DE112021004932T5

DE112021004932T5 - Verfahren zur herstellung von 21-(acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion

Info

Publication number: DE112021004932T5
Application number: DE112021004932.1T
Authority: DE
Inventors: Roberto Lenna; Claudio DELFRATE; Davide RIGAMONTI; Silvia GENOVESE
Original assignee: Industriale Chimica SRL
Current assignee: Industriale Chimica SRL
Priority date: 2020-10-19
Filing date: 2021-02-05
Publication date: 2023-08-10
Also published as: FR3115284A1; CH719319B1; ES2943573R1; WO2022084752A1; FR3115284B1; ES2943573A2; US20240018181A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion (VI) mit der nachstehenden Formel:Verbindung (VI) kann als Vorstufe zur Synthese von Clascoteron verwendet werden, einem zur Behandlung von Akne verwendeten Steroid.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Verfahren zur Synthese von Wirkstoffen zur pharmazeutischen Verwendung und insbesondere auf ein Verfahren zur großtechnischen Herstellung von 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion, einer Verbindung mit der unten aufgeführten Strukturformel (VI):
eine nützliche Vorstufe zur Synthese von 21-Hydroxy-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion, auch unter der Bezeichnung Clascoteron bekannt.
Bei Clascoteron handelt es sich um ein Steroid mit einem Pregnan-Gerüst, das, entsprechend formuliert, jüngst von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zur Behandlung von Akne bei pädiatrischen Patienten ab 12 Jahren und bei Erwachsenen zugelassen wurde. Die Strukturformel von Clascoteron wird unten gezeigt:
STAND DER TECHNIK
Clascoteron wird im US-Patent Nr. 3,152,154 von 1964 beschrieben. Wie oben gezeigt, handelt es sich bei dieser Verbindung um einen 17α-Monoester eines 17α, 21-Dihydroxysteroids.
Nach der Lehre der US 3,152,154 können 17-Monoester von 17α,21-Dihydroxysteroiden durch chemische Hydrolyse in Anwesenheit von Säurekatalysatoren von entsprechenden 17α,21-(1'-Alkoxy)1'-pregnanen (Orthoestern) vom folgenden Typ erhalten werden:
Die in der US 3,152,154 aufgeführte Beschreibung der Versuche stellt keine Einzelheiten über die Reaktionsausbeute und die Qualität der erhaltenen Produkte bereit.
Die in der US 3,152,154 beschriebenen Orthoester können hingegen nach dem Verfahren hergestellt werden, das im US-Patent 3,147,249 beschrieben ist. Auch in diesem zweiten Patent werden keine Einzelheiten zu den Reaktionsausbeuten und der Qualität der erhaltenen Produkte bereitgestellt.
Im Speziellen ist für die Herstellung von Clascoteron die Ausgangsverbindung für die Herstellung des zu hydrolysierenden Orthoesters das 17,21-Dihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion, eine unter der Bezeichnung „Cortexolon“ bekannte Verbindung, welche die unten gezeigte Formelstruktur aufweist:
Allerdings ist diese Verbindung auf dem Markt lediglich in Labormengen erhältlich, nicht aber in den für die großtechnische Herstellung benötigten Mengen.
Eine weitere mögliche Vorstufe von Clascoteron ist die Verbindung 17,21-Bis(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion, und zwar die unten gezeigte Verbindung der Formel (VII):
Verbindung (VII) kann wie in der Patentanmeldung WO 2009/019138 A2 beschrieben hergestellt werden, und zwar nach den Angaben in dem Artikel „Acylation of 17-hydroxy-20-ketosteroids“, R. B. Turner, J. Am. Chem. Soc. 1953, 75, 14, 3489-3492. Die Säurehydrolyse von Verbindung (VII) erfordert allerdings relativ lange Zeiten und erzeugt nicht unerhebliche Mengen an Nebenprodukten.
In der WO 2009/019138 A2 wird auch die selektive enzymatische Hydrolyse von symmetrischen Diestern, d.h. wobei der Rest R der beiden Estergruppen gleich ist, unter Verwendung von Lipase nach der folgenden Reaktion vorgeschlagen:
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues zur Synthese von Clascoteron geeignetes Zwischenprodukt sowie ein Verfahren bereitzustellen, das auf Industrieebene zur Synthese des genannten Zwischenprodukts angewendet werden kann.
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Dieser Gegenstand wird mit der vorliegenden Erfindung erreicht, die sich in einem ersten Aspekt davon auf ein Verfahren zur Synthese von 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion, der Verbindung der Formel (VI), bezieht:
die als Vorstufe bei der Synthese von Clascoteron verwendet werden kann, wobei das genannte Verfahren folgende Schritte umfasst:

a) Reaktion von 17α-Hydroxyprogesteron (I) mit Pyrrolidin unter Bildung von Verbindung (II), 17-Hydroxy-3-(1-pyrrolidinyl)pregna-3,5-dien-20-on:
b) Reaktion von Verbindung (II) zunächst mit Salzsäure und dann mit Brom unter Bildung von Zwischenprodukt (III), einem Gemisch aus (21-Chlor/21-Brom)-17α-hydroxy-3-(1 -pyrrolidinium-1 -yliden)-pregn-4-en-20-onchlorid:
c) basische Hydrolyse von Zwischenprodukt (III) zum Erhalt von Zwischenprodukt (IV), dem entsprechenden Gemisch aus 21-Chlor/21-Brom-17α-hydroxypregn-4-en-3,20-dion:
d) Reaktion von Zwischenprodukt (IV) mit Essigsäure zum Erhalt von Verbindung (V), 21-Acetoxy-17 α-hydroxypregn-4-en-3,20-dion:
e) Reaktion von Verbindung (V) mit Perchlorsäure und Propionsäureanhydrid zum Erhalt von Verbindung (VI), 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion:

Das Verfahren der Erfindung kann ferner einen zusätzlichen Schritt f) der selektiven Hydrolyse der Verbindung (VI) zum Erhalt von Clascoteron umfassen:
Schritt f) kann entweder auf chemischem oder enzymatischem Wege durchgeführt werden.
In einem zweiten Aspekt davon bezieht sich die Erfindung auf die Verbindung (VI), 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion.
In einem dritten Aspekt davon bezieht sich die Erfindung auf den Erhalt von Clascoteron durch enzymatische Hydrolyse von Verbindung (VI), wobei mit einem Durchflussreaktor gearbeitet wird.
In einem vierten Aspekt davon bezieht sich die Erfindung letztendlich auf mit Dimethylsulfoxid solvatisiertes Clascoteron.
Figurenliste

1 zeigt das HPLC-Chromatogramm von Verbindung 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion, erhältlich nach dem Verfahren der Erfindung.
2 zeigt das XPRD-Beugungsspektrum von Verbindung 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion, erhältlich nach dem Verfahren der Erfindung.
3 zeigt das DSC-Thermogramm von Verbindung 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion, erhältlich nach dem Verfahren der Erfindung.
4 zeigt das XPRD-Diffraktogramm von mit Dimethylsulfoxid solvatisiertem Clascoteron und die Daten zum relativen Winkel und zur relativen Intensität der Peaks.
5 zeigt das DSC-Thermogramm von mit Dimethylsulfoxid solvatisiertem Clascoteron.
6 zeigt das FT-IR-Spektrum von mit Dimethylsulfoxid solvatisiertem Clascoteron.
7 zeigt das XPRD-Diffraktogramm von mit Methanol solvatisiertem Clascoteron.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder stellten fest, dass bei der Herstellung von Clascoteron die Hydrolyse eines „nicht-symmetrischen“ Diesters bessere Ergebnisse bereitstellt als die Hydrolyse eines symmetrischen Esters.
Wird in der nachstehenden Beschreibung ein Verhältnis zwischen einer Menge eines Lösungsmittels und einer Verbindung als „Volumen pro Gewicht“ bereitgestellt, so ist darunter zu verstehen, dass das Volumen des Lösungsmittels in Milliliter und das Gewicht der Verbindung in Gramm gemessen wird. Der Einfachheit und Anschaulichkeit der Darstellung halber wird zudem in einigen Fällen die stereochemische Konfiguration einiger Atome des Steroidgerüsts in den vorliegenden Figuren nicht gezeigt; in diesen Fällen versteht es sich, dass die Stereochemie des Moleküls der naturgemäßen Konfiguration der Steroide entspricht.
Der Begriff „nicht-symmetrischer“ Diester bedeutet eine Struktur des folgenden Typs:
wobei die Alkylreste R und R' verschieden sind.
Der nicht-symmetrische Diester, der einer experimentellen Prüfung unterzogen wird, zeigt ein günstigeres Verhalten gegenüber der Säurehydrolyse als das symmetrische 17,21-Bis(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion der Formel (II), das in der WO 2009/019138 A2 beschrieben ist; um Verwechslungen mit der Verbindung (II) der vorliegenden Erfindung (das Zwischenprodukt 17-Hydroxy-3-(1-pyrrolidinyl)pregna-3,5-dien-20-on des Verfahrens) zu vermeiden, wird die Verbindung (II) der WO 2009/019138 A2 in der vorliegenden Beschreibung als Verbindung (VII) angegeben.
Tatsächlich beobachteten die Erfinder bei der parallelen Durchführung von Reaktionen der Säurehydrolyse unter den gleichen Bedingungen (Perchlorsäure in Dichlormethan-Methanol bei 10-12 °C) an der Verbindung (VI) der vorliegenden Erfindung und an der Verbindung (VII) der WO 2009/019138 A2 , dass die Reaktion mit der Verbindung (VI) in 37 Stunden abgeschlossen ist (Restverbindung (VI) <3 %), während 57 Stunden benötigt werden, um ausgehend von der Verbindung (VII) das gleiche Ergebnis zu erzielen.
Des Weiteren unterscheidet sich auch die Zusammensetzung des Gemischs am Ende der Reaktion, und wie aus den Daten der nachstehenden Tabelle 1 hervorgeht, wird das beste Ergebnis in Bezug auf die Ausbeute an Clascoteron durch die Verwendung von Verbindung (VI) erhalten (die in der Tabelle gezeigten Prozentanteile der Konzentrationen werden aus den Peakflächen der HPLC-Tests berechnet): Tabelle 1

Reagenz Reaktionszeit (h) Produkte (%)

Cortexolon „Umgelagert“ Clascoteron Restliches Reagenz

(VI) 37 h 20' 12,3 9,9 73,6 2,7

(VII) 57 h 22,8 10,4 61,0 2,4
Mit Ausnahme des restlichen nicht umgesetzten Reagenzes ist das einzige Nebenprodukt, das in vergleichbaren Mengen im Produkt beider Reaktionen vorhanden ist, jenes, das als „umgelagert“ bezeichnet wird, dessen Bildung, wie in dem Artikel „Corticosteroid 17α-monoesters from 17α, 21-cyclic orthoesters“, R. Gardi et al., Tetrahedron Letters (13) 1961, Seiten 448-451, beschrieben, nicht unterdrückt werden kann, weil es unter den Reaktionsbedingungen spezifisch für das Reaktionsprodukt ist und nicht vom Ausgangssubstrat abhängig ist. Die Umlagerungsreaktion zwischen den Positionen 17 und 21 des Steroids ist nachstehend zusammengefasst:
Monoester in Position 17 mit einer freien Hydroxylgruppe in Position 21 sind durch eine Instabilität unter sauren Reaktionsbedingungen gekennzeichnet, die die Migration der acylierenden Gruppe von Position 17 nach Position 21 verursacht, nach dem unten dargelegten Reaktionsmechanismus:
Im ersten Aspekt davon betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Synthese von 21-(Acetyloxy)-17-(1-Oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion, das die fünf oben aufgeführten Syntheseschritte a) bis e) erfordert.
Schritt a) besteht in der Reaktion der Verbindung (I) mit Pyrrolidin unter Bildung des entsprechenden Enamins, der Verbindung 17-Hydroxy-3-(1-pyrrolidinyl)pregna-3,5-dien-20-on (II), und wird durchgeführt, indem eine Suspension der Verbindung (I) in einem Alkohol hergestellt wird, diese Suspension zum Rückfluss gebracht und dann Pyrrolidin zugegeben wird. Die Ausgangsverbindung (I), 17α-Hydroxyprogesteron, ist im Handel allgemein erhältlich und erfordert keine Synthese eines Orthoesters als Zwischenprodukt des Verfahrens.
Pyrrolidin wird in einem molaren Überschuss zwischen 20 und 60 %, vorzugsweise 40 %, in Bezug auf die Verbindung (I) angewendet.
Alkohole, die zur Herstellung der Suspension angewendet werden können, sind Ethanol, Isopropanol und vorzugsweise Methanol.
Das Reaktionsgemisch wird für eine Zeit zwischen 1 und 3 Stunden, vorzugsweise zwischen 1,5 und 2,5 Stunden, unter Rückfluss gehalten.
Die erhaltene Verbindung (II) wird durch Kristallisation-Ausfällung aus dem Lösungsmittel der Reaktion isoliert.
Schritt b) besteht in der Reaktion von Enamin (II) zunächst mit Salzsäure und dann mit Brom unter Bildung des Zwischenprodukts (III), einem Gemisch aus (21-Chlor/21-Brom)-17a-Hydroxy-3-(1 -pyrrolidinium-1-yliden)-pregn-4-en-20-on-chlorid.
Die Reaktion wird bei einer Temperatur zwischen 10 und 40 °C, vorzugsweise zwischen 20 und 30 °C, durchgeführt.
Das Reaktionslösungsmittel ist ein Alkohol, ausgewählt aus Methanol, Isopropanol und vorzugsweise Ethanol. Der Alkohol wird in einer Menge zwischen 15 und 50 Volumina, vorzugsweise zwischen 15 und 30 Volumina, bezogen auf das Gewicht der Verbindung (II), angewendet.
Salzsäure wird in Form einer 33 Gew.-%igen Lösung in Ethanol oder Isopropanol verwendet; die Menge dieser Lösung, die bei der Reaktion zum Einsatz kommt, liegt im Bereich von 1 bis 3 Mal das Gewicht, bezogen auf das Gewicht der Verbindung (II), vorzugsweise 1,5 Mal.
Die Menge des hinzugefügten Broms, in Molen, liegt im Bereich von 1,0 bis 3 Mal, bezogen auf die Mole der Verbindung (II), vorzugsweise 1,5 Mal.
Brom wird in Form einer Lösung in Ethanol in einem Volumenverhältnis Brom:Ethanol zwischen 1:20 und 1:45, vorzugsweise 1:25, hinzugefügt. Vor dem Hinzufügen zu der im ersten Teil dieses Schrittes hergestellten Lösung wird die Bromlösung in Ethanol auf eine Temperatur zwischen -50 und -60 °C, vorzugsweise auf -55 °C, gekühlt. Das Hinzufügen der Bromlösung erfolgt über einen Zeitraum zwischen 20 Minuten und 2 Stunden, vorzugsweise zwischen 80 und 100 Minuten.
Das am Ende von Schritt b) erhaltene Zwischenprodukt (III) kann unter Verwendung eines geradkettigen oder verzweigten Alkohols mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eines Ethers oder eines Gemischs davon kristallisiert werden; das bevorzugte Lösungsmittel für die Kristallisation von Zwischenprodukt (III) ist Methyl-tert.-butylether (MTBE).
Das Ergebnis der Reaktion ist ein Gemisch aus (21-Chlor/21-Brom)-17a-hydroxy-3-(1-pyrrolidinium-1-yliden)-pregn-4-en-20-on-chlorid, Zwischenprodukt (III), das unverändert für die weitere Synthese verwendet wird, da beide Produkte in gleicher Weise unter Bildung des gewünschten 21-Acetoxy-Produkts umgesetzt werden; aus diesem Grund wird in dieser Beschreibung das Gemisch (III) als ein einziges Reaktionszwischenprodukt angegeben.
Die Nebenkomponente des Gemischs (III), das 21-Chlor-Steroid, ist mit einem Anteil im Bereich von 5 bis 30 % vorhanden.
In einer alternativen Ausführungsform könnte Schritt b) durch direkte Reaktion von Enamin (II) mit Bromwasserstoffsäure durchgeführt werden, wobei in diesem Fall lediglich die Verbindung 21-Bromin als Zwischenprodukt (III) erhalten wird.
Schritt c) des Verfahrens der Erfindung besteht in der basischen Hydrolyse von Zwischenprodukt (III), um das entsprechende 21-Chlor/21-Brom-17α-hydroxypregn-4-en-3,20-dion-Gemisch zu erhalten; auch dieses Gemisch wird in der folgenden Verfahrensreaktion als solches eingesetzt, so dass es in der vorliegenden Beschreibung als ein einziges Zwischenprodukt, Zwischenprodukt (IV), angegeben wird.
Die Reaktion kann in einem wässrigen Gemisch aus Aceton, Methanol oder Ethanol durchgeführt werden, wobei Wasser in Mengen von weniger als 50 Volumen-% vorhanden ist. Vorzugsweise wird ein Gemisch aus Wasser und Methanol verwendet, bei dem das Volumen des Methanols mehr als 70 % des Gesamtvolumens beträgt.
Die zur Anwendung kommende Base kann aus NaHCO₃, Na₂CO₃, KHCO₃ oder K₂CO₃ ausgewählt werden; KHCO₃ wird vorzugsweise in einer Molmenge verwendet, die größer ist als das 2-fache in Bezug auf die Mole des Zwischenprodukts (III).
Die Reaktionstemperatur liegt zwischen 10 °C und der Rückflusstemperatur des Gemischs; vorzugsweise wird die Reaktion bei einer Temperatur zwischen 20 und 30 °C gehalten.
Die Reaktionszeit liegt zwischen 2 und 16 Stunden, vorzugsweise zwischen 4 und 6 Stunden.
Das erhaltene Zwischenprodukt (IV) kann kristallisiert werden, indem als Lösungsmittel Methyl-t-butylether (MTBE), Ethylacetat, Acetonitril, Aceton, Methylethylketon (MEK), Methylisobutylketon (MIBK), ein geradkettiger oder verzweigter Alkohol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Gemische davon verwendet werden; vorzugsweise wird für diesen Vorgang ein 1:1 (v/v) MEK-MeOH-Gemisch mit der Heiß-Kalt-Technik angewendet. Diese Technik, die dem Fachmann für organische Synthese wohlbekannt ist, besteht in der Erwärmung des zu reinigenden Produkts in Anwesenheit eines Lösungsmittels. Die resultierende Suspension und/oder Lösung wird dann gekühlt. Das feste Produkt wird filtriert, während die vorhandenen Verunreinigungen in Lösung verbleiben.
Im nächsten Schritt, d), wird das Zwischenprodukt (IV) unter Bildung der Verbindung (V), 21-Acetoxy-17α-hydroxypregn-4-en-3,20-dion, umgesetzt.
Die Reaktion kann mit Eisessig in einem Lösungsmittel, ausgewählt aus Dimethylformamid (DMF), Aceton, Methylethylketon (MEK), Methylisobutylketon (MIBK), Methanol, Ethanol, 2-Propanol, Toluol oder Gemischen davon durchgeführt werden, in Anwesenheit einer anorganischen Base, ausgewählt aus KHCO₃, NaHCO₃, K₂CO₃, Na₂CO₃ oder einer organischen Base, ausgewählt aus Triethylamin (TEA), Trimethylamin (TMA) oder Pyridin. Vorzugsweise werden die Vorgänge in Aceton oder Methylethylketon (MEK) mit Eisessig und Triethylamin (TEA) durchgeführt. Alternativ dazu kann die Reaktion auch mit Natriumacetat oder Kaliumacetat durchgeführt werden.
Die Reaktionszeit liegt zwischen 1 und 24 Stunden und die Temperatur zwischen 20 °C und der Rückflusstemperatur des Gemischs; vorzugsweise werden die Vorgänge für eine Zeit zwischen 4 und 6 Stunden bei der Rückflusstemperatur des Gemischs durchgeführt.
Die erhaltene Verbindung (V) kann kristallisiert werden, indem Lösungsmittel wie Methyl-t-butylether (MTBE), Aceton, Methylethylketon (MEK), Methylisobutylketon (MIBK), ein geradkettiger oder verzweigter Alkohol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Gemische davon verwendet werden; die bevorzugten Lösungsmittel sind Methylethylketon (MEK) und Ethanol.
Schritt e) des Verfahrens der Erfindung besteht letztendlich in der Reaktion der Verbindung (V) mit Perchlorsäure und Propionsäureanhydrid, um die Verbindung (VI), 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion, zu erhalten.
Die Reaktion wird durch Verdünnen der Verbindung (V) in Dichlormethan (DCM) in einer Menge zwischen 10 und 50 Volumina, vorzugsweise 25 Volumina DCM, bezogen auf das Gewicht des Steroids, bei einer Temperatur zwischen -25 und +25 °C, vorzugsweise zwischen -25 und -15 °C, durchgeführt. Die Reaktionszeit kann im Bereich von 5 bis 60 Minuten, vorzugsweise zwischen 5 und 25 Minuten, liegen.
Propionsäureanhydrid wird in einem molaren Verhältnis zwischen 6:1 und 9:1, vorzugsweise zwischen 6:1 und 8:1, bezogen auf das Steroid, angewendet.
Verbindung (VI) kann durch Kristallisation aus Ethylacetat, Isopropylacetat, Methylethylketon (MEK), Methylisobutylketon (MIBK), Aceton, Methanol, Ethanol, 2-Propanol, Acetonitril, Toluol, THF oder Methyl-THF gereinigt werden.
In einer Ausführungsform davon schließt das Verfahren der Erfindung einen weiteren Schritt f) ein, der in der selektiven Hydrolyse der Verbindung (VI) unter Bildung von Clascoteron besteht.
Schritt f) kann durch Säurehydrolyse durchgeführt werden, unter ähnlichen Bedingungen, wie in der US 3,152,154 f ür die Hydrolyse von Orthoestern beschrieben. Beispielsweise kann die Reaktion unter den oben für den Vergleich zwischen den Verbindungen (VI) der Erfindung und (VII) des Standes der Technik aufgeführten Bedingungen durchgeführt werden, d.h. mit Perchlorsäure in Dichlormethan-Methanol bei 10-12 °C; wie zuvor erwähnt, erfordert die Säurehydrolyse der Verbindung (VI) der Erfindung unter diesen Bedingungen 37 Stunden, um abgeschlossen zu werden.
Die Hydrolyse der Verbindung (VI) kann auch enzymatisch durchgeführt werden, entweder durch Arbeiten in einem klassischen Batch-Reaktor oder durch Arbeiten in einem Durchflussreaktor.
So wurde beispielsweise eine Probe von 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion (VI), durch Reagieren bei 44-46 °C in Toluol/n-Butanol in einem mit mechanischem Rührer und Thermometer ausgerüsteten Mehrhalskolben in Anwesenheit von LIPOMOD™ 34MDP-Lipase (Biocatalysts, 115 E/mg), zu 21-Hydroxy-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion (Clascoteron) hydrolysiert.
In ähnlicher Weise, wobei jedoch mit einem Durchflussreaktor easy-Medchem der E-Serie von Vapourtec Ltd, Bury St Edmunds, (GB) gearbeitet wird, der mit einer Säule ausgerüstet ist, die mit Novozym^® 435 gepackt ist (Lipase B von Candida antarctica auf einem Acrylharzträger; Säule bezogen von Strem Chemicals Inc, Bischheim, Frankreich), wird die in Toluol/n-Butanol gelöste Verbindung (VI) zu 21-Hydroxy-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion (Clascoteron) hydrolysiert.
Bei der enzymatischen Hydrolyse kann das Enzym in freier Form im Reaktionsgemisch angewendet werden, es wird jedoch vorzugsweise in einer geträgerten Form verwendet.
Die Reaktion kann unter statischen Bedingungen durchgeführt werden, wird aber vorzugsweise unter Strömungsbedingungen durchgeführt.
Die Reaktionstemperatur liegt zwischen 40 und 80 °C, vorzugsweise zwischen 50 und 70 °C.
Das bei der Reaktion anzuwendende Lösungsmittelgemisch umfasst Toluol und einen geradkettigen Alkohol, wobei die Hauptkomponente Toluol ist. Alkohole, die zur Anwendung kommen können, sind Methanol, Ethanol, 1-Propanol und vorzugsweise n-Butanol.
Der Gehalt an n-Butanol im Toluol/n-Butanol-Gemisch wird in Bezug auf die Mole der Verbindung (VI) berechnet. Es werden 1 bis 10 Mol, vorzugsweise 2,5 bis 5 Mol, n-Butanol pro Mol der Verbindung (VI) angewendet.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann Clascoteron als Solvat aus Dimethylsulfoxid (DMSO) erhalten werden. Im Solvat liegen Clascoteron und DMSO in einem molaren Verhältnis von 1:1 vor, wie durch NMR-Analyse ermittelt. Das DMSO-Solvat kann direkt aus der Lösung nach der enzymatischen Reaktion erhalten werden, indem das Reaktionslösungsmittel durch DMSO ersetzt wird, oder durch ein festes Zwischenprodukt, das aus einem metastabilen Solvat mit Methanol besteht, wie in Beispiel 11 beschrieben.
Dieses Solvat weist ein Pulverdiffraktionsspektrum (XPRD) wie in 4, ein DSC-Thermogramm wie in 5 und ein FT-IR-Spektrum wie in 6 gezeigt, auf.
Das XPRD-Diffraktogramm ist durch zwei starke Doppel-Peaks gekennzeichnet, mit Reflexen bei 15,71° und 15,79° 2θ für den ersten Doppel-Peak und Reflexen bei 19,61° und 19,71° 2θ für den zweiten Doppel-Peak; weitere charakteristische Peaks im XPRD-Diffraktogramm dieses Solvats liegen bei 11,38°, 12,74°, 16,50°, 17,78°, 18,39°, 18,76° und 20,06° 2θ; alle diese Peakwerte sollten mit einer Annäherung von ± 0,2° 2θ berücksichtigt werden.
Das DSC-Thermogramm, das in Stickstoff und mit einer Aufheizrate von 10 °C/min erhalten wurde, zeigt ein einziges stark endothermes Ereignis mit einem Peak bei 87,45 °C.
Das so erhaltene Solvat von Clascoteron mit DMSO kann mehrmals aus diesem Lösungsmittel umkristallisiert werden, bis der gewünschte Reinheitsgrad erreicht ist. Das Verfahren der Rekristallisation aus einem Lösungsmittel ist dem Fachmann wohlbekannt und besteht in der Bildung einer Lösung der zu reinigenden Substanz in dem gewünschten Lösungsmittel, indem das System auf eine geeignete Temperatur gebracht wird, im Falle von DMSO etwa 65 °C, und dann bis zum Erstarren der Verbindung gekühlt wird, die dann unter Verwendung bekannter Methoden wie der Filtration zurückgewonnen werden kann.
Clascoteron-Solvat aus DMSO ist insbesondere in pharmazeutischen Zusammensetzungen zur topischen Anwendung oder dort, wo es zur Erhöhung der Permeabilität eines Körpergewebes für einen Wirkstoff erforderlich ist, nützlich.
Die Anwendung von Verbindungen als aktive Bestandteile von Formulierungen auf DMSO-Basis ist beispielsweise im US-Patent 3,711,602 von 1973 beschrieben, wobei viele der Beispiele sich auf Steroide beziehen.
Die Erfindung wird ferner anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht.
GERÄTE, METHODEN UND VERSUCHSBEDINGUNGEN
NMR: JEOL 400 YH (400 MHz) NMR-Spektrometer; JEOL Delta Software v5.1.1; Spektren in deuterierten Lösungsmitteln aufgezeichnet, wie: Chloroform-d, D 99,8 %, das 0,1 % (v/v) Tetramethylsilan (TMS) als internen Standard enthält; und Chloroform-d, „100 %“, D 99,96 %, das 0,03 % (v/v) TMS, CD₃OD und DMSO-d₆ enthält.
TLC: MERCK: TLC Kieselgel 60 F₂₅₄ Aluminiumplatten 20 x 20 cm, Kod. 1.0554.0001.
TLC-Färbung: Cerium-Phosphomolybdat: 25 g Phosphomolybdänsäure und 10 g Cer(IV)-sulfat werden in 600 mL H₂O gelöst. 60 mL 98%ige H₂SO₄ werden hinzugefügt und das Volumen wird mit H₂O auf 1 L gebracht. Die Platte wird mit der Lösung imprägniert und dann erhitzt, bis die Produkte nachgewiesen werden.

UPLC-MS: UPLC-MS Waters Acquity-Chromatographiesystem, ausgerüstet mit PDA- und QDa-Detektoren. UPLC-MS-Methode:

Säule:	Waters Acquity BEH C18, 2,1(ID) x 50 (L) mm, 7 µm;
Fluss:	0,8 mL/min;
Mobile Phase:	Acetonitril/Wasser von 1:1 (0-0,5') bis 9:1 (0,5'-2,5');
pH-Modifikator:	0,01 % Ameisensäure;
UV-Detektor:	244 nm;

XPRD: Bruker^® D2 Phaser Diffraktometer (2. Generation), das in Bragg-Brentano-Geometrie arbeitet und mit einem rotierenden Multisampler mit 6 Positionen ausgerüstet ist. Die Röntgenquelle ist eine Röntgenröhre mit einer Kupferanode, die mit 30 kV und 10 mA betrieben wird. Die zur Anwendung kommende analytische Wellenlänge ist Kupfer Kα (λ = 1,54184 Å). Die Kβ-Strahlung wird durch einen Nickelfilter gefiltert. Der Röntgendetektor ist ein linearer Festkörperdetektor, Modell LYNXEYE. Die Proben wurden als dünne Schicht auf Silizium-Probenhalter vom Typ „Zero Background“ geschichtet. Das Diffraktogramm wurde im Winkelbereich 4,0-40,0° 2θ mit Schritten von 0,016° und einer Scanrate von 1,0 s/Schritt im Falle des Solvats aus DMSO aufgenommen, während im Falle des metastabilen Solvats aus Methanol eine Scanrate von 0,25 s/Schritt verwendet wurde.
Die Daten wurden unter Verwendung der DIFFRAC.EVA Software (Bruker) analysiert.
DSC: Diamond DSC-Gerät (Perkin Elmer), betrieben unter Stickstoffatmosphäre. Die Proben wurden in 40 µL Aluminiumtiegeln mit Deckeln hergestellt und unter Verwendung einer geeigneten Presse vor der Analyse verschlossen. Die Analyse wurde mit einer konstanten Aufheizrate von 10 °C/min im Bereich von 25-210 °C durchgeführt.
ATR-FTIR: FTIR-Spektralphotometer Nicolet 6700 (Thermo Fischer Scientific), ausgerüstet mit einem ATR Smart iTR (Thermo Fisher Scientific)-Modul mit Diamantkristall. Die Erfassung wurde durchgeführt, indem 64 Scans im Bereich 4000-650 cm^-1 mit einer Auflösung von 4 cm^-1 für die Messung sowohl der analytischen Probe als auch des Blanks (Messung in Abwesenheit einer Probe) durchgeführt wurden, welcher unmittelbar vor der Messung der Probe erfasst und automatisch davon subtrahiert wurde. Die Anzeige des Spektrums und die Analyse desselben wurden unter Verwendung der Omnic-Software (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt.
ANMERKUNGEN
Sofern nicht anders angegeben, ist das in den Versuchsbeschreibungen angewandte Wasser als reines Wasser zu verstehen.
Sofern nicht anders angegeben, sind die in den Versuchsbeschreibungen verwendeten organischen Lösungsmittel von „technischer“ Qualität.
Sofern nicht anders vermerkt, sind die in den Versuchsbeschreibungen verwendeten Reagenzien und Katalysatoren von handelsüblicher Qualität.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel bezieht sich auf Schritt a) des Verfahrens der Erfindung, von 17α-Hydroxyprogesteron (I) zu 17-Hydroxy-3-(1-pyrrolidinyl)pregna-3,5-dien-20-on (II):
148,1 g 17α-Hydroxyprogesteron (I) werden in 740 mL Methanol suspendiert. Die Suspension wird bis zum Rückfluss (65 °C) erwärmt, ohne dass die Solubilisierung des Feststoffs beobachtet wird. 52,4 mL Pyrrolidin werden zugetropft: Eine vollständige Auflösung des Ausgangsprodukts und eine nahezu sofortige Wiederausfällung von Enamin (II) werden beobachtet. Das Gemisch wird bei dieser Temperatur unter Rühren für 2 Stunden gehalten. Dann wird es zunächst auf Raumtemperatur und dann für 1 h auf 0 °C abgekühlt. Es wird durch eine Nutsche filtriert, wobei mit 200 mL kaltem Methanol gewaschen wird. Der Feststoff wird für 10 h im Vakuum bei 25 °C getrocknet, wobei 166,2 g der Verbindung (II) als cremefarbener Feststoff erhalten werden.
Analyse von 17-α-Hydroxyprogesteron (I):

¹H-NMR, CDCl₃: 5,74 (1H, s, H-4); 2,77 (1H, s, OH-17); 2,72-2,65 (1H, m); 2,47-2,26 (4H, m); 2,29 (3H, s, H-21); 2,06-2,01 (1H, m); 1,90-1,81 (2H, m); 1,77-1,56 (7H, m); 1,46-1,33 (3H, m); 1,19 (3H, s, H-19); 1,17-1,07 (1H, m); 1,02-0,95 (1H, m); 0,77 (3H, s, H-18).
MS: 331 (M⁺+1).

Analyse von Verbindung (II):

¹H-NMR, CDCl₃: 5,07-5,06 (1H, m, H-6); 4,78 (1H, s, H-4); 3,15-3,12 (4H, m, N-CH₂); 2,74 (1H, br, OH); 2,71-2,65 (1H, m); 2,33-2,29 (2H, m); 2,28 (3H, s, H-21); 2,21-2,15 (1H, m); 1,91-1,56 (12H, m); 1,47-1,24 (4H, m); 1,11-1,05 (1H, m); 1,01 (3H, s, H-19); 0,76 (3H, s, H-18).

BEISPIEL 2
Dieses Beispiel bezieht sich auf Schritt b) des Verfahrens der Erfindung, von Enamin (II) zu Zwischenprodukt (III), Gemisch (21-Chlor/21-Brom)-17α-hydroxy-3-(1-pyrrolidinium-1-yliden)-pregn-4-en-20-onchlorid:
83 g der im vorherigen Beispiel erhaltenen Verbindung (II) werden in 1660 mL Ethanol bei 20-25 °C unter Stickstoffatmosphäre suspendiert. 125,6 g HCl in Ethanol (33 % w/w) werden hinzugefügt: Eine vollständige Auflösung wird beobachtet. Eine Lösung von Brom in Ethanol (16,6 mL Di-Brom in 415 mL Ethanol), die zuvor hergestellt und auf -55 °C gekühlt wurde, wird dann über etwa 90 Minuten zugetropft. Zum Ende der Zugabe hin wird die Bildung eines Niederschlags beobachtet. Nach Beendigung der Zugabe wird das Gemisch für etwa 1 h bei 20-25 °C unter Rühren gehalten und mittels TLC überwacht: Das Ausgangsmaterial ist nahezu vollständig verschwunden. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum bei 45 °C mittels Rotationsverdampfer entfernt, 3 Mal mit MTBE (je 450 mL) gestrippt, wobei beim letzten Mal ein Gesamtvolumen von etwa 330 mL zurückbleibt. Es wird auf 0 °C gekühlt und für 1 Stunde unter Rühren gehalten. Dann wird es durch eine Nutsche filtriert, wobei mit kaltem MTBE gewaschen wird. Das Produkt wird für 2 h bei 45 °C im Vakuum getrocknet, wobei 106,6 g des Zwischenprodukts (III) als weißes Pulver erhalten werden.
Analyse von Zwischenprodukt (III):

¹H-NMR, DMSO: 6,51 (1H, s, H-4); 5,62 (1H, br, OH-17); 4,60 (1H, Teil A eines AB-Systems, J_AB = 15 Hz, H-21); 4,37 (1H, Teil B eines AB-Systems, J_AB = 15 Hz, H-21); 3,98-3,78 (4H, m, N-CH₂); 2,89-2,74 (2H, m); 2,61-2,55 (3H, m); 2,05-1,19 (16H, m); 1,12 (3H, s, H-19); 1,09-0,99 (1H, m); 0,95-0,89 (1H, m); 0,56 (3H, s, H-18).
Im Spektrum finden sich auch die folgenden Peaks, die zum 21-Chlor-Derivat des Iminiums gehören: 5,59 (1H, br, OH-17); 4,79 (1H, Teil A eines AB-Systems, J_AB = 17 Hz, H-21); 4,48 (1H, Teil B eines AB-Systems, J_AB = 17 Hz, H-21).
MS: 462, 464 (M⁺+1) 21-Brom;
MS: 418, 420 (M⁺+1) 21-Chlor.

BEISPIEL 3
Dieses Beispiel bezieht sich auf Schritt c) des Verfahrens der Erfindung, von Zwischenprodukt (III) zu Zwischenprodukt (IV), Gemisch 21-Chlor/21-Brom-17α-hydroxypregn-4-en-3,20-dion:
105,5 g des im vorherigen Beispiel erhaltenen Zwischenprodukts (III) werden in 1582 mL Methanol gelöst; eine wässrige Lösung von Kaliumhydrogencarbonat (114,5 g KHCO₃ in 458 g Wasser) wird hinzugefügt, und das Gemisch wird unter Rühren bei 25 °C für etwa 5 Stunden gehalten; die vollständige Reaktion wird durch TLC nachgewiesen. 2000 mL Wasser werden hinzugefügt, und das Gemisch wird für 30 Minuten unter Rühren gehalten. Es wird durch eine Nutsche filtriert, wobei mit 500 mL Wasser gewaschen wird.
Das Produkt wird für 16 h im Ofen bei 50 °C unter Vakuum getrocknet, wobei 75,1 g eines cremefarbenen Feststoffs erhalten werden, der mit 225 mL eines MEK-Methanol-Gemischs von 1:1 (v/v) umkristallisiert wird, wobei 70,2 g des Zwischenprodukts (IV) als cremefarbener Feststoff erhalten werden.
Analyse von Zwischenprodukt (IV):

¹H-NMR, DMSO-d₆: 5,63 (1H, s, H-4); 5,56 (1H, s, OH-17); 4,58 (1H, Teil A eines AB-Systems, J_AB = 15 Hz, H-21); 4,35 (1H, Teil B eines AB-Systems, J_AB = 15 Hz, H-21); 2,60-2,53 (1H, m); 2,45-2,36 (2H, m); 2,26-2,13 (2H, m); 1,99-1,94 (1H, m); 1,84-1,18 (11H, m); 1,14 (3H, s, H-19); 1,05-0,94 (1H, m); 0,92-0,85 (1H, m); 0,56 (3H, s, H-18).
Im Spektrum finden sich auch die folgenden Peaks, die zum 21-Chlor-Derivat gehören: 5,54 (1H, s, OH-17); 4,77 (1H, Teil A eines AB-Systems, J_AB = 17 Hz, H-21); 4,46 (1H, Teil B eines AB-Systems, J_AB = 17 Hz, H-21).
MS: 409, 411 (M⁺+1) 21-Brom; 365, 367 (M⁺+1) 21-Chlor.

BEISPIEL 4
Dieses Beispiel bezieht sich auf Schritt d) des Verfahrens der Erfindung, von Zwischenprodukt (IV), um Verbindung (V), 21-Acetoxy-17α-hydroxypregn-4-en-3,20-dion, zu erhalten:
70 g des im vorherigen Beispiel erhaltenen Zwischenprodukts (IV) werden in 2100 mL Aceton unter Stickstofffluss suspendiert. 190,8 mL TEA und 39,2 mL Eisessig werden hinzugefügt und bis zum Rückfluss (58 °C) erwärmt. Es wird nie eine klare Lösung beobachtet. Nach 5 h ist die Reaktion so gut wie abgeschlossen. Das Lösungsmittel wird mittels Rotationsverdampfer entfernt, der Rest wird mit Wasser (650 mL) und DCM (450 mL) aufgenommen und die Schichten werden getrennt. Die wässrige Schicht wird mit DCM (100 mL) erneut extrahiert, und die vereinigten organischen Schichten werden mit Wasser (2 x 400 mL) gewaschen. Das Lösungsmittel wird mittels Rotationsverdampfer entfernt, und 400 mL MEK werden hinzugefügt. Das Lösungsmittel wird mittels Rotationsverdampfer entfernt, bis eine Paste erhalten wird. Der Vorgang wird mit weiteren 400 mL MEK wiederholt. 400 mL MEK werden hinzugefügt und das Lösungsmittel wird entfernt, bis ein Volumen von etwa 350 mL des Gemisches erhalten wird. Das Gemisch wird für 1 h auf 0 °C gekühlt und durch eine Nutsche filtriert, wobei mit kaltem MEK (80 mL) gewaschen wird. Das Produkt wird bei 45 °C im Ofen unter Vakuum getrocknet, wobei 59,1 g der Verbindung (V) als weißer Feststoff erhalten werden.
Analyse von Verbindung (V):

¹H-NMR, CDCl₃: 5,73 (1H, s, H-4); 5,08 (1H, Teil A eines AB-Systems, J_AB = 17 Hz, H-21); 4,87 (1H, Teil B eines AB-Systems, J_AB = 17 Hz, H-21); 2,76-2,69 (1H, m); 2,72 (1H, s, OH-17); 2,48-2,26 (4H, m); 2,17 (3H, s, CO-CH₃); 2,07-2,01 (1H, m); 1,90-1,33 (11H, m); 1,19 (3H, s, H-19); 1,15-1,04 (1H, m); 1,01-0,94 (1H, m); 0,72 (3H, s, H-18).
MS: 389 (M⁺+1).

BEISPIEL 5
Dieses Beispiel bezieht sich auf Schritt e) des Verfahrens der Erfindung, von Verbindung (V) zu Verbindung (VI), 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion, Gegenstand der Erfindung:
28,8 g der im vorherigen Beispiel erhaltenen Verbindung (V) werden in 720 mL DCM unter Stickstofffluss gelöst. 71,1 mL Propionsäureanhydrid werden hinzugefügt, und das Gemisch wird auf -20 °C gekühlt. 7,3 mL einer wässrigen Lösung von 70 Gew.-% HClO₄ werden hinzugefügt, und es wird eine Exothermie von -20 bis -15 °C beobachtet. Das Gemisch wird unter Rühren für 10 Minuten bei -20 °C gehalten. Die Reaktion ist abgeschlossen, und das Reaktionsgemisch wird in 650 mL gesättigte wässrige NaHCO₃-Lösung gegossen, wobei für 30 min gerührt wird. Die Schichten werden getrennt, und die wässrige Schicht wird erneut mit 100 mL DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten werden mit Wasser (2 x 300 mL) gewaschen. DCM wird mittels Rotationsverdampfer unter Vakuum entfernt, bis eine Paste erhalten wird. 350 mL Heptan werden hinzugefügt, und das Lösungsmittel wird entfernt, bis eine Paste erhalten wird. Der Vorgang wird mit weiteren 350 mL Heptan wiederholt. Abschließend werden 350 mL Heptan hinzugefügt, und das Lösungsmittel wird destilliert, bis ein Restvolumen von etwa 290 mL des Gemischs erhalten wird. Das Gemisch wird für 1 h bei 25 °C unter Rühren gehalten und durch eine Nutsche filtriert, wobei mit Heptan gewaschen wird. Das Produkt wird bei 45 °C im Ofen unter Vakuum getrocknet, wobei, 32,3 g eines cremefarbenen Feststoffs (Verbindung (VI)) erhalten werden.
Analyse von Verbindung (VI):

¹H-NMR, CDCl₃: 5,75 (1H, s, H-4); 4,89 (1H, Teil A eines AB-Systems, J_AB = 16 Hz, H-21); 4,63 (1H, Teil B eines AB-Systems, J_AB = 17 Hz, H-21); 2,88-2,81 (1H, m); 2,49-2,27 (6H, m); 2,17 (3H, s, CO-CH₃); 2,08-2,03 (1H, m); 1,95-1,60 (9H, m); 1,53-1,34 (2H, m); 1,20 (3H, s, H-19); 1,17-1,10 (1H, m); 1,16 (3H, t, J = 7 Hz, CH₂-CH₃); 1,07-0,99 (1H, m); 0,76 (3H, s, H-18).
MS: 445 (M⁺+1).
HPLC (Reinheit): 99 %, das Chromatogramm wird in 1 gezeigt.

Die Probe wird auch einer DSC- und XPRD-Analyse unter den obigen Testbedingungen unterzogen; die Ergebnisse der beiden Tests werden in 2 und 3 gezeigt.
BEISPIEL 6
Dieses Beispiel bezieht sich auf die Hydrolyse der Verbindung (VI) der Erfindung zu Clascoteron unter Verwendung eines geträgerten Enzyms in einem Durchflussreaktor.
Das Verfahren wird unter Verwendung eines Durchflussreaktors easy-Medchem der E-Serie von Vapourtec durchgeführt, in dem der gelieferte Rohrreaktor mit 845 mg Novozym^® 435 (Lipase B von Candida antarctica auf einem Acrylharzträger) gepackt ist.
14,28 g der Verbindung (VI) werden in 1000 mL Toluol in einem Fläschchen gelöst, das zum Anschluss an den Durchflussreaktor ausgelegt ist; 7,5 mL n-Butanol werden hinzugefügt und bis zur Auflösung gerührt. Die Lösung wird durch den mit dem Enzym gepackten, bei 60 °C thermostatisierten Rohrreaktor mit einer Flussrate von 0,1 mL/min geleitet.
Der Verlauf der Umwandlung in Clascoteron wird durch UPLC-MS-Analyse der Proben der Reaktionslösung überwacht.

Die Wirksamkeit des Enzyms verbleibt, wie aus den in der folgenden Tabelle gezeigten Daten hervorgeht, auch nach mehr als 100 Stunden Reaktion im konstanten Fluss unverändert.

Kontrolle	Gesamte Durchflusszeit (h)	Clascoteron: % Fläche des UPLC-Chromatogramms
1	1	95,66
2	9	95,55
3	22,5	96,34
4	33	96,19
5	47	97,00
6	57	96,63
7	71	97,28
8	81	96,33
9	105	96,98

BEISPIEL 7
Dieses Beispiel bezieht sich auf die Hydrolyse der Verbindung (VI) zu Clascoteron unter Verwendung eines geträgerten Enzyms in einem klassischen geschlossenen Reaktor.
In einem 100 mL Glasreaktor werden 250 mg 21-Acetoxy-17α-propoxy-progesteron (VI) in 17,5 mL Toluol gelöst, 250 mg Novozym^® 435 (Lipase B von Candida antarctica auf einem Acrylharzträger) und abschließend 257 µL n-Butanol werden hinzugefügt. Das Gemisch wird gerührt und auf 60 °C gebracht, wobei der zeitliche Verlauf der Reaktion durch UPLC-Analyse überwacht wird.
Nach 14 Stunden und 30 Minuten Rühren liegt die Menge von Restverbindung (VI) und Clascoteron, im Reaktionsgemisch erzeugt, jeweils bei 0,75 % und 96 %, gemessen an der Fläche der entsprechenden Peaks im UPLC-Chromatogramm.
BEISPIEL 8
Dieses Beispiel bezieht sich auf die enzymatische Hydrolyse von Verbindung (VI) der Erfindung zu Clascoteron im Vergleich zur Hydrolyse, wiederum enzymatisch, des symmetrischen Diesters 17,21-Bis(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion (VII), beschrieben in der WO 2009/019138 , wobei in einem Reaktor herkömmlicher Art gearbeitet wird.

„Clascoterone“ = Clascoteron
In einem 50 mL Glaskolben werden 250 mg 21-Acetoxy-17α-propoxy-progesteron (Verbindung (VI), UPLC-Reinheit = 99,7 %) in 17,5 mL Toluol gelöst; 250 mg Novozym^® 435 (Lipase B von Candida antarctica auf einem Acrylharzträger) und abschließend 257 µL Di-n-butanol werden hinzugefügt. Das Gemisch wird gerührt und auf 60 °C gebracht, wobei die Reaktion im Laufe der Zeit durch UPLC-Analyse überwacht wird.
Der Versuch wird unter identischen Bedingungen mit 17,21-Dipropoxy-17α-progesteron (Verbindung (VII), UPLC-Reinheit = 99,5 %) wiederholt, außer dass aufgrund des höheren Molekulargewichts von Verbindung (VII) im Vergleich zu Verbindung (VI) 258 mg der Verbindung (VII) verwendet werden.

Der Verlauf der Umwandlung in Clascoteron wird durch UPLC-MS-Analyse kontrolliert, und die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt (Clascoteron wird in der Tabelle als CLA angegeben). Es ist zu erkennen, dass die Hydrolyse von Verbindung (VI) schneller abläuft als die Hydrolyse von Verbindung (VII).

Reaktionsstunden	0	4	8	11,15	14,3	23,2
(VI)	99,7	24,6	5,34	1,75	0,75	0,47
(VII)	99,5	36,9	12,9	5,27	2,25	0,64
CLA von (VI)	0	74,3	90,2	93,4	96,0	96,5
CLA von (VII)	0	61,9	85	90,3	94,8	95,6

BEISPIEL 9
Dieses Beispiel bezieht sich auf den Erhalt von mit DMSO solvatisiertem Clascoteron. 445 mL der Lösung, die am Ende der in Beispiel 6 beschriebenen Reaktion erhalten wurde, werden bei 50 °C und unter reduziertem Druck bis zum Erhalt von 14,3 g der Lösung konzentriert. 6,2 mL Dimethylsulfoxid werden dann hinzugefügt, und die Verdampfung wird bei 50 °C und reduziertem Druck fortgeführt, und zwar bis zum Erhalt einer Lösung, in der das Lösungsmittel mindestens 99 % Dimethylsulfoxid umfasst (GC-Kontrolle). Die Lösung wird dann für 16 Stunden bei 20-25 °C gerührt, wobei die Ausfällung eines Feststoffs erhalten wird, der nach der Filtration feucht einer XPRD-Analyse unterzogen wird. Das erhaltene Diffraktogramm ist in 4 wiedergegeben; die Liste der Hauptpeaks des Diffraktogramms, gekennzeichnet durch 2θ (± 0,2°) Winkelpositionen und die relativen Intensitäten, ist in der folgenden Tabelle aufgeführt:

2θ (°) Intensität (%)

11,38 47,3

12,74 51,8

15,71 96,2

15,79 100,0

16,50 32,4

17,78 65,5

18,39 48,3

18,76 25,4

19,61 79,2

19,71 86,4

20,06 40,3
Der feuchte Feststoff (3,5 g) wird dann in 3,5 mL Dimethylsulfoxid bei 60 °C unter Rühren gelöst, dann wird die Lösung für etwa 1 Stunde auf 25 °C gekühlt und für 4 Stunden unter Rühren belassen.
Der ausgefällte Feststoff, isoliert durch Filtration, wird unter reduziertem Druck bei 40 °C für 16 Stunden getrocknet (2,6 g weißer Feststoff) und der XPRD-, DSC-, FT-IR-, ¹H-NMR-Analyse (CDCl₃) unterzogen. Das XPRD-Diffraktogramm des trockenen Produkts ist identisch mit dem, das für das feuchte Produkt erhalten wurde (4); das DSC-Thermogramm und das FT-IR-Spektrum sind jeweils in 5 und 6 wiedergegeben (5 zeigt den Signifikanzbereich des DSC-Thermogramms von 25 bis 155 °C). Das NMR-Spektrum zeigt, dass es sich bei dem Feststoff um ein Solvat aus Clascoteron und Dimethylsulfoxid in einem Molverhältnis von 1:1 handelt. 3 $HPLC - Reinheit : > 99 % .$
BEISPIEL 10
Dieses Beispiel bezieht sich auf die enzymatische Hydrolyse der Verbindung (VI) der Erfindung zu Clascoteron im Vergleich zur Hydrolyse, wiederum enzymatisch, des symmetrischen Diesters 17,21-Bis(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion, Verbindung (VII), wobei in einem Durchflussreaktor mit Hilfe eines auf einem inerten Material geträgerten Enzyms gearbeitet wird.
1,01 g der Verbindung (VII) (Reinheit 99,5 %) werden in 68,5 mL Toluol gelöst, 1,01 mL n-Butanol werden hinzugefügt und das Gemisch wird bis zur Auflösung gerührt.
Die so erhaltene Lösung wird durch einen Rohrreaktor geleitet, der zuvor mit 1,068 g Novozym^® 435 gepackt wurde, wobei mit einer Flussrate von 0,134 mL/min und einer Verweilzeit von 19,1 min bei 60 °C gearbeitet wird. Das angewandte Gerät ist ein easy-Medchem der E-Serie von Vapourtec.
Auf ähnliche Art und Weise werden Vorgänge mit einer Lösung der Verbindung (VI) (Reinheit 99,6 %), wiederum in Toluol und n-Butanol, unter den gleichen Bedingungen durchgeführt.
Der Verlauf der Umwandlung in Clascoteron wird durch UPLC-MS-Analyse kontrolliert, indem Proben aus der Reaktionslösung entnommen werden.
Das UPLC-Peak-Flächenverhältnis von nicht umgesetzter Verbindung (VII) zu nicht umgesetzter Verbindung (VI) beträgt 1,64.
BEISPIEL 11
Dieses Beispiel bezieht sich auf den Erhalt von mit DMSO solvatisiertem Clascoteron über das metastabile Solvat von Methanol.
632 mL einer Lösung, die am Ende der in Beispiel 6 beschriebenen Reaktion erhalten wurde, werden bei 50 °C unter reduziertem Druck bis zum Erreichen eines Gewichts von 9 g destilliert.
Die Lösung wird mit Methanol aufgenommen und unter reduziertem Druck und bei 50 °C 3 Mal konzentriert (wobei für jeden Verdünnungs-/Konzentrationszyklus 26,4 mL Methanol angewendet werden), wobei so gearbeitet wird, dass immer eine Lösung vorliegt.
8,8 mL Methanol werden hinzugefügt, und die Lösung wird zunächst für 30 Minuten bei 20-25 °C und dann für 6 Stunden bei 4 °C gerührt.
Die so erhaltene Suspension wird filtriert, um einen weißen Feststoff zu erhalten, dessen XPRD-Diffraktogramm (feuchtes Produkt) sofort aufgezeichnet wird, wobei eine feste Phase hervorgehoben wird, die sich von jeglichen bekannten Formen unterscheidet. Das XPRD-Diffraktogramm dieser Verbindung ist in 7 wiedergegeben; die Liste der Hauptpeaks des Diffraktogramms, gekennzeichnet durch die 2θ-Winkelpositionen und die relativen Intensitäten, ist in der folgenden Tabelle aufgeführt:

2θ (°) Intensität (%)

5,74 100,0

6,02 58,6

11,49 25,2

11,63 11,4

11,74 13,1

15,67 24,4

17,24 10,4
Der feuchte Feststoff wird schnell in 7 mL Dimethylsulfoxid gelöst.
Die so erhaltene Lösung wird unter reduziertem Druck bei 50 °C destilliert, um etwaige Methanolreste zu entfernen, und dann für 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die so erhaltene Suspension wird filtriert und der Feststoff wird für 16 Stunden im Ofen bei 40 °C im Vakuum getrocknet.
2,3 g weißer Feststoff werden erhalten, wobei das XPRD-Diffraktogramm dem in 4 gezeigten von mit DMSO solvatisiertem Clascoteron entspricht.
BEISPIEL 12
Dieses Beispiel bezieht sich auf die Erhaltung von mit DMSO solvatisiertem Clascoteron.
3100 mL der Reaktionslösung, die auf die gleiche Weise wie in Beispiel 6 beschrieben erhalten wurde und etwa 40 g Clascoteron enthält, werden bei 50 °C und reduziertem Druck bis zum Erhalt von 144,2 g der Lösung konzentriert. 40 mL DMSO werden hinzugefügt, und die Lösung wird bei 50 °C und reduziertem Druck bis zu einem Endgewicht von 84,9 g weiter konzentriert. Die Lösung wird auf 65 °C erwärmt, in etwa 1 h auf 20 °C gekühlt und für 22 h unter Rühren belassen (die Ausfällung eines Feststoffs wird beobachtet). Nach der Filtration wird das feuchte Produkt unter reduziertem Druck bei 40 °C für 20 h getrocknet unter Erhalt von 34,3 g Clascoteron, solvatisiert mit DMSO (weißer Feststoff, UPLC-Reinheit = 99,19 %).
Mit DMSO solvatisiertes Clascoteron (34,3 g) wird durch Umkristallisation weiter gereinigt. Das Solvat wird mit 23,4 mL DMSO versetzt. Die Suspension wird auf 65 °C erwärmt, für 10 min unter Rühren gehalten, dann auf 20 °C in 1 Stunde gekühlt und für 22 h bei 20 °C unter Rühren belassen. Die Suspension wird filtriert, und der feuchte Feststoff wird bei 40 °C und unter reduziertem Druck für 20 h im Ofen getrocknet, um mit DMSO solvatisiertes Clascoteron als weißen Feststoff mit UPLC-Reinheit = 99,70 % zu erhalten.
BEISPIEL 13
Dieses Beispiel bezieht sich auf den Erhalt von mit DMSO solvatisiertem Clascoteron durch Auslösen mit einem Kristallkeim.
3350 mL der Reaktionslösung, die auf die gleiche Weise wie in Beispiel 6 beschrieben erhalten wurde, die 43 g Clascoteron enthält, werden bei 50 °C unter reduziertem Druck bis zum Erhalt von 93,2 g der Lösung konzentriert. 43 mL DMSO werden hinzugefügt und die Destillation wird unter reduziertem Druck bis zu einem Endgewicht von 92,5 g fortgeführt. Die Lösung wird auf 65 °C erwärmt, für 10 min gerührt und dann in etwa 15 min auf 50 °C gekühlt. 0,23 g mit DMSO solvatisiertes Clascoteron, erhalten nach dem in Beispiel 12 beschriebenen Verfahren, werden hinzugefügt und für 10 min unter Rühren belassen. Die Suspension wird in 1 h auf 20 °C gekühlt und dann für 18 h bei 20 °C unter Rühren belassen. Der erhaltene Feststoff wird filtriert und dann 20 h bei 40 °C und unter reduziertem Druck im Ofen getrocknet, wobei 43,4 g mit DMSO solvatisiertes Clascoteron erhalten werden (weißer Feststoff, UPLC-Reinheit = 99,41 %).
Wie in Beispiel 12 kann auch in diesem Fall das erhaltene, mit DMSO solvatisierte Clascoteron aus DMSO umkristallisiert werden, bis der gewünschte Reinheitsgrad erreicht ist.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 3152154 [0003, 0004, 0005, 0006]
US 3147249 [0006]
WO 2009/019138 A2 [0010, 0011, 0022, 0023]
US 3152154 f [0058]
US 3711602 [0073]
WO 2009/019138 [0107]

Claims

Verfahren zur Synthese von 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion, Verbindung der Formel (VI):
umfassend folgende Schritte: a) Reaktion von 17α-Hydroxyprogesteron (I) mit Pyrrolidin unter Bildung von Verbindung (II), 17-Hydroxy-3-(1-pyrrolidinyl)pregna-3,5-dien-20-on:
b) Reaktion von Verbindung (II) zunächst mit Salzsäure und dann mit Brom unter Bildung von Zwischenprodukt (III), einem Gemisch aus (21-Chlor/21-Brom)-17α-hydroxy-3-(1-pyrrolidinium-1 -yliden)-pregn-4-en-20-onchlorid:
c) basische Hydrolyse von Zwischenprodukt (III) zum Erhalt von Zwischenprodukt (IV), dem entsprechenden Gemisch aus (21-Chlor/21-Brom)-17α-hydroxypregn-4-en-3,20-dion:
d) Reaktion von Zwischenprodukt (IV) mit Essigsäure zum Erhalt von Verbindung (V), 21-Acetoxy-17α-hydroxypregn-4-en-3,20-dion (V):
e) Reaktion von Verbindung (V) mit Perchlorsäure und Propionsäureanhydrid zum Erhalt von Verbindung (VI), 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion:
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend einen Schritt f) der selektiven Hydrolyse der Verbindung 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion, Verbindung der Formel (VI), zur Bildung der Verbindung 21-Hydroxy-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion (Clascoteron).
Verfahren nach Anspruch 2, wobei Schritt f) mittels Säurehydrolyse durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei Schritt f) mittels enzymatischer Hydrolyse durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die enzymatische Hydrolyse unter Verwendung einer geträgerten Lipase als Reaktant durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Vorgänge in einem Durchflussreaktor durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Vorgänge in Anwesenheit von Toluol und einem Alkohol durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Alkohol n-Butanol ist.
Verbindung 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion (VI):
Verbindung 21-(Acetyloxy)-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion (VI), dadurch gekennzeichnet, dass sie als Zwischenprodukt zur Synthese von 21-Hydroxy-17-(1-oxopropoxy)-pregn-4-en-3,20-dion (Clascoteron) verwendbar ist.
Solvat von Clascoteron mit Dimethylsulfoxid.
Solvat nach Anspruch 11, wobei das molare Verhältnis Clascoteron:Dimethylsulfoxid 1:1 beträgt.
Solvat nach einem der Ansprüche 11 oder 12 zur Verwendung als Medikament.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das Solvat nach einem der Ansprüche 11 oder 12 und pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe umfasst.