DE1201949B

DE1201949B - Process for the biosynthetic production of ergot alkaloids by breeding ergot fungi of the genus Claviceps purpurea Tul.

Info

Publication number: DE1201949B
Application number: DES76603A
Authority: DE
Inventors: Dr Jan Kybal; Jiri Protiva; Karin Strnadova; Dr Frantisek Stary
Original assignee: Spofa Sdruzeni Podniku Pro Zdravotnickou Vyrobu
Current assignee: Spofa Sdruzeni Podniku Pro Zdravotnickou Vyrobu
Priority date: 1960-11-11
Filing date: 1961-11-08
Publication date: 1965-09-30

Description

Verfahren zur biosynthetischen Herstellung von Mutterkornalkaloiden durch Züchtung von Mutterkornpilzen der Gattung Claviceps purpurea Tul. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biosynthetischen Herstellung von Mutterkornalkaloiden durch Züchtung von Mutterkornpilzen der Gattung Claviceps purpurea Tul.Process for the biosynthetic production of ergot alkaloids by breeding ergot fungi of the genus Claviceps purpurea Tul. The invention relates to a process for the biosynthetic production of ergot alkaloids by breeding ergot fungi of the genus Claviceps purpurea Tul.

Von den durch verschiedene Vertreter der Gattung Claviceps Tul. (Ordnung Xylariales - früher Sphaeriales) produzierten Alkaloiden findet das Ergotamin in der medizinischen Praxis die größte Armendung. Als einziger, zur Isolation dieses Alkoloids im industriellen Maßstab verwendbarer Rohstoff dienten bisher die Sklerotien des Mutterkorns (Claviceps purpurea/Fr./Tul.), die man von einer parasitischen Kultur auf künstlich infizierten Roggenähren erhält. Durch Selektion reiner Rassen und Stämme des Pilzes ist- es gelungen, aus dem ursprünglich heterogenen Material Stämme mit hohem Alkaloidgehalt zu gewinnen, die nur das gewünschte Ergotamin, praktisch ohne bedeutende Beimischung von Alkaloiden der Ergotoxingruppe, produzieren. Dies, im Zusammenhang mit vollständiger Mechanisation der Impfung und Ernte des Mutterkorns, ermöglichte seine rationelle Feldproduktion und verdrängte die früher verarbeitete, durch Sammeln wildwachsender Sklerotien gewonnene Droge vom Weltmarkt.From the by various representatives of the genus Claviceps Tul. (Order Xylariales - formerly Sphaeriales) found the ergotamine in produced alkaloids the largest arm extension in medical practice. As the only one to isolate this Alkoloids raw material usable on an industrial scale were previously used by the sclerotia of ergot (Claviceps purpurea / Fr. / Tul.), which can be obtained from a parasitic culture on artificially infected ears of rye. By selecting pure races and Strains of the fungus succeeded in making strains from the originally heterogeneous material with a high alkaloid content to gain only the desired ergotamine, practical without significant admixture of alkaloids of the ergotoxine group. This, in connection with full mechanization of vaccination and harvesting of ergot, enabled its rational field production and displaced the previously processed, drug obtained by collecting wild sclerotia from the world market.

Mit Rücksicht auf den großen Verbrauch der Mutterkornalkaloide und auf deren verhältnismäßig hohen Preis wurden gleichzeitig mit den Anfängen der Feldprodukton erste Versuche mit der Biosynthese der Mutterkornalkaloide in saprophytischen Kulturen ,angelegt. In der ersten Phase dieser Forschung versuchten verschiedene Autoren bei Kultivation des Pilzes übliche mikrobiologische Methoden anzuwenden, ohne Rücksicht auf seinen eigenartigen Charakter (W. Bonns, Am. J. Bot., 9, 339, 1922; A.McCrea,Am.J.Bot.,18,50,1931; R.Jaretzky, Arch. Pharm., 273, 348, 1935; E. B a 1 d a c i , Farmaco, 1, Nr. 2-3, 1946; H. D. Michener, N. Snell, Am. J. Bot., 37, 52, 1950). Dieser Weg führte jedoch nicht zum Ziel, denn die Kulturen produzierten keine Alkaloide. Auch die Methoden zur Bewertung des Alkaloidgehaltes (van Urks Reaktion mit p-Dimethylaminobenzaldehyd, pharmakologische Teste) waren nicht insoweit spezifisch, um erhaltene Ergebnisse eindeutig erklären zu können. Erst die Entwicklung der Verteilungsehromatographie und deren Verwendung zur Bewertung der Mutterkornalkaloide (K. M a c ek, Pharmazie, 9, 420, 1954) ermöglichte die Durchführung serioser biosynthetischer Versuche mit Kulturen in vitro. ES ist gelungen, die Entwicklungsbiologie des Pilzes in der natürlichen parasitischen Kultur auf der Wirtspflanze näher zu erkennen und die erhaltenen Erfahrungen in der künstlichen saprophatischen Kultur zu applizieren (J. K yb a 1, F. S t a r y, Planta Medica, 6, 406, 1958). Auf Grund dieser Versuche ist es heute möglich, das Problem der Biosynthese der Mutterkornalkaloide durch saprophytische Kultivation in vitro mit vollständiger Sicherheit als lösbar zu betrachten.In view of the large consumption of ergot alkaloids and their relatively high price, the first experiments with the biosynthesis of ergot alkaloids in saprophytic cultures were made at the same time as the beginning of field production. In the first phase of this research, various authors tried to use the usual microbiological methods in cultivating the fungus, regardless of its peculiar character (W. Bonns, Am. J. Bot., 9, 339, 1922; A.McCrea, Am.J. Bot., 18, 50, 1931; R. Jaretzky, Arch. Pharm., 273, 348, 1935; E. B a 1 daci, Farmaco, 1, No. 2-3, 1946; HD Michener, N. Snell, Am. J. Bot., 37, 52, 1950). However, this path did not lead to the goal, because the cultures did not produce any alkaloids. The methods for evaluating the alkaloid content (van Urk's reaction with p-dimethylaminobenzaldehyde, pharmacological tests) were not specific enough to clearly explain the results obtained. Only the development of distribution chromatography and its use to evaluate ergot alkaloids (K. M ac ek, Pharmazie, 9, 420, 1954) made it possible to carry out serious biosynthetic experiments with cultures in vitro. It has succeeded in identifying the developmental biology of the fungus in the natural parasitic culture on the host plant more closely and in applying the experience obtained in the artificial saprophatic culture (J. K yb a 1, F. S ta ry, Planta Medica, 6, 406 , 1958). On the basis of these experiments it is now possible to consider the problem of the biosynthesis of ergot alkaloids by saprophytic cultivation in vitro with complete certainty as solvable.

Von den verschiedenen Alkaloiden, die der Pilz produziert, ist die Biosynthese der Clavinalkaloide (Agroclavin, Elymoclavin u. a.; M. Abe, Sammelreferat auf der Tagung in Halle 1960; A. Hofmann et a1., Helv. Chem. Acta, 40, 1358, 1957; japanische Patentschrift 178 336; britische Patentschrift 757 696 und belgische Patentschrift 515 266) in saprophytischer Kultur am einfachsten realisierbar.Of the various alkaloids that the fungus produces is the Biosynthesis of the clavine alkaloids (agroclavine, elymoclavine and others; M. Abe, collective lecture at the conference in Halle in 1960; A. Hofmann et al., Helv. Chem. Acta, 40, 1358, 1957; Japanese Patent 178,336; British patent 757 696 and Belgian Patent 515 266) can be implemented most easily in saprophytic culture.

Über Versuche mit der Biosynthese der Alkaloide vom Peptidtyp, zu denen auch das Ergotamin gehört, berichten Arbeiten mehrerer Autoren (A. G. Paul et a1., J. Am. Pharm. Assoc., Sci. Ed., 43, 205, 1954; W. A. Taber, L. C. Vinning, Canad. J. Microbiol., 3, 1, 1957, und 4, 611, 1958). Nur wenigen ist es aber gelungen, einige von diesen Alkaloiden aus den Kulturen zu isolieren und zu identifizieren (H. R a s s b a c h et a1., Arzneimittel-Forschung, 6, 690, 1956; J. Kybal, F. Stary, a. a. O.). Die Angaben über Durchführung dieser Versuche sind aber durchwegs sehr unvollständig, so daß man sie nicht reproduzieren kann. Näheres findet man nur in der Patentliteratur.About experiments with the biosynthesis of the alkaloids of the peptide type, too to whom the ergotamine also belongs, report the work of several authors (A. G. Paul et al., J. Am. Pharm. Assoc., Sci. Ed., 43, 205, 1954; W. A. Taber, L. C. Vinning, Canad. J. Microbiol., 3, 1, 1957 and 4, 611, 1958). But only a few have succeeded isolate and identify some of these alkaloids from cultures (H. R a s s b a c h et a1., Arzneimittel-Forschung, 6, 690, 1956; J. Kybal, F. Stary, a. a. O.). The information but are about to carry out these experiments very incomplete throughout, so that they cannot be reproduced. Find out more one only in the patent literature.

Das erste Verfahren zur Gewinnung einer zur Herstellung von Mutterkornpräparaten geeigneten Droge durch saprophytische Kultivation meldete zum Patentschutz A. Mc C r e a an (USA.-Patent 2056360). Im Hinblick auf damalige methodische Möglichkeiten, insbesondere auf dem Gebiet der Analyse und Isolation der Mutterkornalkaloide, sind die Angaben der Autorin heute nicht mehr überzeugend. Die Reproduktionen dieses Verfahrens lieferten keine Mutterkornalkaloide, auch nicht in analytisch faßbaren Mengen (J. C a p k o v a et a1., Cs. farmacie, 1, 1, 1952). Zu deselben Resultaten kamen auch andere Autoren (H. D. M i c h e n e r , N. S n e 11, Am. J. Bot., 37, 52, 1950; S. K. S i m, H. W. J o u n g k e n, J. Am. Pharm. Assoc., Sei. Ed., 40, 434, 1951; V. E. Tyler, A. E. Schwarting, J. Am. Pharm. Assoc., Sei. Ed., 41, 590, 1952). Das britische Patent 755 555 und das französische Patent 1108l20 schützen ein Verfahren zur Gewinnung der Mutterkornalkaloide, bei welchem man eine stationäre Kultivation auf synthetischen flüssigen Nährböden durchführt und nach 26tägiger Fermentation aus dem Mycelium und der Kultivationsflüssigkeit ein Gemisch von Ergotamin, Ergotaminin und Ergometrin isoliert. Als Grundbedingung zur Realisierung der Biosynthese dieses Alkaloidgemisches wird die Anwesenheit einer ganz bestimmten Menge der Fe++- und Zn++-Ionen im Nährboden angegeben. Außerdem wird in allen Beispielen als einzige Stickstoffquelle das Asparagin angeführt, und zwar in Mengen, die in bezug auf seinen Preis die Verwendung des vorgeschlagenen Nährmediums im industriellen Maßstab nicht gestatten. Das Verfahren gemäß genannten Patenten zeigte sich auch als nicht reproduzierbar. Es wurde im Gegenteil experimentell festgestellt, daß sich unter Bedingungen, welche zur Bildung der Alkaloide in vitro führen, in den Patenten nicht formuliert sind und daß diese nur allgemeine Angaben enthalten.The first process for obtaining a drug suitable for the production of ergot preparations by saprophytic cultivation was registered for patent protection by A. Mc C rea ( USA patent 2056360). With regard to the methodological possibilities of that time, especially in the field of analysis and isolation of ergot alkaloids, the author's statements are no longer convincing today. The reproductions of this process did not yield any ergot alkaloids, not even in analytically detectable amounts (J. C apkova et al., Cs. Farmacie, 1, 1, 1952). Other authors (HD M ichener, N. S ne 11, Am. J. Bot., 37, 52, 1950; SK S im, HW J oungken, J. Am. Pharm. Assoc., Sci. Ed., 40, 434, 1951; VE Tyler, AE Schwarting, J. Am. Pharm. Assoc., Sci. Ed., 41, 590, 1952). British patent 755 555 and French patent 1108l20 protect a process for the production of ergot alkaloids, in which stationary cultivation is carried out on synthetic liquid culture media and, after fermentation for 26 days, a mixture of ergotamine, ergotamine and ergometrine is isolated from the mycelium and the culture liquid. The presence of a very specific amount of Fe ++ and Zn ++ ions in the nutrient medium is stated as a basic condition for realizing the biosynthesis of this alkaloid mixture. In addition, asparagine is cited as the only nitrogen source in all examples, in amounts which, in relation to its price, do not allow the proposed nutrient medium to be used on an industrial scale. The process according to the patents mentioned also turned out to be non-reproducible. On the contrary, it was found experimentally that under conditions which lead to the formation of alkaloids in vitro, the patents are not formulated and that these contain only general information.

Die japanische Firma Takeda Pharmaceutical Industries Ltd. patentierte ein Fermentations- und Isolationsverfahren von zwei Alkaloiden der Clavinreihe, des Agroclavins und Elymoelavins (a. a. O.). Neben Elymoclavin wurde in bedeutender Menge auch ein Vertreter der Peptidalkaloide, das Ergocryptin, produziert und isoliert. Es handelt sich um eine stationäre Kultur eines auf dem Grass Elymus mollis TRIN. parasitierenden Mutterkornstammes. In, dieser Patentschrift ist zum erstenmal der Gedanke formuliert, das Wachstum des Mikroorganismus in solcher Phase der Kultivation zu inhibieren, in der die Biosynthese der Alkaloide zustande kommen soll. Die genannten drei Alkaloide wurden stets nebeneinander produziert und entweder separat isoliert oder nach Isolation der Gesamtalkaloide getrennt.The Japanese company Takeda Pharmaceutical Industries Ltd. patented a fermentation and isolation process of two alkaloids of the clavin series, des agroclavins and elymoelavins (op. cit.). Besides Elymoclavin became in significant Lot also produces and isolates a representative of the peptide alkaloids, ergocryptine. It is a stationary culture of an Elymus mollis TRIN on the grass. parasitic ergot strain. In, this patent is for the first time the Thought formulated, the growth of the microorganism in such a phase of cultivation to inhibit, in which the biosynthesis of the alkaloids should come about. The mentioned three alkaloids were always produced side by side and either isolated separately or separated after isolation of the total alkaloids.

Die Herstellung der Peptidalkaloide ist ferner in der deutschen Patentschrift 1073 689 und in der britischen Patentschrift 837 423 beschrieben. Durch stationäre oder auch submerse Kultivation wurde ein Gemisch der Ergotoxinalkaloide (Anteil der einzelnen Alkaloide ist nicht angeführt). Ergotamin und Ergometrin einschließlich der rechtsdrehenden Isomeren und niedermolekularen Alkaloide der Clavinreihe erhalten. Diese Fermentationen sind im Vergleich mit obenerwähnten Verfahren durch Verlauf in zwei nacheinanderfolgenden Stufen gekennzeichnet. Das Ziel der ersten Phase der Kultivation ist die Produktion der Trockensubstanz; diesem Zwecke werden auch die Kultivationsbedingungen, vor allem intensive Aeration, angepaßt. In der zweiten Phase werden die Bedingungen vor allem durch Zugabe von Substanzen, die den Rh-Wert erniedrigen, und durch Luftausschluß so eingestellt, daß die Kultur Alkaloide produziert. Derselbe Effekt kann auch durch Zugabe von Atmungsgiften oder durch Verwendung von defizienten Mengen an assimilierbarem Stickstoff, Phosphor oder Schwefel im Nährmedium erzielt werden. Alle diese im Verlauf der Kultivation durchgeführten Eingriffe bilden den eigentlichen Gegenstand des Patentschutzes. Dieser Auffassung nach nähern sich beide Patentschriften der schon erwähnten Patentschrift der japanischen Firma.The preparation of the peptide alkaloids is also in the German patent 1073,689 and in British Patent 837,423. By stationary or submerged cultivation was a mixture of ergotoxine alkaloids (proportion of the individual alkaloids is not listed). Including ergotamine and ergometrine of the dextrorotatory isomers and low molecular weight alkaloids of the clavin series. These fermentations are gradual in comparison with the above-mentioned processes marked in two successive stages. The goal of the first phase of Cultivation is the production of dry matter; for this purpose also the Cultivation conditions, especially intensive aeration, adapted. In the second Phase are the conditions mainly by adding substances that increase the Rh value and adjusted by exclusion of air so that the culture produces alkaloids. The same effect can also be achieved by adding or using respiratory toxins deficient amounts of assimilable nitrogen, phosphorus or sulfur in the nutrient medium be achieved. All of these interventions carried out in the course of cultivation constitute the actual subject of patent protection. According to this view are approaching both patents of the aforementioned patent specification of the Japanese company.

Im Laufe der Erforschung der Biosynthese des Ergotamins durch saprophytische Kultivation strebten die Erfinder vorliegender Erfindung danach, sich mit den Bedingungen der Kultivation in vitro der natürlichen Entwicklung des Pilzes, wie diese in parasitischer Kultur auf der Wirtspflanze zustande kommt, zu nähern. Diese Idee wurde im Jahre 1958 veröffentlicht (J. Kybal, F. Story, a. a. O.), und gleichzeitig wurde über die Isolation des reinen Ergotamins aus saprophytischem Mycelium berichtet (J. K y b a 1, F. S t a r y, a. a. O.). Von dieser Zeit an wurden die optimalen Bedingungen der Biosynthese der Mutterkornalkaloide in saprophytischer Kultur näher geprüft und in ein reproduzierbares Verfahren, das ökonomisch bedeutsame Ausbeuten an Mutterkornalkaloiden, vor allem an dem meist gewünschten Ergotamin, liefert, ausgearbeitet.In the course of research into the biosynthesis of ergotamine by saprophytic Cultivation, the inventors of the present invention strove to familiarize themselves with the conditions the cultivation in vitro of the natural development of the fungus, such as this in parasitic Culture on the host plant comes about to approach. This idea came up in Published in 1958 (J. Kybal, F. Story, op. Cit.), And at the same time was about the isolation of pure ergotamine from saprophytic mycelium reported (J. K y b a 1, F. S t a r y, a. a. O.). From that time on, the conditions were optimal examined the biosynthesis of ergot alkaloids in saprophytic culture and in a reproducible process that produces economically significant yields of ergot alkaloids, especially on the most desired ergotamine, delivers, worked out.

Den Gegenstand vorliegender Erfindung bildet ein Verfahren zur künstlichen Kultivation des Mutterkorns (Claviceps purpurea Tul:) in einer Oberflächen-oder Submerskultur unter Luftzufuhr auf flüssigen Nährböden, welche Zucker, wie Saccharose oder Glukose, Quellen von assimilierbarem Stickstoff, mineralische Nährsalze, Spurenelemente und Wuchsstoffe enthalten, bei einer Temperatur von 20 bis 30° C und einem pH-Wert von 4 bis 7. Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivation in einem flüssigen Nährboden durchführt, welcher 2 bis 30 Volumprozent, vorzugsweise 5 bis 10 Volumprozent, einer Mischung von Saccharose oder Glukose mit einem Hexit, insbesondere Sorbit oder Mannit, in einem Gewichtsverhältnis 1: 1 bis 10:1, vorzugsweise 3 : 1, ferner assimilierbaren Stickstoff in Form von Ammoniumionen in einer Menge von 0,05 bis 1,0 Volumprozent und organische Mono- bis Tricarbonsäuren mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, welche gesättigt oder ungesättigt sein können und gegebenenfalls an der Kohlenstoffkette mit Hydroxylgruppen substituiert sind oder in der Kohlenstoffkette eine Ketogruppe tragen, wie Oxal-, Zitronen-, Fumar-, Äpfel-, Milch- oder Brenztaubensäure, in einer Menge von 0,05 bis 1,0 Volumprozent, enthält, und daß man die Kultivation nach Erreichung des höchsten Mutterkornalkaloidgehaltes in einer Volumeneinheit des Nährbodens unterbricht.The subject of the present invention is a method for artificial Cultivation of the ergot (Claviceps purpurea Tul :) in a surface or Submerged culture with air supply on liquid culture media containing sugars such as sucrose or glucose, sources of assimilable nitrogen, mineral nutrient salts, trace elements and contain growth substances at a temperature of 20 to 30 ° C and a pH value from 4 to 7. The new method is characterized in that the cultivation in a liquid nutrient medium, which is 2 to 30 percent by volume, preferably 5 to 10 percent by volume, a mixture of sucrose or glucose with a hexitol, in particular sorbitol or mannitol, in a weight ratio of 1: 1 to 10: 1, preferably 3: 1, furthermore assimilable nitrogen in the form of ammonium ions in an amount from 0.05 to 1.0 percent by volume and organic mono- to tricarboxylic acids with 2 to 6 carbon atoms, which can be saturated or unsaturated and optionally are substituted with hydroxyl groups on the carbon chain or in the carbon chain carry a keto group, such as oxalic, citric, fumaric, malic, lactic or pygmy acid, in an amount of 0.05 to 1.0 percent by volume, and that the cultivation after reaching the highest ergot alkaloid content in one volume unit interrupts the culture medium.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist weiter dadurch gekennzeichnet, daß man die Oberflächenkultivation in Gegenwart von Stoffen, welche die Viskosität des Nährbodens erhöhen, wie Agar, Gelatine oder Methylcellulose, in einer Menge von 0,01 bis 2,0 Volumprozent, auf das Nährbodenvolumen bezogen, durchführt.The method according to the invention is further characterized in that the surface cultivation is carried out in the presence of substances which increase the viscosity of the nutrient medium, such as agar, gelatin or methyl cellulose, in an amount of 0.01 to 2.0 percent by volume, based on the nutrient medium volume .

Zur Kultivation werden Stämme benutzt, die man durch Monokonidien- oder Monoaskosporenisolation aus Sklerotien des Mutterkorns, das am Roggen oder an anderen Wirtspflanzen parasitiert, gewinnt. Als Ausgangsmaterial zur Isolation dienen hochwertige Sklerotien mit gewünschtem Alkaloidspektrum (Preslia, 26, 105, 1954). Die auf diese Weise gewonnenen Monosporenkulturen werden durch regelmäßiges Überimpfen auf Malzextrakt weitergezüchtet. Als Konserven der Produktionsstämme dienen Sklerotien, welche jedes Jahr durch künstliche Infektion des Roggens gewonnen werden. Auf Grund der Analysenwerte dieser Sklerotien wird es beurteilt, inwieweit die Reinheit und die gewünschten Eigenschaften der Stämme erhalten bleiben.Strains are used for cultivation, which one by monoconidia or monoascospore isolation from sclerotia of the ergot grown on rye or parasitizes on other host plants, wins. As a starting material for insulation serve high-quality sclerotia with the desired alkaloid spectrum (Preslia, 26, 105, 1954). The monospore cultures obtained in this way are through regular Inoculated on malt extract further bred. As canned food of the production strains serve sclerotia, which are obtained every year by artificial infection of the rye will. On the basis of the analytical values of these sclerotia, it is assessed to what extent the purity and the desired properties of the strains are preserved.

Zur Inokulation der Fermentationsböden wird ein Inokulum verwendet, das durch Kultivation auf einer Rotationsschüttelmaschine hergestellt wird. Für die Kultivation des Inokulums eignet sich am besten ein 3°-Be-Malzextrakt mit einem Anfangs-pH-Wert von etwa 6,0. Zur Impfung der Inokulationsmedien dienen Wassersuspensionen der Konidien, die man von der Oberfläche der Schrägagarkulturen abschwemmt. Dazu benutzt man 17 bis 21 Tage alte Kulturen. Zur Inokulation verwendet man eine Suspension, die wenigstens 4 - 10s Konidien pro Milliliter enthält. Die Kultivation des Inokulums dauert 48 Stunden bei 25° C. Nach dieser Zeit befindet sich die Kultur am Anfang der logarithmischen Phase des Vermehrens und weist höchste metabolische Aktivität auf, nach der Intensität des Sauerstoffverbrauchs beurteilt. Zur Inokulation der Produktionsnährböden wird das Inokulum in einer Menge von 1 bis 5%, auf das Volumen des Nährbodens bezogen, verwendet.An inoculum is used to inoculate the fermentation bottoms, which is produced by cultivation on a rotary shaker. For the cultivation of the inoculum is best suited to a 3 ° Be-malt extract with a Initial pH of about 6.0. Water suspensions are used to inoculate the inoculation media of the conidia washed away from the surface of the agar slant cultures. In addition cultures that are 17 to 21 days old are used. A suspension is used for inoculation which contains at least 4 - 10s conidia per milliliter. The cultivation of the inoculum takes 48 hours at 25 ° C. After this time, the culture is at the beginning the logarithmic phase of multiplication and exhibits highest metabolic activity on, judged according to the intensity of oxygen consumption. For inoculation of the Production mediums add the inoculum in an amount of 1 to 5%, by volume related to the culture medium, used.

Wird die Fermentation unter submersen Bedingungen durchgeführt, dann läßt sich das schnelle Wachstum des Pilzmyceliums durch ausreichende Menge des Inokulums und durch ausreichende Sauerstoffzuführung sichern. Im Verlauf der stationären Fermentation kommt es aber oft zu einem »Ersinken« des Inokulums; diese verlängert beträchtlich die sogenannte »Lag-Phase« (das Inokulum sinkt unter die Oberfläche des Mediums, wo der Sauerstoffvorrat nicht mehr ausreichend ist). Dieses kann durch Zugabe kleiner Mengen von Stoffen, welche die Viskosität des Mediums erhöhen, wie Agar, Gelatine, Methylcellulose u. ä., verhindert werden. Das Nährmedium bleibt dabei flüssig, das Inokulum jedoch, welches spezifisch schwerer als das Nährmedium ist, kann nicht zum Boden sinken. Auch bei stationären Kulturen ist eine intensive Aeration durch einen zur Oberfläche des Nährbodens zugeführten Luftstrom notwendig, besonders dann, wenn man in größerem Maßstab arbeitet. In stationären Kulturen erreicht der Mikroorganismus unter diesen Bedingungen schon am zweiten bis dritten Tag die logarithmische Phase des Wachstums. Das Trockengewicht des Myceliums erhöht sich dann annähernd linear im Laufe von 10 Tagen. In den ersten Tagen der Inkubation ist das Sphacelium an Reservestoffen arm, erst während des Wachstums fängt es an, Fette anzuhäufen, deren Gehalt dann bis zum Ende konstant bleibt und dem Fettgehalt der parasitischen Sklerotien desselben Stammes entspricht. Zum Ende des Wachstums erreicht auch der Ergotamingehalt sein Maximum und entspricht gleichfalls dem der Sklerotien des verwendeten Stammes. Parallel mit dem Ergotamin erscheint auch die Pigmentation, die gleichfalls dem Pigment der Oberfläche der in der parasitischen Kultur auf der Wirtspflanze aufgewachsenen Sklerotien entspricht. Nach Beendigung der Kultivation wird das Ergotamin aus dem Mycelium wie auch aus dem Fermentationsboden isoliert.If the fermentation is carried out under submerged conditions, then The rapid growth of the mycelium of the fungus can be controlled by a sufficient amount of the inoculum and secure by adequate oxygen supply. In the course of stationary fermentation but there is often a "sinking" of the inoculum; this lengthens considerably the so-called "lag phase" (the inoculum sinks below the surface of the medium, where the oxygen supply is no longer sufficient). This can be made smaller by adding Amounts of substances that increase the viscosity of the medium, such as agar, gelatin, Methyl cellulose and the like. The nutrient medium remains liquid, the Inoculum, however, which is specifically heavier than the nutrient medium, cannot sink to the bottom. Even with stationary cultures, intensive aeration is through a flow of air to the surface of the culture medium is necessary, especially when when working on a larger scale. In stationary cultures, the microorganism reaches under these conditions the logarithmic phase already on the second to third day of growth. The dry weight of the mycelium then increases almost linearly within 10 days. The Sphacelium is on for the first few days of incubation Poor in reserves, only during growth does it begin to accumulate fats, theirs Content then remains constant until the end and the fat content of the parasitic sclerotia of the same tribe. At the end of growth, the ergotamine content also reaches its maximum and also corresponds to that of the sclerotia of the strain used. In parallel with the ergotamine, the pigmentation also appears, which is also the Pigment of the surface of those grown in the parasitic culture on the host plant Corresponds to sclerotia. After the cultivation is finished, the ergotamine is released from the Mycelium as well as isolated from the fermentation bottom.

Die submerse Kultivation hat einen ähnlichen Verlauf wie die stationäre, sie ist aber kürzer, so daß das Optimum, d. h. der maximale Alkaloidgehalt in einer Volumeinheit der Kultur, früher erreicht wird als in 10 Tagen. Dasselbe, was über die Fettbildung und Pigmentierung gesagt wurde, gilt auch hier.The submerged cultivation has a similar course as the stationary, but it is shorter, so that the optimum, i.e. H. the maximum alkaloid content in one Unit of volume of culture, reached earlier than in 10 days. Same thing about The fat formation and pigmentation was said to apply here as well.

An dem günstigen Verlauf und Ergebnis der Kultivation beteiligt sich außer den bereits erwähnten Arbeitsbedingungen die Zusammensetzung des Fermentationsbodens; von größter Bedeutung ist dabei die Qualität und Menge der anwesenden Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und .deren gegenseitiges Verhältnis.Participates in the favorable course and result of cultivation in addition to the working conditions already mentioned, the composition of the fermentation soil; of the greatest importance is the quality and quantity of the carbon and nitrogen sources and their mutual relationship.

Kohlenstoffquellen: Aus der Literatur ist es bekannt, daß der Pilz eine ganze Reihe von Monosaccharide, Disacchariden und höheren Zuckern assimilieren kann (W. A. T a b e r, L. C. V i n n i n g, Can. J. Microbil., 3, 1, 1957). Auf Grund der Versuche mit der Assimilierbarkeit verschiedener Glycide konnte deren Ausnutzung folgender Reihe nach festgestellt werden: Glukose, Saccharose, Trehalose, Rafinose, Mannit, Cellabiose, Sorbit, Malto.se,Galaktose, Xylose, Laktose, Arabinose, Rhamnose, Sorbose. Die ersten sieben Substanzen sind zur Bildung der Trockensubstanz praktisch verwendbar. Aus ökonomischen Gründen wird die Saccharose bevorzugt. Verwendet man die Saccharose als einzige Zuckerart, erzielt man zwar eine befriedigende Trockensubstanzbildung, die Biosynthese des Ergotamins erfolgt jedoch nicht. Dagegen ermöglichen bereits kleine Mengen einiger alkoholischer Zucker, z. B. Sorbits, die Bildung des Ergotamins in bedeutsamer Menge. Es wurde versuchsweise festgestellt, daß optimale Bedingungen für die Biosynthese des Ergotamins nur bei einem ganz bestimmten Verhältnis der Saccharose zum Sorbit erreicht werden können.Carbon sources: From the literature it is known that the fungus assimilate a whole range of monosaccharides, disaccharides, and higher sugars can (W. A. Tab e r, L. C. V i n n i n g, Can. J. Microbil., 3, 1, 1957). on The reason for the experiments with the assimilability of various glycides could their Utilization of the following sequence can be determined: glucose, sucrose, trehalose, Rafinose, mannitol, cellabiose, sorbitol, malto.se, galactose, xylose, lactose, arabinose, Rhamnose, sorbose. The first seven substances are used to form the dry matter practically usable. Sucrose is preferred for economic reasons. Used if sucrose is the only type of sugar, a satisfactory dry matter formation is achieved, however, the biosynthesis of ergotamine does not take place. On the other hand, already enable small amounts of some alcoholic sugars, e.g. B. sorbitol, the formation of ergotamine in a significant amount. It has experimentally been found that the conditions are optimal for the biosynthesis of ergotamine only with a very specific ratio of Sucrose to sorbitol can be achieved.

Stickstoffquellen: Als Stickstoffquellen wurde eine ganze Reihe von Substanzen, welche den Stickstoff in einer N03--, NH4+-Amino- oder Amidoform enthalten, vorgeschlagen (W. A. T a b e r, L. C. V i n -n i n g, Can. J. Microbiol., 3, 1, 1957; 4, 611, 1958). Wenn sich auch für die Kultivation eine ganze Reihe von Stickstoffquellen verwenden läßt, sowohl definierte als auch komplexe Substanzen, sind aus ökonomischen Gründen nur Nitrate und Ammoniumsalze praktisch von Bedeutung.Nitrogen sources: A whole series of substances containing nitrogen in an NO3-, NH4 + -amino or amido form have been proposed as nitrogen sources (WA T but, LC V in -ning, Can. J. Microbiol., 3, 1 , 1957; 4, 611, 1958). Even if a whole series of nitrogen sources can be used for cultivation, both defined and complex substances, only nitrates and ammonium salts are of practical importance for economic reasons.

Neuerdings beschäftigten sich mit Problemen der Stickstoffquellen T a b e r und V i n n i n g (a. a. O.). Wenn auch ihre Angaben über den Alkaloidgehalt in Kulturen nur auf einer unspezifischen Farbreaktion mit dem Van-Urk-Reagens basieren konnten sie auf Grund der Bewertung der Trockensubstanzproduktion eine sehr schlechte Assimilierbarkeit des Nitratstickstoffs beweisen. Ebenfalls die Ammoniumform des Stickstoffs, als Salz einer anorganischen Säure zugegeben, wurde im Vergleich mit organischen Stickstoffquellen sehr schlecht assimiliert. Die Autoren vermuten mit Recht, daß das schlechte Wachstum auf Nährböden mit Ammoniumsalzen anorganischer Säuren durch einseitige Assimilation der NH4+-Ionen und durch mit ihr verbundene Verschiebung des pH-Wertes in nicht physiologischen sauren Bereich verursacht wird. Sie stellten weiter fest, daß zur Einstellung des AnfangspH-Wertes des Produktionsmediums nur die Bernsteinsäure, nicht aber die Zitronen-, Wein-, Essig-, Phosphor- oder Schwefelsäure mit Erfolg verwendet werden konnte. In übereinstimmung damit findet man in mehreren Arbeiten auch bei anderen Autoren (A. S t o 11 et 11l., Helv. Chim. Acta, 37, 1815, 1954; M. Abe, Ann. Rep. of the Takeda Res. Lab., 10, 129, 1951) die Verwendung des Ammoniumsuccinats als einzige Stickstoffquelle. Andere Formen der Ammoniumverbindungen wurden bisher nicht benutzt.Recently, problems of nitrogen sources have been dealt with T a b e r and V i n n i n g (a. A. O.). Even if their information about the alkaloid content in cultures based only on a non-specific color reaction with the Van-Urk reagent could they get a very bad one based on the evaluation of the dry matter production Prove assimilability of nitrate nitrogen. Also the ammonium form of Nitrogen, added as a salt of an inorganic acid, was compared with poorly assimilated organic nitrogen sources. the authors rightly suspect that the poor growth on nutrient media with ammonium salts inorganic acids through unilateral assimilation of the NH4 + ions and through with their associated shift of the pH value in the non-physiologically acidic range caused. They also found that to set the initial pH value of the production medium only succinic acid, but not the lemon, wine, Acetic, phosphoric or sulfuric acid could be used with success. In accordance thus one finds in several works also with other authors (A. S t o 11 et 11l., Helv. Chim. Acta, 37, 1815, 1954; M. Abe, Ann. Rep. Of the Takeda Res. Lab., 10, 129, 1951) the use of ammonium succinate as the only nitrogen source. Other Forms of ammonium compounds have not previously been used.

Den Versuchsergebnissen nach kann man ein sehr gutes Wachstum des Pilzes und die Biosynthse des Ergotamins auf Nährböden, die als einzige Stickstoffquelle das NH4+-Ion enthalten, erzielen, und zwar in Anwesenheit von verschiedenen organischen Säuren im Nährboden, wie Zitronen-, Oxal-, Fumar-, Äpfel-, Milch- und Brenztraubensäure. Diese organischen Säuren, welche zu den Zwischenprodukten des aeroben Abbaues der Brenztraubensäure gehören, wurden auch in jungen Sklerotien der parasitisch wachsenden Kultur desselben Stammes gefunden. Bei Verwendung einer Stickstoffquelle in Ammoniumform in Gegenwart einiger der obenerwähnten organischen Säuren war es während der Kultivation nicht notwendig, das pH, dessen Wert sowohl für das Wachstum als auch für die Biosynthese des Ergotamins günstig geblieben war, einzustellen.According to the test results, the growth of the Fungus and the biosynthesis of ergotamine on nutrient media as the only source of nitrogen containing the NH4 + ion, achieve, in the presence of various organic Acids in the culture medium, such as citric, oxalic, fumaric, malic, lactic and pyruvic acids. These organic acids, which are the intermediate products of the aerobic degradation of the Pyruvic acid were also parasitically growing in young sclerotia Culture of the same tribe found. When using a nitrogen source in ammonium form in the presence of some of the organic acids mentioned above, it was during cultivation not necessary the pH, its value both for growth and for biosynthesis of ergotamine had remained cheap to discontinue.

Das Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis: Es wurde versuchsweise festgestellt, daß die durch die Kultur produzierte Alkaloidmenge im direkten Bezug zum Lipoidstoffgehalt in der Trockensubstanz des Myceliums steht. Bei relativ hohem Gehalt an assimilierbarem Stickstoff im Nährmedium wächst ein Mycelium mit niedrigem Fettgehalt an, und wenn der Trockensubstanzfettgehalt unter 1011/o sinkt, dann produziert die Kultur keine bedeutende Alkaloidmenge mehr. Der höchste Alkaloidgehalt dagegen wurde bei Kulturen mit 3011/oigem und höherem Trockensubstanzfettgehalt gefunden.The carbon-nitrogen ratio: it has been experimentally determined that the amount of alkaloid produced by the culture is directly related to the lipoid content is in the dry matter of the mycelium. With a relatively high content of assimilable Nitrogen in the nutrient medium grows a mycelium with a low fat content, and if so the dry matter fat content falls below 1011 / o, then the culture does not produce any significant amount of alkaloid more. The highest alkaloid content, however, was found in cultures found with 3011% and higher dry matter fat content.

Es gibt mehrere Kriterien für richtigen Kultivationsverlauf: schneller Anwuchs des Sphaceliums, rechtzeitige Pigmentation, genügender Lipoidstoffgehalt im Mycelium, Sporulation des Myceliums und schließlich der Alkaloidgehalt. Wird die Methode erfindungsgemäß modifiziert, so erzielt man einen schnellen Anwuchs des Sphaceliums, welches in einer bestimmten Phase zu pigmentieren und Fett anzuhäufen beginnt, ähnlich wie bei der Pilzentwicklung auf der Wirtspflanze. Das Mycelium ändert sein Aussehen während der Kultivation vom ursprünglich weißen luftigen Sphaceliums in ein sprödes pigmentiertes Mycelium, das mit seinem Charakter einem Sklerotium ähnelt (P. M i 1 o v i d o v , Ceska mykologie, 10, 221, 1956).There are several criteria for the correct cultivation process: faster Growth of the Sphacelium, timely pigmentation, sufficient lipoid content in the mycelium, sporulation of the mycelium and finally the alkaloid content. Will If the method is modified according to the invention, rapid growth is achieved of the Sphacelium, which in a certain phase pigment and accumulate fat begins, similar to the development of fungi on the host plant. The mycelium changes its appearance during cultivation from the originally white, airy Sphaceliums into a brittle pigmented mycelium, which, with its character, resembles a sclerotium is similar (P. M i 1 o v i d o v, Ceska mykologie, 10, 221, 1956).

Allgemein kann man zusammenfassen, daß das erfindungsgemäße Verfahren die saprophytische Kultivation in einer Richtung zu führen ermöglicht, die dem Verlauf des Wachstums in natürlicher parasitischer Kultur entspricht, was auch die Ursache dessen ist, daß das beschriebene Kultivationsverfahren nicht nur für einen Stamm des Mutterkorns spezifisch ist, sondern auch für die verschiedensten Stämme, die sich voneinander durch ihre Produktionsfähigkeit und ihren Alkaloidtyp unterscheiden, verwendbar ist. Das Spektrum der in saprophytischer Kultur produzierten Alkaloide entspricht dann dem Typ des Sklerotiums, aus welchem der benutzte Stamm isoliert wurde.In general, it can be summarized that the method according to the invention the saprophytic cultivation to lead in a direction that allows the course of growth in natural parasitic culture, which is also the cause that is, the cultivation method described is not only for one strain of ergot is specific, but also for the most diverse strains that differ from each other in terms of their ability to produce and their alkaloid type, is usable. The range of alkaloids produced in saprophytic culture then corresponds to the type of sclerotium from which the strain used is isolated became.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur künstlichen Kultivation von Mutterkorn in saprophytischer Kultur ist durch hohen technischen und ökonomischen Fortschritt gekennzeichnet; dessen Vorteile liegen in Verwendung von leicht zugänglichem und billigem Ausgangsmaterial, insbesondere Stickstoffquellen. Während der ganzen Kultivationsdauer sind ferner keine im technischen Maßstab anspruchsvolle und kostspielige Eingriffe erforderlich. Die Kultivation verläuft einstufig unter natürlichen Bedingungen, welche die Selbstregelung des ganzen Prozesses ermöglichen.The method according to the invention for the artificial cultivation of ergot in saprophytic culture is due to high technical and economic progress marked; its advantages lie in the use of easily accessible and cheap feedstock, especially nitrogen sources. During the entire cultivation period are also not technically demanding and costly interventions necessary. Cultivation takes place in one stage under natural conditions, which enable self-regulation of the whole process.

Beispiel 1 Die Kultivation wurde in Fernbachflaschen mit einem Inhalt von 1000 ml, gefüllt mit je 600 ml Kultivationsboden, enthaltend Saccharose 7,511/o, Sorbit 2,51/o Zitronensäure 0,511/o, NH3 0,541/o Ca(N03)2 4H20 0,1511/o, MgS04 0,025%, KH,P04 0,0250/0, Agar 0,05 %, Leitungswasser, durchgeführt. Der pH-Wert wurde vor der Sterilisation auf 6,0 eingestellt. Die Sterilisation dauerte 35 Minuten bei einem Druck von 1 Atü. Jede Fernbachflasche wurde mit 20 ml 48 Stunden altem Inokulum, angewachsen an 3° B6 dichtem Malzextrakt, auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 25° C beimpft. Nach Beimpfung wurde der Flascheninhalt durchgemischt. Die Kulturen wurden bei 25° C 22 Tage bebrütet. Nach der Beendigung der Kultivation wurde das Mycelium von der Kultivationslösung abgetrennt, mit Wasser gewaschen und im Luftstrom bei Zimmertemperatur getrocknet. In einem aliquoten Teil des Myceliums wurde der Ergotamingehalt mit Hilfe der Papierchromatographie semiquantitativ bestimmt. In Trokkensubstanz desMyceliums wurden 0,14 % Ergotamin gefunden. Mit Hilfe .der Papierchromatographie wurden außer Spuren von Ergotamin, welches wahrscheinlich während der Bearbeitung der Proben entstanden ist, keine anderen Peptidalkaloide festgestellt. In gleicher Weise wurde auch die Kultivationslösung nachTrocknendurch Lyophilisation analysiert. Aus der übrigen Trockensubstanz wurden die Alkaloide folgenderweise isoliert und identifiziert: Nach Alkalisierung wurden die Basen mit einem organischen Lösungsmittel (Benzol) extrahiert, aus diesem Extrakt in einer Lösung einer organischen Säure (Weinsäure) aufgenommen und durch Alkalisieren dieses sauren Extraktes das rohe Ergotamin gewonnen, welches nach Reinigung gleiche Eigenschaften wie eine authentische Probe zeigte. Beispiel 2 Die Kultivation wurde in einem Laboratoriumsfermentationstank mit einem Inhalt von 31, gefüllt mit 1400 ml Fermentationsmedium, enthaltend Saccharose 4%, Sorbit 1,511/o, Zitronensäure 0,311/o, NH3 0,32%, Ca(N03)2 - 4H20 011501" M9S04 0,025%, KH2P04 0,025'%, Hefeautolysat 0,1%, Leitungswasser, durchgeführt. Der pH-Wert wurde vor der Sterilisation auf 6,3 eingestellt. Die Sterilisation dauerte 60 Minuten bei einem Druck von 1 Atü. Zur Beimpfung wurde ein 5%iger, analog dem Beispiel 1 hergestellter Impfstoff verwendet. Die Fermentation wurde bei 25° C bei einer Aeration von 0,7 l/Min. und 700 Umdrehungen des Rührwerkes per Minute durchgeführt. Die Fermentation dauerte 7 Tage. Die Trockensubstanzproduktion des Myceliums betrug 1,5 0/0. Das Mycelium und der Fermentationsboden wurden analog wie im Beispiel l aufgearbeitet. In der Trockensubstanz des Myceliums wurden 0,07% Ergotamin gefunden.Example 1 The cultivation was carried out in Fernbach bottles with a content of 1000 ml, each filled with 600 ml of cultivation soil, containing sucrose 7.511 / o, Sorbitol 2.51 / o Citric acid 0.511 / o, NH3 0.541 / o Ca (N03) 2 4H20 0.1511 / o, MgS04 0.025%, KH, P04 0.0250 / 0, agar 0.05%, tap water. The pH was before the sterilization set to 6.0. The sterilization lasted 35 minutes a pressure of 1 atm. Each Fernbach bottle was filled with 20 ml of 48 hour old inoculum, grown on 3 ° B6 dense malt extract, on a rotating shaker inoculated at 25 ° C. After inoculation, the contents of the bottle were mixed thoroughly. The cultures were incubated at 25 ° C for 22 days. After the cultivation ended, it became The mycelium is separated from the cultivation solution, washed with water and in a stream of air dried at room temperature. In an aliquot of the mycelium, the Ergotamine content determined semiquantitatively with the help of paper chromatography. In Dry matter of the mycelium was found to be 0.14% ergotamine. With the help of paper chromatography were except for traces of ergotamine, which probably occurred during processing of the samples, no other peptide alkaloids were found. In the same Also, the culture solution after drying by lyophilization was analyzed. The alkaloids were isolated from the remaining dry matter as follows identified: After alkalization, the bases were washed with an organic solvent (Benzene) extracted from this extract in a solution of an organic acid (Tartaric acid) and by alkalizing this acidic extract the raw Ergotamine obtained, which after cleaning has the same properties as an authentic one Sample showed. Example 2 The cultivation was carried out in a laboratory fermentation tank with a content of 31, filled with 1400 ml of fermentation medium containing sucrose 4%, sorbitol 1.511 / o, citric acid 0.311 / o, NH3 0.32%, Ca (NO3) 2-4H20 011501 "M9S04 0.025%, KH2P04 0.025%, yeast autolysate 0.1%, tap water. The pH was before the sterilization set to 6.3. The sterilization lasted 60 minutes at a pressure of 1 atm. A 5% analog was used for inoculation the vaccine prepared in Example 1 was used. The fermentation was at 25 ° C with an aeration of 0.7 l / min. and 700 revolutions of the agitator per minute carried out. The fermentation lasted 7 days. The dry matter production of the Mycelium was 1.5%. The mycelium and fermentation tray were analogous worked up as in example l. In the dry matter of the mycelium, 0.07% Ergotamine found.

Beispiel 3 Die Kultivation wurde mit einem Mutterkornstamm durchgeführt, der aus einem auf Roggen parasitierenden Sklerotium mit 0,42%igem Gehalt der Alkaloide der Ergotoxingruppe in der Trockensubstanz isoliert wurde. Die einzelnen Alkaloide der Ergotoxingruppe wurden im Verhältnis Ergocristin zu Ergocornin zu Ergokryptin = 3:1:2 vertreten. Die stationäre Kultivation wurde in Fernbachflaschen mit einem Inhalt von 251 gefüllt, mit je 141 Kultivationsmedium der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 1, nur mit dem Unterschied, daß vom dritten Tage der Inkubation an auf die Oberfläche des Mediums milder Luftstrom zugeleitet wurde. Kultivationsdauer 19 Tage. Das Mycelium sowie auch der Fermentationsboden wurden analog wie im Beispiel 1 aufgearbeitet. In der Trockensubstanz des Myceliums wurden 0,18% Gesamtalkaloide gefunden. Durch Papierchromatographie wurde festgestellt, daß das Verhältnis der einzelnen Alkaloide der Ergotoxingruppe dem des benutzten Stammes entspricht.Example 3 The cultivation was carried out with an ergot strain that from a sclerotium parasitizing on rye with a 0.42% content of alkaloids the ergotoxin group was isolated in the dry matter. The individual alkaloids of the ergotoxine group were in the ratio of ergocristine to ergocornine to ergocryptine = 3: 1: 2 represented. The stationary cultivation was in Fernbach bottles with a Contents of 251 filled, each with 141 culture medium of the same composition as in Example 1, only with the difference that from the third day of incubation a mild stream of air was supplied to the surface of the medium. Cultivation time 19 days. The mycelium as well as the fermentation bottom were analogous to the example 1 worked up. In the dry matter of the mycelium, 0.18% total alkaloids were found found. It was found by paper chromatography that the ratio of individual alkaloids of the ergotoxin group corresponds to that of the strain used.

Claims

Claims: 1. Process for the biosynthetic production of Ergot alkaloids of the ergotamine and ergotoxin group through the cultivation of ergot fungi of the genus Claviceps purpurea Tul. in a surface or submerged culture below Air supply at a temperature of 20 to 30 ° C and a pH value of 4 to 7 liquid nutrient media containing a saccharide, organic acids and compounds with assimilable nitrogen, mineral nutrients, trace elements and growth substances contain, characterized in that the cultivation is carried out in a nutrient medium, the 2 to 30 volume percent, preferably 5 to 10 volume percent of a mixture of Sucrose or glucose with a hexitol, especially with sorbitol or mannitol in a weight ratio of 1: 1 to 10: 1, preferably 3: 1, further as assimilable Nitrogen 0.05 to 1.0 percent by volume ammonium ions and 0.05 to 1.0 percent by volume organic saturated or unsaturated, optionally with hydroxyl groups or a keto radical substituted mono- to tricarboxylic acids with 2 to 6 carbon atoms, z. B. oxalic, fumaric, malic, lactic or pyruvic acid, especially citric acid, contains, and one breeding after reaching the highest alkaloid content in one Volume unit of the culture medium interrupts.

2. The method according to claim 1, characterized in that the cultivation is carried out in a surface culture which contains 0.01 to 2.0 percent by volume viscosity-increasing additives, in particular agar, gelatin or methyl cellulose. Considered publications: German Auslegeschriften Nos. 1073 689, 1077 826; British Patent Nos. 757 696, 755 555, 837 423; USA. Patent No. 2 056 360. Contemplated older patents: German patent no. 1,140,670..