Verfahren zur Gewinnung von bIuskeladenylsäure. Bekanntlich ist die Muskeladenylsäure in den tierischen Geweben nicht als solche ent halten, sondern gebunden an Pyrophosphor- säure als sogenannte Adenylpyrophosphor- säure oder Adenosintriphosphorsäure. Bei den bisher bekannt gewordenen Verfahren zur Darstellung der Muskeladenylsäure wird diese entweder erst im Laufe der Aufarbei tung, die eine Reihe von Schwermetallsalz- fällungen umfasst,
aus der Adenosintriphos- phorsäure gebildet, oder aber, es wird die Adenosintriphosphorsäure zunächst in Form von Schwermetallsalzfällungen abgetrennt und darauf einem besonderen Spaltungs verfahren unterworfen. Alle diese bekannten Verfahren sind für die technische Herstellung wegen der erforderlichen Metallsalzfällungen zu umständlich und zu teuer.
Dazu kommt, da.ss bei der Zerlegung der Metallsalzfällun- gen der Adenylsäure mit Schwefelwasserstoff grosse Verluste an Adenylsäure infolge Ad sorption an die Metallsulfidniederschläge un vermeidbar sind.
Es wurde nun gefunden, dass man die Muskeladenylsäure in technisch einfacher Weise dadurch gewinnen kann, dass man die aus frischen Geweben in an sich bekannter Weise (beispielsweise aus Zeitschrift für Biologie; 9-1 [19311, Seite 315 ff.) oder durch Extraktion- mit Trichloressigsäure in der Kälte erhaltenen eiweissfreien Rohextrakte bei alkalischer Reaktion, und zwar in Gegenwart von Erdalkalihydroxyden, wie Calcium-, Ba rium-, Strontiumhydroxyd, einige Zeit er hitzt,
wodurch neben der Bildung der Adenyl- säure zugleich Zerstörung der desamidieren- den Fermente eintritt, dann das entstandene unlösliche Erdalkaliphosphat, beispielsweise durch Abfiltrieren oder Zentrifugieren, ent fernt und aus der erzielten Lösung die Adenylsäure in bekannter Weise mit Hilfe von Schwermetallsalzen abscheidet.
Diese Ab scheidung ist beispielsweise in der oben ge nannten Literaturstelle, sowie in der Zeit schrift für physiologische Chemie,<B>161</B> (1927), Seite 137, und 179 (1928), Seite 14d beschrieben. Hierbei verwendet man zur Fällung der Adenylsäure zweckmässig ein solches Metallsalz, dessen Metallion aus der entstandenen Adenylsäure-Metallsalzfällung ohne Zuhilfenahme von Schwefelwasserstoff beseitigt werden kann. Dies geschieht bei spielsweise durch Verwendung von Bleiacetat und Zerlegung des Adenylsäurebleisalzes mittelst Schwefelsäure.
Das Verfahren wird beispielsweise so aus geführt, dass man frisches Muskelfleisch mit Trichloressigsäurelösung extrahiert, die Lö sung mit Kalkmilch alkalisch macht, die ent standene Fällung einige Zeit auf Tempera turen zwischen etwa <B>50'</B> und etwa<B>100'</B> er hitzt, bezw. fast zum Sieden, und dann durch Zugabe von Bariumacetat das anorganische Phosphat abscheidet. Die Erhitzungsdauer richtet sich nach dem angewandten Erdalkali hydroxyd, sowie nach der Temperatur; sie beträgt etwa zwischen 10 Minuten und 10 Stunden.
Aus dem Filtrat fällt man dann die entstandene Adenylsäure mit Bleiacetat und zerlegt die Fällung mit Schwefelsäure. Aus dem Filtrat vom Bleisulfat kann die Adenyl- säure in. bekannter Weise, zum Beispiel wie in den oben genannten Literaturstellen be schrieben, gewonnen werden.
Man kann das Verfahren auch so aus führen, dass man die Alkalisierung der Roh- extrakte mit Erdalkalihydroxyd, zum Bei spiel Bariumhydroxyd, vornimmt, wobei man in möglichst grosser Konzentration arbeitet, den entstandenen, das adenosintriphosphor- saure Barium enthaltenden Niederschlag ab trennt und diesen durch Erhitzen in wässeri ger Suspension in adenylsaures Barium über führt.
Die weitere Reinigung der Adenyl- säure durch Darstellung und Abtrennung eines Schwermetallsalzes und dessen Zer legung geschieht wie oben angegeben. Die Ausbeute beträgt durchschnittlich 0,5 gr Muskeladenylsäure aus 1 kg Frischfleisch.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Muskel - adenyIsäure, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man -die aus tierischen Geweben durch Extraktion mit Trichloressigsäure er- halten Rohextrakte unter Verwendung von Erdalkalihydroxyden alkalisch macht, die entstandene Fällung einige Zeit erhitzt, das entstandene anorganische Phosphat ausfällt und aus dem Filtrat die Adenylsäure isoliert.
Die Muskeladenylsäure soll als Heilmittel verwendet werden. <I>Beispiele:</I> 1. 1 kg Muskelfleisch vom Pferd, unmittel bar nach dem Schlachten entnommen, wird durch einen mit Eis gekühlten Fleischwolf in. 2 Liter auf 0 vorgekühlte 10%ige Tri- chloressigsäurelösung eingemahlen und das Ganze eine halbe Stunde unter Kühlung gründlich- verrührt. Man presst dann gut ab, macht das Filtrat mit Hilfe von Kalkmilch phenolphthaleinalkalisch, erhitzt während fünf Stunden auf 90 bis 100 und kühlt dann rasch auf Zimmertemperatur ab.
Man setzt so lange 20%ige Bariumacetatlösung zu, bis keine weitere Fällung mehr auftritt. Das ausgeschiedene anorganische Phosphat, dessen Phosphorsäurerest zum Teil aus dem Roh extrakt stammt und zum Teil bei der Um- wandlung der Adenylpyrophosphorsäure in Adenylsäure frei wird, wird abfiltriert. Das Filtrat wird mit Bleiacetatlösung gefällt,
die Fällung gründlich gewaschen und durch Ver reiben mit Schwefelsäure zerlegt. Die vom Bleisulfat abgetrennte Lösung wird von über schüssiger Schwefelsäure quantitativ befreit und im Vakuum bis zur beginnenden Kri stallisation eingeengt. Durch vorsichtige Zu gabe von Alkohol oder Aceton wird die Muskeladenylsäure dann vollends in kristal lisierter Form abgeschieden.
2. 1 kg Herzmuskel vom Pferd wird un mittelbar nach dem Schlachten, wie in Bei spiel 1, verarbeitet. Die erhaltene Trichlor- essigsäurelösung wird mit Natronlauge bis zur kongoneutralen Reaktion versetzt, dann durch gieselgur klar filtriert und nunmehr mit Bariumhydroxydlösung eben phenol- phthaleinalkalisch gemacht und die Fällung durch Zugabe von Bariumacetatlösung ver vollständigt.
Die Fällung wird nunmehr ab getrennt, in Wasser verteilt, die Aufschwew mung gegebenenfalls mit soviel Barium- liydroxydlösung versetzt, dass die Reaktion deutlich phenolphthaleinalkalisch ist und dann, wie in Beispiel 1, erhitzt.
Das aus gefallene anorganische Phosphat wird abfil- triert und aus dem Filtrat die Adenylsäure durch Fällung mit Bleiacetat und Zerlegung der Fällung mit Schwefelsäure isoliert.
An Stelle des Bariumhydroxyds und -acetats lassen sich auch Strontiumhydroxyd und -acetat verwenden.
3. 10 kg Muskelfleisch werden sofort nach dem Schlachten durch einen gekühlten Fleisch wolf in 10 Liter vorgekühlte 10%ige Tri- chloressigsäure eingemahlen. Man rührt eine Stunde unter Kühlung und presst dann in einer hydraulischen Presse gut ab. Der Press- saft wird durch Kieselgur klar filtriert und mit Natronlauge neutralisiert, worauf man je Liter Lösung 10 gr Caleiumhydroxyd ein trägt.
Man schleudert sofort ab, verteilt die Fällung in 5 Liter Wasser und erhitzt drei Stunden unter Rühren auf dem Dampfbad. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur gibt man unter Rühren so lange Oxalsäure zu, bis eine abfiltrierte Probe auf weiteren Zusatz eben keine Trübung mehr gibt. Man saugt ab, macht das Filtrat mit Barium hydroxyd eben phenolphthaleinalkalisch und filtriert die Fällung ab. Aus dem Filtrat wird dann mit Schwefelsäure das Barium entfernt, worauf man im Vakuum bis zur beginnenden Kristallisation einengt.
Beim Stehen in der Kälte kristallisiert dann die reine Muskeladenylsäure aus.
Process for the production of musceladenylic acid. It is known that muscle adenylic acid is not contained as such in animal tissues, but is bound to pyrophosphoric acid as so-called adenylpyrophosphoric acid or adenosine triphosphoric acid. In the previously known processes for the preparation of muscle adenylic acid, this is either only in the course of processing, which includes a series of heavy metal salt precipitations,
formed from the adenosine triphosphoric acid, or else the adenosine triphosphoric acid is first separated off in the form of heavy metal salt precipitates and then subjected to a special cleavage process. All these known processes are too laborious and too expensive for industrial production because of the metal salt precipitations required.
In addition, when the metal salt precipitates of adenylic acid are decomposed with hydrogen sulfide, great losses of adenylic acid as a result of adsorption to the metal sulfide precipitates are unavoidable.
It has now been found that muscle adenylic acid can be obtained in a technically simple manner by extracting the from fresh tissues in a manner known per se (for example from Zeitschrift für Biologie; 9-1 [19311, page 315 ff.) Or by extraction. with trichloroacetic acid obtained in the cold, protein-free crude extracts with an alkaline reaction, namely in the presence of alkaline earth metal hydroxides, such as calcium, barium, strontium hydroxide, heated for some time,
whereby, in addition to the formation of the adenic acid, the deamidating ferments are also destroyed, then the insoluble alkaline earth phosphate formed is removed, for example by filtration or centrifugation, and the adenic acid is separated from the resulting solution in a known manner with the help of heavy metal salts.
This separation is described, for example, in the above-mentioned literature, and in the journal for physiological chemistry, <B> 161 </B> (1927), page 137, and 179 (1928), page 14d. To precipitate the adenylic acid, it is expedient to use a metal salt whose metal ion can be removed from the adenylic acid metal salt precipitate without the aid of hydrogen sulfide. This is done, for example, by using lead acetate and breaking down the adenylic acid lead salt using sulfuric acid.
The process is carried out, for example, in such a way that fresh muscle meat is extracted with trichloroacetic acid solution, the solution is made alkaline with milk of lime, and the resulting precipitate is kept at temperatures between about <B> 50 '</B> and about <B> 100 for a while '</B> he heats, resp. almost to the boil, and then the inorganic phosphate is deposited by adding barium acetate. The heating time depends on the alkaline earth metal hydroxide used and on the temperature; it is approximately between 10 minutes and 10 hours.
The adenic acid formed is then precipitated from the filtrate with lead acetate and the precipitate is broken down with sulfuric acid. The adenylic acid can be obtained from the lead sulfate filtrate in a known manner, for example as described in the above-mentioned literature references.
The process can also be carried out in such a way that the crude extracts are made alkaline with alkaline earth metal hydroxide, for example barium hydroxide, working in the highest possible concentration, separating the precipitate containing the adenosine triphosphoric acid and barium Heating in aqueous suspension leads to adenylic acid barium.
The further purification of the adenic acid by preparation and separation of a heavy metal salt and its decomposition takes place as stated above. The average yield is 0.5 gram of muscle adenylic acid from 1 kg of fresh meat.
The present invention relates to a process for obtaining muscle adenyI acid, which is characterized in that the crude extracts obtained from animal tissues by extraction with trichloroacetic acid are made alkaline using alkaline earth metal hydroxides, the precipitate formed is heated for some time and the resultant inorganic phosphate precipitates and the adenic acid is isolated from the filtrate.
The muscle adenylic acid is said to be used as a remedy. <I> Examples: </I> 1. 1 kg of muscle meat from the horse, taken immediately after slaughter, is ground into 2 liters of 10% trichloroacetic acid solution pre-chilled to 0 using an ice-cooled meat grinder, and the whole is half a half Stirred thoroughly for an hour while cooling. It is then pressed well, the filtrate is made phenolphthalein alkaline with the help of milk of lime, heated to 90 to 100 for five hours and then rapidly cooled to room temperature.
20% barium acetate solution is added until no further precipitation occurs. The precipitated inorganic phosphate, the phosphoric acid residue of which comes partly from the raw extract and which is partly released when the adenylpyrophosphoric acid is converted into adenylic acid, is filtered off. The filtrate is precipitated with lead acetate solution,
the precipitate was washed thoroughly and broken down by rubbing with sulfuric acid. The solution separated from the lead sulfate is freed quantitatively from excess sulfuric acid and concentrated in vacuo until crystallization begins. By carefully adding alcohol or acetone, the muscle adenylic acid is then completely separated out in crystallized form.
2. 1 kg of horse heart muscle is processed immediately after slaughtering, as in Example 1. The trichloroacetic acid solution obtained is mixed with sodium hydroxide solution until the reaction is Congo-neutral, then filtered through Gieselgur until clear and then made phenolphthalein-alkaline with barium hydroxide solution and the precipitation is completed by adding barium acetate solution.
The precipitate is now separated off, distributed in water, and if necessary, enough barium hydroxide solution is added to the swelling so that the reaction is clearly phenolphthalein-alkaline and then, as in Example 1, heated.
The precipitated inorganic phosphate is filtered off and the adenylic acid is isolated from the filtrate by precipitation with lead acetate and decomposition of the precipitate with sulfuric acid.
Strontium hydroxide and acetate can also be used in place of the barium hydroxide and acetate.
3. Immediately after slaughtering, 10 kg of muscle meat is ground into 10 liters of pre-cooled 10% trichloroacetic acid using a chilled meat grinder. The mixture is stirred for one hour with cooling and then pressed well in a hydraulic press. The pressed juice is filtered clear through kieselguhr and neutralized with sodium hydroxide solution, whereupon 10 grams of calcium hydroxide are added per liter of solution.
It is spun off immediately, the precipitate is distributed in 5 liters of water and heated for three hours on the steam bath while stirring. After cooling to room temperature, oxalic acid is added with stirring until a sample that has been filtered off is no longer cloudy after further addition. It is suctioned off, the filtrate is made alkaline with barium hydroxide and the precipitate is filtered off. The barium is then removed from the filtrate with sulfuric acid, whereupon it is concentrated in vacuo until crystallization begins.
When standing in the cold, the pure muscle adenylic acid then crystallizes out.