DE1620548C - Process for the production of inosine, adenosm, cytidine and / or undine 5 phosphate - Google Patents
Process for the production of inosine, adenosm, cytidine and / or undine 5 phosphateInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Inosin-, Adenosin-, Cytidin- und/oder Uridin-5'-phosphat aus den entsprechenden Ribonucleosidcn. The invention relates to a method for Production of inosine, adenosine, cytidine and / or uridine 5'-phosphate from the corresponding ribonucleosides.
RibonucIcosid-S'-phosphate sind sehr wertvoll als Würze für Speisen sowie in der pharmazeutischen Industrie. Sie werden hergestellt, indem zunächst die Hydroxylgruppen, die in 2'- und 3'-Stellung des Riboseanteils gebunden sind, mit einer Acyl- oder Isopropylidengruppe geschützt werden und dann die 5'-I lydroxylgruppe der so geschützten Verbindung mit fünfwertigen Phosphorverbindungen, wie Phosphorpentachlorid oder Phosphoroxychlorid, phosphoryliert wird und anschließend die schützenden Gruppen entfernt werden. Zu diesen bekannten Verfahren gehört die in der französischen Patentschrift L 369 079 beschriebene Phosphorylierung von Nucleosidcn in Gegenwart von Ketonen, bei derzunächstdie Hydroxylgruppen in 2'- und 3'-Stellimg maskiert und danach die Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe unter Verwendung von POCla durchgeführt wird. Das bekannte Verfahren erfordert jedoch eine lange Zeit (etwa 7 bis 30 Stunden) bis zum vollständigen Schutz und für die Phosphorylierung und ist daher für die technische Herstellung unvorteilhaft.Ribonucicoside-S'-phosphates are very valuable as a seasoning for dishes and in the pharmaceutical industry. They are produced by first protecting the hydroxyl groups bonded in the 2 'and 3' positions of the ribose moiety with an acyl or isopropylidene group and then protecting the 5'-hydroxyl group of the compound protected with pentavalent phosphorus compounds such as phosphorus pentachloride or phosphorus oxychloride, is phosphorylated and then the protecting groups are removed. These known processes include the phosphorylation of nucleosides in the presence of ketones described in French patent specification L 369 079, in which the hydroxyl groups are first masked in the 2'- and 3'-positions and then the phosphorylation of the 5'-hydroxyl group is carried out using POCl a will. However, the known method requires a long time (about 7 to 30 hours) for complete protection and for phosphorylation and is therefore disadvantageous for industrial production.
Hs wurde nun gefunden, daß eine selektive Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe des Ribonucleosids leicht in kurzer Zeit erzielt werden kann, wenn man an Stelle der bekanntermaßen verwendeten fünfwertigen Phosphorverbindungen Phosphortrichlorid als Phosphorylierungsmittel verwendet und die Phosphorylierung in Gegenwart von Sauerstoff vornimmt. It has now been found that a selective phosphorylation of the 5'-hydroxyl group of the ribonucleoside can easily be achieved in a short time if one is used in place of the known pentavalent phosphorus compounds phosphorus trichloride is used as a phosphorylating agent and the Performs phosphorylation in the presence of oxygen.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Inosin-, Adenosin-, Cytidin- und/oder Uridin-5'-phosphat durch Umsetzen der entsprechenden Ribonucleosidc mit 10 bis 100 Mol eines Phosphorylierungsmittels, bezogen auf das Ribonucleosid, in Gegenwart von Wasser und aliphatischen Ketonen mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und anschließende Hydrolyse des Rcaklionsproduktes zum gewünschten S'-Ribonuclcotid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Phosphorylierungsmittel Phosphortrichlorid einsetzt und dabei in Gegenwart von Sauerstoff arbeitet.The invention accordingly provides a process for the preparation of inosine, adenosine, Cytidine and / or uridine 5'-phosphate by reacting the corresponding ribonucleosidc with 10 to 100 moles of a phosphorylating agent, based on the ribonucleoside, in the presence of water and aliphatic ketones with 3 to 6 carbon atoms and subsequent hydrolysis of the reaction product to the desired S'-ribonuclcotide, which is characterized in that the phosphorylating agent Phosphorus trichloride uses and works in the presence of oxygen.
Hei diesem Verfahren werden die entsprechenden Ribonucleosid-S'-phosphate in kurzer Zeit und in guter Ausbeute erhalten.Hei this process, the corresponding ribonucleoside-S'-phosphate in a short time and in good yield obtained.
Als aliphatische Ketone mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen eignen sich für die Zwecke der Erfindung beispielsweise Aceton, Methyläthylketon, Mcthylisohulylkcton und Methylisopropylketon.Aliphatic ketones with 3 to 6 carbon atoms are suitable for the purposes of the invention for example acetone, methyl ethyl ketone, Mcthylisohulylkcton and methyl isopropyl ketone.
Die Reaktion wird im allgemeinen durchgeführt, indem man zuerst das Ribonucleosid im Keton löst oder suspendiert und dann Phosphortrichlorid und Wasser zur Lösung oder Suspension gibt, wobei man das Reaktionssystem in Berührung mit der Atmosphäre hält oder Sauerstoff oder ein sauerstoffhaltiges Gas, /.. IJ. Luft, in das Reaktionssystem bläst.The reaction is generally carried out by first dissolving the ribonucleoside in the ketone or suspended and then phosphorus trichloride and water are added to the solution or suspension, whereby keeps the reaction system in contact with the atmosphere or keeps oxygen or an oxygen-containing gas, / .. IJ. Air, blows into the reaction system.
Da das Keton als Lösungsmittel wirkt, ist für die Reaktion ein weiteres Lösungsmittel nicht unbedingt erforderlich. Das Keton kann in einer solchen Menge verwendet werden, daü das Ribonucleosid ausreichend gelöst oder suspendiert wird. Vorzugsweise wird das Keton im großen Oberschuß verwendet.Since the ketone acts as a solvent, another solvent is not required for the reaction necessary. The ketone can be used in such an amount that the ribonucleoside is sufficient is dissolved or suspended. The ketone is preferably used in large excess.
Das Molverhältnis von Phosphortrichlorid und Wasser zum Nucleosid ist verschieden, je nach dem Ausgangsmaterial. Hs liegt vorzugsweise im Bereich von 40 bis 60 MoI Phosphortrichlorid und 2 bis 20 Mol, vorzugsweise 2 bis 4 Mol, Wasser pro Mol Ribonucleosid. The molar ratio of phosphorus trichloride and water to nucleoside is different depending on the Source material. Hs is preferably in the range from 40 to 60 mol phosphorus trichloride and 2 to 20 mol, preferably 2 to 4 moles of water per mole of ribonucleoside.
Die gesamte erforderliche Menge an Phosphors' trichlorid kann dem Reaktionssystem auf einmal zugesetzt werden, jedoch ist es zur Erzielung der besten Ausbeute zweckmäßig, das Phosphortrichlorid in zwei Portionen dem Reaktionssystem zuzugeben. Dies kann so geschehen, daß man zuerst etwa 1 bisThe total required amount of phosphorus trichloride can be fed into the reaction system at one time be added, but to achieve the best yield it is advisable to use the phosphorus trichloride in add two portions to the reaction system. This can be done in such a way that you first have about 1 to
ίο 10 Mol (zweckmäßig 1 bis 2 Mol) Phosphortrichlorid pro Mol Ribonucleosid zusammen mit etwa 2 bis 20 Mol (zweckmäßig 2 bis 4 Mol) Wasser pro Mol Ribonucleosid zum Reaktionssystem gibt, die Reaktion stattfinden läßt, bis das Reaktionsgemisch klar wird, und dann etwa 10 bis 90 Mol (zweckmäßig 40 bis 60 Mol) Phosphortrichlorid pro Mol Ribonucleosid zur weiteren Fortsetzung der Reaktion zum Reaktionsgemisch gibt. In diesem Fall ist für die erste Reaktionsstufe nicht unbedingt Sauerstoff erforderlich, aber die zweite Reaktionsstufe muß so durchgeführt werden, daß das Reaktionssystem der Atmosphäre ausgesetzt ist oder Sauerstoff oder Luft eingeblasen wird. ■ίο 10 moles (expediently 1 to 2 moles) of phosphorus trichloride per mole of ribonucleoside together with about 2 to 20 moles (expediently 2 to 4 moles) of water per mole Ribonucleoside is added to the reaction system, the reaction is allowed to take place until the reaction mixture is clear and then about 10 to 90 moles (suitably 40 to 60 moles) of phosphorus trichloride per mole of ribonucleoside to continue the reaction to the reaction mixture. In this case it is for the first reaction stage does not necessarily require oxygen, but the second reaction stage must do so be carried out so that the reaction system is exposed to the atmosphere or oxygen or air is blown in. ■
Bei der ersten Stufe des Verfahrens gemäß der Erfindung werden die Hydroxylgruppen in der 2'- und 3'-Stellung des Riboseanteils durch das aliphatische Keton in Gegenwart von Phosphortrichlorid und Wasser geschützt, und die freie 5'-Hydroxylgruppe wird durch Phosphortrichlorid und Sauerstoff in Gegenwart des aliphatischen Ketons phosphoryliert. Auf diese Weise wird das entsprechende geschützte Ribonucleosid-S'-dichlorphosphat erhalten.In the first stage of the process according to the invention, the hydroxyl groups in the 2 'and 3'-position of the ribose portion by the aliphatic ketone in the presence of phosphorus trichloride and Water is protected, and the free 5'-hydroxyl group is in by phosphorus trichloride and oxygen Phosphorylated in the presence of the aliphatic ketone. In this way the appropriate one is protected Ribonucleoside S'-dichlorophosphate obtained.
Die Reaktion wird vorteilhaft so durchgeführt, daß die Temperatur durch Kühlung bei etwa 0 bis K)0C gehalten wird.The reaction is advantageously carried out in such a way that the temperature is kept at about 0 to K) 0 C by cooling.
In der zweiten Stufe des Verfahrens gemäß der Erfindung wird die geschützte Verbindung in bekannter Weise zu Ribonucleosid-5'-phosphat hydrolysiert. Dies kann beispielsweise geschehen, indem man das erhaltene Produkt in Eiswasser gibt, den pH-Wert mit einer Alkaliverbindung (z. B. Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd und Natriumcarbonat) auf 1,0 bis 2,0 einstellt und das Gemisch auf etwa 40 bis 100" C, vorzugsweise auf 50 bis 8O0C, erhitzt.In the second stage of the process according to the invention, the protected compound is hydrolyzed to ribonucleoside-5'-phosphate in a known manner. This can be done, for example, by adding the product obtained to ice water, adjusting the pH value with an alkali compound (e.g. sodium hydroxide, potassium hydroxide and sodium carbonate) to 1.0 to 2.0 and the mixture to about 40 to 100 " C, preferably at 50 to 8O 0 C, heated.
Das als Endprodukt gcbildeteRibonucleosid-S'-phosphal kann vom Reaktionsgemisch nach beliebigen, bekannten Methoden abgetrennt werden, z. B. unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen oder Aktivkohle oder durch Kristallisation in Form eines Salzes,The ribonucleoside S'-phosphhale formed as the end product can be separated from the reaction mixture by any known method, e.g. More colorful Use of ion exchange resins or activated carbon or by crystallization in the form of a salt,
Z. B. des Natriumsalzes. Das erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht somit die Herstellung des betreffenden RibonucIeosid-5'-phosphats in kurzer Zeit
und in guter Ausbeute.
Um die erfindungsgemäß erforderliche kurze Reaktionsdauer zu veranschaulichen, wird der folgende
Versuch beschrieben.For example the sodium salt. The process according to the invention thus enables the ribonucleoside 5'-phosphate in question to be prepared in a short time and in good yield.
In order to illustrate the short reaction time required according to the invention, the following experiment is described.
Zu einer Suspension von 2 g Inosin in 50 ml Aceton wurden 3 ml Phosphortrichlorid und dann I ml Wasser gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 20"C gerührt. Dann wurden weitere 50 ml Phosphortrichlorid dem Reaktionsgemisch bei 0 bis 5°C zugesetzt. In geeigneten Zeitabständen wurde jeweils 0,1 ml der Reaktionslösung entnommen, um die Bildung von Inosin-5'-monophosphat (nachstehend als 5'- IMP bezeichnet) zu überwachen. Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle genannt. Es zeigt, daß innerhalb von 60 Minuten nach Beginn der Reaktion 94 ü/„ 5'-IMP gebildet wurden.To a suspension of 2 g of inosine in 50 ml of acetone were added 3 ml of phosphorus trichloride and then 1 ml of water. The reaction mixture was stirred for 30 minutes at 20 ° C. A further 50 ml of phosphorus trichloride were then added to the reaction mixture at 0 to 5 ° C. At suitable intervals, 0.1 ml of the reaction solution was removed in each case to prevent the formation of inosine 5'-monophosphate (hereinafter referred to as 5'-IMP). The result is given in the following table. It shows that 94 µ / "5'-IMP were formed within 60 minutes after the start of the reaction.
'/.of 5'-IMP,
'/.
B e i s ρ i e 1 LB e i s ρ i e 1 L
Zu einer Suspension von 2 g Inosin in 50 ml Aceton wurden unter Rühren 3 ml Phosphortrichlorid und dann 1 ml Wasser gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 10°C gerührt. Zum Reaktionsgemisch wurden weitere 40 ml Phosphortrichlorid gegeben, wobei die Temperatur 2 Stunden bei 0 bis 50C gehalten wurde und die weitere Reaktion bei offenem Reaktionsgefäß stattfand. Das Reaktionsgemisch wurde in 11 Eiswasser gegossen und die erhaltene Lösung mit einer 20°/0igen wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf pH 1,5 eingestellt. Diese Lösung wurde zur Abspaltung der Isopropylidengruppen 30 Minuten bei 70° C gehalten. Die so behandelte Lösung wurde an einer Aktivkohlesäule adsorbiert. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer O,5°/oigen wäßrigen Natriumhydrox'ydlösung eluiert. Das Eluat wurde auf pH-Wert 8 eingestellt und eingeengt. Die Analyse des Konzentrats durch Papierelektrophorese (0,05 Mol Boratpufier) ergab, daß das Inosin-5'-monophosphat in einer Ausbeute von 88°/o gebildet worden war. Durch Zugabe von Methanol zum Konzentrat wurden 3,3 g des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat (8H2O) erhalten. Ausbeute 8t °/0.To a suspension of 2 g of inosine in 50 ml of acetone, 3 ml of phosphorus trichloride and then 1 ml of water were added with stirring. The reaction mixture was stirred at 10 ° C. for 30 minutes. A further 40 ml of phosphorus trichloride were added to the reaction mixture, the temperature being kept at 0 to 5 ° C. for 2 hours and the further reaction taking place with the reaction vessel open. The reaction mixture was poured into 1 liter of ice water and the resulting solution was adjusted to pH 1.5 with a 20% strength aqueous sodium hydroxide solution. This solution was kept at 70 ° C. for 30 minutes in order to split off the isopropylidene groups. The solution thus treated was adsorbed on an activated charcoal column. The column was washed with water and with a O, eluted 5 ° / s oig aqueous Natriumhydrox'ydlösung. The eluate was adjusted to pH 8 and concentrated. Analysis of the concentrate by paper electrophoresis (0.05 mol of borate buffer) showed that the inosine 5'-monophosphate had been formed in a yield of 88%. By adding methanol to the concentrate, 3.3 g of the disodium salt of inosine 5'-monophosphate (8H 2 O) was obtained. Yield 8% / 0 .
Ein Gemisch von 2 g Adenosin in 50 ml Aceton, 4 ml Phosphortrichlorid und 2 ml Wasser wurden auf die im Beispiel 1 angegebene Weise umgesetzt, worauf weitere 45 ml Phosphortrichlorid zum Reaktionsgemisch gegeben wurden. Durch Aufarbeitung des hierbei erhaltenen Reaktionsgemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wurden 2,3 g des Dinatriumsalzes von 5'-Adenylsäure erhalten. Die Ausbeute betrug 77%.A mixture of 2 g of adenosine in 50 ml of acetone, 4 ml of phosphorus trichloride and 2 ml of water was added implemented the manner indicated in Example 1, whereupon a further 45 ml of phosphorus trichloride were added to the reaction mixture. By processing the the resulting reaction mixture in the manner indicated in Example 1 were 2.3 g of the Obtained disodium salt of 5'-adenylic acid. The yield was 77%.
B e i s ρ i e 1 3B e i s ρ i e 1 3
Ein Gemisch von 2 g Cytidin als Lösung in 100 ml Aceton, 3 ml Phosphortrichlorid und 1 ml Wasser wurden auf die im Beispiel 1 angegebene Weise umgesetzt, worauf weitere 50 ml Phosphortrichlorid zum Reaktiönsgemisch gegeben wurden. Durch Aufarbeitung des hierbei erhaltenen Reaktionsgemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wurden 2,8 g des Dinatriumsalzes von 5'-Cytidylsäure erhalten. Die Ausbeute betrug 75 %.A mixture of 2 g of cytidine as a solution in 100 ml of acetone, 3 ml of phosphorus trichloride and 1 ml of water were implemented in the manner indicated in Example 1, whereupon another 50 ml of phosphorus trichloride for Reaction mixture were given. By working up the reaction mixture obtained in this way 2.8 g of the disodium salt of 5'-cytidylic acid were obtained in the manner indicated in Example 1. The yield was 75%.
Zu einer Suspension von 2 g Inosin in 50 ml Aceton wurden 3 ml Phosphortrichlorid und dann 1 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 10°C gerührt und dann mit 50 ml Phosphortrichlorid bei 0 bis 5°C versetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten der Reaktion überlassen. Die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die im Beispiel I angegebene Weise ergab 3,2 g Dinatriiimsalz von 5'-Inosinsäure. Die Ausbeute betrug 80%.3 ml of phosphorus trichloride and then 1 ml of water were added to a suspension of 2 g of inosine in 50 ml of acetone given. The mixture was stirred for 30 minutes at 10 ° C. and then with 50 ml of phosphorus trichloride 0 to 5 ° C offset. The mixture was left to react for 30 minutes. The processing of the Reaction mixture in the manner indicated in Example I gave 3.2 g of the disodium salt of 5'-inosinic acid. The yield was 80%.
2 g fnosin, 70 ml Aceton, 40 ml Phosphortrichlorid und 1 ml Wasser wurden gleichzeitig gemischt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0 bis 50C der Reaktion überlassen. Durch Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die im Beispiel I angegebene Weise ίο wurden 3 g des Dinatriumsalzes von Inosinsäure erhalten. Die Ausbeute betrug 75%.2 g of fnosine, 70 ml of acetone, 40 ml of phosphorus trichloride and 1 ml of water were mixed at the same time. The mixture was left to react at 0 to 5 ° C. for 2 hours. By working up the reaction mixture in the manner indicated in Example I, 3 g of the disodium salt of inosinic acid were obtained. The yield was 75%.
Ein Gemisch von 2 g Uridin, 50 ml Aceton, 3 ml Phosphortrichlorid und I ml Wasser wurde auf die im Beispiel I angegebene Weise behandelt. Anschließend wurden 50 ml Phosphortrichlorid zum Reaktionsgemisch gegeben. Durch Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wurden 2,9 g des Dinatriumsalzes von 5'-Uridinsäure erhalten. Die Ausbeute betrug 80%·A mixture of 2 g uridine, 50 ml acetone, 3 ml phosphorus trichloride and 1 ml water was added to the treated in the manner indicated in Example I. Then 50 ml of phosphorus trichloride were added to the reaction mixture. By working up the reaction mixture in the manner indicated in Example 1 2.9 g of the disodium salt of 5'-uridic acid were obtained. The yield was 80%
Zu einer Suspension von 2 g Inosin in 50 ml Methyläthylketon wurden 3 ml Phosphortrichlorid und dann 1 ml Wasser gegeben. Das Reaktiönsgemisch wurde 30 Minuten bei 100C gerührt. Nach Zugabe von 50 ml Phosphortrichlorid zum Reaktionsgemisch wurde dieses 30 Minuten in einem offenen Gefäß gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in 1 1 Eiswasser gegossen und die erhaltene Lösung mit einer 20%igen wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf pH-Wert 1,5 eingestellt. Diese Lösung wurde 30 Minuten auf 70°C erhitzt, um die Isopropylidengruppen zu entfernen. Sie wurde dann an einer Aktivkohlesäule adsorbiert. Diese Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer 0,5%igen wäßrigen Natriumhydroxydlösung eluiert. Das Eluat wurde auf pH-Wert 8 eingestellt und eingeengt. Die Analyse der geringen Konzentratmenge durch Papierelektrophorese (0,05 Mol BoratpuiTer) ergab, daß Inosin-5'-monophosphat in einer Ausbeute von 81% gebildet worden war. Durch Zugabe von Methanol zum Konzentrat wurden 3,0 g des Dinatriumsalzes von lnosin-5'-monophosphat (8H2O) erhalten. Die Ausbeute betrug 74%.3 ml of phosphorus trichloride and then 1 ml of water were added to a suspension of 2 g of inosine in 50 ml of methyl ethyl ketone. The Reaktiönsgemisch was stirred for 30 minutes at 10 0 C. After adding 50 ml of phosphorus trichloride to the reaction mixture, this was stirred for 30 minutes in an open vessel. The reaction mixture was then poured into 1 l of ice water and the resulting solution was adjusted to pH 1.5 with a 20% strength aqueous sodium hydroxide solution. This solution was heated to 70 ° C. for 30 minutes to remove the isopropylidene groups. It was then adsorbed on an activated charcoal column. This column was washed with water and eluted with a 0.5% aqueous sodium hydroxide solution. The eluate was adjusted to pH 8 and concentrated. Analysis of the small amount of concentrate by paper electrophoresis (0.05 mol of borate powder) showed that inosine 5'-monophosphate had been formed in a yield of 81%. By adding methanol to the concentrate, 3.0 g of the disodium salt of inosine 5'-monophosphate (8H 2 O) was obtained. The yield was 74%.
Ein Gemisch von 2 g Inosin, 4 ml Phosphortrichlorid, 20 ml Methylisobutylketon und 2 ml Wasser wurde auf die im Beispiel 7 angegebene Weise behandelt. Nach Zugabe von 40 ml Phosphortrichlorid zum Reaktionsgemisch wurde dieses auf die im Beispiel 7 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 2,9 g des Dinatriumsalzes von 5'-Inosinsäureerhaltenwurden. Die Ausbeute betrug 71 %·A mixture of 2 g of inosine, 4 ml of phosphorus trichloride, 20 ml of methyl isobutyl ketone and 2 ml of water was treated in the manner given in Example 7. After adding 40 ml of phosphorus trichloride to give the reaction mixture this was worked up in the manner indicated in Example 7, with 2.9 g of the disodium salt of 5'-inosinic acid. The yield was 71%
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