DE1643701A1 - Process for the production of creatine phosphate - Google Patents
Process for the production of creatine phosphateInfo
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Description
Verfahren zur Herstellung von Creatinphosphat Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Creatinphosphat, welches sich zur Durchführung in industriellem Maßstab eignet. Process for the preparation of creatine phosphate The invention relates to a process for the production of creatine phosphate, which is used to carry out suitable on an industrial scale.
Es ist bereits bekannt, Oreatinphosphat durch Phosphorylierung von Creatin mit Phosphoroxychlorid herzustellen (K.Zeile und G.Fawaz, Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie 256, 193 (1938)). Die hauptsächlichen Nachteile dieses bekannten Verfahrens sind a) schlechte Ausbeute, b) die Reaktionsbedingungen müssen ziemlich genau eingelalten werden, um wenigstens diese geringe Ausbeute zu erziele, und c) die Methode eignet sich nicht zur Durchführung in gr@sserem Maßstab, da sich der entstehende Na3PO4-3rei weder rühren noch kühlen lässt.It is already known to produce orreatine phosphate by phosphorylation of To produce creatine with phosphorus oxychloride (K.Zeile and G.Fawaz, Hoppe-Seyler's Journal of Physiological Chemistry 256, 193 (1938)). The main drawbacks of this known process are a) poor yield, b) the reaction conditions must be introduced pretty precisely in order to at least achieve this low yield and c) the method is not suitable for implementation on a larger scale, since the resulting Na3PO4-3rei can neither be stirred nor cooled.
Die Erfindung vermeidet alle diese Nachteile und ermöglicht die Herstellung von Creatinphosphat in prak-tisch unbegrenzten Mengen in äusserst einfacher Weise mit hervorragender Ausbeute.The invention avoids all of these disadvantages and enables manufacture of creatine phosphate in practically unlimited amounts in an extremely simple way with excellent yield.
Das erfindungsgemässe Verfahren beruht auf der enzyinatischen Phosphorylierung von Creatin. Es besteht darin, dass Creatin und 3-Phosphoglycerinsäure mit einem wassrigen Muskel extrakt in Gegenwart katalytischer Mengen Adenosintriphosphat in alkalischem Milieu inkubiert, dann die Lösung kurzzeitig auf eine Temperatur von 70 bis 100° C erhitzt und das gebildete Creatinphosphat daraus isoliert wird.The method according to the invention is based on enzymatic phosphorylation of creatine. It consists in having creatine and 3-phosphoglyceric acid with one aqueous muscle extract in the presence of catalytic amounts of adenosine triphosphate in incubated in an alkaline medium, then the solution briefly to a temperature of Heated 70 to 100 ° C and the creatine phosphate formed is isolated from it.
Eine enzymatische Phosphorylierung von Oreatin zur analytischen Bestimmung von Creatin im Gewebe war bereits bekannt (.U.An enzymatic phosphorylation of orreatine for analytical determination of creatine in tissue was already known (.U.
Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Academic Press, -1963, S. 407). Dieses Verfahren war jedoch zu einer präparativen Herstellung unbrauchbar, da hierzu teures Phosphoenolpyruvat und hochgereinigte Creatinphosphokinase notwendig sind und überdies die Reaktion durch Serumbestandteile gehemmt wird. Ausserdem wäre bei den einzuhaltenden Konzentrationen die Isolierung von gebildetem Creatinphosphat sehr aufwendig.Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, Verlag Chemie, Academic Press, -1963, p. 407). However, this procedure was too preparative unusable, since this is expensive phosphoenolpyruvate and highly purified creatine phosphokinase are necessary and, moreover, the reaction is inhibited by serum components. Besides that at the concentrations to be observed would be the isolation of the creatine phosphate formed very expensive.
Es war daher äusserst iiberraschend, als nun gefunden wurde, dass sich eine enzymatische Phosphorylierung des Creatinphosphats auch unter Beseitigung der geschilderten Schwierigkeiten auf die oben erwahnte, äusserst einfache Weise mit hervorragenden Ausbeuten durchfUhren lässt.It was therefore extremely surprising when it was now found that an enzymatic phosphorylation of the creatine phosphate even with elimination the described difficulties in the extremely simple way mentioned above can be carried out with excellent yields.
Es ist weiterhin überraschend, dass die enzymatische Reaktion durch Erhitzen auf die angegebene Temperatur abgestoppt werden kann, da aus der Vorschrift von Zeile et al. auf eine ausgeprägte Temperaturempfindlichkeit von Creatinphosphat geschlossen werden muss und die chemische Synthese bei niedriger Temperatur, allenfalls Zimmertemperatur, ausgeführt wird. Die Säureempfindlichkeit des Phosphocreatins verbietet auch die iiblichen Isolierungsmethoden für organische Phosphorsäureverbindungen, wie sie z. B. für llucleotide oder Zuckerphosphate möglich sind. Ein noch so kurzes Ansäuern sowie eine Austauscherchromatographie oder Kohlepassage sind nicht ohne erhebliche Verluste durchführbar.It is also surprising that the enzymatic reaction works Heating to the specified temperature can be stopped as out of regulation vonzeile et al. on a pronounced temperature sensitivity of creatine phosphate Must be closed and chemical synthesis at low temperature, at most Room temperature. The acid sensitivity of phosphocreatine also prohibits the usual isolation methods for organic phosphoric acid compounds, how they z. B. for llucleotides or sugar phosphates are possible. A short one Acidification and exchange chromatography or charcoal passage are not without it considerable losses feasible.
Tatsächlich hält Creatinpho sphat jedoch, wie nunmehr gefunden wurde, im schwach-alkalischen Bereich sogar ein 1o-minütiges Erhitzen auf 80 bis 9o C aus, ohne dass merkliche Verluste entstehen.In fact, however, Creatinpho sphat, as has now been found, in the weakly alkaline range even a 10-minute heating to 80 to 9o C, without noticeable losses.
Der beim erfindungsgemässen Verfahren verwendete Muskel extrakt kann einfach durch Extraktion von frischem Fleisch, z.B. Kalbfleisch, mit Wasser und Abfiltrieren der unlöslichen Bestandteile hergestellt werden. Anstelle von Kalbfleischextrakt können natürlich auch Extrakte aus Muskeln anderer Herkunft mit gleichen Erfolg verwendet werde. Wichtig ist, dass der Huskelextrakt eine gewisse Menge Creatinphosphokinase enthält, die jedoch sehr viel geringer sein kamm, als sie entsprechend der analytischen Vorschrift benötigt wird. Für einen befriodigenden Ablauf ist e .< erfind ungsgemäs sen Verfahrens gonügt eine Einheit Creatinphosphokinase für je 1 bis 10 mg Creatin.The muscle extract used in the method according to the invention can simply by extracting fresh meat, e.g. veal, with water and Filtering off the insoluble constituents are produced. Instead of veal extract Of course, you can also use extracts from muscles of other origins with the same success used. It is important that the husk extract contains a certain amount of creatine phosphokinase contains, which, however, can be much smaller than the analytical ones Regulation is required. For a satisfactory process, e. <Is according to the invention this procedure is sufficient one unit of creatine phosphokinase for every 1 up to 10 mg creatine.
Es können natürlich auch grössere Enzymmengen eingesetzt werden, wodurch zwar die Reaktionsdauer etwas verkürzt wird, darüberhinaus aber keine besonderen Vorteile entstehen.Of course, larger amounts of enzyme can also be used, which means the reaction time is shortened somewhat, but beyond that, nothing special Benefits arise.
Auch die Verwenclung eines Puffers ist nicht erforderlich. Von Vorteil ist ein Zusatz von Magnesium und Kaliumionen, falls im Muskelrohextrakt die Konzentration dieser Ionen wesentlich unter 1 bis 2 x 10-3 M liegt. Eine Erhöhung der Konzentrationen über diese Werte hinaus bringt keinen besonderen Vorteil.The use of a buffer is also not necessary. Advantageous is an addition of magnesium and potassium ions, if the concentration is in the raw muscle extract of these ions is significantly below 1 to 2 x 10-3 M. An increase in concentrations beyond these values does not bring any particular advantage.
Bei der Umsetzung werden Creatin und 3-Phosphoglycerinsäure in etwa äquimolarem Verhältnis verbraucht. Die Reaktion lässt sich durch Anwendung eines geringen Überschusses eines dieser beiden Stoffe leicht bis zur vollständigen Umsetzung des anderen Reaktionspartners durchführen. Vorzugsweise werden etwa 1,1 bis 1,5 Äquivalente Creatin pro Äquivalent 3-Phosphoglycerinsäure eingesetzt, um eine quantitative Umsetzung der letzteren zu erzielen. Ein Überschuss an Oreatin ist von Vorteil, da dieses den wesentlich billigeren Reaktionspartner darstellt.In the implementation, creatine and 3-phosphoglyceric acid are roughly consumed equimolar ratio. The reaction can be controlled by applying a slight excess of one of these two substances until it is completely converted of the other reaction partner. Preferably about 1.1 to 1.5 Equivalents of creatine per equivalent of 3-phosphoglyceric acid used to achieve a quantitative Implementation of the latter to achieve. An excess of orreatine is beneficial, since this is the much cheaper reaction partner.
Adenosintriphosphat wird nur i21 katalytischen Mengen zugesetzt. silan verwendet etwa 1 Äquivalent denosintriphosphat auf je Go bis 100 Äquivalente Creatin bzw. 3-Phosphoglycerinsäure. Die Adenosintriphosphatmenge kann natürlich auch erhöht werden, dies ist jedoch aus wirtschaftlichen Gründen unerwünscht und technisch nicht von besonderem Vorteil. Die Adenosintriphosphatmenge kann auch verringert werden. Hierbei erhöht sich jedoch die Reaktionsdauer.Adenosine triphosphate is only added in catalytic amounts. silane uses about 1 equivalent of denosine triphosphate for every Go to 100 equivalents of creatine or 3-phosphoglyceric acid. The amount of adenosine triphosphate can of course also be increased are, however, this is undesirable for economic reasons and technically not of particular benefit. The amount of adenosine triphosphate can also be decreased will. However, this increases the reaction time.
Wie bereits erwähnt, ist ein Zusatz von Puffer nicht erforderlich. Der gewünschte alkalische pH-Wert kann mit irgendeinem alkalischen Mittel wie Natronlauge eingestellt werden.As already mentioned, it is not necessary to add a buffer. The desired alkaline pH can be achieved with any alkaline agent such as caustic soda can be set.
Der geeignete pH-Wert liegt zwischen etwa 7,o und 11, vorzugsweise zwischen 8 und 9. Die Reaktionstemperatur liegt günstig zwischen Zimmertemperatur und etwa 450 C, vorzugsweise zwischen 32 und 400 C. Die angegebene Temperatur kann bei Verwendung einer relativ hohen Enzymkonzentration noch gesteigert werden und auch 50° C noch etwas überschreiten.The suitable pH is between about 7.0 and 11, preferably between 8 and 9. The reaction temperature is favorably between room temperature and about 450 C, preferably between 32 and 400 C. The specified temperature can when using a relatively high enzyme concentration can be increased and even exceed 50 ° C a little.
Die Reaktionsdauer hängt von der Temperatur und von der eingesetzten Rohenzymmenge ab. Bei den angegebenen bevorzugten Mengen und Temperaturen beträgt die Ausbeute nach einstündiger Reaktionsdauer etwa 80 bis ; der Theorie. Durch Verlängerung der Reaktionsdauer bis zu 3 und gegebenenfalls auch 4 Stunden ist unter den genannten Bedingungen die Erzielung einer quantitativen Ausbeute möglich.The reaction time depends on the temperature and on the one used Amount of crude enzyme. In the stated preferred amounts and temperatures the yield after one hour of reaction time about 80 to; the theory. By extension the reaction time up to 3 and optionally also 4 hours is among those mentioned Conditions to achieve a quantitative yield possible.
Wenn die Reaktion bis zum gewünschten Umsetzungsgrad fortgesehritten ist, wird sie durch rasches Erhitzen des Reaktionsgemischs auf eine Temperatur von 70 bis 100°C, vorzugsweise 80 bis 90° C abgestoppt. Hierbei flockt Protein aus und wird gegebenenfalls nach dem Abktililen entfernt, beispielsweise durch Abfiltrieren.When the reaction has proceeded to the desired degree of conversion is, it is achieved by rapidly heating the reaction mixture to a temperature of 70 to 100 ° C, preferably 80 to 90 ° C stopped. This causes protein to flocculate and will possibly removed after the abktililen, for example by filtering off.
Die Gewinnung des Creatinphosphats erfolgt durch Abtrennung der Fremdione, Einengen der Lösung und Fällung durch Zusatz von Alkohol oder einem anderen, die Löslichkeit herabsetzenden Stoff, vorzugsweise unter Animpfen mit Creatinpho sphatkristallen.Creatine phosphate is obtained by separating foreign ions, Concentration of the solution and precipitation by adding alcohol or another that Solubility-reducing substance, preferably with inoculation with creatine phosphate crystals.
Die Lösung wird bei schwach-alkalischem pH-Wert (vorzugsweise pH-8 bis 8,5) mit einem mit Natrium equilibrierten Kationenaustauscher behandelt. Vorzugsweise wird sie über eine Austauscher säule gezogen. Den creatinphosphathaltigen Durchlauf, der dann eingeengt wird, wird Alkohol bis zum Auftreten einer deutlich erkennbaren Trübung zugesetzt. Vorzugsweise wird mit Creatinphosphat angeimpft und die Mischung einige Zeit in der Kälte stehengelassen. Der dabei gebildete Kristallbrei wird vom Überstand abgetrennt. Das so erhaltene Roh-Creatinphosphat wird durch eine, gegebenenfalls zwei Umkristallisationen gereinigt.The solution is at a weakly alkaline pH value (preferably pH 8 up to 8.5) treated with a cation exchanger equilibrated with sodium. Preferably it is drawn over an exchanger column. The creatine phosphate run, which is then concentrated, alcohol becomes clearly noticeable until a appears Added turbidity. Preferably, creatine phosphate is inoculated and the mixture left in the cold for a while. The resulting crystal pulp is from Separated supernatant. The crude creatine phosphate obtained in this way is optionally replaced by a Purified two recrystallizations.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.The following examples further illustrate the invention.
Beispiel 1 a) Herstellung eines Kaninchenmuskelextraktes Kaninchenmuskel wird zerkleinert, homogenisiert und mit Wasser extrahiert. Der pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt und die Ilischung 15 Minuten auf 530 C erhitzt. Ausgefallenes Protein wird abzentrifugiert. Dem Überstand wird Ammonsulfat bis zu einer Konzentration von 1,5 M zugesetzt.Example 1 a) Production of a Rabbit Muscle Extract Rabbit Muscle is crushed, homogenized and extracted with water. The pH will be on 6.5 and the mixture heated to 530 C for 15 minutes. Failed protein is centrifuged off. Ammonium sulfate is added to the supernatant to a concentration of 1.5 M added.
Eventuell ausfallendes Protein wird abzentrifugiert. Dann wird die Ammonsulfatkonzentration auf 3 M erhöht. Das ausgefallene Protein wird abzentrifugiert und die erhaltene Ammonsulfatpaste nach 3-stundiger Dialyse gegen Leitungswasser für die weitere Reaktion eingesetzt. b) In 100 1 Wasser werden 26o g Creatin gelöst, dann werden 15 g ATPNa2H2#3 H2O (entspricht etwa 12 g ATP), 380 g 3-Phosphoglycerinsäure-Na, 14 g Mg-Acetat, 17 g K-Acetat und 80 g Ammoniumacetat zugegeben und gut gemischt. Mit Natronlauge wird der pH-Wert auf 8,5 eingestellt und die Itischung auf 370 C erwärmt. Nun wird das nach a) erhaltene Enzymgemisch zugegeben, das ca. 80 ooo Einheiten Creatinphosphokinase, ca. 100 000 Einheiten Enolase, ca. loo 000 Einheiten Phosphorglyceratmutase und ca. 250 ooo Einheiten Pyruvatkinase enthält. Unter Konstanthalten des pH-Wertes wird die Mischung 1 bis 3 Stunden bei 370 C belassen. Any protein that has precipitated is centrifuged off. Then the Ammonium sulfate concentration increased to 3M. The precipitated protein is centrifuged off and the ammonium sulfate paste obtained after dialysis against tap water for 3 hours used for the further reaction. b) In 100 l of water, 26o g of creatine are dissolved, then 15 g of ATPNa2H2 # 3 H2O (corresponds to about 12 g of ATP), 380 g of 3-phosphoglyceric acid-Na, 14 g of Mg acetate, 17 g of K acetate and 80 g of ammonium acetate were added and mixed well. The pH value is adjusted to 8.5 and the mixture to 370 ° C. with sodium hydroxide solution warmed up. The enzyme mixture obtained according to a) is then added, which is about 80,000 units Creatine phosphokinase, approx. 100,000 units of enolase, approx. 100,000 units of phosphorus glycerate mutase and contains about 250,000 units of pyruvate kinase. Keeping the pH constant the mixture is left at 370 ° C. for 1 to 3 hours.
Nach Ablauf der Raktion, die durch enzymatische Analyse des gebildeten Creatinphosphate verfolge werden kenn, wind die Mischung rasch auf 80 bis 9o° C erhitzt und wieder gekühlt. Das ausgefallene Protein wird gegebenenfalls abfiltriert und die Lösung wird über 1o 1 mit Natriumhydroxyd behandelten und auf pH 8-9 gewaschenen Kationenaustauscher (z.B. Amberlite IR 120 oder Dowex 50) gezogen. At the end of the reaction, which is formed by enzymatic analysis of the Creatine phosphates will pursue the wind the mixture up quickly Heated to 80 to 90 ° C and then cooled again. The precipitated protein is optionally used filtered off and the solution is treated over 1o 1 with sodium hydroxide and on pH 8-9 washed cation exchanger (e.g. Amberlite IR 120 or Dowex 50).
Der schwach gelb gefärbte klare Durchlauf wird gesammelt und eingee-.ngt, bis das Volumen ca. 4 bis 6 1 beträgt. The pale yellow clear run-through is collected and concentrated, until the volume is approx. 4 to 6 liters.
Nun wird mit 8 bis 12 1 Alkohol unter gutem Rühren versetzt und bei beginnender Trübung mit kristallisiertem Natrium-Creatinphosphat angeimpft. Die Mischung lässt man über Nacht in-der Kälte stehen, saugt den ausgefallenen Kristallbrei ab und wäscht ihn gut mit Alkohol. Nach Umkristallisation wird das Creatinphosphat im Vakuum getrocknet. 8 to 12 liters of alcohol are then added with thorough stirring and at Inoculated with crystallized sodium creatine phosphate when clouding begins. the The mixture is left to stand in the cold overnight and the precipitated crystal pulp is sucked off and washes it well with alcohol. After recrystallization, the creatine phosphate becomes dried in vacuum.
Ausbeute: 300 bis 350 g Creatinphosphat (CP-Na2 . 6 H20). Yield: 300 to 350 g creatine phosphate (CP-Na2. 6 H20).
Beispiel 2 Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen, jedoch wird anstelle des dialysierten Kaninchen-Rohenzyms ein Kalbfleischextrakt verwendet, der durch Extraktion von frischem zerkleinertem Kalbfleisch mit dem doppelten Volumen Wasser durch Abfiltrieren der festen Bestandteile gewonnen wurde. Es wird soviel Extrakt verwendet, dass 50 ooo -80 ooo Einheiten Creatinphosphokinase zur Anwendung kommen.Example 2 The procedure described in Example 1 is followed, however a veal extract is used instead of the dialyzed raw rabbit enzyme, that by extraction of fresh minced veal with twice the volume Water was obtained by filtering off the solid components. It will be so much Extract uses that 50,000 -80,000 units of creatine phosphokinase for application come.
Der Zusatz von Magnesium und Kaliumionen kann hier unterbleiben, da eine ausreichende Menge dieser Ionen bereits im Extrakt vorhanden ist. The addition of magnesium and potassium ions can be omitted here, there is a sufficient amount of these ions already present in the extract is.
Die Reaktionsdauer beträgt 2 bis 4 Stunden, die Ausbeute 250 bis 300 g, da einmal öfter unkristallisiert werden muss.The reaction time is 2 to 4 hours, the yield 250 to 300 g, because it has to be uncrystallized once more often.
Claims (9)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US792182*A US3639211A (en) | 1967-11-29 | 1968-11-19 | Process for the preparation of creatine phosphate |
| FR1593485D FR1593485A (en) | 1967-11-29 | 1968-11-27 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DEB0095621 | 1967-11-29 | ||
| DEB0095621 | 1967-11-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1643701A1 true DE1643701A1 (en) | 1971-06-24 |
| DE1643701C DE1643701C (en) | 1973-05-10 |
Family
ID=
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1044765B (en) | 1980-04-21 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 |