DE1643701B

DE1643701B - Process for the enzymatic production of creatm phosphate

Info

Publication number: DE1643701B
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr rer nat 8132Tutzing C07f 1 02 Beaucamp
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH

Description

trationen über diese Werte hinaus bringt keinen besonderen Vorteil.Tration beyond these values does not bring any particular advantage.

Bei der Umsetzung werden Creatin und 3-Phosphoglycerinsäure in etwa äquimolarem Verhältnis verbraucht. Die Reaktion läßt sich durch Anwendung eines geringen Überschusses eines dieser beiden Stoffe leicht bis zur vollständigen Umsetzung des anderen Reaktionspartners durchführen. Vorzugsweise werden etwa 1,1 bis 1,5 Äquivalente Creatin pro Äquivalent 3-Phosphoglycerinsäure eingesetzt, um eine quantitative Umsetzung der letzteren zu erzielen. Ein Überschuß an Creatin ist von Vorteil, da dieses den wesentlich billigeren Reaktionspartner darstellt. During the implementation, creatine and 3-phosphoglyceric acid are in an approximately equimolar ratio consumed. The reaction can be made by using a slight excess of either of these Carry out substances easily until the other reactant has fully implemented. Preferably about 1.1 to 1.5 equivalents of creatine are used per equivalent of 3-phosphoglyceric acid, to achieve a quantitative implementation of the latter. An excess of creatine is beneficial, since this is the much cheaper reaction partner.

Adenosintriphosphat (abgekürzt ATP) wird nur in katalytischen Mengen zugesetzt. Man verwendet etwa 1 Äquivalent Adenosintriphosphat auf je 60 bis 100 Äquivalente Creatin bzw. 3-Phosphoglycerinsäure. Die Adenosintriphosphatmenge kann natürlich auch erhöht werden, dies ist jedoch aus wirtschaftlichen Gründen unerwünscht und technisch nicht von besonderem Vorteil. Die Adenosintriphosphalmenge kann auch verringert werden. Hierbei erhöht sich jedoch die Reaktionsdauer.Adenosine triphosphate (abbreviated to ATP) is only added in catalytic amounts. One uses about 1 equivalent of adenosine triphosphate for every 60 to 100 equivalents of creatine or 3-phosphoglyceric acid. The amount of adenosine triphosphate can of course also be increased, but this is for economic reasons Reasons undesirable and technically not particularly advantageous. The adenosine triphosphere can also be decreased. However, this increases the reaction time.

Wie bereits erwähnt, ist ein Zusatz von Puffer nicht erforderlich. Der gewünschte alkalische pH-Wert kann mit irgendeinem alkalischen Mittel wie Natronlauge eingestell· werden.As already mentioned, it is not necessary to add a buffer. The desired alkaline pH can be adjusted with any alkaline agent such as caustic soda.

Der geeignete pH-Wert lift zwischen etwa 7,0 und 11, vorzugsweise zwischen 8 und 9. Die Reaktionstemperatur liegt günstig zwischen Zimmertemperatur und etwa 45° C, vorzugsweise zwischen 32 und 40° C. Die angegebene Temperatur kann bei Verwendung einer relativ hohen Enzymkonzentration noch gesteigert werden und auch 50° C noch etwas überschreiten.The suitable pH value lift between about 7.0 and 11, preferably between 8 and 9. The reaction temperature is favorably between room temperature and about 45 ° C, preferably between 32 and 40 ° C. The specified temperature can be achieved when using a relatively high enzyme concentration can still be increased and also exceed 50 ° C a little.

Die Reaktionsdauer hängt von der Temperatur und von der eingesetzten Rohenzymmenge ab. Bei den angegebenen bevorzugten Mengen und Temperaturen beträgt die Ausbeute nach einstündiger Reaktionsdauer etwa 80 bis 9O°/o der Theorie. Durch Verlängerung der Reaktionsdauer bis zu 3 und gegebenenfalls auch 4 Stunden ist unter den genannten Bedingungen die Erzielung einer quantitativen Ausbeute möglich.The reaction time depends on the temperature and the amount of crude enzyme used. at the specified preferred amounts and temperatures is the yield after one hour Reaction time about 80 to 90% of theory. By extending the reaction time up to 3 and possibly also 4 hours is the achievement of a quantitative one under the conditions mentioned Yield possible.

Wenn die Reaktion bis zum gewünschten Umsetzungsgrad fortgeschritten ist, wird sie durch rasches Erhitzen des Reaktionsgemischs auf eine Temperatur von 70 bis 100° C, vorzugsweise 80 bis 90° C abgestoppt. Hierbei flockt Protein aus und wird gegebenenfalls nach dem Abkühlen entfernt, beispielsweise durch Abfiltrieren.When the reaction has progressed to the desired degree of conversion, it is by rapid Heating the reaction mixture to a temperature of 70 to 100 ° C, preferably 80 to 90 ° C stopped. In this process, protein flocculates and is optionally removed after cooling, for example by filtering off.

Die Gewinnung des Creatinphosphats erfolgt durch Abtrennung der Fremdionen, Einengen der Lösung und Fällung durch Zusatz von Alkohol oder einem anderen, die Löslichkeit herabsetzenden Stoff, vorzugsweise unter Animpfen mit Creatinphosphatkristallen. Creatine phosphate is obtained by separating the foreign ions and concentrating them Dissolution and precipitation by adding alcohol or another substance that reduces the solubility, preferably with inoculation with creatine phosphate crystals.

Die Lösung wird bei schwach-alkalischem pH-Wert (vorzugsweise pH 8 bis 8,5) mit einem mit Natrium equilibrierten Kationenaustauscher behandelt. Vorzugsweise wird sie über eine Austauschersäule gezogen. Dem creatinphosphathaltigcn Durchlauf, der dann eingeengt wird, wird Alkohol bis zum Auftreten einer deutlich erkennbaren Trübung zugesetzt. Vorzugsweise wird mit Creatinphosphat angeimpft und die Mischung einige Zeit in der Kälte stehengelassen. Der dabei gebildete Kristallbrei wird vom Überstand abgetrennt. Das so erhaltene Roh-Creatinphosphat wird durch eine, gegebenenfalls zwei Umkristallisationen gereinigtThe solution is at a weakly alkaline pH (preferably pH 8 to 8.5) with a Treated sodium equilibrated cation exchanger. It is preferably via an exchange column drawn. The creatine-phosphate-containing flow, which is then concentrated, becomes alcohol up to Occurrence of a clearly recognizable turbidity added. It is preferred to inoculate with creatine phosphate and let the mixture stand in the cold for some time. The resulting crystal pulp is separated from the supernatant. The crude creatine phosphate obtained in this way is optionally replaced by a Purified two recrystallizations

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.The following examples further illustrate the invention.

example 1

a) Herstellung eines Kaninchenmuskelextraktes.
Kaninchenmuskel wird zerkleinert, homogenisiert und mit Wasser extrahiert. Der pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt und die Mischung 15 Minuten auf 53° C erhitzt. Ausgefallenes Protein wird abzentrifugiert. Dem Überstand wird Ammonsulfat bis zu einer Konzentration von 1,5 M zugesetzt.a) Production of a rabbit muscle extract.
Rabbit muscle is minced, homogenized and extracted with water. The pH is adjusted to 6.5 and the mixture is heated to 53 ° C. for 15 minutes. Precipitated protein is centrifuged off. Ammonium sulfate is added to the supernatant to a concentration of 1.5M.

Eventuell ausfallendes Protein wird abzentrifugiert. Dann wird die Ammonsulfatkonzentration auf 3 M erhöht. Das ausgefallene Protein wird abzentrifugiert und die erhaltene Ammonsulfatpaste nach 3stündiger Dialyse gegen Leitungswasser für die weitere Reaktion eingesetzt. Any protein that has precipitated is centrifuged off. Then the ammonium sulfate concentration increased to 3 sts. The precipitated protein is centrifuged off and the ammonium sulfate paste obtained after 3 hours of dialysis against tap water used for the further reaction.

b) In 1001 Yasser werden 260g Creatin gelöst, dann werden 15 g ATPNa.,H., · 3 H₀O" (entspricht etwa 12 g ATP), 380 g" 3-Phösphoglycerinsäure-Na, 14 g Mg-Acetat, 17 g K-Acetat und 80 g Ammoniumacetat zugegeben und gut gemischt. Mit Natronlauge wird der pH-Wert auf 8,5 eingestellt und die Mischung auf 37° C erwärmt. Nun wird das nach a) erhaltene Enzymgemisch zugegeben, das etwa 80 000 Einheiten Creatinphosphokinase, etwa 100 000 Einheiten Enolase, etwa 100 000 Einheiten Phosphorglyceratmulase und etwa 250 ΓΌΟ Einheiten Pyruvatkinase enthält, duter Konstanthalten des pH-Wertes wird die Mischung 1 bis 3 Stunden bei 37° C belassen.
Nach Ablauf der Reaktion, die durch enzymatische Analyse des gebildeten Creatinphosphats verfolgt werden kann, wird die Mischung rasch auf 80 bis 90° C erhitzt und wieder gekühlt. Das ausgefallene Protein wird gegebenenfalls abfiltriert, und die Lösung wird über 101 mit Natriumhydroxyd behandelten und auf pH 8 bis 9 gewaschenen Kationenaustauscher gezogen. Der schwachgelb gefärbte klare Durchlauf wird gesammelt und eingeengt, bis das Volumen etwa 4 bis 61 beträgt. Nun wird mit 8 bis 121 Alkohol unter gutem Rühren versetzt und bei beginnender Trübung mit kristallisiertem Natrium-Creatinphosphat angeimpft. Die Mischung läßt man über Nacht in der Kälte stehen, saugt den ausgefallenen Kristallbrei ab und wäscht ihn gut mit Alkohol. Nach Umkristallisation wird das Creatinphosphat im Vakuum getrocknet. b) 260 g of creatine are dissolved in 1001 Yasser, then 15 g of ATPNa., H., · 3 H ₀ O "(corresponds to about 12 g of ATP), 380 g of" 3-phosphoglyceric acid Na, 14 g of Mg acetate, 17 g of K acetate and 80 g of ammonium acetate were added and mixed well. The pH value is adjusted to 8.5 with sodium hydroxide solution and the mixture is heated to 37.degree. Now the enzyme mixture obtained according to a) is added, which contains about 80,000 units of creatine phosphokinase, about 100,000 units of enolase, about 100,000 units of phosphorus glycerate mulase and about 250 ΓΌΟ units of pyruvate kinase, the mixture is kept constant for 1 to 3 hours at Leave at 37 ° C.
After the reaction, which can be followed by enzymatic analysis of the creatine phosphate formed, the mixture is quickly heated to 80 to 90 ° C and cooled again. The precipitated protein is filtered off, if necessary, and the solution is drawn over 101 cation exchangers which have been treated with sodium hydroxide and washed to pH 8 to 9. The pale yellow colored clear run-through is collected and concentrated until the volume is about 4-61. 8 to 121 alcohol are then added with thorough stirring and, when the cloud starts to become cloudy, crystallized sodium creatine phosphate is inoculated. The mixture is left to stand in the cold overnight, the precipitated crystal pulp is suctioned off and it is washed well with alcohol. After recrystallization, the creatine phosphate is dried in vacuo.

Ausbeute: 300 bis 350 g Creatinphosphat
(CP-Na., · 6 H„O).Yield: 300 to 350 g of creatine phosphate
(CP-Na., · 6 HO "O).

Example 2

Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen, jedoch wird an Stelle des dialysierten Kaninchen-Rohenzyms ein Kalbfleischextrakt verwendet, der durch Extraktion von frischem zerkleinertem Kalbfleisch mit dem doppelten Volumen Wasser durch Abfiltrieren der festen Bestandteile gewonnen wurde. Es wird sovielThe procedure is as described in Example 1, but instead of the dialyzed Rabbit crude enzyme, a veal extract used by extraction of fresh minced veal with twice the volume of water by filtering off the solid Ingredients was obtained. It will be so much

Extrakt verwendet, daß 50 000 bis 80 000 Einheiten Creatinphosphokinase zur Anwendung kommen.Extract uses that 50,000 to 80,000 units of creatine phosphokinase for use come.

Der Zusatz von Magnesium und Kaliumionen kann hier unterbleiben, da eine ausreichende Menge dieser Ionen bereits im Extrakt vorhanden ist.The addition of magnesium and potassium ions can be omitted here, as they are sufficient Amount of these ions is already present in the extract.

Die Reaktionsdauer beträgt 2 bis 4 Stunden, die Ausbeute 250 bis 300 g. da einmal öfter umkristallisiert werden muß.The reaction time is 2 to 4 hours, the yield 250 to 300 g. there once more must be recrystallized.

Claims

with an aqueous muscle extract creatine phosphate claims: form. However, this is not a preparative process and the yields are good

1. Process for enzymatic production low, although work is carried out on a microscale,
of creatine phosphate by incubating 5 The object of the invention is to create a pre-creatine and 3-phosphoglyceric acid with a parative enzymatic process which can be carried out in aqueous muscle extract in the presence of an extremely simple manner and with good yield in adenosine diphosphate in an alkaline medium and in any dimension is, without stopping the reaction, thus required more expensive starting products,
draws that one uses instead of adenosine io The inventive method for enzymatiphosphate catalytic amounts of adenosine triphos- see production of creatine phosphate by Inkuphat, the reaction by briefly brewing creatine and 3-phosphoglyceric acid with heating the solution to 70 to 100 ° C stops a aqueous muscle extract in the presence of and the creatine phosphate formed isolated therefrom in a manner known to adenosine diphosphate in an alkaline medium and Absich. 15 stopping the reaction is characterized

2. The method according to claim 1, characterized in that, instead of adenosine diphosphate, the catalytic converter indicates that 1.1 to 1.5 equivalents of Crea- see amounts of adenosine triphosphate are used, which set the tin per equivalent of 3-phosphoglyceric acid by briefly heating the solution will. stops at 70 to 100 ° C and the crea-

3. The method according to claim 1 or 2, isodic 20 tin phosphate therefrom in a manner known per se characterized in that the molar ratio lates.

Adenosine triphosphate to creatine about 1:60 to With the method according to the invention it is

Is 1: 100. Surprisingly possible, the above described

to eliminate the most difficult difficulties and to achieve excellent yields in an extremely simple way.

len.

It is also surprising that the enzymatic reaction by heating to the specified Temperature can be stopped because of the

The invention relates to a method for the preparation of the 30 regulation of Linie et al. on a pronounced development of creatine phosphate, which leads to the temperature sensitivity of creatine phosphate suitable on an industrial scale. must be closed and chemical synthesis It is already known to produce creatine phosphate chemically at low temperature, possibly room temperature. One of these procedures is the door that is run. The acid sensitivity of the Phosphorylation of creatine with phosphoroxy- 35 phosphocreatine also prohibits the usual isolating chloride (K. Line and G. Fawaz, Hoppe-Seyler's rungs methods for organic phosphoric acid compound journal for physiological chemistry 256, 193 fertilize, as z. B. for nucleotides or sugar [1938]). The main disadvantages of this phosphate are possible. A brief acknowledgment Process are acidic as well as an exchange chromatography or

3Ϊ bad healed ⁴ ° ^K ° ^cave passage ^{are not without} significant losses

a; Small yield, feasible.

b) The reaction conditions have to be fairly must be adhered to, so that at least this has been found more in the \ weakly alkaline range Yield, and even heating to 80 for 10 minutes

c) the method is not suitable for the implementation of ⁴⁵ 90 ° C from arise without noticeable Verlüde.

on a larger scale, since the resulting _, which are used in the inventive method

Well, "PO, porridge neither stir nor cool. ^{dete muscle} extract can be obtained simply by extraction

of fresh meat, e.g. B. Veal, with water

Also from the United States patent specification 3,036,087 and filtering off the insoluble constituents

known chemical process represents a multi-stage 50 represents. Instead of veal extract

Synthesis, which is useful for large-scale engineering, of course, extracts from muscles can also be used

Implementation unsuitable and cannot be used in the rer origin with equal success.

Has introduced practice. It is important that the muscle extract has a certain amount

An enzymatic phosphorylation of creatine contains amount of creatine phosphokinase, however

for the analytical determination of creatine can in general be much less than it is accordingly

weave was already known (H. U. Bergmeyer, Me- the analytic regulation is needed. For one

methods of enzymatic analysis, Verlag Chemie, more satisfactory. Procedure of the inventive

Academic Press, 1963, p. 407). One unit of creatine phosphokinase is sufficient for this procedure

was, however, for a preparative production un- for each 1 to 10 mg creatine. It can of course

useful, since this expensive phosphoenolpyruvate and 60 larger amounts of enzyme are used, whereby

highly purified creatine phosphokinase are necessary, although the reaction time is shortened somewhat,

and, moreover, the reaction caused by serum constituents but no particular advantages arise.

is inhibited. In addition, they would have to be complied with.

the

Creatine phosphate very expensive. 65 required. It is advantageous to add magnetic

From Biochem. J. 70 (1958) p. 633 to 641 it is sium and potassium ions, if in the crude muscle extract

known that creatine and 3-phosphoglyceric acid reduce the concentration of these ions significantly below 1

in the presence of adenosine diphosphate is at pH 7.4 to 2 · 10 ~ ^s M. An increase in the