-Wert auf etwa 4,5 gesunken ist (Fig. 3). Die aktiven Fraktionen enthielten 9,35 Mio KE (86,5%). Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert und über eine Säule von quervernetztem Polydextrangel mit einem Ausschlußvolumen für Molekulargewichte größer als 5000 entsalzt; eine lyophilisierte Probe hatte die spezifische Aktivität 414 KE/mg Einwaage.a) 200 l of an eluate obtained from pig pancreas according to DE-PS 910580 and dialyzed a lead salt precipitate containing 10.8 million KE were concentrated to 15 l in a thin-film evaporator and then by gel filtration over a column of crosslinked polydextrangel with an exclusion volume for molecular weights greater than 5000. The desalinated The solution was adjusted to pH 5.0 with acetic acid and a small amount of precipitation resulted filtered off. Solid ammonium acetate was then added up to a specific conductivity of 12 mS. This solution was through a 20 x 65 cm column (20 1) containing diethylaminoethyl groups cross-linked polydextrangel, equilibrated with 0.2 M ammonium acetate pH 5.0, added, whereby kallikrein is adsorbed. the Column was then first with about 40 l of 0.25 M ammonium acetate pH 5.0 and then with 0.3 M ammonium acetate pH 4.5 eluted. Kallikrein appears in the eluate shortly after the pH value has dropped to about 4.5 (Fig. 3). The active fractions contained 9.35 million KE (86.5%). The solution was concentrated in vacuo and crosslinked through a column of Polydextrangle with an exclusion volume for molecular weights greater than 5000 desalinated; a lyophilized sample had the specific activity of 414 KE / mg initial weight.
b) Die entsalzte Lösung mit einem Volumen von 300 ml wurde über eine 10 X 130 cm große Säule (101) vom carboxymethylgruppenhaltigem quervernetzten Polydextrangel, äquilibriert mit 0,01 M Ammoniumacetat pH 5,0, filtriert. Im Eluäi erschien zuerst Kaüikrein, gefolgt von inaktiven Verunreinigungen (Fig. 4). Die KaIIikrein-Fraktion (930 ml) enthielt 5,5 Mio KE (59%). Eine lyophilisierte Probe hatte die spezifische Aktivität 1060 KE/mg Einwaage bzw. 120 KE/mg Protein.b) The desalted solution with a volume of 300 ml was over a 10 X 130 cm Column (101) of crosslinked polydextrangel containing carboxymethyl groups, equilibrated with 0.01 M ammonium acetate pH 5.0, filtered. Kaüikrein appeared first in the Eluäi, followed by inactive impurities (Fig. 4). The Kalikrein fraction (930 ml) contained 5.5 million KE (59%). A lyophilized sample had the specific activity 1060 KE / mg weight or 120 KE / mg protein.
c) 4,42 Mio KE einer Lösung von hochgereinigtem Kallikrein, erhalten nach b), wurden auf einer Säule 5 X 100 cm von diäthylaminoäthylgruppenhaltigem quervernetztem Polydextrangel, äquilibriert mit 0,2 M Ammoniumacetat, pH 6,7, adsorbiert. Die Elution erfolgte mit einem konvexen Gradienten 0,2 bis 0,55 M Ammoniumacetat pH 6,7, hergestellt mit einem 2-1-Mischgefäß. Im Eluat erschienen zwei leicht überlappende Aktivitätsgipfel von Kallikrein, von denen der erste elektrophoretisch als Kallikrein-Komponente B, der zweite als Kallikrein-Komponente A identifiziert wurde. Die reines KaIIi-c) 4.42 million KE of a solution of highly purified kallikrein, obtained according to b), were on a Column 5 X 100 cm of diethylaminoethyl group-containing cross-linked polydextrangel, equilibrated with 0.2 M ammonium acetate, pH 6.7, adsorbed. Elution took place with a convex Gradient 0.2 to 0.55 M ammonium acetate pH 6.7 made with a 2-1 mixing vessel. Two slightly overlapping peaks of activity of kallikrein appeared in the eluate, one of which the first electrophoretically as kallikrein component B, the second as kallikrein component A was identified. The pure kai
krein A bzw. B enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt. Erhalten wurden: 2,1 Mio KE Kallikrein-Komponente
B (47,5%), 1,25 Mio KE Kallikrein-Komponente A (28%) und 0,32 Mio KE eines Gemisches von Kallikrein-Komponenten
A und B aus dem Überlappungsbereich der Gipfel (7,2%), zusammen 83%.
Ein Teil der die Kallikrein-Komponente B enthaltenden Lösung wurde auf eine Konzentration
von ca. 20000 KE/ml eingeengt und mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung bis 45 % SättigungFractions containing pure A and B, respectively, were pooled. The following were obtained: 2.1 million KE kallikrein component B (47.5%), 1.25 million KE kallikrein component A (28%) and 0.32 million KE of a mixture of kallikrein components A and B from the overlap area the summit (7.2%), together 83%.
Part of the solution containing the kallikrein component B was concentrated to a concentration of approx. 20,000 KE / ml and saturated ammonium sulfate solution to 45% saturation
versetzt. Nach 6 Tagen bei 20 bis 25° C setzte die Kristallisation ein. Nach 4 Wochen wurden die Kristalle abzentrifugiert, mit 50% gesättigter Ammoniumsulfatlösung gewaschen und in 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst. Die spezifische Aktivität betrug 1650 KE/mg Protein, die Ausbeute 64%.offset. After 6 days at 20 to 25 ° C., crystallization began. After 4 weeks were the crystals centrifuged off, washed with 50% saturated ammonium sulfate solution and in 0.05 M phosphate buffer pH 7.0 dissolved. The specific activity was 1650 KE / mg protein, the Yield 64%.
In gleicher Weise wurde auch Kallikrein-Komponente A kristallisiert. Im mikroskopischen Aussehen der Kristalle besteht kein Unterschied. Kallikrein component A was also crystallized in the same way. In the microscopic There is no difference in appearance of the crystals.
Hierzu 3 Biau ZeichnungenFor this purpose 3 blue drawings
Claims (2)
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