DE1200827B

DE1200827B - Process for making aquocobalamin

Info

Publication number: DE1200827B
Application number: DEP29470A
Authority: DE
Inventors: Gerardo Fabrizio; Ivan Rolovich
Original assignee: Pierrel SpA
Current assignee: Pierrel SpA
Priority date: 1961-06-12
Filing date: 1962-05-24
Publication date: 1965-09-16
Also published as: NL279534A; ES274708A1; GB1007973A; AT251204B; DK107373C; CH413234A

Description

Verfahren zur Herstellung von Aquocobalamin Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Aquocobalamin aus Bromo-, Chloro-, Sulfato-, Acetato-, Nitratocobalamin oder aus deren Gemischen. Das Verfahren nach der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung dieser dissoziierbaren Cobalamine durch eine mit Hydroxylionen beladene Anionenaustauschersäule schickt und aus der so erhaltenen Lösung das Aquocobalamin in bekannter Weise isoliert.Method of Making Aquocobalamin The invention relates to a process for the production of aquocobalamin from bromo-, chloro-, sulfato-, acetato-, Nitratocobalamin or mixtures thereof. The method of the invention is characterized in that an aqueous solution of these dissociable cobalamins is used sends through an anion exchange column loaded with hydroxyl ions and from the solution obtained in this way, the aquocobalamin is isolated in a known manner.

Entsprechend einigen in der Literatur beschriebenen Verfahren wird Aquocobalamin durch katalytische Reduktion oder durch UV-Bestrahlung aus Cyanocobalamin in wäßriger Lösung hergestellt. According to some of the procedures described in the literature Aquocobalamin by catalytic reduction or by UV radiation from cyanocobalamin produced in aqueous solution.

Andere Verfahren zur Herstellung der Vitamine B12a und B12b aus Fermentations-Nährlösungen gewisser Mikroorganismen vom Typ der Streptomyces sind ebenfalls beschrieben worden. Man hat durch Forschungsarbeiten ermittelt, daß das nach diesen Verfahren erhaltene und als Vitamine B12a und B12b bezeichnete Produkt kein reines Aquocobalamin im Zustand der freien Base ist. Geeignete analytische Untersuchungen ergaben, daß Aquocobalamin als freie Base in den Streptomyces- und anderen Bakterienkulturen und auch in anderem biologischem Material nicht existiert. Tatsächlich wird die OH-Gruppe des Aquocobalaminmoleküls gemäß seiner starken Neigung, zu reagieren, leicht durch andere im Kulturmedium anwesende Ionen ersetzt, wobei Analoge des Vitamins B12, hauptsächlich Chlorocobalamin und Dichlorocobalamin gebildet werden, da diese Medien reich an Chlorionen sind, welche als Komponente entweder aus den Kulturmedien selbst oder aus dem Molekül, welches die Rolle des »Precursors« spielt (Kobalt(II)-chlorid), eingeführt wird. Other methods of producing vitamins B12a and B12b from fermentation nutrient solutions certain Streptomyces-type microorganisms have also been described. It has been found through research that the obtained by these methods and the product designated as vitamins B12a and B12b is not a pure aquocobalamin im State of the free base is. Appropriate analytical tests showed that aquocobalamin as a free base in the Streptomyces and other bacterial cultures and also in others biological material does not exist. It actually becomes the OH group of the aquocobalamin molecule according to its strong tendency to react, easily through others in the culture medium present ions replaced, being analogues of vitamin B12, mainly chlorocobalamin and dichlorocobalamin are formed, as these media are rich in chlorine ions, which as a component either from the culture media itself or from the molecule, which plays the role of the »precursor« (cobalt (II) chloride) is introduced.

Die Bildung von Chloro-, Bromo-, Sulfato- und Nitratocobalamin usw. findet äußerst leicht in Gegenwart kleinster Mengen dieser Anionen statt (s. USA.-Patentschrift 2 738 302).The formation of chloro-, bromo-, sulfato- and nitrocobalamin, etc. takes place extremely easily in the presence of the smallest amounts of these anions (see USA patent 2 738 302).

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Herstellung von Aquocobalamin in Form der freien Base aus Naturstoffen ermöglicht wird. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß die aktiven Substanzen in Form der substituierten Cobalamine den Isolations- und Reinigungsverfahren unterworfen werden können, wobei die nicht ionisierbaren Cobalamine, wie Cyanocobalamin, Schwefelcobalamin usw. allerdings ausgeschlossen sind. Als Folge der besseren Stabilität der substituierten Cobalamine gegenüber dem Aquocobalamin, welches unter den physikochemischen Bedingungen dieser Reinigungsprozesse sehr instabil ist, können viel höhere Ausbeuten erzielt werden. Die Umwand- lung zum Aquocobalamin findet im Anschluß an das Reinigungsverfahren statt und liefert Ausbeuten von mehr als 80O/o. The advantage of the method according to the invention is that the Production of aquocobalamin in the form of the free base from natural substances enables will. Another advantage of the process is that the active substances in the form of substituted cobalamins subjected to isolation and purification processes can be, the non-ionizable cobalamins, such as cyanocobalamin, sulfur cobalamin etc. are excluded. As a result of the better stability of the substituted Cobalamine versus Aquocobalamin, which under the physicochemical conditions This cleaning process is very unstable, much higher yields can be achieved will. The conversion The treatment for aquocobalamin takes place after the cleaning process instead and gives yields of more than 80O / o.

Es ist vorteilhaft, die konzentrierte, gereinigte Cobalamine mit einem Reinheitsgrad von mehr als 50°/0, wenn möglich von 50 bis 80°/o enthaltende Lösung durch eine mit einem geeigneten Ionentauscherharz, vorzugsweise vom Typ der quervernetzten Polystyrole, beschickte Säule zu schicken. It is beneficial to use the concentrated, purified cobalamine containing a degree of purity of more than 50%, if possible from 50 to 80% Solution by one with a suitable ion exchange resin, preferably of the type cross-linked polystyrene to send loaded column.

Das Verhältnis von Harzvolumen zu Cobalamingewicht soll 10:1 betragen. Während dieser Behandlung werden die vom Cobalamin dissoziierten Cl-, SO4-, NO3-, Br- und Acetat-Ionen durch die gleiche Zahl OH-Ionen ersetzt, und es bildet sich Aquocobalamin in Form der freien Base. Es wurde jedoch gefunden, daß Cyanocobalamin durch dieses Verfahren nicht zu Aquocobalamin übergeführt werden kann, wahrscheinlich, weil die CN-Ionen vom gelösten Cyanocobalamin nicht dissoziiert sind.The ratio of resin volume to cobalamine weight should be 10: 1. During this treatment, the Cl-, SO4-, NO3-, Br and acetate ions are replaced by the same number of OH ions, and it is formed Aquocobalamin in the form of the free base. However, it has been found that cyanocobalamin cannot be converted to aquocobalamin by this process, probably, because the CN ions are not dissociated from the dissolved cyanocobalamin.

Die verfahrensgemäß erhaltene Aquocobalaminlösung wird sodann in bekannter Weise konzentriert und mit 6 Volumina Aceton versetzt, worauf sich das Aquocobalamin unter Bildung von Kristallen aus der Lösung abscheidet, die isoliert werden. The aquocobalamin solution obtained according to the method is then in Concentrated in a known manner and mixed with 6 volumes of acetone, whereupon the Aquocobalamin separates from the solution with the formation of crystals, which isolates will.

Beispiel a) Isolation und Reinigung der aktiven Cobalamine Die cobalaminhaltigen Stoffe - Cyanocobalamin darf nicht anwesend sein - werden in Wasser in einem Verhältnis von 5 bis 20 Teilen fester Stoff auf 100 Teile Suspension suspendiert, auf 100 bis 120"C erwärmt und unter Rühren 10 Minuten bei dieser Temperatur gehalten. Example a) Isolation and purification of the active cobalamins The cobalamin-containing Substances - cyanocobalamin must not be present - are in water in a proportion suspended from 5 to 20 parts of solid substance to 100 parts of suspension, to 100 to 120 "C and kept stirring for 10 minutes at this temperature.

Nach dem Abkühlen wird ein gleiches Volumen Aceton zugegeben. Abgeschiedene Feststoffe werden abfiltriert, und das Filtrat wird unter vermindertem Druck auf drei Zehntel seines ursprünglichen Volumens eingeengt. After cooling, an equal volume of acetone is added. Secluded Solids are filtered off and the filtrate is taken up under reduced pressure three tenths of its original volume.

Die angereicherte wäßrige Lösung wird durch Behandlung mit Kalziumoxyd gereingt, welches in einer Menge von 1,5 Teilen pro 100 Teile Lösung zugegeben wird, wodurch der pH-Wert der Lösung auf etwa 10 gebracht wird. Von Proteinen und anderen Niederschlägen wird filtriert. Die Niederschläge werden verworfen. The enriched aqueous solution is made by treatment with calcium oxide cleaned, which is added in an amount of 1.5 parts per 100 parts of solution, bringing the pH of the solution to about 10. Of proteins and others Precipitates are filtered. The precipitates are discarded.

In der nächsten Reinigungsstufe werden die Cobalamine als Gerbsäurekomplexe ausgefällt. Zu diesem Zweck setzt man 100Teilen der gereinigten Lösung 0,5 Teile Gerbsäure zu und rührt diese Mischung 60 Minuten. Nach Filtration wird der Niederschlag in 5%iger Essigsäure gelöst. Die essigsaure Lösung wird auf die Hälfte ihres ursprünglichen Volumens eingeengt und mittels einer Aluminiumoxydsäule chromatographiert. In the next purification stage, the cobalamins are used as tannic acid complexes failed. For this purpose, 100 parts of the purified solution are added to 0.5 parts Add tannic acid and stir this mixture for 60 minutes. After filtration, the precipitate becomes dissolved in 5% acetic acid. The acetic acid solution will be half of its original Concentrated in volume and chromatographed using an aluminum oxide column.

Die Hauptfraktionen werden getrennt und die Lösungen auf einen Gehalt von etwa 5 g Cobalamin pro Liter Lösung konzentriert. b) Umwandlung zu Aquocobalamin Aus der gereinigten und konzentrierten Lösung wird Aquocobalamin durch Ionenaustausch erhalten. The main fractions are separated and the solutions are reduced to one content concentrated from about 5 g of cobalamin per liter of solution. b) Conversion to aquocobalamin The purified and concentrated solution becomes aquocobalamin through ion exchange obtain.

1. Herstellung der Säule 11 Ionenaustauscherharz Amberlite IRA 400 wird unter Rühren in 251 einer 4%igen Natronlauge suspendiert. Diese Mischung wird in eine Glassäule von 211 Inhalt gegossen. Das Verhältnis von innerem Durchmesser der Säule zu ihrer Höhe beträgt etwa 0,25. Die Höhe der sich auf dem Filter absetzenden Harzschicht soll etwa die Hälfte der Kolonnenhöhe betragen. Nachdem die Natronlauge vollständig abgelaufen ist, wird so lange mit ionenfreiem Wasser nachgewaschen, bis das ablaufende Wasser einen pH-Wert von etwa 7 besitzt. Die Säule ist dann betriebsfertig. 1. Manufacture of column 11 ion exchange resin Amberlite IRA 400 is suspended in a 4% sodium hydroxide solution with stirring. This mixture will poured into a glass column of 211 content. The ratio of the inner diameter the column to its height is about 0.25. The amount of deposits on the filter Resin layer should be about half the height of the column. After the caustic soda has expired completely, it is washed with ion-free water for as long as until the draining water has a pH of about 7. The column is then ready for use.

2. Umwandlung in freies Aquocobalamin 11 der nach a) erhaltenen Lösung, welche etwa 5 g Cobalamine enthält, wird durch die Säule gegeben. 2. Conversion into free aquocobalamin 11 of the solution obtained according to a), which contains about 5 g of cobalamine is passed through the column.

Man reguliert die Durchflußgeschwindigkeit so ein, daß in der Minute etwa 30 bis 50 ml durchlaufen. Der pH-Wert der behandelten Lösung liegt bei 8,0 bis 8,5. c) Kristallisation des Aquocobalamins Die aus dem Ionentauschverfahren erhaltene Lösung wird im Vakuum bis zu einem Aquocobalamingehalt von 15 bis 25 g pro Liter eingeengt. Dann gießt man sie unter Rühren langsam in das achtfache Volumen Aceton. Es bilden sich Aquocobalaminkristalle in Form braunroter Nadeln. Die Ausbeute beträgt 4,6 g Material mit den folgenden Eigenschaften: Absorptionsspektren in Wasser: Schulterbande bei 273 bis 275 um, E:, m * 135 bis 140 Starkes Maximum bei 350 bis 352 itm, E1cm1% .... >170 Maximum bei 520 bis 525 Fm, EE, ?.... . . . >60 pH der Lösung (5 mg/cm3) .... 8,2 bis 8,6 Test auf anorganische und organische Anionen . @ @ @ @ @ negativ Verteilungskoeffizient Benzylalkohol-Wasser .8,0 Schmp.: Schmilzt nicht bis 350"C, wird bei 205°C dunkel.The flow rate is regulated so that every minute pass through about 30 to 50 ml. The pH of the treated solution is 8.0 to 8.5. c) Crystallization of the aquocobalamin from the ion exchange process The solution obtained is reduced in vacuo to an aquocobalamine content of 15 to 25 g concentrated per liter. Then it is slowly poured into eight times its volume while stirring Acetone. Aquocobalamin crystals form in the form of brown-red needles. The yield is 4.6 g of material with the following properties: Absorption spectra in water: Shoulder band at 273 to 275 µm, E :, m * 135 to 140 strong maximum at 350 to 352 itm, E1cm1% ....> 170 maximum at 520 to 525 Fm, EE,? ..... . . > 60 pH of the solution (5 mg / cm3) .... 8.2 to 8.6 Test for inorganic and organic anions . @ @ @ @ @ negative partition coefficient benzyl alcohol-water .8.0 m.p .: melts not up to 350 "C, becomes dark at 205 ° C.

Für die unter a) und c) beschriebenen Verfahrensabschnitte wird kein Schutz beansprucht. For the procedural stages described under a) and c) no Protection claimed.

Claims

Claim: Process for the production of aquocobalamin from Bromo-, chloro-, sulfato-, acetato-, nitratocobalamin or their mixtures, d a d u r c h characterized that an aqueous solution of this dissociable Sends cobalamine through an anion exchange column loaded with hydroxyl ions and the aquocobalamin is isolated in a known manner from the solution thus obtained.

References considered: U.S. Patent No. 2,709 669