DE1793269B2

DE1793269B2 - Verfahren zur gewinnung von saponinen und sapogeninen

Info

Publication number: DE1793269B2
Application number: DE19681793269
Authority: DE
Inventors: Roland Bradford-on-Avon Wiltshire Hardman (Großbritannien)
Original assignee: National Research Development Corp UK
Current assignee: National Research Development Corp UK
Priority date: 1967-08-30
Filing date: 1968-08-23
Publication date: 1977-03-24
Also published as: US3620919A; DE1793269A1; GB1239555A; FR1604560A; OA02884A; NL6812231A; CH512586A

Description

Pie Erfindung betrifft dit Extraktion von steroidischen Saponinen und Sapogeninen aus pflanzlichem Material.

Sapogenine lieferndes pflanzliches Material wächst in fielen Teilen der Welt Die aus ihnen gewonnenen Sapogenine haben eine erhebliche wirtschaftliche Bedeutung. Man kann sie als Ausgangsmaterial für die Herstellung verschiedener biologisch aktiver steroidischer Verbindungen verwenden, insbesondere zur Herstellung von Corticosteroiden. Zu den wirtschaftlich wichtigen Sapogeninen gehören Diosgenin, Hecogenin und die Sapogenine aus Solanum. die alle steroidische Alkaloide sind. Sapogenine befinden sich üblicherweise in pflanzlichem Material in der Form von Saponinen in verhältnismäßig kleinen Mengen von beispielsweise etwa 2%. Es ist schon viel gearbeitet worden an Verfahren, um sie wirksam zu extrahieren. Hierbei sind tuch schon verschiedene Arten der Vorbehandlung des pflanzlichen Materials vorgesehen worden, um die Menge des erhältlichen Sapogenins zu erhöhen oder um das Verfahren wirksamer zu machen. Zu diesen Verfahren gehört beispielsweise das Fermentieren des pflanzlichen Materials vor der Extraktion oder das mechanische Zerkleinern des Materials, um die Zellwände so weitgehend wie möglich zu brechen.

Es wurde nun gefunden, daß die Gesamtmenge des zu gewinnenden Sapogenins erhöht werden kann, wenn man dasjenige pflanzliche Material, aus welchem das Sapogenin gewonnen werden soll, vor der Gewinnung des Sapogenins mit bestimmten Stoffen behandelt, welche den pflanzlichen Stoffwechsel beeinflussen. Welche Umsetzungen hierbei stattfinden, ist nicht genau bekannt. Vielleicht fördern diese Stoffe die Biosynthese von Sapogenin lieferndem Material, z. B. durch Förderung der Enzymaktivität, oder vielleicht hindern sie die Wirksamkeit von Enzymen, welche das Sapogenin liefernde Material abbauen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von steroidischen Saponinen oder Sapogeiiinen aus steroidischen Sapogenine lieferndem pflanzlichen Material. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man das pflanzliche Material vor der Gewinnung der Saponine oder Sapogenine mit einem Regulator behandelt, der den normalen pflanzlichen Stoffwechsel oder das normale pflanzliche Wachstum ändert. Bei Anwendung des Verfahrens werden erhöhte Ausbeuten an steroidischen Saponinen oder Sapogeninen erhalten im Vergleich mit sonst ähnlichen Verfahren, aber ohne Anwendung eines Regulators.

Es ist noch nicht gelungen, die Wirksamkeit des Regulators in Verbindung zu setzen mit bestimmten chemischen Strukturen. Immerhin gehören die wirksamen erfindungsgemäß zu verwendenden Regulatoren, die in der Regel organische Verbindungen sind, zu einer verhältnismäßig kleinen Anzahl von Gruppen mit anerkannten biologischen Aktivitäten. Diese Gruppen sind:

(a) natürliche, das Pflanzenwachstum beeinflussende Regulatoren, einschließlich der Auxine und Hormone,

(b) synthetische, das Pflanzenwachstum beeinflussende Regulatoren, einschließlich der Auxine, Hormone und Herbicide,

(c) Sulphydryl-Inhibitoren,

(d) Regulatoren des Lipid-Stoffwechsels,

(e) Regulatoren des Steroid-Stoffwechsels,

(f) natürlich vorkommende und racemische Λ-Aminosäuren.

(g) Vitamine der Gruppe B, Rutin und wasserlösliche

Derivate von Vitamin A und Tocopherol,
(h) Analoge von Wachstumsfaktoren, wie Vitamin-An-

timelabolite und Aminosäuren-Antimetabolite,
(i) Antibiotica aus der Klasse der Penicilline, der

Griseofulvine und der Chloramphenieole.
Die erfindungsgemäß zu verwendenden Regulatoren können auch mehr als eine der obengenannten Eigenschaften haben und können daher auch in mehr als ίο eine der Klassen (a) bis (i) eingeordnet werden. Man kann auch Mischungen solcher Stoffe verwenden. Diese Mischungen werden weiter unten mehr im einzelnen besprochen.

Es gibt natürlich erhebliche Unterschiede bei den biologischen Aktivitäten dieser Klassen. Ein aus mehreren Enzymen bestehendes System wirkt innerhalb des pflanzlichen Materials, welches das Sapogenin liefert. Der anwesende Regulator kann direkt wirken durch Förderung der Biosynthese von Saponin oder durch Verhinderung des Abbaus von Saponin. Die Wirkung kann aber auch auf einem mehr indirekten Wege erreicht werden. So braucht beispielsweise der Regulator nicht selbst ein Regulator für das Enzym zu sein, sondern kann durch die Wirkung der endogenen Enzyme oder eines weiteren Regulators chemisch oder physikalisch in einen Regulator übergeführt werden. Der Regulator kann in einigen Fällen auch so wirken, daß er nicht die Bildung oder die Freisetzung des Sapogenins fördert, sondern auf gewisse Prozesse innerhalb der Zellen einwirkt, durch welche im Endeffekt eine Erhöhung der Ausbeute an Sapogenin erzielt wird.

Nachstehend werden einige erfindungsgemäß zu verwendende Regulatoren genannt. Durch diese bei-.15 spielsweise Aufzählung soll aber der Umfang der Erfindung nicht eingeschränkt werden.
Klasse (a)

Natürlich vorkommende, das Pflanzenwachstum beeinflussende Regulatoren: 3-Indol-Essigsäure, Gibberclline, Kinetin (6-Furfurylaminopurin), Traumasäure (traumatic acid), Abscissinsäure (abscissic acid).
Klasse (b)

Synthetische, das Pflanzenwachstum beeinflussende Regulatoren: Derivate der Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Maleinsäure, Acrylsäure, Benzoesäure und Picolinsäure, beispielsweise 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure und andere chlorierte Phenoxyalkansäuren, ebenso ihre Salze, Ester und Amide,

Trichloressigsäure, 4-Amino-3,5,6-trichlorpicolinsäure;

Derivate des Naphthalins, z. B. Methyl-1-naphthalin-acetat;

Bipyridylium-Herbicide, z. B. 1,1 '-Äthylen-2,2'-bipyridyliumdibromid und
l,r-Dimethyl-4,4'-bipyridyliumdichlorid;
Carbamate, z. B. Isopropyl-N-(3-chlorphenyl)-carbamat;

Amide, z. B. 2-Chlor-N,N-diallyl-acetamid;
Harnstoffverbindungen, z. B. N'-(4-Chlorphenyl)-N,N-dimethylharnstoff;
Diazine, z. B. !^,S.ö-Tetrahydro-S.e-dioxopyridazin;

f>5 Triazine, z. B. 2-Chlor-4-äthylamino-6-iso

propylamino-1,3,5-triazin:
Phenole, z. B. 2-(I -Methylpropyl)-4,6-dinitroDhenol:

substituierte Uracile ζ. B. 5-Brom-3-sec-butyl-6-methyluracil;

verschiedene Herbicide, wie Äthylen-glycolbistrichloracetat;

23,6-Trichlorbenzyloxypropano!· 2,6-Dichlorbenzonitril;3-Amino-l,2,4-triazol;
2,6-Dichlor-thiobenzamid;
Disulphide wie Di-(äthoxythiocarbonyl)-disulphid;

organische Arsenverbindungen, z. B.

Dinttrium-Methan-Arsonat;
N-6-Benzyladenin.
Klasse (c)

Sulphydryl-Inhibitoren: Derivate der Milchsäure und Maleinsäure, Indole, z.B. N-Äthylmalemid, N-Phenylmalemid, DL-3-Indolmilchsäure, 5-Hydroxyindol, 3-Methylindol; Jodessigsäure, Jodosobenzoesäureund Jodacetamid.
Klasse (d)

Regulatoren des Lipid-Stoffwechsels: Die Enzympräparation Vasolastine (Enzypharm C. V.).
Klasse (e)

Regulatoren des Steroid-Stoffwechsels:
Äthyl-a-(4-chlorphenoxy)-«-methylpropionat;
2-(p-Chlorphenyl)-1 -[p-[2-(diäthyl-

amino)Äthoxy]-phenyl]-1 -p-tolyl-äthanol;
Lipostabil, ein Präparat aus der Sojabohne.
Klasse (0

Natürlich vorkommende und racemische Aminosäuren: L-Valin, L-Threonin, DL-Isoleuch, L-Leucm.
Klasse (g)

Vitamine der Gruppe B: Cholinchlorid, Pyridoxalhydrochlorid. Riboflavin, Thiaminhydrochlorid, vitamiinische Wachstumsfaktoren wie Präparate aus Hefe, Baumwollsamen, Getreide und Sojabohnen. Solche Präparate enthalten in der Regel auch Aminosäuren.
Klasse (h)

Λ-Picolinsäurehydrochlorid, DL-Desthiobiotin, Al- 4c lyl-DL-glycin.
Klasse (i)

Antibiotica: Das Natriumsalz von Penicillin G, Chloramphenicol, Griseofulvin.

Im Anschluß an den erfindungsgemäßen Verfahrensschritt können die Sapogenine durch bekannte Verfahren direkt aus dem pflanzlichen Materia! gewonnen werden, z. B. dadurch, daß man das behandelte pflanzliche Material mit einem Stoff behandelt, der wie eine wäßrige Säure oder Wasser unter Druck die glycosidischen Bindungen hydrolysierend spalten kann. Dann gewinnt man die Sapogenine aus dem Hydrolyseprodukt, z. B. durch Extraktion mit einem Lösungsmittel. Man kann aber auch die Sapogenine indirekt aus dem pflanzlichen Material gewinnen, und zwar durch Extrahieren des behandelten pflanzlichen Materials mit einem Lösungsmittel für Saponin wie Methanol. Anschließend hydrolysiert man die glycosidischen Bindungen in dem Extrakt mit einer Säure, um die Sapogenine freizusetzen. Diese können Cmn aus dem ho Hydrolysat gewonnen werden, z. B. durch Extraktion mit einem Lösungsmittel. Bei beiden Wegen sollte die Behandlung mit dem Regulator vor der Hydrolyse durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft insbeson- fts dere die Gewinnung von steroidischen Stoffen aus dem Material von Monocotyledonen, die als Rohmaterial für die Gewinnung von Sapogeninen schon verwendet werden, z. B. die Früchte, Blätter, Sprossen, Rhizome, Knollen oder Wurzeln von Dioscoreaceen, Liliaceen und Amaryllidaceen. Hierzu gehören insbesondere die verschiedenen Dioscoreaceen, wie Dioscorea sylvatica, Dioscorea composita, Dioscorea floribunda, Dioscorea mexicana, Dioscorea tokoro, Dioscorea deltoidea und andere Arten, wie Tamus, Agave, Aletris, Asparagus, Similax, Trillium, Yucca. Man kann das erfindungsgemäße Verfahren aber auch zur Gewinnung von Sapogeninen aus Dicotyledonen verwenden, z. B. aus Leguminosen, Solanaceen, Balanitaceen und Zygophyllaceen, insbesondere aus den Samen und Früchten von Trigonella, Trifolium, Solanum und Balanites, wie Trigonella foenumgraecum, Trigonella coerulea, Trigonella corniculata, Trigonella cretica, Trifolium ornithopodiodes, Solanum laciniatum, Solanum khasianum, Balanites aegyptiaca (Balanites roxburghii), Balanites orbicularis, Balanites pedicellaris und Balanites wilsoniana.

Es ist schon vorgeschlagen, pflanzliches, Sapogenin lieferndes Material zu incubieren, und zwar dadurch, daß man es eine geeignete Zeit lang in einem wäßrigen Medium hält, häufig bei erhöhter Temperatur. Wenn erforderlich, gibt man dem pflanzlichen Material Wasser in solcher Menge zu, daß während der ganzen Incubationsperiode eine gesonderte wäßrige Phase besteht. Diese Vorbehandlung kann mit Vorteil in das erfindungsgemäße Verfahren eingeschlossen v/erden. Wenn man diese Incubation durchführt, z. B. während einer Zeitdauer von 1 bis 30 Tagen, und in Gegenwart eines Regulators, der bei Beginn oder während der Incubationsperiode zugegeben wird, so kann die Ausbeute an Sapogeninen erhöht werden. Ein Teil der erhöhten Ausbeute ist wahrscheinlich mit der Incubation selbst zu erklären. Vergleichsversuche haben aber gezeigt, daß die erhöhte Ausbeute zu einem wesentlichen Teil auf der Gegenwart des Regulators beruht. Auch dann, wenn der Regulator erst kurz vor der Gewinnung des steroidischen Materials, d. h. kurz vor der Hydrolyse, zugegeben wird, so wird die Menge des gewinnbaren Sapogenins erhöht im Vergleich zu Kontrollextraktionen ohne Regulator. Bei dieser Durchführungsform des Verfahrens kann man das pflanzliche Material in Gegenwart eines wäßrigen Mediums beispielsweise 1 bis 30 Tage lang incubieren, dann mit dem Regulator behandeln und hydrolysieren. Selbstverständlich ist die Incubation aber nicht zwingend notwendig.

Wie schon bemerkt, beeinflußt der Regulator die Biosynthese des Sapogenin liefernden Materials und bewirkt eine erhöhte Ausbeute. Wahrscheinlich nimmt der Regulator aber nicht selbst teil an der Biosynthese. Daher braucht man lediglich kleine Mengen des Regulators zuzusetzen, in der Regel nicht mehr als etwa 1000 Gew.-Teile je eine Million Gew.-Teile lufttrockenes Pflanzenmaterial mit einem Wassergehalt von nicht mehr als 10%. Typische Mengen liegen bei 50 bis 100 Gew.-Teilen Regulator auf eine Million Gew.-Teile lufttrockenes Pflanzenmaterial.

Der Regulator kann als reiner chemischer Stoff oder in Form von Gemischen zugegeben werden, die den Regulator als aktive Substanz enthalten.

Zu behandelndes Pflanzenmaterial in Form von Knollen kann vor der Behandlung zerkleinert werden, damit die Flüssigkeiten einen freien Zutritt zu allen Teilen haben. Knollen kann man z. B. zu dünnen Scheiben zerschneiden, und dann so zerkleinern, daß die Zellwände zerbrochen werden. Man kann die Scheiben

auch trocknen und dann pulvern. Eine Vorbehandlung kann auch darin bestehen, daß man das pflanzliche Material mit abbauenden Enzymen wie Cellulase oder Pectinase incubiert. Dadurch werden der Regulator und später das hydrolysierende Mittel in Berührung mit einer möglichst großen Anzahl von Zellen gebracht. Verwendet man eine Vorbehandlung mit einem Enzym, so werden diese Vorbehandlung und die erwähnte Incubation am besten gleichzeitig durchgeführt. Der Regulator kann zu einem beliebigen Zeitpunkt während der Incubationsperiode zugesetzt werden.

Die Incubation in Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise so durchgeführt, daß man eine genügende Menge Wasser dem pflanzlichen Material zusetzt, so daß beim Ende der Incubationsperiode eine besondere wäßrige Phase vorhanden ist. Zusätzliches Wasser ist in der Regel erforderlich bei der Behandlung von Samen und getrockneten Knollen und Blättern. Das Gemisch wird vorzugsweise bei einer erhöhten Temperatur, beispielsweise von 25 bis 40° C oder herauf bis zu 80°C, gehalten, und zwar in Gegenwart des zugesetzten Regulators. Die Ausbeute an Sapogeninen ist abhängig von der lncubationsdauer und von der Incubationstemperatur. Während der Incubation wird das steroidische Material laufend biosynthetisiert und laufend abgebaut. Zur Feststellung der optimalen Incubationszeiten und -temperaturen können einfache Versuche durchgeführt werden.

Die Gewinnung der Sapogenine aus dem behandelten Produkt kann so geschehen, daß man es mit einer Mineralsäure behandelt, wobei die glycosidischen Bindungen hydrolysiert werden. Man kann beispielsweise ein Incubationsprodukt unter Rückfluß mit 2normaler Chlorwasserstoffsäure 5 Stunden lang erwärmen, wobei die in Säure unlöslichen Sapogenine freigesetzt werden. Anstelle von Salzsäure können auch andere nichtoxydierende Mineralsäuren, wie Schwefelsäure, verwendet werden, ebenso auch weitere Säuren oder saure Salze. Das in den Säuren unlösliche Material wird dann von dem Hydrolysat getrennt, z. B. durch Filtrieren oder Abschleudern. Aus dem säurefreien unlöslichen Rückstand können die Sapogenine dann mit einem Lösungsmittel wie Petroläther extrahiert werden.

Verwendet man ein Material von Dicotyledonen, z. B. Samen, so sollten diese nicht zu stark zerkleinert werden, wie es beispielsweise in der britischen Patentschrift 11 36 626 beschrieben ist. Es kann aber angebracht sein, größere Samenkörner, z. B. von Balanites, zu kleineren Stücken zu zerkleinern, öle enthaltende Samen, z. B. von Balanites, werden vorzugsweise vor der Zugabe des Regulators wenigstens teilweise entfettet

Zur Herstellung des Ausgangsmaterials kann das pflanzliche Material nach dem Verfahren der britischen Patentschrift 11 98 626 mit bestimmten gesättigten Kohlenwasserstoffen, die am Stoffwechsel wahrscheinlich teilnehmen, vorbehandelt werden.

Die hierbei zv verwendenden gesättigten Kohlenwasserstoffe sind solche mit 10 bis 36 Kohlenstoffatomen im Molekül. Hierzu gehören beispielsweise n-Hexadecan, n-Eicosan, n-Pentacosan, n-Hexacosan und n-Octacosan. Ebenso können auch Kohlenwasserstoffe mit verzweigter Kette verwendet werden, z.B. Squalan (2,6,10,15,19,23-HexamethyItetracosan). Ähnliche Erfolge können erzielt werden bei Verwendung des Regulators zusammen mit Vorläufern von Steroiden, z.B. Mevalonsäure oder ihre Derivate oder Squalen.

Vielleicht können die besonders hohen Ausbeuten an Sapogenin damit erklärt werden, daß ciic eingeführten gesättigten Kohlenwasserstoffe oder die Vorläufer eines Steroids während der Incubation Sapogenine biosynthetisieren. Vielleicht nehmen diese Stoffe direkt oder indirekt an der Biosynthese teil. Die Gegenwart des Regulators verringert hierbei die Verluste an Sapogenin.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit besonderem Erfolg anwendbar bei der Extraktion von Sapogeninen wie Diosgenin aus Pflanzen der Gattungen Dioscorea, Trigonella und Balanites. Die nachstehenden Beispiele erläutern das Verfahren. Die Mengenangaben des Regulators beziehen sich auf das Gewicht des pflanzlichen Materials in dem Zustande, in welchem es jeweils verwendet wurde. Das ist ein an Luft getrocknetes Material, das weniger als 10% Wasser enthält. Die Ausbeuten sind angegeben in bezug auf wasserfreies, pflanzliches Material.

Beispiel 1

Behandeln von Dioscorea deltoidea mit lndol-3-Essigsäure (IAA) als Regulator.

G. I.Verfahren A
Saure Hydrolyse allein

100 g getrocknete und zerkleinerte Knollen von Dioscorea deltoidea mit Teilchengrößen unter 2 mm und einem Feuchtigkeitsgehalt von 5,5% wurden unter Rückfluß mit 730 ml 2-normaler Chlorwasserstoffsäure in einer konischen Flasche mit einem Fassungsvermögen von 2 1 2 Stunden lang gekocht. Dann kühlte man die Mischung auf Raumtemperatur ab, sammelte das in Säure unlösliche Material, wusch es mit Wasser und dann mit einer 5%igen Ammoniaklösung bis zur alkalischen Reaktion. Man trocknete den unlöslichen Rückstand 16 Stunden lang bei 6O⁰C und verkleinerte ihn in einer Handmühle so weit, daß alle Teilchen einen Durchmeser von weniger als 1,7 mm hatten. Dieses Pulver wurde in einer Soxhlet-Apparatur 48 Stunden lang mit 1200 ml Leichtpetroleum mit einem Siedebereich von 40 bis 6O⁰C extrahiert. Den Pelroleumextrakt ließ man 16 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen. Das kristalline Diosgenin wurde abgefiltert und mit Leichtpetroleum gewaschen, wobei ein erster Anteil an weißen Kristallen anfiel. Die Mutterlauge und die WasJiwässer wurden bis auf ein Volumen von 200 ml eingeengt. Hierbei entstand ein zweiter Anteil von weißen Kristallen.

G. 2. Verfahren B/b Saure Hydrolyse mit einem Regulator

2,5 ml einer Lösung von lndol-3-Essigsäure (48 mg in 10 ml absolutem Alkohol) wurde in eine 2 Liter fassende konische Flasche einpipettiert Man ließ über Nacht verdampfen. In die Flasche gab man 100 g gepulverte Knollen und 730 ml 2normaler Chlorwasserstoffsäure. Die Behandlung wurde dann ebenso und ebenso lang fortgesetzt, wie es oben unter G. 1. beschrieben ist

G. 3. Verfahren C Incubation ohne Regulator

In eine 2 Liter fassende Flasche wurden 100 g des oben beschriebenen pflanzlichen Materials gebracht Man gab 600 ml Leitungswasser zu und schüttelte 2

709 512/322

Minuten lang. Dann brachte man die Flasche in einen iunklen Incubator und ließ 48 Stunden lang bei 37°C itehen. 2 Stunden nach dem Einbringen wurde die Flasche geschüttelt, und ebenso nach weiteren 22

10

Stunden. Dann gab man 130 ml konzentrierte Chlorwasserstoffsäure zu, kochte unter Rückfluß und arbeitete ebenso auf, wie es unter G. !.beschrieben ist.

G. 4. Verfahren C Incubation mit Regulator

Wie unter G. 2. beschrieben, wurde der Regulator in eine 2 Liter fassende Flasche gegeben. Am nächsten Morgen gab man die gepulverten Knollen zu, so daß die Incubation zu derselben Zeit begann wie bei G. 3. Die beiden Versuche wurden dann zusammen durchgeführt.

IO Die Konzentrationen des Regulators und die Incubationszeiten sind in der Tabelle 1 wiedergegeben. Die Ausbeuten geben die Gewichtsmengen von Sapogenin an, das tatsächlich als festes Material gewonnen wurde.

Tabelle I

Beispiel	Verfahren	Regulator	lncubations-	Ausbeute	in g	Schmelzpunkt, °C	2. Am.	Gesamt- ausbeute an
				1. Ant.	2. Ant.	1. Anl.		Sapogenin
		p.p.m.	Stunden				206-7	%
G 1	A	0	0	3,11	0,82	210	207-8	4,16
G2	B/b	20	0	3,43	0,63	209	205-6	4,30
G3	C	0	48	4,21	0,54	210	206-7	5,02
G4	C	20	48	4,00	1,04	210	5,33

Ein Vergleich von G 2 mit G 1 und von G 4 mit G 3 zeigt, daß der Regulator eine günstige Wirkung hat. _v>

Die Verwendung von IAA als Regulator wurde in weitern Versuchen geprüft, wobei die Mengen an IAA und die Dauer der lncubationen wie folgt waren:

Das Verfahren C wurde abgeändert zum Verfahren D/a, wobei die Incubation ohne Regulator durchgeführt wurde, wobei man aber den Regulator nach der Chlorwasserstoffsäure und vor der Hydrolyse zugab. Bei dem Versuch D/b wurde die Incubation ohne Regulator durchgeführt, und man gab den Regulator vor der Zugabe der Chlorwasserstoffe und vor der sauren Hydrolyse zu. Bei den Versuchen 1-16 wurden jeweils 2,5 g von getrockneten Knollen der Dioscorea deltoidea in eine Flasche gebracht, die gegebenenfalls IAA enthielt. Das IAA wurde als Lösung in Äthanol zugegeben, worauf das Lösungsmittel entfernt wurde. Dann gab man jeweils 25 ml Leitungswasser zu. schüttelte die Mischung 5 Minuten lang, wusch die Wände der Flasche mit weiteren 25 ml Leitungswasser und brachte die Flasche in einen auf 37°C gehaltenen dunklen Incubator. Dann wurde das Produkt hydrolysiert und das in Säure unlösliche Material so extrahiert, wie es beim Verfahren A beschrieben ist. Man erhielt rohes Diosgenin. Dieses Produkt wurde dann durch Dünnschicht-Chromatographie untersucht, wobei mar einen Chromoscan-Densitometer verwendete. Die Ergebnisse sind in der Tabelle II enthalten.

Tabelle II

Versuch Nr. Verfahren Regulator- Ineubationsdauer Chromoscan-

Konzentration Sapogenin-

p.p.m. Stunden Ausbeute in %

1	A	0	0	4,20
2	B/b	200	0	4.31
3	C	0	24	4,68
4	C	0	48	4,65
5	C	0	72	4,68
6	C	2	24	4.98
7	C	2	48	5,18
8	C	2	72	5,24
9	C	20	24	5.18
10	C	20	48	5,41
11	C	20	72	5.21
12	C	200	24	5.31
13	C	200	48	5,40
14	C	200	72	5.24
15	D/b	200	48	5,55
16	D/a	200	48	5.43

Ein Vergleich der Ergebnisse zeigt die günstige Wirkung des Regulators.

11 ' 12

Beispiel 2

Behandlung von Dioscorea deltoidea mit Giberellin (A + X)

Die in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden im ? Research Laboratories Inc. hergestellt war. Die selben Maßstab wiederholt, wobei man als Regulator Ergebnisse sind in den Tabellen III und IV enthalten. Giberellin (A + X) verwendete, das von der Firma Mann

Tabelle III	Verfahren	Regulator	lncubations-	Ausbeule	in g	Schmelzpunkt, °C	2. Anteil	Gesamt
Versuch			zeu					ausbeute an
				1. Anteil	2. Anteil	1. Anteil	206-7	Sapogenin
		p.p.m.	Stunden				197-8	%
	A	0	0	2.83	0,86	209	207-8	3,91
G5	B/b	20	0	3,68	0,07	210	207-8	3,97
G 6	A	0	72	3,58	0,99	210		4.84
G7	C	20	72	3,32	1,66	210	5,29
G8

Ein Vergleich von G 6 mit G 5 und von G 8 mit G 7 zeigt die günstige Wirkung des Regulators.

Tabelle IV	Verfahren	Regulator	lncubations-	Ausbeute an
Versuch		konzentration	dauer	Sapogenin
Nr.		p.p.m.	Stunden	%
	A	0	0	4,20
1	B/b	200	0	4,52
2	C	0	24	4.68
3	C	0	48	4,65
4	C	0	72	4,68
5	C	2	24	5,00
6	C	2	48	5.30
7	C	2	72	5.18
8	C	20	24	4,91
9	C	20	48	5,42
10	C	20	72	5,86
11	C	200	24	5,18
12	C	200	48	4,98
13	C	200	72	5,17
14	D/b	200	48	5,05
15	D/a	200	48	5,05
16

Auch diese Versuche zeigen die günstige Wirkung des Regulators.

Beispiel 3 Behandlung von Trigonella foenumgraecum mit lndol-3-Essigsäure (IAA)

5 g unzerkleinerter Samen von Trigonella foenumgraecum wurden zu 25 ml Leitungswasser gegeben. Man incubierte das Gemisch im Dunkeln 6 bzw. 24 Stunden lang bei 37* C. Dann gab man Chlorwasserstoffsäure zu, so daß eine 2normale Lösung entstand. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt Nach dem Abkühlen filtrierte man ab, wusch den in Säure unlöslichen Rückstand mit Wasser und verdünntem Ammoniak, bis alle Säurespuren entfernt waren, trocknete und extrahierte mit Petroläther in einer Soxhlet-Apparatur. Das organische Lösungsmittel wurde dann verdampft, wobei ein Rückstand von rohem Diosgenin anfiel. Verschiedene Mengen von IAA wurden dem Gemisch zugegeben, bevor man es in den Incubator brachte. Ein Vergleichsversuch wurde ohne Incubation durchgeführt, wobei div. Samen sofort sauer

hydrolysiert wurden. Die Ausbeuten wurden durcl Untersuchung des Rohprodukts in Chloroform unte: Verwendung eines Infrarot-Spektrophotometers fest gestellt

Tabelle V

Ausbeute an Sapogenin in %

Incubationsdauer, Std.
0 6 24

Trigonella allein 1,13 1,06 1,01

Trigonella + 1 p.p.m. IAA 13Γ 137

Trigonella + 10 p.p.m. IAA 1,26 13Ί

Trigonella+100 p.p.m. IAA 1,29 134

Trigonella +800 p.p.m. IAA 1,11 1,14 1,«

Beispiel 4 Behandlung von Trigonella foenumgraecum

mitGibberellinen

Die im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren wurden wiederholt, wobei man eine 10%ige Lösung des Kaliumsalzes von Gibberellin-Säure anstelle von IAA verwendete. Die Ergebnisse sind in den Tabellen Vl und VIl enthalten.

Tabelle Vl

Gibberellin (A+ X)

Ausbeute an Sapogenin in %

Incubationsdauer. Std. 0 6 24

Trigonella allein

Trigonella + 1 p.p.m.

Regulator

Trigonella + 10 p.p.m.

Regulator

Trigonella +100 p.p.m.

Regulator

Tabelle VII

1,13

1,06 1,28

1,09 1,14

1,01 1.33

1,29 1.29

Saures Kaliumsalz der Gibberellin- Ausbeute an Sapogenin säure (10%) in %

Incubationsdauer, Std. 0 6 24

Trigonella	allein	1,13	1,06	1,01
Trigonella	+ 1 p.p.m.		1,28	1,29
Regulator
Trigonella	+ 10 p.p.m.		1,10	1,19
Regulator
Trigonella	+ 100 p.p.m.		1,19	1,34
Regulator

Beispiel 5

Das Verfahren C nach Beispiel 1 wurde wiederholt zur Behandlung von Dioscorea deltoidea, Trigonella s foenumgraecum ode¹· Balanites aegyptica mit verschie denen Regulatoren und verschiedenen Incubationsdauern bei 37⁰C. Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen in den Spalten D, F und B wiedergegeben. Nach der Incubation wurde das Material sauer

ίο hydrolysiert, so wie es bei Verfahren A des Beispiels 1 beschrieben ist. Wenn nichts anderes angegeben ist, so wurde der Gehalt des Sapogenins in dem Hydrolysat durch Infrarot-Spektroskopie festgestellt. * bedeutet, daß die Ergebnisse mit der Chromoscan-Vorrichtung

is nach Beispiel 1 erhalten sind. Die Ausbeute ist in Prozenten angegeben, bezogen auf das lufttrockene Ausgangsmaterial. Die in der Spalte »Prozentzuwachs« angegebenen Zahlen bedeuten den Zuwachs der Ausbeute, verglichen mit einer Ausbeute unter denselben Bedingungen, aber ohne Regulator.

Die Versuche mit Dioscorea wurden mit Knollen durchgeführt, die an Luft getrocknet und dann zerkleinert waren. Außer dort, wo es anders angegeben ist, wurden die Versuche mit Trigonella mit ganzen Samen durchgeführt. Das Zeichen »4« bedeutet, daß zerkleinerte Samen teilweise entfettet waren. Außer dort, wo es anders angegeben ist, wurden die Versuche mit Balanites mit zerkleinerten Samen durchgeführt, die teilweise entfettet waren (der restliche ölgehalt betrug 3-20Gew.-%).

Die Beispiele 1 bis 4 beschreiben die Verwendung von natürlich vorkommenden Regulatoren des Pflanzenwachstums der Gruppe (a).
Die Verwendung von Stoffen der Gruppen (b) bis (i)

ist in den nachstehenden Tabellen beschrieben.

Regulator

Konzentration p.p.m.

Incubationsdaucr
Stunden

Zunahme in % DFB

Pharmamedia

Proflo

Yeatex granules

Yeatex super

Lipostabil

Vasolastine

10⁵	6	5	28
105	48
105	6	8	39
105	48
5x10"	24		48
2x105	24	42

Pharmamedia ist eine Präparation aus Baumwollsaatkeimen, wobei der Hauptbestandteil ein nicht hydrolysiertes Globularprotein ist

Yeatex ist ein sprühgetrockneter, wäßriger Hefeextrakt Lipostabii ist ein Gemisch von bestimmten Fraktionen von Sojabohnen-Phosphatiden und Pyridoxinhydrochlorid in einem Gewichtsverhältnis von 400 :3. Vasolastin ist erhalten aus Ampullen, die ein Gemisch aus 8000 Einheiten von Enzymen des Lipid-Stoffwechsels, 4000 Einheiten Tyrosin, 400C Einheiten Aminoxidase und ein stabilisierendes Lö sungsmittel enthalten.

Proflo ist teilweise entfettetes gekochtes Baumwoll samenmehl.

Regulator

Konzentration Incubationsdauer Zunahme in % p.p.m. Stunden D F

Äthyl-a-(4-chlorphenoxy)-	105	48
a-methylpropionat
Äthyl-a-(chlorphenoxy)-	5xlCH	24
«-methylpropionat
Äthyl-a-(4-chlorphenoxy)-	5x10<	24
Λ-methylpropionat

34

Fortset/unt!

Regulator	Konzentration	Incubationsdauer	Zunahme in ⁰A	5	6	Ul	8	}	B	8	7
	p.pjn.	Stunden	D	6					6
Alloxan-monohydrat	400	24			6			10	8
Alloxan-monohydrat	400	24		6
N-6-Benzyl-adenin	400	48			5		13·/-	15
2,4-Dichlorphenoxy-Essigsäure	400	24			(JI
2,4,5-Trichlorphenoxy-Essigsäure	400	24	9				9-/-
2,4,5-Trichlorphenoxy- Propion	10,8	12
säure							8
3-Indol-Buttersäure	400	6			14
Jcdessigsäure	400	72	16			7 -f-
Jodessigsäure	400	24			9
Jodoacetamid	400	48	10		7	8-/-
Jodosobenzoesäure	400	6				6
«-Naphthalin- Essigsäure	400	72	5
«-Naphthalin-Essigsäure	400	6			12
«-Naphthalin-Essigsäure	400	24			5
N-Äthyl-maleimid	400	72		13
Maleinsäurehydrazid	400	24		11
Maleinsäurehydrazid	400	6		6
/?-(2-Furyl)-acrylsäure	400	24		8
/3-(2-Furyl)-acrylsäure	400	6		15
1,r-Dimethyl-4,4'-dipyridylium-	1,6x103	24		7
dibromid				15
Nikotinsäureamid	400	24		7
Pyrodoxin-hydrochlorid	400	24		15
Riboflavin	400	6		11
Thiamin-hydrochlorid	400	24		14
D-Calcium-pantothenat	400	24		12
Cholinchlorid	400	24		8
Acetylcholinchlorid	400	24		13
Folsäure	400	24		6
Meso-inositol	400	24		14
Nikotinsäure	400	24		19
Pyridoxal-hydrochlorid	400	24	9
p-Aminobenzoesäure	400	24	14
DL-a-TocopheroIacetat	6x103	6	8
Rutin	400	6	15
Vitamin A, Acetat	400	6	14
DL-Äthionin	400	24	11
DL-3-Thienyl-DL-Alanin	400	24	13
Glycin	400	6	17
Allyl-DL-Glycin	400	6
DL-0-Phenylmilchsäure	400	6
a-Picolinsäurehydrochlorid	400	24
2-Chlor-4-aminobenzoesäure	400	24
Oxythiamin-hydrochlorid	400	24
DL-Desthiobiotin	400	24
Desoxypyridoxin-hydrochlürid	400	6
Chloramohenicol	2x104	24
Propranol-hydrochlorid	2x103	24
Kerbisan-5[diäthyldithio-	4x103	24
bis(thionoformat), 58%]
5-Brom-6-methyl-3-(l-methyl-	400	24
propyl)-uracil
Griseofulvin	5x104	48
Penicillin G₁ Natriumsalz	5x104 Ein	48
	heiten pro g
	lufttrockener
	Knollen
Orotinsäure (Uracil-4-carboxy-	400	48
säure
3-Amino-1,2,4-triasol	400	48
DL-Isoleucin	4x103	48

Beispiel 6

Das Verfahren und die Berechnungen des Beispiels 5 wurden wiederholt, mit dem Unterschiede, daß anstelle eines einzelnen Regulators Mischungen von zwei Regulatoren oder von einem oder mehreren Regulatoren zusammen mit einem Vorläufer eines Steroids oder

einem langkettigen, gesä«igteη

als Vorläufer emes ^s^^^^^S^St Die Ausbeutezunahmen smd bezogen auf vergle.chbare

Versuche ohne Zusätze.

Zusätze

Konzentration p.pjn.

Incubationsdauer Stunden

Ausbeutezunahme in % DFB

(a) DL-Mevalonsäurelacton 2,5XlO⁴ 2,4,5-Trichlorphenoxy-propionsäure 1,08 DL-Mevalonsäurelacton 2,5XlO⁴ zusammen mit 2,4,5-Trichlorphenoxy- 1,08 I propionsäure,

beide zugegeben bei Beginn der Incubation

(b) 2,6,10,15,19,23-Hexamethyl-tetracosa- 1,5x105 2,6,10,14,18,22-hexaen (Squalen) Gibberellinsäure(90% + ) 138 , Squalen 1,5 χ 10⁵ I

zusammen mit Gibberellinsäure (90%+), 138 |

beide zugegeben bei Beginn der Incubation

(c) n-Hexadecan 2x10* zusammen mit Gibberellin (A+ X), 480 beide zugegeben bei Beginn der Incubation

(d) n-Hexadecan 2x105 zusammen mit Gibberellin (A + X) und 480 3-Indol-Essigsäure, 480 alle zugegeben bei Beginn der Incubation n-Hexadecan, 2xlO⁵ zugegeben bei Beginn der Incubation 480 zusammen mit Gibberellin (A+ X)

und 3-lndol-Essigsäure, 480

beide zugegeben 24 Std. nach der Incubation

12 ₁₂

₂4 24

12

36

26

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von steroidischen Saponinen oder Sapogen'.nen aus stereoidische Sapogenine lieferndem pflanzlichen Material, dadurch gekennzeichnet, daß man das pflanzliche Material vor der Gewinnung der Saponine oder Sapogenine mit einem Stoff behandelt, der den normalen pflanzlichen Stoffwechsel oder das norma- ι ο le pflanzliche Wachstum beeinflußt (sog. Regulator) und der einer der nachstehenden Stoffgruppen angehört:

(a) natürliche, das Pflanzenwachstum beeinflussende Regulatoren,

(b) synthetische, das Pflanzenwachstum beeinflussende Regulatoren,

(c) Sulphydryl-Inhibitoren,

(d) Regulatoren des Lipid-Stoffwechsels,

(e) Regulatoren des Steroid-Stoffwechsels,

(f) natürlich vorkommende und racemische α-Ami nosäuren,

(g) Vitamine der Gruppe B, Rutin und wasserlösliche Derivate von Vitamin A und Tocopherol,

(h) Analoge von Wachstumsfaktoren, wie Vitamin-Antimetabolite und Aminosäuren-Antimetabolite,
(i) Antibiotica aus der Klasse der Penicilline, der

Griseofulvine und der Chloramphenicole
und das Verfahren mit Regulatoren, welche das Saponin sauer hytrolysieren, derart durchführt, daß die Ausbeute steigt, ohne daß das Saponin hydrolysiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Regulator Indol-3-Essigsäure oder ein Giberelliri verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Regulator eine chlorierte Phenoxyalkansäure oder ein Salz, einen Ester oder ein Amid einer selchen Säure; lndol-3-Buttersäure; α-Naphthalin-Essigsäure oder ein Salz, einen Ester oder ein Amid dieser Säure; l,l'-DimethyI-4,4'-dipyridylium-dibromid; /?-(2-Furyl)-acrylsäure oder 3-Amino-1,2,4-Triiazol verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch von Enzymen verwendet, die den Lipid-Stoffwechsel regeln.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Regulator N-Äthyl-malmid, Jodessigsäure, Jodosobenzoesäure oder Jodacetamid verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Regulator DL-lsoleucin oder ein Hefepräparat mit einem Gehalt von «-Aminosäuren verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Regulator Nicotinsäure oder ihr Amid, Riboflavin, Thiaminhydrochlorid, D-Calcium-Panthothenat. Cholin-chlorid, Acetylcholinchlorid, Folsäure, Meso-Inositol, Pyridoxalchlorid, p-Aminobenzoesiiure, Stoffe in Extrakten aus Hefe, Baumwollsamen, Getreide oder Sojabohnen, die reich an Vitaminen der Gruppe B sind, oder das Acetat von Vitamin A, das Acetat von DL-a-Tocopherol oder Rutir verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Regulator Glycin, DL-Allylglycin, «-Picolinsiurehydrochlorid, Oxythiaminhydrochlorid, DL-Desthiobiotin oder Desoxypyridoxinhydirochlorid verwendet

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Regulator Chloramphenicol, Griseofulvin oder das Natriumsalz des Penicillin G verwendet.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man den Regulator in einer Mienge bis zu etwa 1000 Gewichtsteilen je 1 000 000 Gewichtsteile lufttrockenes Pflanzenmaterial verwendet

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das pflanzliche Material zuvor mit einem Lösungsmittel für Saponine extrahiert und der Extrakt anschließend unter Spaltung der glycosidischen Bindung sauer hydrolysiert wurde.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet daß das pflanzliche Material zuvor unter hydrolysierenden Bedingungen zur Spaltung der glycoaidischen Bindung behandelt und dann mit einem Lösungsmittel für Sapogenine extrahiert wurde.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung mit dem Regulator vor der Hydrolyse durchführt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das pflanzliche Material in Gegenwart eines wäßrigen Mediums incubiert wurde.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der incubierenden Masse so viel Wasser zugegeben wurde, daß während der ganzen Incubationszeit eine wäßrige Phase besteht.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß man den Regulator bei Beginn oder wa hrend der Incubationsperiode zugibt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das pflanzliche Material vor der Gewinnung des Saponins oder des Sapogenine mit einem Vorläufer eines Steroids in Berührung gebracht wurde.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß als Vorläufer eines Steroids Mevalonsäure, ein Derivat dieser Säure oder Squaler verwendet wurde.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 dadurch gekennzeichnet, daß das pflanzliche Material vor der Gewinnung des Saponins oder des Sapogenins mit einem gesättigten Kohlenwasserstoff mit 10 bis 36 Kohlenstoffatomen im Molekül ir Berührung gebracht wurde.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurcl· gekennzeichnet, daß als gesättigter Kohlenwasser stoff n-Hexadecan, n-Pentacosan oder n-Octacosar verwendet wurde.

21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß als gesättigter Kohlenwasser stoff Squalan verwendet wurde.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 dadurch gekennzeichnet, daß man ein Ausgangsma terial verwendet, das aus den Knollen vor Dioscorea, den Früchten von Solanum ode Balanites oder den Samen von Balanites ode Trigonella gewonnen wurde.