DE1795308A1

DE1795308A1 - 6-chloropurine ribonucleoside-3 ', 5'-cyclophosphate and process for its preparation

Info

Publication number: DE1795308A1
Application number: DE19681795308
Authority: DE
Inventors: Weimann Dr Rer Nat Guenter; Erich Haid; Dietmann Dr Med Karl; Klaus Muehlegger; Bergmeyer Dr Rer Nat Ha Ulrich
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1968-09-10
Filing date: 1968-09-10
Publication date: 1970-10-29

Description

und Verfahreii Zu spi.ner Ilerstsdlung In der R ein Wasserstoffatom, eine Hydroxyl- oder Aminogruppe bedeutet, sowie ein Verfahren zu ihrer direkten chemischen Herstellung aus den entsprechenden 6-Hydroxypurinnucleosid-31,51-cyclophosphaten. Cyclische 31,51-Phoophate von Nucleosiden gewinnen in der Biochemie laufend an Bedeutung und Adenosin-3',51-cyclophoophat istv. seit seiner Entdeckung durch Sutherland vor 10 Jahren (Sutherland,' Rall, J.Amer.Chem.Soc. 79, 3608 (1957» zu einer Schlüsselsubstanz in der Glykolyse, der Lipolyse und bei Hormonstoffwechselwirkungen geworden, deren physiologische Bedeutung vielfach mit dem wichtigsten Energieüberträger ATP in der Zelle gleichgesetzt wird. Nach der Theorie von Sutherland fällt dem Adenosin-3f95'-cYclophosphat physiologisch in der Zelle die Funktion eines "second messenger11 zu, was am Beispiel der Wirkung den Peptidhormone ACTH kurz veranschaulicht sei. Von der Hypophyse ausgeschüttetes ACTH gel,niii"#-t Über die Blutbahn an die Ilebennierenrinde, in deren ZellwatL.i tl-zo.i#,nzym Adenyleyelase sitzt, die auf das extracelluläre Entfernung der Schutzgruppe und Einführung einer neuen Schutzgruppe an 21,31-Hydroxylgruppe (z.B. durch Ketalisierung), wobei die 51-OH-Stellung freibleibt - Phosphorylierung am 5'011 mit ß-Cyanoäthylphosphat und DCC als Kondensationsmittel Abspaltung a) von 21,3'OH-Schutzgruppe- b) von Phosphat-Schutzgruppe - Cyclisierung zum gewünschten Produkt. Die Ausbeuten bei dieser vielstufigen Synthese sind sehr niedrig (1,5 % der Theorie; J. Thomas, Montgomery J. Med. Pharm. Chem. " 9 44 (1968», zumal die hydrolyse- und oxydationsempfindliche Mereaptogruppe von Anfang an mit durch die einzelnen Reaktionsstufen gezogen werden muß. Auf analogem Wege wurden diverse Derivate von Deazapurinribonuoleosid-31,59-cyclophoaphat (Tubereidin) hergestellt (A.Hanze, Upjohn, USA-Patentschrift 3 300 479; A. Hanze, Biochemistry 7, 932 (1968»; ebenso Cytosinarabinosid-21,51-cyclophosphat. Für ein industriell anwendbares Verfahren schied die obige Herstellungsweise aufgrund ihrer Umständlichkeit und geringen Ausbeute aus. Es wurde daher ein Weg gesucht, von der präformierten Cyclophoaphatverbindung ausgehend die Substitution in Stellung 6 des Puringerüstet durchzuführen. Folgende Verfahren zur Umwandlung der Hydroxylgruppe in die Chlorgruppe bei Nueleosiden sind bekannt: 1. Chlor in Methanal (G.D. Daves et al., J. Amer. Chem. Soe. 82e 2633 (1960); F. Bergmann et al.. J. Chem. Soe. 10, 1966)9 2. konzentrierter Salzsäzre, Ohlorgas und Methanol (Gerster et al., J, Org. Chem. 28, 945 (1963»t 3. Diäthylanilin und 2001 3 (Gerster et al., J. Org. Chem. 28, 945 (1963», 4. SO012-DMF (M. Ikeharai.Chem. Pharm. Bull. 129 267 (1964». Es wurde jedoch gefunden, daß keines dieser bekannten Verfahren bei Amiendung auf das 6-Hydroxypurinribonueleosid-3f95t-cYclophosphat zu dem gesuchten Produkt führt. Die Versuche zeigten, daß hierbei entweder eine extensive Degradation auftrat oder das Ausgangsmaterial überhaupt nicht umgesetzt wurde. Dies zeigt, daß die Heaktionsfähigkeit bei Einführung einer Cyclophosphatgruppe auch im Purinkern grundsätzlich verändert wird und daher die für die Purinnueleoside bekannten Verfahren sich nicht auf die cyclisehen Nueleosid-31,51-phosphate übertragen lassen. Das gleiche gilt auch für die in der Nueleosidreihe bekannte Umwandlung von Inosin in das entsprechende 6-Mereaptoderivat durch Umsetzung mit P2S 5* Am präformierten Cyclophosphat ist diese mit den Nueleosiden glatt verlaufende Reaktion nicht durchführbar und führt unter kei-.nen Bedingungen zum gewünschten 6-Mercaptoderivat. In der japanischen Patentschrift 7957/68 wurde bereits die Herstellung von 6-Ohlorpurin-deaoxyribosid-3',51-cyclophoaphat beschrieben durch Umsetzung mit Phosphortrichlorid und einer alkalischen Substanz, wie einem anorganischen Alkali oder aliphatisehen oder aromatischen Amin. Dieses bekannte Verfahren fUhrt zu einer Ausbeute von 26 Es wurde j#e-doch-fes-bgästellt) daß sich diese Umsetzung,nicht beim geVdhnlichen 6-Hydro2nurinribonueleos'id-3'i5'-cyclophösph.at durchfuhren läßt. In Gegenwart von Basen wie z.B. Diäthylanilin ergibt sich unter den Bedingungen des bekannten Verfahrens keine Umwandlung und das Reaktbnemedium färbt sich schwarz-braun und enthält zahlreiche Zersetzungsprodukte.and procedural to spi.ner Ilerstsdlung In which R denotes a hydrogen atom, a hydroxyl or amino group, and a process for their direct chemical preparation from the corresponding 6-hydroxypurine nucleoside-31,51-cyclophosphates. Cyclic 31,51-phosphates of nucleosides are becoming increasingly important in biochemistry, and adenosine-3 ', 51-cyclophophate is v. since its discovery by Sutherland 10 years ago (Sutherland, 'Rall, J.Amer.Chem.Soc. 79, 3608 (1957) it has become a key substance in glycolysis, lipolysis and hormone metabolic interactions, whose physiological importance is often associated with the most important energy carrier According to Sutherland's theory, adenosine-3f95'-cyclophosphate has the physiological function of a "second messenger11 in the cell, which is illustrated briefly using the example of the action of the peptide hormones ACTH. ACTH gel released by the pituitary gland , niii "# - t Via the bloodstream to the ileus renal cortex, in whose cell adenyl yelase sits in the cell water, which acts on the extracellular Removal of the protective group and introduction of a new protective group on the 21,31-hydroxyl group (e.g. by ketalization), whereby the 51-OH position remains free - phosphorylation on 5'011 with ß-cyanoethyl phosphate and DCC as condensation agents Cleavage a) of 21.3 ' OH protective group - b) of phosphate protective group - cyclization to the desired product. The yields in this multi-stage synthesis are very low (1.5% of theory; J. Thomas, Montgomery J. Med. Pharm. Chem. " 9 44 (1968"), especially since the mereapto group, which is sensitive to hydrolysis and oxidation, is involved from the start Various derivatives of deazapurine ribonuoleoside-31,59-cyclophoaphate (tubereidin) were prepared in an analogous way ( A. Hanze, Upjohn, USA patent 3 300 479; A. Hanze, Biochemistry 7, 932 (1968 »; As well as cytosine arabinoside-21,51-cyclophosphate. For an industrially applicable process, the above production method was ruled out due to its inconvenience and low yield. A way was therefore sought to carry out the substitution in position 6 of the purine armor starting from the preformed cyclophosphate compound. The following process for Conversion of the hydroxyl group into the chlorine group in nucleosides are known: 1. Chlorine in methanal (GD Daves et al., J. Amer. Chem. Soe. 82e 2633 (1960); F. Bergma nn et al . J. Chem. Soe. 10, 1966) 9 2. concentrated hydrochloric acid, Ohlorgas and methanol (Gerster et al., J, Org. Chem. 28, 945 (1963 > t 3. diethylaniline and 2001 3 (Gerster et al., J. Org. Chem. 28, 945 (1963 ", 4. SO012-DMF (M. Ikeharai. Chem. Pharm. Bull. 129 267 (1964".) It was found, however, that none of these known methods when applied to the 6-hydroxypurine ribonueleoside-3f95t-cyclophosphate The experiments showed that either extensive degradation occurred or that the starting material was not converted at all. This shows that the reactivity is fundamentally changed when a cyclophosphate group is introduced in the purine nucleus and that the processes known for purine neosides are therefore changed The same also applies to the conversion of inosine into the corresponding 6-mereaptoderivat known in the nucleoside series by reaction with P2S 5 * on the preformed cyclophosphate, this is mi The reaction cannot be carried out smoothly with the nucleosides and does not lead to the desired 6-mercapto derivative under any conditions. The preparation of 6-chloropurine-deaoxyriboside-3 ', 51-cyclophoaphate by reaction with phosphorus trichloride and an alkaline substance such as an inorganic alkali or aliphatic or aromatic amine has already been described in Japanese patent 7957/68. This known process leads to a yield of 26. It was established that this reaction cannot be carried out with the similar 6-hydro2nurineribonueleosid-3'i5'-cyclophosphophosphate. In the presence of bases such as diethylaniline, no conversion takes place under the conditions of the known process and the reaction medium turns black-brown and contains numerous decomposition products.

Uberranchenderweise wurde nun ggfunden, daß die gewUnachte Um-.setzung glatt und mit sehr guter Ausbeute verläuft, wenn man ein 6-Hydroxypurinribonueleosid-31,51-cyclophoophat als Ausgangsmaterial in an sich bekannter Weise acyliert und das Acylierungs- Man erhält auf diese Weise das entsprechende 6-Ohlorpurinriboüucleosid-3195'cyclophoophat In über 50%iger Ausbeute.Surprisingly enough, it has now been found that the conversion. In this way, the corresponding 6-Ohlorpurinriboüucleosid-3195'cyclophoophat is obtained in a yield of over 50%.

Als Ausgangsprodukt für das Verfahren der Erfindung wird ein 6-Hydroxypurinribonualeosid-39,51-cyclophosphat der Pormel worin R ein Wasserstof fatom, eine Hydroxyl- oder Aminogruppe bedeutet, verwendet. Dieses Ausgangsprodukt läßt sich leicht durch chemische Desaminierung von beispielsweise Adenosin-3',5'-cYclophosphat in hoher Ausbeute erhalten. The starting product for the process of the invention is a 6-hydroxypurine ribonualeoside 39,51-cyclophosphate of the formula wherein R is a hydrogen fatom, a hydroxyl or amino group is used. This starting product can easily be obtained in high yield by chemical deamination of, for example, adenosine 3 ', 5'-cyclophosphate.

Das Ausgangsprodukt-wird in der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahren acyliert, um es in Phosphoroxychlorid löslich zu machen. Die Acylierung muß nur in solchem Ausmaß durchgeführt werden, daß das acylierte Produkt ausreichend löslich für die Umsetzung in POCi 3 ist. Vorzugsweise wird die Acylierung mit einem Acylchlorid oder Acylanhydrid in Gegenwart eines alkalischen Mittels durchgeführt. Bevorzugt erfolgt die Acylierung-mit Acetylchlorid, Besigsäureanhydrid oder Benzoylelilorid. Als alkalisches 1-Uttel werden vorzugsweise organische Basen verwendet, die sich zusammen mit überschüssigem Acylierungsmittel leicht durch Destillation vom acylierten Nucleosid abtrennen lassen. Als gut geeignet erwies sich die Umsetzung mit Essigsäureanhydrid in Pyridin, die.* unschwierig auch bei Haumtemperatur durchgeführt werden kann. Hierbei entsteht das 6-Hydroxypurin-21-0-acetylribonueleosid-3', 51-cycloacetylphosphat, welches in P0C1 3-gut löslich ist und sich daher für die Umsetzung besonders eignet. Das 21-0-Acetyl-6-hydroxypurinribonucleosid-31.51-cyclophosphat eignet sich ebenfalls, jedoch ist die Ausbeute infolge der geringeren Löslichkeit schlechter.The starting product is acylated in the first stage of the process according to the invention in order to make it soluble in phosphorus oxychloride. The acylation only has to be carried out to such an extent that the acylated product is sufficiently soluble for the conversion in POCi 3 . Preferably, the acylation is carried out with an acyl chloride or acyl anhydride in the presence of an alkaline agent. The acylation is preferably carried out with acetyl chloride, acetic anhydride or benzoyl chloride. The alkaline 1-Uttel used is preferably organic bases which, together with excess acylating agent, can easily be separated from the acylated nucleoside by distillation. The reaction with acetic anhydride in pyridine has proven to be very suitable, and it can also be carried out without difficulty at room temperature. This produces 6-hydroxypurine-21-0-acetylribonueleoside-3 ', 51-cycloacetyl phosphate, which is 3-soluble in POCl and is therefore particularly suitable for the reaction. The 21-0-acetyl-6-hydroxypurine ribonucleoside-31.51-cyclophosphate is also suitable, but the yield is poorer because of the lower solubility.

Nach beendeter Acylierung werden restliches Acylierungsmittel-und Base entfernt, vor zugsweise durch Destillation. Das zurückbleibent de ölige Acylierungsprodukt wird direkt mit überschüssigem 20C1 3 umgesetzt. Hierbei dient das 20C1 sowohl als Lösungsmittel als 3 auch als Reagens. I'n Abwesenheit einer basischen Substanz, wie z.B. Diäthylanilin bildbt sich hierbei innerhalb kurzer Zeit mit einer'Ausbeute vän über 50 % das gewünschte 6-Chlorp'urinribonucleoeid-31.51-cyclophoaphat, wobei als Hauptnebenprodukt 6-Chlorpurin gebildet wird.After the acylation has ended, the remaining acylating agent and base are removed, preferably by distillation. The oily acylation product that remains is reacted directly with excess 20C1 3. Here, the 20C1 both as solvent and 3 as a reagent used. In the absence of a basic substance, such as diethylaniline, the desired 6-chloropurinribonucleoeid-31.51-cyclophoaphate is formed within a short time with a yield of more than 50% , with 6-chloropurine being formed as the main by-product.

Die Acylierung in der ersten Stufe des erfindungegemäßen Verfahrens erfolgt in üblicher Weise, vorteilhaft bei Haumtemperatur. Vorzugeweise.erfolgt die Unisetzung hierbei untler Lichtabschluß. Nach der Entfernung des restlichen Acylierungsmittels und der alkalischen Substanz wird das zurückbleibende Öl vorzugsweise durch Waschen mi,t einem geeigneten Maungsmittel, wie Äther, von letzten Resten an alkalischer Substanz und Acylierungsmittel befreit. Die Acylierungsreak tion kann bei Temperaturen zwischen-Zimmertemperatur und der Rückflußtemperatur.der am niedrigsten siedenden Komponente-durchgeführt:werdew Die Umsetzungmit.dem überschüssigen PX1 läßt.sich.äbenfalle-3-bei Temperaturen zwischen Raumtemperatur und der Rückflußtempera--tur durchfühi*9-'n.-Vorzugewei.se-wir-d-bel-erhöhter Temperatur, ins-, besondere am-.Rückfluß gekocht.-.Unter-diesen Bedingungen Ist die Umsetzung nach etwa 15 bis 30 Minuten beendet und überschüssigen 1?Ocl- 3 wird abdestilliert.' Die Reinigung des so gewonnenen rohen 6-Chlorpurinribonueleosid-31.51-cyclophosphain erfolgt vorteilhaft durch Ohromatographie an einem geeigneten-Ionenaustauscher. ,Die erfindungegemäßen neuen Verbiiidungen.stellen interessante therapeutisch wirksame Substanzen dar und können als solche oder in Form ihrer Salze mit physiologisch verträglichen-Basen zur Beeinflussung der Glykolyse, der lipolys'e und des Hormonstoffwechsels eingesetzt-werden.' Sie zeichnen sich hierbei bedonders durch ihre verlängerte Wirkungedauer im Vergleich zu den entsprechenden 6-Aminoverbindungen aus, was auch die größere Beständigkeit gegen enzymatische Spaltung zeigt.. Außerdem sind die erfindungsgemäßen Verbindungen wichtige Zwischenprodukte zur Herstellung weiterer in Stellung 6 substituierter Derivate, da sich der Chlorsubstituent leicht-gegen andere Substituenten austau%hen läßt. Die gelbe Lösung wird auf eine mit Carboraffin C-Kohle gefüllte Chromatographieeäule (Länge 120 cm, 0 2,5 cm) aufgezogen und mit dest. Wasser so lange-nachgewaschen, bis der Durchlauf frei von po 4 3- und al- ist. Die Blution erfolgt mit Äthanol: H 20 : NR4OH (33%ig) (50:50:1). Die im UV-Licht bei 260 m4i abeorbierenden Fraktionen (oder durch TW ; System Butanol :.H 20 : Eisessig = 50 : 25 : 15 auf Kieselgel PF 254 RF = 0,6) werden vereinigt und bis auf 200 ml konzentriert.The acylation in the first stage of the process according to the invention is carried out in the customary manner, advantageously at room temperature. Preferably, the unisposition takes place below the light. After the remaining acylating agent and the alkaline substance have been removed, the remaining oil is freed from the last residues of alkaline substance and acylating agent, preferably by washing with a suitable digesting agent, such as ether. The acylation reaction can be carried out at temperatures between room temperature and the reflux temperature of the lowest-boiling component: the reaction with the excess PX1 can be carried out at temperatures between room temperature and the reflux temperature * 9- 'n.-Vorzugewei.se-we-d-bel-elevated temperature, especially boiled on reflux. Under these conditions, the reaction is over after about 15 to 30 minutes and excess 1? Ocl- 3 is distilled off. ' The crude 6-chloropurine ribonueleoside-31.51-cyclophosphaine obtained in this way is advantageously purified by chromatography on a suitable ion exchanger. "The new compounds according to the invention represent interesting therapeutically active substances and can be used as such or in the form of their salts with physiologically compatible bases to influence glycolysis, lipolysis and hormone metabolism." They are particularly characterized by their longer duration of action compared to the corresponding 6-amino compounds, which also shows the greater resistance to enzymatic cleavage. In addition, the compounds according to the invention are important intermediates for the preparation of further derivatives substituted in position 6 , since the chlorine substituent easily exchanged for other substituents. The yellow solution is drawn up on a chromatography column (length 120 cm, 0 2.5 cm) filled with carboraffin carbon and washed with dist. Water rewashed until the passage is free of po 4 3- and al-. The bleeding takes place with ethanol: H 20 : NR4OH (33%) (50: 50: 1). The fractions absorbing in UV light at 260 m 4i (or by TW ; system butanol: H 20 : glacial acetic acid = 50: 25 : 15 on silica gel PF 254 RF = 0.6) are combined and concentrated to 200 ml.

Das Konzentrat wird über einer Ionenaustauschersäule (Dowex 50 11 + Form; 1 m Länge, 2 cm 0) von Kationen befreit und das saure Bluat mit Barytlauge auf pli 7,0 neutralisiert. Der ausgefallene Niederschlag wird abzentrifugiert,-gut mit H 2 0 gewaschen und die Überstände auf etwa 40 bis 50 ml konzentriert. Dieses Konzentrat wird mit 500 ml Methanol versetzt, der Niederschlag abzentrifugiert und mit 807'4aigem Methanol gewaschen. Die vereinigten Überstände werden mit Barytlauge auf pIl 10 bis 11 gestellt und nach 20 Ylinuten bei ilaumtemperatur mit 2 n Schwefelsäure auf pH 7 neutralisiert. Der Niederschlag wird abzentrifugiertmit wenig 80jAigem Methanoi gewaschen und die vereinigten Lösunigen auf 50 ml konzentriert. Dem Konzentrat werdenzuerst 100 ml Methanol und dann 500 ml Äther zugesetzt. Den ausgefallenen Niederschlag zentrifu-I giert man ab, wäscht ihn zweimal mit Äther und trocknet im Vakuum über CaC12.The concentrate is freed of cations over an ion exchange column (Dowex 50 11 + shape; 1 m length, 2 cm 0) and the acidic blood is neutralized to pH 7.0 with barite liquor. The precipitate is centrifuged off, -good with H 2 0 washed and the supernatants to about 40 to 50 ml concentrated. 500 ml of methanol are added to this concentrate, the precipitate is centrifuged off and washed with 807% methanol. The combined supernatants are adjusted to pH 10 to 11 with barite liquor and, after 20 minutes at room temperature, neutralized to pH 7 with 2N sulfuric acid. The precipitate is centrifuged off, washed with a little 80% methanol and the combined solutions concentrated to 50 ml. First 100 ml of methanol and then 500 ml of ether are added to the concentrate. The deposited precipitate is centrifuged off, washed twice with ether and dried in vacuo over CaCl2.

Ausbeute: 13 g 6-Chlorpurinribofuranosid-3'951-monophoaphat-cyclischbariumsalz (51 der Theorie) bezogen auf 100 % reines BaSalz (0,5 Ba/MolekUl Analyse für C H N 0 Cl 2 Ba 10 9 4 6 .1 /2- Berechnet: PO 7,5' N 1394 Cl 8e5 Ba 16,5 4 Gefunden: 793 13,2 8P3 16,8 % Elektrophoretisches Verhalten: Mobilität in 0,05 m Triäthylammonium-Bicarbonat 2uffer PH 7,5, 10 V/emp 2 Std. = 0,87 (gegen Inosin-3",5'-VIP 190) UV-Spektrum: -1 max = 264--mii ..Quotient 250/260 mg = 0980 280/260 u4i = 0917 290/260 u41 0,02 Yield: 13 g of 6-chloropurine ribofuranoside-3,951-monophoaphate-cyclic barium salt (51 of theory) based on 100% pure Ba salt (0.5 Ba / molecule Analysis for C H N 0 Cl 2 Ba 10 9 4 6 .1 / 2- Calculated: PO 7.5 'N 1394 Cl 8e5 Ba 16.5 4th Found: 793 13.2 8P3 16.8% Electrophoretic behavior: Mobility in 0.05 m triethylammonium bicarbonate buffer pH 7.5, 10 V / emp 2 hours = 0.87 (against inosine 3 ", 5'-VIP 190) UV spectrum: -1 max = 264 - mii .. quotient 250/260 mg = 0980 280/260 u4i = 0917 290/260 u41 0.02

Claims

P atentans p r ü che 1. 6-Chlorpurinribonueleosid-31,51-cyclo phosphate of the general formula in which R is a hydrogen atom, a hydroxyl or amino group, as well as their salts with physiologically compatible bases.

2. Process for the preparation of the compounds of claim 1, characterized in that a 6-hydroxypurine ribonueleoside-3 ', 5lcyclophosphate reacted with an acylating agent in the presence of a base, unreacted acylating agent and base removed and the residue with excess 20C1 3 at a temperature is implemented between the ramming temperature and the reflux temperature. 3. The method according to claim 2, characterized in that the acylation with acetic acid anhydride, acetylochloride or benzoylohloride in the presence of an organic nitrogen base at a temperature between 000 and the reflux temperature is carried out. 4. The method according to claim 3.-characterized in that it is carried out at room temperature and with exclusion of light. 5. The method according to any one of claims 2 to 4, characterized in that residual acylating agent and residual base are removed by washing the residue with an organic solvent, preferably ether. 6. The method according to any one of claims 2 to 5, characterized in that the reaction with 2001 3 is carried out at reflux temperature.