DE1077826B

DE1077826B - Process for the biosynthetic production of ergot alkaloids

Info

Publication number: DE1077826B
Application number: DEV10160A
Authority: DE
Inventors: Dr Siegfried Windisch; Walther Bronn
Original assignee: Versuchs & Lehranstalt
Current assignee: Versuchs & Lehranstalt
Priority date: 1956-02-10
Filing date: 1956-02-10
Publication date: 1960-03-17

Description

Verfahren zur biosynthetischen Erzeugung von Mutterkornalkaloiden Zusatz zur Patentanmeldung I9885IVa/30h (Auslegeschrift 1073 689) Die Erfindung betrifft eine Verbesserung des Verfahrens nach Patentanmeldung J 9885 IVa/30h zur, biosynthetischen Erzeugung von Mutterkornalkaloiden durch saprophytische Züchtung von Mutterkornpilzen in Nährsubstraten unter besonderen Bedingungen.Process for the biosynthetic production of ergot alkaloids Addition to patent application I9885IVa / 30h (Auslegeschrift 1073 689) The invention relates to an improvement of the process according to patent application J 9885 IVa / 30h for the biosynthetic production of ergot alkaloids by saprophytic cultivation of ergot fungi in nutrient substrates under special conditions.

In der Patentanmeldung J 98&5 IVa/30h wurde dargelegt, daß eine Alkaloidanhäufung in saprophytischen Claviceps-Kulturen dann eintritt, wenn diese nach der einleitenden Wachstumsphase, welche unter aeroben Bedingungen bei pH-Werten von etwa 3,0 bis 5,0 durchgeführt wird, anschließend in einer Phase stark verminderter Zellatmung bei pH-Werten - von etwa 5,5 bis 7,0 gehalten werden. Als Mittel zur Einschränkung der Zellatmung wurde dabei eine starke Erniedrigung des Redoxpotentials der Kulturlösung auf pH-Werte von etwa 18 vorgeschlagen (Fernhalten des Luftsauerstoffs und/oder Zusatz üblicher pH-erniedrigender Stoffe).In the patent application J 98 & 5 IVa / 30h it was stated that a Alkaloid accumulation in saprophytic claviceps cultures occurs when these after the initial growth phase, which takes place under aerobic conditions at pH values from about 3.0 to 5.0 is carried out, then in a phase greatly reduced Cellular respiration can be maintained at pH levels - from about 5.5 to 7.0. As a means of Restriction of cell respiration resulted in a strong decrease in redox potential of the culture solution to pH values of about 18 suggested (keeping away the oxygen in the air and / or addition of usual pH-lowering substances).

Bei weiteren Untersuchungen konnte festgestellt werden, daß die zur Alkaloidbildung erforderliche Herabsetzung der Zellatmung auch noch durch andere Methoden zu erreichen ist, und zwar durch eine bestimmte Mangelernährung der Pilze oder durch Zusatz spezifischer, an sich bekannter Zellatmungsgiften. Bei diesen Verfahren tritt die Atmungshemmung und damit die- Alkaloidbildung auch unter aeroben Verhältnissen ein.In further investigations it was found that the for Alkaloid formation required reduction of cellular respiration also by others Methods to be achieved is through a certain malnutrition of the mushrooms or by adding specific, known per se cell respiratory toxins. With these Procedure occurs the respiratory inhibition and thus the alkaloid formation also under aerobic Circumstances.

Das Verfahren derAtmungshernmung durch Mangelernährung beruht auf der bekannten Erscheinung, daß Mikroorganismenkulturen eine gegebene Kohlenhydratmenge nur so lange assimilieren und veratmen können, wie auch eine bestimmte assimilierbare Menge anderer essentieller Nährstoffe, insbesondere Stickstoff, Phosphat und Sulfat, vorhanden ist. Sind in einer ihrer sonstigen Zusammensetzung nach für optimales Wachstum ausgewogenen Nährlösung nur unzureichende Mengen Stickstoff, Phosphat oder Sulfat enthalten, so wachsen und atmen die Kulturen darin nur so lange, bis der Mangelnährstoff völlig assimiliert ist. Von diesem Zeitpunkt ab stagniert das Wachstum, und der Atmungsstoffwechsel geht in eine Art Ruhezustand über. Je nach Art der Mikroorganismen ist dies mit einer zunehmenden Verfettung der Zellen oder Speicherung von Polysaccharariden verbunden. Es lag nun nicht ohne weiteres nahe, diese vorzugsweise bei der Hefe gemachten Erfahrungen auch auf die Lebensverhältnisse der Mutterkornpilze zu übertragen, da es sich hier um ganz andere Organismen handelt und auch die Stoffwechselprodukte ganz andere sind. Trotzdem zeigte sich, daß dies auch für die Claviceps-Kulturen zutrifft. Mit zunehmendem Mangel an Stickstoff, Phosphat oder Sulfat gehen die Claviceps-Zellen ebenfalls aus der Wachstumsphase in die atmungsgehemmte Ruhephase über, und gleichzeitig setzt eine Alkaloidanhäufung ein.The process of respiratory failure due to malnutrition is based on the well-known phenomenon that microorganism cultures a given amount of carbohydrate can assimilate and breathe only as long as a certain assimilable one can Amount of other essential nutrients, especially nitrogen, phosphate and sulfate, is available. Are in one of their other composition for optimal Growth balanced nutrient solution only has insufficient amounts of nitrogen, phosphate or If they contain sulfate, the cultures in it only grow and breathe until the Nutrient deficiency is fully assimilated. From this point on, growth stagnates, and the respiratory metabolism goes into a kind of dormant state. Depending on the type of microorganism is this with increasing obesity of the cells or storage of polysaccharides tied together. It was not immediately obvious that this should be the case with the yeast transferring experiences made to the living conditions of ergot mushrooms, because we are dealing here with completely different organisms and also with metabolic products are completely different. Nevertheless, it was found that this also applies to the claviceps cultures applies. As the lack of nitrogen, phosphate, or sulfate increases, the claviceps cells go down also from the growth phase to the respiratory restraint phase, and at the same time starts an alkaloid accumulation.

Es wird daher vorgeschlagen, das Verfahren der Mangelernährung zur Atmungshemmung und damit zur Alkaloidbildung bei den Mutterkornpilzen zu benutzen.It is therefore suggested to use the method of malnutrition To use respiratory inhibition and thus for alkaloid formation in the ergot fungi.

Das für ungehindertes Wachstum und intensive Atmung der Claviceps-Kulturen notwendige Verhältnis von Kohlenstoff zu Stickstoff zu Phosphat zu Sulfat ist mindestens C : N : P 04: S 04 wie 2001:5:3: 1. Hierbei wird unter aeroben Bedingungen der Kohlenstoff eben noch optimal in Zellsubstanz umgewandelt, und die Kulturen gehen nach völligem Kohlenhydratverbrauch in das autolytische Stadium über. Während der gesamten Kulturdauer ist hierbei die Atmung uneingeschränkt. Die Phase verminderter Atmung und Alkaloidbildung wird nicht erreicht.That for unhindered growth and intensive breathing of the claviceps cultures necessary ratio of carbon to nitrogen to phosphate to sulfate is at least C: N: P 04: S 04 like 2001: 5: 3: 1. Here, the carbon is produced under aerobic conditions just now optimally converted into cell substance, and the cultures go to full Carbohydrate consumption into the autolytic stage. During the entire cultivation period breathing is unrestricted here. The phase of decreased breathing and alkaloid formation will not be reached.

Als günstig für eine Mangelzüchtung, bei der die atmungsintensive Wachstumsphase in die atmungsgehemmte Ruhephase mit Alkaloidanhäufung übergeht, haben sich folgende Konzentrationsverhältnisse erwiesen C: N: P O4: S O4 wie 200:2:3:1 (Stickstoffmangel), C : N : P O4: S O4 wie 200:5:0,8:1 (Phosphatmangel), C: N: P O4: S O4 wie 200:5:3:0,35 (Sulfatmangel). The following concentration ratios C: N: P O4: S O4 such as 200: 2: 3: 1 (nitrogen deficiency), C: N: P have proven to be favorable for deficient breeding, in which the respiratory-intensive growth phase changes into the respiratory-inhibited resting phase with alkaloid accumulation O4: S O4 like 200: 5: 0.8: 1 (phosphate deficiency), C: N: P O4: S O4 like 200: 5: 3: 0.35 (sulfate deficiency).

Werden die Mengen der Mangelnährstoffe noch kleiner gewählt, dann tritt zwar ebenfalls eine gewisse Alkaloidbildung auf, aber die zuerst einsetzende Wachstumsphase ist zu kurz. Das bedeutet, es steht in der anschließenden stationären, atmungsgehemmten Phase zu wenig Pilzmaterial zur Alkaloidbildung zur Verfügung. Durch Wahl der Stickstoff-; Phosphat-und Sulfatmenge kann der Übergang zwischen den beiden Phasen zeitlich geregelt werden. Das kennzeichnende Prinzip kann auch in zwei verschiedenen Chargen durchgeführt werden, nämlich durch eine normale Anzucht des Pilzmaterials in einem Züchtungsgefäß unter Bedingungen einer reinen Wachstums- und Atmungsphase und anschließendes Überführen des Pilzmaterials in ein zweites Gärmedium, das alle normalen Nährstoffe außer Stickstoff, Phosphat oder Sulfat enthält.If the amounts of the deficient nutrients are chosen to be even smaller, then A certain alkaloid formation also occurs, but the one that sets in first Growth phase is too short. That means it is in the subsequent stationary, breath-inhibited Phase too little fungal material for alkaloid formation to disposal. By choosing the nitrogen; Phosphate and sulfate can make the transition can be timed between the two phases. The distinguishing principle can also be carried out in two different batches, namely by one normal cultivation of the mushroom material in a cultivation vessel under conditions of pure growth and breathing phase and subsequent transfer of the mushroom material in a second fermentation medium that contains all normal nutrients except nitrogen, phosphate or contains sulfate.

Das Verfahren der Atmungshemmung durch Zusatz spezifischer Atmungsgifte ist an sich bekannt und bei einer großen Anzahl von Organismen untersucht worden. Es liegt heute auch schon eine Liste von Chemikalien vor, die als spezifische Atmungsgifte wirken, ebenso sind Angaben über ihre Wirksamkeit in Abhängigkeit von der Dosierung bekannt. Aber auch hier lag es nicht ohne weiteres nahe, diese Erkenntnisse auf die Züchtung von Mutterkornpilzen und deren Alkaloidbildung zu übertragen. Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, die Mutterkornpilze nach der Wachstumsphase in die zur Alkaloidbildung notwendige Phase verminderter Atmung überzuführen durch Zusatz bekannter Atmungsgifte, wie z. B. Cyanid, Jodacetat, Arsenit, Fluorid, Azid, 2,4-Dinitrophenol, in den üblichen, zur Atmungshemmung genügenden Mengen. Geeignete Konzentrationen der Atmungsgifte in den Kulturlösungen von Oberflächenkulturen sind etwa 10-2 Mol Cyanid, 10-3 bis 5 - 10-s Mol Jodacetat, 10-2 Mol Arsenit, 10-2 Mol Fluorid, 10-2 Mol Azid. Für Submerskulturen genügt meist eine Dosierung, die um etwa eine Zehnerpotenz -niedriger liegt. So konnte festgestellt werden, daß die Atmung von Oberflächenmy cel des Mutterkornpilzes durch Zugabe von 10-2 Mol Cyanid zu 79%, durch 10-3 Mol Cyanid aber nur zu 20% gehemmt wird, während Submersmycel desselben Stammes unter gleichen Bedingungen durch 10-3 Mol Cyanid schon eine 83%ige Atmungshemmung zeigt.The process of inhibiting breathing through the addition of specific respiratory toxins is known per se and has been studied in a large number of organisms. Today there is already a list of chemicals that are known to be specific respiratory toxins work, as well as information about their effectiveness depending on the dosage known. But here, too, it was not immediately obvious to base this knowledge on to transfer the cultivation of ergot fungi and their alkaloid formation. According to the invention it is suggested that the ergot fungi after the growth phase in the alkaloid formation transferring the necessary phase of reduced breathing by adding known respiratory toxins, such as B. cyanide, iodine acetate, arsenite, fluoride, azide, 2,4-dinitrophenol, in the usual, Amounts sufficient to inhibit breathing. Appropriate concentrations of respiratory toxins in the culture solutions of surface cultures there are about 10-2 moles of cyanide, 10-3 to 5 - 10-s moles iodine acetate, 10-2 moles arsenite, 10-2 moles fluoride, 10-2 moles azide. For submerged cultures A dosage that is about a power of ten lower is usually sufficient. So it was found that the respiration of surface mycelium of the ergot fungus by adding 10-2 moles of cyanide to 79%, but by 10-3 moles of cyanide only 20% inhibited is, while submerged mycelium of the same strain under the same conditions by 10-3 Mol cyanide already shows 83% respiratory inhibition.

Das bereits in der Patentanmeldung J 9885 IV a/30 h Angeführte, daß nämlich die Alkaloidausbeute und Zusammensetzung der gebildeten Gesamtalkaloide weitgehend von dem verwendeten Pilzstamm abhängig sind, gilt entsprechend auch für die hier beschriebenen Verfahren. Beispiel 1 Dieses Beispiel soll die Atmungshemmung und damit verbundene Alkaloidbildung durch Stickstoffmangelernährung beschreiben. Eine Nährlösung, bestehend aus 50/a Glucose, 0,04% Harnstoff, 0,2% K H2 P 04, 0,1% Mg S 04 - 7 aq, 0.010/0 Fe S 04 - 7 ad und Spurenelemente (1 Milligrammprozent Zn S 04 -7 aq, 50 Gammaprozent CU S 04 - 5 aq, 5 Gammaprozent (N H4) B M07 024 - 4 aq, 8 Gammaprozent Mn S 04, 2 Gammaprozent H3 BO.), gelöst in destilliertem Wasser (diese Nährlösung wird im weiteren als `\T-arme Nährlösung bezeichnet), und eine entsprechende Nährlösung (im weiteren als N-reiche Nährlösung bezeichnet), die statt 0,04% Harnstoff 0.11% enthält, werden zu je 1 1 in mehrere 5-1-Erlenmeyerkolben abgefüllt und 15 Minuten bei 120° C im Autoklav sterilisiert. Der Harnstoff wird dabei zu beiden Nährlösungen erst nach dem Hitzesterilisieren in Form einer kalt bereiteten, sterilfiltrierten konzentrierten Stammlösung zugegeben, da er sich beim Erhitzen teilweise zersetzt. Ebenso wird der p11-Wert erst nach :dem Sterilisieren auf 4,6 eingestellt. Danach werden die Kolben mit je 10 ml einer dichten Konidiensuspension eines Stammes von Claviceps microcephala, TUL. (isoliert aus einem Sklerotium von Phragmitis communis) beimpft und als Ober--flächenkulturen bei 28° C bebrütet. Nach 12tägiger Züchtung wird "der pH-Wert der, Nährlösungen durch Zugabe einer sterilen Alkalilauge auf 6,0 eingestellt und in der Folgezeit in 3tägigen Intervallen kontrolliert und gegebenenfalls nachkorrigiert.What has already been stated in patent application J 9885 IV a / 30 h, namely that the alkaloid yield and composition of the total alkaloids formed are largely dependent on the fungus strain used, also applies accordingly to the processes described here. Example 1 This example is intended to describe the inhibition of breathing and the associated formation of alkaloid due to nitrogen malnutrition. A nutrient solution consisting of 50 / a glucose, 0.04% urea, 0.2% K H2 P 04, 0.1% Mg S 04 - 7 aq, 0.010 / 0 Fe S 04 - 7 ad and trace elements (1 milligram percent Zn S 04 -7 aq, 50 gamma percent CU S 04 - 5 aq, 5 gamma percent (N H4) B M07 024 - 4 aq, 8 gamma percent Mn S 04, 2 gamma percent H3 BO.), Dissolved in distilled water (this nutrient solution is hereinafter referred to as `\ T-poor nutrient solution), and a corresponding nutrient solution (hereinafter referred to as N-rich nutrient solution), which contains 0.11% instead of 0.04% urea, 1 1 each in several 5-1 Erlenmeyer flasks bottled and sterilized in an autoclave at 120 ° C for 15 minutes. The urea is added to both nutrient solutions after heat sterilization in the form of a cold, sterile-filtered concentrated stock solution, as it partially decomposes when heated. Likewise, the p11 value is only set to 4.6 after: the sterilization. The flasks are then each filled with 10 ml of a dense conidia suspension of a strain of Claviceps microcephala, TUL. (isolated from a sclerotium of Phragmitis communis) and incubated as surface cultures at 28 ° C. After 12 days of cultivation, "the pH value of the nutrient solutions is adjusted to 6.0 by adding a sterile alkaline solution and then checked at 3-day intervals and corrected if necessary.

Etwa 3 Tage später weisen die Kulturen mit der N-armen Nährlösung ein Myceltrockengewicht von annähernd 8 g pro Kolben auf, der Restzuckergehalt beträgt etwa 2% und der Gesamtalkaloidgehalt (berechnet als Ergotamin), im Kulturfiltrat 0,005% und im Feuchtmycel 0,008%. Demgegenüber haben die Kulturen mit der N-reichen Nährlösung den Zucker eben verbraucht, ein Myceltrockengewicht von 16 g pro Kolben erreicht und dabei keine Alkaloide gebildet.About 3 days later, the cultures with the low-N nutrient solution show a dry mycelium weight of approximately 8 g per flask, the residual sugar content is about 2% and the total alkaloid content (calculated as ergotamine) in the culture filtrate 0.005% and in the moist mycelium 0.008%. In contrast, the cultures with the N-rich Nutrient solution the sugar just used up, a dry mycelium weight of 16 g per flask reached and thereby no alkaloids formed.

Nach einer Gesamtkulturdauer von 3 Wochen enthalten die N-armen Kulturen 0,02% Gesamtalkaloide im Kulturfiltrat und 0,01% im Feuchtmycel. Die N-reichen Kulturen sind zu diesem Zeitpunkt bereits in das Stadium der Autolyse übergegangen, ohne daß bei ihnen nachweisbare Alkaloidmengen gebildet worden wären.After a total culture time of 3 weeks, the N-poor cultures contain 0.02% total alkaloids in the culture filtrate and 0.01% in the moist mycelium. The N-rich cultures have already passed into the autolysis stage at this point, without that detectable amounts of alkaloid would have been formed in them.

Eine Auftrennung der aus den N-armen Kulturen extrahierten Gesamtalkaloide nach den bekannten, im Beispiel 1 der Patentanmeldung J 9885 IV a / 30h beschriebenen Methoden ergibt, daß diese zum überwiegenden Teil aus Vertretern der. Ergotoxin- und Ergotiningruppe und daneben aus niedrigmolekularen Mutterkornalkaloiden bestehen. Beispiel 2 Dieses Beispiel soll die Atmungshemmung und damit verbundene Alkaloidbildung durch Phosphatmangelernährung beschreiben.A separation of the total alkaloids extracted from the N-poor cultures according to the known, described in Example 1 of patent application J 9885 IV a / 30h Methods shows that these are for the most part made up of representatives of the. Ergotoxin and ergotinine group and also consist of low molecular weight ergot alkaloids. Example 2 This example aims at the inhibition of breathing and associated alkaloid formation describe by phosphate malnutrition.

Eine phosphatarme Nährlösung, bestehend aus 511/9 Glucose, 1% Kaliumnitrat, 0,011% K H2 P 04, 0,05 % K Cl (zur Kaliumergänzung), 0,1% Mg S 04 -7 aq, 0,01% Fe S 04 * 7 aq und Spurenelementen (wie im Beispiel 1), gelöst in destilliertem Wasser, pH-Wert eingestellt auf 4,8, sowie eine phosphatreiche entsprechende Nährlösung, die statt 0,011% KH2P04 0,1% und kein KCl enthält, werden zu je 1 1 in mehrere 5-1-Erlenmeyerkolben abgefüllt und 15 Minuten bei 120° C im Autoklav sterilisiert. Danach werden die Kolben mit je 10 ml einer dichten Konidiensuspension eines Stammes von Claviceps purpurea (Fr.) TIM. (isoliert aus einem Sklerotium von Festuca arundinacea) beimpft und als Oberflächenkulturen bei 28° C bebrütet.A low-phosphate nutrient solution, consisting of 511/9 glucose, 1% potassium nitrate, 0.011% K H2 P 04, 0.05% K Cl (for potassium supplement), 0.1% Mg S 04 -7 aq, 0.01% Fe S 04 * 7 aq and trace elements (as in example 1), dissolved in distilled water, pH adjusted to 4.8, as well as a corresponding nutrient solution rich in phosphate, which contains 0.1% KH2P04 instead of 0.011% and no KCl, are poured 1 liter into several 5-1 Erlenmeyer flasks bottled and sterilized in an autoclave at 120 ° C for 15 minutes. After that, the Flasks with 10 ml each of a dense conidia suspension of a strain of Claviceps purpurea (Fr.) TIM. (isolated from a Festuca arundinacea sclerotium) and incubated as surface cultures at 28 ° C.

Nach 12tägiger Züchtung wird der pH Wert der Nährlösungen durch Zugabe einer sterilen Alkalilauge auf 6,0 eingestellt und in der Folgezeit in 3tägigen Intervallen kontrolliert und nachkorrigiert. Zu diesem Zeitpunkt ergibt eine Analyse der Kulturen folgendes Bild: Die Kulturen mit der phosphatarrnen Nährlösung haben ein Myceltrockengewicht von etwa 6 g pro Kolben, ihr Restzuckergehalt beträgt etwa 3 %, Alkaloide sind erst in Spuren vorhanden. Die Kulturen mit der phosphatreichen Nährlösung enthalten annähernd 17 g Myceltrockengewicht pro Kolben, der Zucker ist fast völlig verbraucht, und Alkaloide sind nicht nachweisbar.After 12 days of cultivation, the pH of the nutrient solutions is adjusted by adding a sterile alkali lye set to 6.0 and then in 3 days Checked and corrected at intervals. At this point an analysis results of the cultures as follows: The cultures with the low-phosphate nutrient solution have a dry mycelium weight of about 6 g per flask, its residual sugar content is about 3%, alkaloids are only present in traces. The cultures with the phosphate rich Nutrient solutions contain approximately 17 grams of dry mycelium weight per flask, which is sugar almost completely consumed, and alkaloids are undetectable.

Nach einer Gesamtzüchtungsdauer von 24 Tagen haben die phosphatarmen Kulturen 0,08% Gesamtalkaloide im Kulturfiltrat und 0,3% im Feuchtmycel gebildet. Bei längerer Kulturdauer nimmt die Alkaloidmenge wieder ab. Zu diesem Zeitpunkt sind die phosphatreichen Kulturen schon im autolytischen Stadium, ohne daß während der Züchtung Alkaloide gebildet wurden.After a total cultivation period of 24 days, they are low in phosphate Cultures 0.08% total alkaloids formed in the culture filtrate and 0.3% in the moist mycelium. If the cultivation takes longer, the Alkaloid amount decreases again. To this At this point, the phosphate-rich cultures are already in the autolytic stage, without that alkaloids were formed during cultivation.

Die aus den phosphatarmen Kulturen extrahierten Gesamtalkaloide bestehen etwa zur Hälfte aus Ergotoxin- und Ergotininalkaloiden sowie Ergosin und Ergosinin und zur anderen Hälfte aus niedrigmolekularen Mutterkornalkaloiden und Zersetzungsprodukten. Beispiel 3 Dieses Beispiel soll die Atmungshemmung und damit verbundene Alkaloidbildung durch Sulfatmangelernährung beschreiben.The total alkaloids extracted from the low-phosphate cultures are composed about half of ergotoxin and ergotinine alkaloids as well as ergosin and ergosinin and the other half from low molecular weight ergot alkaloids and decomposition products. Example 3 This example aims at the inhibition of breathing and associated alkaloid formation describe by sulfate malnutrition.

Ein Laborfermenter von 51 Nutzinhalt üblicher Bauart (Belüftungsvorrichtung, Rührwelle, Einrichtung zur Schaumbekämpfung, pH-Regulierung und steriler Probenahme) wird mit folgender sulfatarmer Nährlösung befällt: 2,5% Glucose, 0,5% Kaliumnitrat, 0,1% K H2 P O4, 0,005% Mg S 04 - 7 aq, 0,02 0/ö Mg C12 (zur Magnesiumergänzung), 0,00511/o, Fe S 04 ' 7 äq, gelöst in Leitungswasser, p$ Wert eingestellt auf 4,8. Parallel dazu wird ein zweiter Fermenter mit einer sulfatreichen, entsprechenden Nährlösung, die statt 0,005% Mg S 04 . 7 aq 0,05% und kein Mg C12 enthält, befällt. Die Fermenter werden samt Inhalt 30 Minuten bei 120° C im Autoklav sterilisiert und nach dem Abkühlen mit je 500 ml einer voll ausgewachsenen Submerskultur desselben Claviceps-Stammes wie bei Beispiel 2 beimpft. Zur Züchtung werden die Fermenter bei 28° C mit steriler Luft belüftet (10001/Std.) und mit 400 U/min gerührt.A laboratory fermenter with a usable capacity of 51 of the usual design (ventilation device, Stirrer shaft, device for foam control, pH regulation and sterile sampling) is filled with the following nutrient solution, which is low in sulphate: 2.5% glucose, 0.5% potassium nitrate, 0.1% K H2 P O4, 0.005% Mg S 04 - 7 aq, 0.02 0 / ö Mg C12 (to supplement magnesium), 0.00511 / o, Fe S 04 '7 eq, dissolved in tap water, p $ value adjusted to 4.8. In parallel, a second fermenter with a sulphate-rich, corresponding Nutrient solution, which instead of 0.005% Mg S 04. 7 aq 0.05% and contains no Mg C12. The fermenters and their contents are sterilized in an autoclave at 120 ° C for 30 minutes and after cooling with 500 ml each of a fully grown submerged culture of the same Claviceps strain as in Example 2 inoculated. The fermenters are used for cultivation aerated with sterile air at 28 ° C. (1000 l / hour) and stirred at 400 rpm.

Nach 48 Stunden wird der pH-Wert der Kulturen auf 6,0 eingestellt und im weiteren laufend nachkorrigiert. Die sulfatreiche Kultur ist zu diesem Zeitpunkt fast völlig ausgewachsen (Myceltrockengewicht etwa 11 g/1) und enthält nur noch eine geringe Restzuckermenge. Alkaloide sind weder im Kulturfiltrat noch im Mycel nachweisbar. Demgegenüber zeigt die sulfatarme Kultur noch einen Restzuckergehalt von etwa 1,5 % und ein Myceltrockengewicht von etwa 4 g/1: Alkaloide sind nur in Spuren vorhanden.After 48 hours the pH of the cultures is adjusted to 6.0 and subsequently corrected continuously. The culture rich in sulfate is at this point almost fully grown (dry mycelium weight about 11 g / 1) and only contains a small amount of residual sugar. Alkaloids are neither in the culture filtrate nor in the mycelium verifiable. In contrast, the low-sulfate culture still shows a residual sugar content of about 1.5% and a dry mycelium weight of about 4 g / 1: alkaloids are only in Traces present.

Nach einer Züchtungszeit von insgesamt 120 Stunden ist die sulfatreiche Kultur im autolytischen Stadium, ohne daß Alkaloide gebildet worden wären. Dagegen hat die sulfatarme Kultur immer noch einen gewissen Restzuckergehalt und enthält 0,01% Gesamtalkaloide im Kulturfiltrat und 0,1% im Feuchtmycel. Bei längerer Kulturdauer nimmt die Alkaloidmenge wieder ab. Die Zusammensetzung der extrahierten Gesamtalkaloide entspricht derjenigen im Beispiel 2'. Beispiel 4 Dieses Beispiel soll die Atmungshemmung und damit verbundene Alkaloidbildung durch Zusatz spezifischer Atmungsgifte beschreiben.After a total of 120 hours of cultivation, the sulphate-rich one Culture in the autolytic stage without the formation of alkaloids. Against it the low-sulfate culture still has a certain residual sugar content and contains 0.01% total alkaloids in the culture filtrate and 0.1% in the moist mycelium. For longer cultivation times the amount of alkaloid decreases again. The composition of the total alkaloids extracted corresponds to that in example 2 '. Example 4 This example aims to inhibit breathing and describe the associated alkaloid formation through the addition of specific respiratory toxins.

Eine Nährlösung, bestehend aus 5% Glucose, 0,2% K H2 P 04, 0;1% Mg S O4 * 7 aq, 0,01% Fe S O4 ' 7 aq und 0,2% Maisquellextrakt, gelöst in Leitungswasser, PH-Wert eingestellt auf 4,6, wird zu je 1 1 in mehrere 5-1-Erlenmeyerkolben abgefüllt und 15 Minuten bei 120° C im Autoklav sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird die Nährlösung ergänzt durch Zusatz von 0,110/0 Harnstoff. Der Harnstoff ist vorher in Form einer konzentrierten Stammlösung auf einen pH-Wert von 4,6 einzustellen und durch EK-Filtration zu sterilisieren. Danach werden die Kolben mit je 10 ml einer dichten Konidiensuspension eines Claviceps-spec.-Stammes (isoliert aus einem Sklerotium von Brachiaria brizantha) beimpft und als Oberflächenkulturen bei 28° C bebrütet.A nutrient solution consisting of 5% glucose, 0.2% K H2 P 04, 0; 1% Mg S O4 * 7 aq, 0.01% Fe S O4 '7 aq and 0.2% corn source extract, dissolved in tap water, PH-value adjusted to 4.6, 1 liter each is filled into several 5-1 Erlenmeyer flasks and sterilized for 15 minutes at 120 ° C in an autoclave. After cooling down, the nutrient solution becomes supplemented by the addition of 0.110 / 0 urea. The urea is previously in the form of a Adjust the concentrated stock solution to a pH of 4.6 and filter through EK to sterilize. Then the flasks are each filled with 10 ml of a dense conidia suspension of a Claviceps spec. strain (isolated from a sclerotium of Brachiaria brizantha) inoculated and incubated as surface cultures at 28 ° C.

Das Fortschreiten des Pilzwachstums wird an Hand einer wiederholten Restzuckerbestimmung verfolgt und die Wachstums- und Atmungsphase bei einem Restzuckergehalt von ungefähr 1,5 % (gewöhnlich erreicht nach 10 bis 12 Tagen) durch Zusatz einer sterilfiltrierten Lösung von 0,65 g Kaliumcyanid pro Kulturkolben (entsprechend einer Konzentration von 10-2 Mol) unterbrochen. Gleichzeitig wird der pH-Wert der Kulturlösung auf 6,0 eingestellt.The progression of fungal growth is repeated on the basis of one Residual sugar determination tracked and the growth and respiratory phase in the case of residual sugar of about 1.5% (usually achieved after 10 to 12 days) by adding one sterile-filtered solution of 0.65 g potassium cyanide per culture flask (corresponding to a concentration of 10-2 mol) interrupted. At the same time, the pH value of the Culture solution adjusted to 6.0.

Nach einer weiteren Kulturdauer von einer Woche befinden sich in den Kulturen 0,1% Gesamtalkaloide im Kulturfiltrat und 0,4% im Feuchtmycel. Parallelkulturen ohne Cyanidzusatz enthalten nur geringe Alkaloidspuren.After another week of cultivation, the Cultures 0.1% total alkaloids in the culture filtrate and 0.4% in the moist mycelium. Parallel cultures without added cyanide contain only minor traces of alkaloid.

Die extrahierten Gesamtalkaloide bestehen zu etwa einem Drittel aus Ergotoxin- und Ergotininalkaloiden und zu annähernd zwei Dritteln aus niedrigmolekularen Mutterkornalkaloiden.The extracted total alkaloids consist of about one third Ergotoxin and ergotinine alkaloids and almost two thirds from low molecular weight Ergot alkaloids.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for the biosynthetic production of ergot alkaloids according to patent application J 9885 IV a / 30h, characterized in that the for alkaloid formation necessary phase of greatly reduced cell respiration even under aerobic conditions Deficiency of assimilable nitrogen or deficiency in phosphate or deficiency in sulfate is achieved.

2. Process for the biosynthetic production of ergot alkaloids according to patent application J 9885 IV a / 30 h, in particular according to claim 1, characterized in that that the phase necessary for alkaloid formation is also under greatly reduced breathing aerobic conditions through the addition of known cell respiratory toxins such as cyanide, Iodine acetate, arsenite, fluoride, 2,4-dinitrophenol.

3. Procedure according to Claim 1, characterized in that nutrient solutions with a ratio of assimilable Nitrogen to assimilable carbon less than 1:40, mainly 1:70 to 1: 100 can be used.

4. The method according to claim 1, characterized in that that nutrient solutions with a ratio of P 04 to assimilable carbon are smaller as 1: 100, especially 1: 200 to 1: 280, can be used.

5. The method according to claim 1, characterized in that nutrient solutions with a ratio of S O4 to assimilable Carbon smaller than 1: 300, primarily 1: 500 to 1: 1000, can be used.