DE112008000363T5 - Vorrichtung zur Detektion und ihre Verwendung - Google Patents

Vorrichtung zur Detektion und ihre Verwendung Download PDF

Info

Publication number
DE112008000363T5
DE112008000363T5 DE112008000363T DE112008000363T DE112008000363T5 DE 112008000363 T5 DE112008000363 T5 DE 112008000363T5 DE 112008000363 T DE112008000363 T DE 112008000363T DE 112008000363 T DE112008000363 T DE 112008000363T DE 112008000363 T5 DE112008000363 T5 DE 112008000363T5
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
flow cell
biomolecules
light
solution
imaging system
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE112008000363T
Other languages
English (en)
Other versions
DE112008000363B4 (de
Inventor
Steven J. Weston Gordon
Steven Cohasset Auger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ISOPLEXIS CORP., BRANFORD, US
Original Assignee
Intelligent Bio Systems Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Intelligent Bio Systems Inc filed Critical Intelligent Bio Systems Inc
Publication of DE112008000363T5 publication Critical patent/DE112008000363T5/de
Application granted granted Critical
Publication of DE112008000363B4 publication Critical patent/DE112008000363B4/de
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N21/03—Cuvette constructions
    • G01N2021/0325—Cells for testing reactions, e.g. containing reagents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6463—Optics
    • G01N2021/6471—Special filters, filter wheel
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N21/03—Cuvette constructions
    • G01N21/05—Flow-through cuvettes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Verfahren umfassend:
a) Bereitstellen eines bildgebenden Systems, wobei das bildgebende System umfasst:
i) eine Nicht-Laser-Lichtquelle, die so konfiguriert ist, dass das von dieser Quelle emittierte Licht einen Teil
ii) einer Durchflusszelle beleuchtet, die eine Anordnung von Biomolekülen auf einer ersten Oberfläche umfasst, wobei die erste Oberfläche nach Innen zeigt, sodass in Lösung eingeführte Reagenzien die Biomoleküle kontaktieren können,
iii) eine Linse, die so positioniert ist, dass sie mindestens einen Teil der sichtbaren Fluoreszenz sammelt; und
iv) eine Kamera;
b) Einführen einer Lösung in die Durchflusszelle, wobei die Lösung ein oder mehrere fluoreszierende Stoffe umfasst, unter solchen Bedingungen, dass mindestens ein Teil der fluoreszierenden Stoffe an mindestens einen Teil der Anordnung von Biomolekülen bindet, um behandelte Biomoleküle zu schaffen, und
c) Aufnehmen eines Bildes der behandelten Biomoleküle mit dem bildgebenden System.

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Vorrichtungen, Verfahren zum Herstellen von Vorrichtungen und Verfahren zur Verwendung der Vorrichtungen, einschließlich Vorrichtungen zur Detektion von Fluoreszenz. In einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein optisches System vor zum Anregen und Messen von Fluoreszenz auf oder in Proben, die fluoreszierendes Material umfassen (z. B. fluoreszierende Markierungsstoffe, Farbstoffe oder Pigmente). In einer Ausführungsform wird eine Vorrichtung zur Detektion von fluoreszierenden Markierungsstoffen auf Nukleinsäure verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Vorrichtung so konfiguriert, dass fluoreszierende Markierungsstoffe in einer Mehrzahl von unterschiedlichen DNS-Vorlagen gleichzeitig detektiert werden.
  • Hintergrund
  • Raster-Lichtmikroskope sind seit mehreren Dekaden bekannt. Ihr Funktionsprinzip basiert auf einem Lichtstrahl, der auf einen kleinen Lichtpunkt (der erste Fokalpunkt) auf einer Probe konzentriert wird. Die Probe und dieser Lichtpunkt werden beide auf eine Art und Weise bewegt, dass ein spezifisches Gebiet der Pro be durch den Lichtpunkt abgerastert wird. Das Licht, das die Probe durchdringt, oder von ihr reflektiert wird und/oder die Fluoreszenz die auf oder in der Probe während des Rasterns ausgelöst wird, wird daher als „von der Probe stammendes Licht” bezeichnet und wird durch ein oder mehrere Fotodetektoren gemessen. Ein vergrößertes Bild wird dadurch produziert, dass ein ursprünglicher Messpunkt einem spezifischen Gebiet auf dem Bild der Probe zugeordnet wird. Im Prinzip enthält daher ein solches Raster-Lichtmikroskop: Eine Lichtquelle, wie einen Laser, der einen Lichtstrahl produziert; einen Probenhalter zum Halten der Probe; eine Optik zum Produzieren eines ersten Fokussierpunkts auf der Probe; eine optische Anordnung zum Aufnehmen eines Bildes eines zweiten Fokalpunktes, wobei das Licht verwendet wird, das durch die Probe scheint und/oder von der Probe reflektiert wird und/oder die Fluoreszenz repräsentiert, die auf oder in der Probe ausgelöst wurde; ein Fotodetektor zum Messen der Intensität des zweiten Fokalpunktes; und einen Rastermechanismus zum gleichzeitigen Bewegen der Probe und des ersten Fokalpunktes.
  • Diese Vorgehensweise hat eine Anzahl von Nachteilen. Erstens, der kleine Fokalpunkt bedeutet, dass nur eine sehr kleine Zahl von Proben zu einem Zeitpunkt untersucht werden können. Zweitens erzeugt die Notwendigkeit des Bewegens von Licht signifikante technische Probleme und erhöhte Kosten.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Vorrichtungen, Verfahren zum Herstellen von Vorrichtungen und Verfahren zur Verwendung der Vorrichtungen, einschließlich Vorrichtungen zur Detektion von Fluoreszenz. In einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein optisches System vor zum Erregen und Messen von Fluoreszenz auf oder in Proben umfassend fluoreszierendes Material (z. B. fluoreszierende Markierungsstoffe, Farbstoffe oder Pigmente). In einer Ausführungsform wird eine Vorrich tung verwendet zur Detektion von fluoreszierenden Markierungsstoffen auf Nukleinsäure.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Vorrichtung so konfiguriert, dass fluoreszierende Markierungsstoffe in einer Mehrzahl von verschiedenen DNA-Vorlagen gleichzeitig detektiert werden. Mit anderen Worten, anstatt eine Lichtquelle zu verwenden, die einen kleinen Fokalpunkt erzeugt (wie beispielsweise einen Laser), erleuchtet die bevorzugte Lichtquelle der vorliegenden Erfindung (vorzugsweise eine Nicht-Laser Lichtquelle) einen großen Bereich der Probe (z. B. mindestens 10% des Gebietes, das durch einen konventionellen Mikroskop-Objektträger definiert wird, weiterhin bevorzugt größer als 20% des Gebietes, das durch einen konventionellen Mikroskop-Objektträger definiert wird, und weiterhin, größer als 50% des Gebietes, das durch einen konventionellen Mikroskop-Objektträger definiert wird, und am meisten bevorzugt größer als 70% des Gebietes, das durch einen konventionellen Mikroskop-Objektträger definiert wird). In einer anderen Ausführungsform erleuchtet die bevorzugte Lichtquelle der vorliegenden Erfindung (bevorzugt eine Nicht-Laser Lichtquelle) ein definiertes Gebiet auf einem Chip (z. B. mindestens 10% des Bereichs auf dem Chip oder 14,9 × 10 mm des Sichtfeldes). In einer weiteren Ausführungsform beleuchtet die bevorzugte Lichtquelle der vorliegenden Erfindung einen größeren Bereich auf dem Chip (z. B. bis und einschließlich eines Bildbereiches von 22 mm × 22 mm, und weiterhin bevorzugt, 22 mm × 66 mm). In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das System ein Mittel zum Lichtsammeln, wie beispielsweise eine Digitalkamera, die in der Lage ist Bilder aufzunehmen (die in der Lage ist 120 μm Merkmale aufzunehmen, und weiterhin bevorzugt, 10 μm Merkmale oder weniger).
  • Überdies ist es mit konventionellen Vorrichtungen schwierig, gleichzeitige Messungen einer Zahl von unterschiedlichen fluoreszierenden Markierungsstoffen durchzuführen, die in einer Pro be vorhanden sein können (oder in unterschiedlichen Proben). Es kann eine Vielzahl von fluoreszierenden Markierungsagenzien geben, die unterschiedliche Erregungs- und/oder Emissions-Wellenlängen haben. Die vorhandenen Fluorometer jedoch ermöglichen solche Experimente mit multiplen Markierungen nicht. Viele Fluorometer sind für eine einzige Kombination von Erregungs- und Emissions-Wellenlängen konstruiert. Im Gegensatz dazu ist in einer bevorzugten Ausführungsform das bildgebende System der vorliegenden Erfindung für multiple Erregungs- und Emissions-Wellenlängen konstruiert.
  • In einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein bildgebendes System vor, umfassend: eine Nicht-Laser Lichtquelle, die so konfiguriert ist, dass das emittierte Licht der Quelle eine Durchflusszelle (oder einen Teil davon) erleuchtet (und bevorzugt darauf konvergiert), wobei das emittierte Licht geeignet ist, sichtbare Fluoreszenz von fluoreszierenden Stoffen zu erzeugen; eine Linse, die so positioniert ist, dass sie mindestens einen Teil der sichtbaren Fluoreszenz sammelt; und ein Mittel zum Sammeln von Licht (z. B. ein Licht-Bildgebendes/Aufnahmemittel, wie beispielsweise eine ladungsgekoppelte Vorrichtung, eine CMOS-Vorrichtung, oder andere Kameratypen), das so positioniert ist, dass der Teil der sichtbaren Fluoreszenz, der von der Linse gesammelt wird, zu dem Lichtsammelmittel durchstrahlt. In einer Ausführungsform ist das Bildgebende System leicht handhabbar in einem Gehäuse enthalten (von dem Teile lichtundurchlässig oder transparent sein können). In einer Ausführungsform ist die Durchflusszelle auf einer Plattform oder einer anderen Abstützungsstruktur montiert. In einer anderen Ausführungsform ist die Durchflusszelle an dem Gehäuse befestigt (z. B. an einer Wand des Gehäuses oder an einem Halter, der an dem Gehäuse befestigt ist).
  • Die verschiedenen Ausführungsformen des bildgebenden Systems der vorliegenden Erfindung können durch Hardware komplementiert wer den (z. B. einen Computer) oder durch Software. Auf diese Weise umfasst in einer Ausführungsform das bildgebende System weiterhin einen Prozessor, der mit der Lichtsammelvorrichtung (z. B. CCD oder andere Digitalkameras) in Kommunikation ist, wobei der Prozessor in der Lage ist, Bilder aufzunehmen und (optional) Bilder des Systems zu optimieren. In Bezug auf das Optimieren kann es praktisch und angenehm sein, das Optimieren des Bildrauschens zusätzlich zu der Kompensation der Helligkeit von einzelnen Bereichen des Bildes durchzuführen. Entsprechende Verfahren zum adaptiven, Bildrausch-optimierten Filtern sind bekannt, beispielsweise aus dem Text von William A. Pratt mit dem Titel „Digital Imaging Processing", 1978, John Wiley & Sons, Inc., New York.
  • Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung durch die Anordnung des bildgebenden Systems begrenzt ist. In einer Ausführungsform ist die Durchflusszelle auf dem Boden des Systems und die anderen Elemente sind über diesem positioniert. In einer anderen Ausführungsform ist die Durchflusszelle auf der einen Seite der anderen Elemente positioniert, wobei die anderen Elemente in einer Zug oder zug-ähnlichen Anordnung positioniert sind. In einer Ausführungsform kann die Durchflusszelle zwei räumliche Achsen X und Y einnehmen, mit mindestens einem der anderen Elemente (z. B. der Lichtquelle) positioniert in der Z-Achse, um die Durchflusszelle zu beleuchten (oder die Probe darin). Auf der anderen Seite kann die Lichtquelle anders positioniert sein, wobei das emittierte Licht durch Spiegel in die Z-Achse gerichtet wird. In einer Ausführungsform wurde es vorteilhaft gefunden, die Durchflusszelle so zu positionieren, dass das Auswaschen der Durchflusszelle (z. B. das Entfernen der Flüssigkeiten, wie beispielsweise Lösungen, die Reagenzien enthalten oder Waschpuffer und ähnliche) teilweise durch die Gravitation erreicht wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Durchflusszelle mit einem Fluidik-System verbunden, das verschiedene Reagenzien und Lösungs-Reservoire umfasst, die in fluider Kommunikation mit der Durchflusszelle sind (z. B. über Schläuche). In einer Ausführungsform wird das Fluidik-System unter Druck gesetzt, und verschiedene Reagenzien und Lösungen werden durch kontrolliertes Betätigen von Ventilen eingeführt (unten im Detail beschrieben). In einer Ausführungsform umfasst die Durchflusszelle ein oder mehrere Anschlussbuchsen zum Verbinden der Schläuche.
  • Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung begrenzt wird durch die Art der detektierten fluoreszierenden Stoffe. Die Vorrichtungen und Systeme der vorliegenden Erfindung können mit einer Vielzahl von Stoffen verwendet werden, einschließlich aber nicht begrenzt auf Farbstoffe, inorganische Moleküle, multi-molekulare Mischungen von organischen und/oder inorganischen Molekülen, Kristalle, Heteropolymere und ähnliche. Z. B. können CdSe-CdS Kern-Schalen-Nanokristalle eingeschlossen in einer Silika-Schale, für die Kopplung an biologische Moleküle einfach derivatisiert werden (Bruchez et al. (1998) Science, 281: 2013–2016). Ähnlich wurden stark fluoreszierende Quantum-Dots (Zinksulfid-überschichtetes Cadmiumselenid) kovalent an Biomoleküle gekoppelt zur Verwendung in ultrasensitiver biologischer Detektion (Warren and Nie (1998) Science, 281: 2016–2018). Fluoreszierende Oligonukleotide (Primes oder Sonden), die Basenverbundene oder terminal-verbundene Fluorophore enthalten und Quencher sind im Stand der Technik gut bekannt. Sie können beispielsweise von Life Technologies (Gaithersburg, Md.), Sigma-Genosis (The Woodlands, Tex.), Genset Corp., (La Jolla, Calif.), oder Synthetic Genetics (San Diego, Calif.) erhalten werden. Der Fachmann wird erkennen, dass eine große Zahl von unterschiedlichen Fluorophoren verfügbar ist, einschließlich solcher von kommerziellen Quellen wie beispielsweise Molecular Probes, Eugene, Oreg., und andere Fluorophore sind dem Fachmann bekannt. Nützliche Fluorophore schließen ein: Fluoreszein, Fluoreszein- Isothiozyanat (FITC), Carboxy-Tetrachlor-Fluoreszein (TET), NHS-Fluoreszein, 5 und/oder 6-Carboxy-Fluoreszein (FAN), 5-(oder 6-)Iodoazetamidofluoreszein, 5-{[2(und 3)-5-(Azetylmercapto)succinyl]amino} Fluoreszein (SAMSA-Fluoreszein) und andere Fluoreszeinderivate, Rhodamin, Lissamin-Rhodamin B Sulfonylchlorid, Texas Rot-sulfonyl-chlorid, 5 und/oder 6-Carboxyrhodamin (ROX) und andere Rhodaminderivate, Coumarin, 7-Amino-methyl-coumarin, 7-Amino-4-methyl-coumarin-3-Essigsäure (AMCA), und andere Coumarin-Derivate, BODIPY TM Fluorophore, Cascade Blue TM Fluorophore wie beispielsweise 8-Methoxypyren-1,3,6-Trisulfonsäure-Trinatriumsalz, Luzifer-gelb-Fluorophore wie beispielsweise 3,6-Disulfonat-4-amino-Naphthalimid, Phycobiliprotein-Derivate, Alexa-Fluor-Farbstoffe (erhältlich von Molecular Probes, Eugene, Oreg.) und andere Fluorophore, die dem Fachmann bekannt sind. Für eine allgemeine Liste von nützlichen Fluorophoren siehe auch Hermanson, G. T., BIOCONJUGATE TECHNIQUES (Academic Press, San Diego, 1996). Alle diese fluoreszierenden Materialien werden im Kontext der vorliegenden Erfindung berücksichtigt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des bildgebenden Systems der vorliegenden Erfindung umfasst die Durchflusszelle eine Anordnung von Nukleinsäure (z. B. das Netz ist in der Durchflusszelle enthalten) und mindestens ein Bereich der Nukleinsäure umfasst fluoreszierende Farbstoffe (z. B. fluoreszierende Markierungsstoffe, die an ein in die Nukleinsäure inkorporiertes Nukleotid gebunden sind). Bevorzugt umfasst die Durchflusszelle Mittel zum Einführen der Reagenzien in die Lösung (so dass die biologischen Reaktionen auf oder in der Anordnung stattfinden können), wobei die Reagenzien ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus markierten Nukleotiden und Enzymen (die typischerweise in Lösung eingeführt werden, wie beispielsweise Puffer; die Puffer sind auch alleine nützlich zum Freiwaschen der Anordnung von Reaktanden).
  • Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung begrenzt ist auf die Art der Nicht-Laser-Lichtquelle. Eine Vielzahl von Nicht-Laser-Typ Lichtquellen werden in Erwägung gezogen, einschließlich aber nicht begrenzt auf Licht-emittierende Dioden (LEDs). In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf ein bildgebendes System, worin die Nicht-Laser-Lichtquelle eine Vielzahl von Licht-emittierenden Dioden umfasst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Mehrzahl von Licht-emittierenden Dioden vier unterschiedliche Sätze von Licht-emittierenden Dioden, von denen jede Licht unterschiedlicher Wellenlänge emittiert (z. B. 488 nm, 530 nm, 585 nm und 615 nm). Die Licht-emittierenden Dioden können so in einer Anordnung angebracht werden (z. B. linear oder zirkulär), dass das emittierte Licht eine Probe (z. B. Material auf einem mikroskopischen Objektträger, eine Anordnung, eine Anordnung in einer Durchflusszelle, einer Durchflusszelle etc.) beleuchtet (und bevorzugt auf dieser konvergiert). Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung begrenzt ist durch die Zahl der Licht-emittierenden Dioden. In einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung den einfachen Fall vor, in dem nur vier unterschiedliche LEDs verwendet werden (zu unterscheiden von vier verschiedenen Sätzen von LEDs), von denen jede eine unterschiedliche Wellenlänge emittiert. Sogar da, wo vier verschiedene Sätze verwendet werden, sieht die vorliegende Erfindung Ausführungsformen vor, in denen gleiche Zahlen innerhalb eines Sets vorhanden sind, und Ausführungsformen, in denen einige oder alle Sätze unterschiedliche Anzahlen von Lichtemittierenden Dioden haben. Auf diese Weise können beispielsweise in einer zirkulären Anordnung von 20 LEDs sieben nur bei einer bestimmten Wellenlänge emittieren, während 3 bei einer anderen Wellenlänge emittieren können, wobei die verbleibenden 10 zwei Sätze von 5 LEDs umfassen, wobei jeder Satz bei einer wieder anderen Wellenlänge emittiert. Optional können sie mit engen Bandpass-Filtern kombiniert werden, die zwischen den LEDs und der Probe platziert werden, um die Wellenlängen, die von den LEDs emittiert werden, weiter zu begrenzen oder einzugrenzen (z. B. die Durchflusszelle, die die Anordnung auf einem Chip enthält). Weitere Ausführungsformen können optional zusätzliche Elemente einschließen, die können zum Formen der Lichtquelle verwendet werden (z. B. eine formgebende Linse und/oder ein Kollimator).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das bildgebende System Filter, die vor der Linse, in der Linse oder zwischen der Linse und dem Lichtsammelmittel positioniert sind.
  • Bevorzugt sind die Filter optische Bandpass-Filter, die in einer linearen oder zirkulären Art und Weise positioniert werden können. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des oben beschriebenen bildgebenden Systems umfasst das System weiterhin ein Filterrad, das ein Zentrum und eine Mehrzahl von sich radial erstreckenden Haltern aufweist, wobei jeder der Halter einen optischen Bandpass-Filter enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform sind vier solcher Filter eingesetzt, wobei jeder für unterschiedliche bevorzugte Wellenlängen ausgewählt ist. In einer Ausführungsform werden vier 50 mm Interferenzfilter eingesetzt, um das Messen der Fluoreszenzemissionen von vier unterschiedlichen Fluorophoren zu erlauben.
  • Die Filter können stationär oder beweglich sein. In einer bevorzugten Ausführungsform des oben beschriebenen bildgebenden Systems umfasst das System weiterhin einen Motor, der mit dem Zentrum des Filterrads (entweder direkt oder durch Transmissionselemente) verbunden ist, worin der Motor so adaptiert ist, dass er das Filterrad so rotieren kann, dass er jeden der Mehrzahl der Filter zwischen das Lichtsammelmittel (z. B. eine Ladungsgekoppelte Vorrichtung) und die Probe (z. B. die Durchflusszelle) positionieren kann. Andere Mittel zur Begrenzung der Bandbreite des Lichts, wie beispielsweise dichromatische Spiegel können auch als eine Art von Filter verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein bildgebendes System vor, umfassend: eine Anordnung von Licht-emittierenden Dioden, die so konfiguriert sind, dass das emittierte Licht die Probe umfassend fluoreszierendes Material erhellt (und bevorzugt darauf konvergiert), wobei das emittierte Licht dazu geeignet ist sichtbare Fluoreszenz des fluoreszierenden Materials zu erzeugen; eine Linse positioniert zum Sammeln von mindestens einem Teil der sichtbaren Fluoreszenz; und eine ladungsgekoppelte Vorrichtung, die so positioniert ist, dass der Teil der sichtbaren Fluoreszenz, der von der Linse gesammelt wird, durchläuft zu der ladungsgekoppelten Vorrichtung. In einer bevorzugten Ausführungsform des bildgebenden Systems umfasst die Anordnung von Licht-emittierenden Dioden vier unterschiedliche Licht-emittierende Sätze von Dioden, von denen jeder Licht einer unterschiedlichen Wellenlänge emittiert (z. B. 488 nm, 530 nm, 585 nm und 615 nm). Die Licht-emittierenden Dioden können in einer Anordnung konfiguriert sein (z. B. linear oder zirkulär) so, dass das emittierte Licht eine Probe (z. B. Material oder ein Mikroskop-Träger ein Feld, ein Feld enthalten in der Durchflusszelle, eine Durchflusszelle etc.) beleuchtet (und bevorzugt darauf konvergiert). Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung begrenzt ist durch die Zahl von Licht-emittierenden Dioden. Sogar wenn vier verschiedene Sätze verwendet werden, sieht die vorliegende Erfindung Ausführungsformen vor, in denen gleiche Anzahlen in jedem Satz sind, und Ausführungsformen, in denen einige oder alle der Sätze eine unterschiedliche Anzahl von Licht-emittierenden Dioden haben. Auf diese Weise können beispielsweise in einer zirkularen Anordnung von 20 LEDs 7 bei einer bestimmten Wellenlänge emittieren, während 3 bei einer anderen emittieren können, wobei die verbleibenden 10 zwei Sätze von 5 LEDs umfassen, von denen jeder Satz bei wieder einer anderen Wellenlänge emittiert. Optional, um die Wellenlängen, die von den LEDs emittiert werden, weiter zu begrenzen oder einzuengen, können sie mit engen Bandpass-Filtern kombiniert werden, die zwischen die LEDs und die Probe platziert werden (z. B. die Durchflusszelle, die die Anordnung auf dem Chip enthält). Weitere Ausführungsformen können optional zusätzliche Elemente enthalten, die verwendet werden, um das Licht der Lichtquelle zu formen (z. B. eine formende Linse und/oder Kollimator). In einer Ausführungsform des bildgebenden Systems umfasst die Probe Nukleinsäure, wobei mindestens ein Teil der Nukleinsäure fluoreszierende Farbstoffe umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probe in einer Durchflusszelle enthalten. In einer Ausführungsform umfasst die Durchflusszelle Mittel zum Einführen von Reagenzien (typischer Weise in Lösung zu der Probe). In einer Ausführungsform sind diese Reagenzien ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus markierten Nukleotiden und Enzymen (z. B. Polymerasen). Wie oben diskutiert ist in einer Ausführungsform die Durchflusszelle in fluider Kommunikation mit einem Fluidik-System (über Schläuche und Anschlussbuchsen).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das bildgebende System Filter, die vor der Linse, innerhalb der Linse, oder zwischen der Linse und dem Lichtsammelmittel positioniert sind. Bevorzugt sind diese Filter optische Bandpass-Filter, die in einer linearen oder zirkulären Art und Weise positioniert werden können. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des oben beschriebenen bildgebenden Systems umfasst das System weiterhin ein Filterrad, das ein Zentrum und eine Mehrzahl von sich radial ausstreckenden Haltern umfasst, wobei jeder dieser Halter einen optischen Bandpass-Filter enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform werden vier solcher Filter eingesetzt, wobei jeder für unterschiedliche bevorzugte Wellenlängen ausgewählt ist. In einer Ausführungsform werden 50 mm Interferenzfilter eingesetzt, um die Messung der Fluoreszenzemissionen von vier verschiedenen Fluorophoren zu erlauben.
  • Die Filter können stationär oder beweglich sein. In einer bevorzugten Ausführungsform des oben beschriebenen bildgebenden Systems umfasst das System weiterhin einen Motor, der mit dem Zent rum des Filterrades verbunden ist (entweder direkt oder durch Transmissionselemente), worin der Motor so adaptiert ist, dass er das Filterrad so rotiert, um jedes der Mehrzahl von Filtern zwischen das Lichtsammelmittel (z. B. eine ladungsgekoppelte Vorrichtung) und die Probe (z. B. die Durchflusszelle) zu positionieren.
  • In einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung die Herstellung eines bildgebenden Systems vor umfassend Zusammensetzen von: eine Nicht-Laser-Lichtquelle, die so konfiguriert ist, dass das von der Quelle emittierte Licht eine Durchflusszelle (oder einen Teil davon) erleuchtet (und bevorzugt darauf konvergiert), wobei das emittierte Licht geeignet ist, sichtbare Fluoreszenz von fluoreszierenden Stoffen zu erzeugen; eine Linse positioniert zum Sammeln mindestens eines Teils der sichtbaren Fluoreszenz; und ein Lichtsammelmittel (z. B. eine ladungsgekoppelte Vorrichtung, eine CMOS-Vorrichtung, oder andere Typen von Kameras), das so positioniert ist, dass der Teil der sichtbaren Fluoreszenz, der von der Linse gesammelt wird, durchstrahlt hin zu dem Lichtsammelmittel. In einer Ausführungsform umfasst die Lichtquelle LEDs (z. B. ein zirkluares Feld von LEDs).
  • In einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren vor umfassend: a) Bereitstellen eines bildgebenden Systems, wobei das bildgebende System eine Nicht-Laser-Lichtquelle umfasst, die so konfiguriert ist, dass das von der Quelle emittierte Licht die Durchflusszelle (oder einen Teil davon) beleuchtet (und bevorzugt darauf konvergiert) umfassend eine Anordnung von Biomolekülen, wobei das emittierte Licht geeignet ist, sichtbare Fluoreszenz der fluoreszierenden Stoffe zu erzeugen; eine Linse, die so positioniert ist, dass sie mindestens einen Teil der sichtbaren Fluoreszenz sammelt; und ein Lichtsammelmittel (z. B. eine ladungsgekoppelte Vorrichtung, eine CMOS-Vorrichtung, oder andere Kameratypen), das so positioniert ist, dass ein Teil der sichtbaren Fluoreszenz, die von der Linse gesammelt wird, durchstrahlt hin zu dem Lichtsammelmittel; b) Einführen einer Lösung in die Durchflusszelle, wobei die Lösung ein oder mehr fluoreszierende Stoffe umfasst, unter solchen Bedingungen, dass mindestens ein Teil der fluoreszierenden Stoffe an mindestens einen Teil der Anordnung von Biomolekülen bindet, um behandelte Biomoleküle zu erschaffen, und c) Aufnehmen eines Bildes der behandelten Biomoleküle mit dem bildgebenden System. In einer Ausführungsform dieses Verfahrens umfassen die Biomoleküle Nukleinsäure. In einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens umfasst die Lösung Oligonukleotide, die fluoreszierende Anhänger umfassen, worin ein Teil der Oligonukleotide mit einem Teil der Nukleinsäure-Biomoleküle auf der Anordnung hybridisiert.
  • In einer anderen Ausführungsform umfassen die Biomoleküle Nukleinsäure und die Lösung umfasst Fluoreszenz-markierte Nukleotide und ein Enzym, das in der Lage ist zu bewirken, dass mindestens ein Teil der Nukleotide in mindestens einen Teil der Nukleinsäure-Biomoleküle auf der Anordnung eingebaut wird. In einer Ausführungsform sind die Nukleotide BODIPY-markierte Nukleotide. In einer anderen Ausführungsform wird eine zweite Lösung eingesetzt, die ein oder mehrere Enzyme (oder Chemikalien) umfasst, die in der Lage sind, die fluoreszierenden Markierungsstoffe zu entfernen. In einer Ausführungsform werden erste und zweite Lösungen schrittweise verwendet, wobei Markierungsstoffe eingeführt werden, ein Bild aufgenommen wird, und sie danach entfernt werden (wobei der Zyklus mindestens zwei Mal wiederholt wird, weiterhin bevorzugt 10 Mal oder mehr).
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren umfassend a) Konstruktion einer Crosstalk-Matrix aus der Messung der reinen Farbstoffe, b) Invertieren der Matrix und c) Verwendung dieser zur Trennung von nachfolgenden Messungen, wobei das bildgebende System verwendet wird (wie beispielsweise das LED-Illuminations-basierte Detektorsystem, das oben beschrieben ist). Diese Crosstalk-Matrix kann für ein Vierfarbensystem konstruiert werden (aber ist nicht auf vier Farben).
  • Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt schematisch eine Ausführungsform des bildgebenden Systems der vorliegenden Erfindung, wobei die Ausführungsform umfasst a) ein zirkuläres Feld von LEDs, das so konfiguriert sind, dass das emittierte Licht auf eine Region oder Plattform konvergiert (z. B. eine Position für eine Probe, Durchflusszelle, etc.) um Fluoreszenz des Fluoreszenzmaterials zu erregen, b) eine Linsenanordnung, die über der Region positioniert ist, sodass sie mindestens einen Teil der Fluoreszenz auffängt, c) ein Filterrad umfassend Bandpass-Filter und d) Lichtsammelmittel (in diesem Fall eine gekühlte CCD-Kamera), worin das Filterrad zwischen der Region, wo das Licht konvergiert, und dem Lichtsammelmittel poitioniert ist.
  • 2 zeigt schematisch eine Ausführungsform der Durchflusszelle. 2A zeigt eine dreidimensionale transparente Ansicht der Durchflusszelle, umfassend Flüssigkeit-Schlauch-Verbindungen, Einsatzheizer und eine O-Ring-Dichtung. 2B ist eine zweidimensionale Zeichnung einer Seitenansicht der Durchflusszelle, die eine Anordnung oder einen Ausschnitt mit räumlich gesetzten Punkten auf der Oberfläche zeigt (die Positionen für Biomoleküle und/oder Anker-Moleküle repräsentieren), wobei das Feld in einem Flüssigkeitskanal so positioniert ist, dass Lösungen von Puffern und/oder Reagenzien über die Oberfläche eingeführt werden können, unter Bedingungen, unter denen Reaktionen und/oder Waschen erreicht werden kann. Die Pfeile zeigen eine bevorzugte Richtung des Flüssigkeitsstroms, mit Eingangs- und Ausgangs-Buchsen, sowie ein bevorzugtes Verfahren der Abdichtung (O-Ring-Dichtung).
  • 3 zeigt schematisch eine Ausführungsform des Fluidik-Systems, umfassend eine Vielzahl von illustrativen Reagenz- und Puffer-Reservoiren, die in Kommunikation (über Schläuche oder andere Kanalstrukturen in einen Ventile-enthaltenden Mehrfachverteiler) mit einer Ausführungsform eine Durchflusszelle stehen (umfassend eine Seiteneingangsbuchse und ein oder mehrere Heizer), wobei die Anordnung oder der Chip invertiert ist und die Ausgangsbuchse auf dem Boden ist, wodurch es dem Flüssigkeitskanal erlaubt wird, zumindest teilweise durch Gravitation entleert zu werden, sodass der Abfall sofort in einem Reservoir gesammelt werden kann.
  • 4 zeigt schematisch eine andere Ausführungsform des bildgebenden Systems, worin zwei Durchflusszellen und zwei Kameras eingesetzt werden, um die Kapazität und Effizienz zu erhöhen (z. B. während ein Chip in einer ersten Durchflusszelle ein oder mehrere Reaktionsschritte durchläuft, wird ein zweiter Chip in einer zweiten Durchflusszelle abgerastert und ein Bild gemacht).
  • 5 zeigt eine illustrative Auswahl von Exitations- und Emissions-Filtern (graue Rechtecke) für vier illustrative Farbstoffe, relativ zu dem Anregungsspektrum (gestrichelt) und dem Emissionsspektrum des Farbstoffs (durchgezogen).
  • 6 zeigt die Rohdaten (6A) und Crosstalk-angepasste Daten (6B) für vier illustrative Farbstoffe.
  • Genaue Beschreibung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Fluoreszenz-Detektionssystem und eine Durchflusszelle für das Prozessieren von Biomolekülen (z. B. Nukleinsäure-Proben), die auf einem „Chip” oder einer anderen Oberfläche (z. B. Mikroskop-Objektträger, etc.) angeordnet sind. Die Durchflusszelle erlaubt dem Benutzer das Durchführen von biologischen Reaktionen, ein schließlich aber nicht begrenzt auf Hybridisieren und Sequenzieren von Nukleinsäuren.
  • Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung begrenzt ist auf bestimmte Lichtquellen.
  • Nur als Beispiel kann das System ultra-helle LEDs (wie solche erhältlich von Phillips Lumileds Lighting Co., San Jose, CA) von verschiedenen Farben verwenden, um Farbstoffe anzuregen, die an den Nukleinsäuren auf der Anordnung angebracht sind. Diese LEDs sind am kosteneffektivsten und haben eine längere Lebensdauer als gewöhnlich verwendete Gase oder Festphasenlaser. Andere Nicht-Laser-Lichtquellen wie beispielsweise Glühlichter oder fluoreszierende Lichter können auch verwendet werden.
  • 1 zeigt eine nützliche Konfiguration von LEDs, wobei das emittierte Licht auf einer Region oder Plattform konvergiert (z. B. geeignet zum Positionieren der Durchflusszelle oder der Probe). Jedoch können auch lineare Felder von LEDs verwendet werden.
  • Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung begrenzt ist auf bestimmte Lichtsammelmittel. Nur als Beispiel kann das System eine Hochsensitiv-CCD-Kamera verwenden (wie beispielsweise erhältlich von Roper Scientific, Inc., Photometric division, Tucson AZ oder solche erhältlich von Apogee Instruments, Roseville, CA), um Bilder von fluoreszierenden Farbstoffen aufzunehmen und Messungen ihrer Intensität durchzuführen. Die CCD-Kameras können auch gekühlt werden, um ihre Sensitivität für Signale auf niedrigem Niveau zu erhöhen. Diese können auch ein CMOS sein, Vidicon oder andere Typen von elektronischen Kamerasystemen.
  • Weil LED-Illuminationslicht nicht ein gerichteter Strahl wie der von Lasern ist, ist es eine angemessene Wahl zur Aufnahme eines Bildes eines größeren Bereichs von vielen Nukleinsäurepunkten. Um genügend Licht und damit Fluoreszenzsignale über einen größeren Bereich zu bekommen, muss das Gebiet, das von jedem Pixel der Kamera gesehen wird, von ausreichender Größe sein, um es genügend Fluoreszenzfarbstoff-Molekülen zu erlauben, ein ausreichendes Signal zu erzeugen (beispielsweise ein Apogee Ul3 CCD, das erhältlich ist als 1,3 Megapixel von 16 Mikrons in Größe, während das Apogee U 32 3,2 Megapixel hat von 6,8 Mikrons in Größe). Um die Kapazität und Effizienz zu erhöhen, sieht die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform vor, dass das System ein Zwei-Durchflusszellen-System ist (z. B. während ein Chip in einer ersten Durchflusszelle ein oder mehrere Reaktionsschritte durchläuft, wird ein zweiter Chip in einer zweiten Durchflusszelle abgerastert und ein Bild von ihm gemacht) mit einer einzelnen Kamera. In einer anderen Ausführungsform des bildgebenden Systems werden zwei Durchflusszellen und zwei Kameras eingesetzt (4).
  • In einer Ausführungsform wird der Chip, der die Anordnung von Nukleinsäure-Punkten enthält, in einer transparenten Durchflusszelle prozessiert, die in dem Instrument eingebaut ist, die Reagenzien an den Punkten vorbei fließen lässt und ein Signal produziert, das notwendig ist zum Sequenzieren (siehe 2A und 2B). In einer bevorzugten Ausführungsform bleibt der Chip in der Durchflusszelle, während von ihm mit einem LED-Detektor ein Bild gemacht wird. Die Durchflusszelle und die assoziierten Reagenzien geben die Nukleinsäuren, Enzyme, Puffer, etc. hinzu, die notwendig sind zum Produzieren des Fluoreszenzsignals, das für jeden Sequenzierschritt notwendig ist, wonach die Durchflusszelle die benötigten Reagenzien zur Verfügung stellt, um die Fluoreszenzsignale in Vorbereitung für den nächsten Zyklus zu entfernen. Die Messung durch den Detektor findet zwischen diesen beiden Schritten statt. Damit die Reaktionen stattfinden, müssen die Durchflusskanäle ausreichende Dimensionen haben. Beispielsweise sollte der Kanal bei dem Feld mindestens 0,1 mm an Tiefe aufweisen (weiterhin bevorzugt 0,5 mm in Tiefe) und das von dem Chip, dem Block und der Abdichtung geformte Volumen sollte mindestens 100 Mikroliter an Volumen sein (weiterhin bevorzugt, zwischen 100 und 700 Mikrolitern, und weiterhin bevorzugt zwischen 150 und 300 Mikrolitern, z. B. 200 Mikrolitern an Volumen).
  • Die Durchflusszelle ist bevorzugt bewegungslos (d. h. sie wird während der Reaktionen oder während des Bildaufnehmens nicht bewegt). Auf der anderen Seite kann die Durchflusszelle sofort auf einer drehbaren oder einer oder mehreren linearen Plattform montiert sein, die Bewegung erlaubt. Beispielsweise können in einer Ausführungsform mit zwei Durchflusszellen die zwei Durchflusszellen sich nach oben oder unten bewegen (oder von der einen Seite zur anderen) über das bildgebende System hinweg. Bewegung kann erwünscht sein, wo zusätzliche Prozesse erwünscht sind (z. B. wo Exposition an UV-Licht für die photochemischen Reaktionen innerhalb der Durchflusszelle gewünscht ist, wie beispielsweise das Entfernen von photospaltbaren Fluoreszenzmarkierungen), wenn multiple Durchflusszellen eine einzelne Kamera teilen, oder wenn das Sichtfeld des Detektionssystems kleiner als das gewünschte Gebiet ist, um auf der Durchflusszelle gemessen zu werden. Das Detektorsystem kann auch anstelle der Durchflusszelle bewegt werden.
  • Die Durchflusszelle ist bevorzugt in fluider Kommunikation mit einem Fluidik-System (siehe das illustrative System, das in 3 gezeigt ist). In einer Ausführungsform wird jede Flasche mit einem geringen positiven Gasdruck unter Druck gesetzt. Das Öffnen des geeigneten Ventils erlaubt Reagenz, von der Quellflasche durch die Durchflusszelle zu dem geeigneten Sammelgefäß(e) zu fließen. In einer Ausführungsform werden die Nukleotide und Polymerase-Lösungen in separaten Sammelflaschen zur Wiederverwendung in einem nachfolgenden Zyklus gesammelt. In einer Ausführungsform wird gefährlicher Abfall in einer separaten Sammel flasche aufgefangen. Die Konfiguration der Flasche und des Ventils erlauben es der Waschlösung, den gesamten Ventilzug des Systems und auch die Durchflusszelle durchzuspülen. In einer anderen Ausführungsform umfasst der Prozess die Schritte: 1) Durchspülen des Systems mit Waschreagenz, 2) Einführen der Nukleotide (z. B. Durchspülen eines Cocktails aus Nukleotiden) und Polymerase, 3) Durchspülen des Systems mit einem Waschreagenz, 4) Einführen von Deblockier-Reagenz (Enzyme oder Stoffe, die in der Lage sind, protektive Gruppen zu entfernen, um eine Extension der Nukleinsäure durch eine Polymerase zu erlauben), 5) Aufnehmen des Bildes, 6) Einführen eines Reagenzes, das Markierungsstoffe entfernt (Enzyme oder Stoffe, die in der Lage sind, fluoreszierende Markierungsstoffe zu entfernen), und 7) Durchspülen des Systems mit Waschreagenz.
  • Das System kann so gemacht werden, dass es ein Benutzer-Interfacesystem einschließt. Das Labview-System (National Instruments, Austin, TX) ist erhältlich und stellt eine relativ einfache Software für Computer-kontrollierte Systeme zur Verfügung. Galil Motion Control (Rocklin, CA) stellt Bewegungskontroll-Systeme zur Verfügung, die so eingerichtet werden können, dass sie das Instrument kontrollieren.
  • Beispiel: Verfahren zum Entfernen von Crosstalk zwischen detektierten Fluoreszenzsignalen für ein Multicolor-System. Die bisherigen Sequenziersysteme, die Laser benutzen, haben versucht die Zahl der Laser zu minimieren, um die Kosten zu reduzieren (beispielsweise ABI Prism Sequenzer). Für ein Vierfarben-Detektionssystem, das LEDs verwendet, sind die Lichtquellen verhältnismäßig preiswert, und es ist wünschenswert, vier separate Farblichtquellen zu haben, um den Crosstalk zwischen den Farben wie folgt zu reduzieren.
  • Um die wirklichen Fluoreszenz-Intensitäten für die vier Farben A, B, C und D von den gemessenen Detektor-Ausgangssignalen MA, MB, MC, MD in korrespondierenden Kanälen zu bestimmen, muss man alle Crosstalk-Faktoren kennen: RAB, RBA, RBC, RCB, RCD, RDC. Sechs Crosstalk-Faktoren werden für illustrative Zwecke verwendet. Es können auch mehr oder weniger Faktoren da sein, die in die Analyse mit eingebaut werden können.
  • Beispielsweise ist RAB das Verhältnis zwischen dem Teil des Signals in dem A-Kanal, der von dem B-Farbstoff kommt und der wirklichen Intensität des B-Farbstoffs. Wenn beispielsweise RAB 20% ist, dann wird der A-Kanal ein zusätzliches Signal haben, das gleich 2 Mal der wirklichen B-Farbstoff-Intensität in dem B-Kanal sein wird. Auf diese Weise ist für den Kanal B die beobachtete Messung, MB die direkte Messung von B und die zwei Anteile von den benachbarten Kanälen (falls vorhanden): MB = B + RBAA + RBCC (1)
  • Für die vier Kanäle kann dies in einer Matrixform geschrieben werden:
    Figure 00200001
    worin
  • Figure 00200002
  • Jeder dieser sechs Crosstalk-Faktoren kann durch ein einfaches Experiment mit reinen Farbstoffen bestimmt werden. Einige können Null sein und sie können in ihrer Intensität variieren, sodass wir eine Tabelle von einer Anzahl von Werten für jeden benötigen könnten abhängig von dem gemessenen Intensitätsbereich. Wir wollen für die tatsächlichen Fluoreszenzsignale A, B, C und D lösen, wobei die Detektormesswerte MA, MB, MC, MD gegeben sind. Auf diese Weise wollen wir die oben angegebene Matrixgleichung (2) lösen. Dies ist:
    Figure 00210001
    worin K–1 die Inverse der Matrix K ist. Obwohl dies in Form der sechs Crosstalk-Faktoren ausgeschrieben werden kann, ist es etwas komplex und wird am besten durchgeführt, indem die Zahlen in einen Computer eingegeben werden, und dieser das Inverse berechnet. 6 zeigt die Rohdaten (6A) und die Crosstalkangepassten Daten (6B) für vier illustrative Farbstoffe.
  • Zusammenfassung
  • Ein bildgebendes System zum Anregen und Messen von Fluoreszenz auf oder in Proben, die fluoreszierendes Material umfassen (z. B. fluoreszierende Markierungsstoffe, Farbstoffe oder Pigmente). In einer Ausführungsform wird eine Vorrichtung verwendet, um fluoreszierende Markierungsstoffe auf Nukleinsäure zu detektieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Vorrichtung so konfiguriert, dass fluoreszierende Markierungsstoffe in einer Mehrzahl von verschiedenen DNS-Vorlagen gleichzeitig detektiert werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - William A. Pratt mit dem Titel „Digital Imaging Processing”, 1978, John Wiley & Sons, Inc., New York [0008]
    • - Bruchez et al. (1998) Science, 281: 2013–2016 [0011]
    • - Warren and Nie (1998) Science, 281: 2016–2018 [0011]
    • - Hermanson, G. T., BIOCONJUGATE TECHNIQUES (Academic Press, San Diego, 1996) [0011]

Claims (11)

  1. Verfahren umfassend: a) Bereitstellen eines bildgebenden Systems, wobei das bildgebende System umfasst: i) eine Nicht-Laser-Lichtquelle, die so konfiguriert ist, dass das von dieser Quelle emittierte Licht einen Teil ii) einer Durchflusszelle beleuchtet, die eine Anordnung von Biomolekülen auf einer ersten Oberfläche umfasst, wobei die erste Oberfläche nach Innen zeigt, sodass in Lösung eingeführte Reagenzien die Biomoleküle kontaktieren können, iii) eine Linse, die so positioniert ist, dass sie mindestens einen Teil der sichtbaren Fluoreszenz sammelt; und iv) eine Kamera; b) Einführen einer Lösung in die Durchflusszelle, wobei die Lösung ein oder mehrere fluoreszierende Stoffe umfasst, unter solchen Bedingungen, dass mindestens ein Teil der fluoreszierenden Stoffe an mindestens einen Teil der Anordnung von Biomolekülen bindet, um behandelte Biomoleküle zu schaffen, und c) Aufnehmen eines Bildes der behandelten Biomoleküle mit dem bildgebenden System.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Durchflusszelle transparent ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Anordnung von Biomolekülen eine Anordnung von Nukleinsäure umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die fluoreszierenden Stoffe markierte Nukleotide umfassen.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Lösung von Schritt b) weiterhin eine Polymerase umfasst.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, weiterhin umfassend Rückgewinnen der markierten Nukleotide und Polymerase zur Wiederverwendung.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend vor dem Schritt c) Entfernen der Lösung von der Durchflusszelle.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Entfernen teilweise durch die Gravitation erreicht wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Durchflusszelle mit einem Fluidiksystem verbunden ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Fluidiksystem unter Druck ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Lösung in Schritt b) durch kontrolliertes Betätigen eines Ventils eingeführt wird.
DE112008000363.7T 2007-02-05 2008-01-30 Vorrichtung zur Detektion und ihre Verwendung Active DE112008000363B4 (de)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US89945407P 2007-02-05 2007-02-05
US60/899,454 2007-02-05
US2028408A 2008-01-25 2008-01-25
US12/020,284 2008-01-25
PCT/US2008/001208 WO2008097455A1 (en) 2007-02-05 2008-01-30 Detection device and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE112008000363T5 true DE112008000363T5 (de) 2010-05-12
DE112008000363B4 DE112008000363B4 (de) 2021-12-02

Family

ID=39682005

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE112008000363.7T Active DE112008000363B4 (de) 2007-02-05 2008-01-30 Vorrichtung zur Detektion und ihre Verwendung

Country Status (5)

Country Link
US (3) US8940481B2 (de)
CA (2) CA2891142C (de)
DE (1) DE112008000363B4 (de)
GB (1) GB2458855B (de)
WO (1) WO2008097455A1 (de)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2891142C (en) 2007-02-05 2018-10-09 Intelligent Bio-Systems, Inc. A method of nucleic acid sequencing comprising first and second flow cells
US11940413B2 (en) * 2007-02-05 2024-03-26 IsoPlexis Corporation Methods and devices for sequencing nucleic acids in smaller batches
EP2612200A4 (de) * 2010-09-01 2015-11-25 Spectral Instr Imaging Llc Erregung einer lichtquellenanordnung
US20130217596A1 (en) * 2012-02-16 2013-08-22 Intelligent Biosystems, Inc. Detection Device And Methods Of Use
ES2701750T3 (es) 2012-10-16 2019-02-25 Abbott Molecular Inc Procedimientos para secuenciar un ácido nucleico
US9146248B2 (en) 2013-03-14 2015-09-29 Intelligent Bio-Systems, Inc. Apparatus and methods for purging flow cells in nucleic acid sequencing instruments
US9591268B2 (en) 2013-03-15 2017-03-07 Qiagen Waltham, Inc. Flow cell alignment methods and systems
US10036013B2 (en) 2013-08-19 2018-07-31 Abbott Molecular Inc. Next-generation sequencing libraries
CA2996476A1 (en) 2015-09-01 2017-03-09 Qiagen Instruments Ag Systems and methods for color detection in high-throughput nucleic acid sequencing systems
US10733707B2 (en) 2015-12-10 2020-08-04 Qiagen Gmbh Method for determining the positions of a plurality of objects in a digital image
EP3387617B1 (de) 2015-12-10 2020-05-27 Qiagen GmbH Verfahren zur bestimmung der gesamthelligkeit von mindestens einem objekt in einem digitalen bild
EP3387613B1 (de) 2015-12-10 2020-07-01 QIAGEN GmbH Hintergrundkompensation
JP6832933B2 (ja) 2015-12-10 2021-02-24 キアゲン ゲーエムベーハー １つのデジタル画像の少なくとも一部分を別のデジタル画像の少なくとも一部分と整列させるための方法
CN108369734B (zh) 2015-12-10 2022-04-26 凯杰有限公司 数字图像中的对象分类方法、系统及计算机可读介质
US9962701B2 (en) 2015-12-28 2018-05-08 Qiagen Sciences, Llc Flowcells with microretainers and particle separators for discrete seeding microspots
US20170259262A1 (en) * 2016-03-09 2017-09-14 Intelligent Bio-Systems, Inc. Laminar fluidic separation in flowcells for minimal reagent usage
WO2018042251A1 (en) 2016-08-29 2018-03-08 Oslo Universitetssykehus Hf Chip-seq assays
EP3513376B1 (de) 2016-09-16 2020-11-04 QIAGEN GmbH Nachbareinflusskompensierung
EP3532963B1 (de) 2016-10-25 2024-01-03 QIAGEN GmbH Übersprechungskompensation
US10871440B2 (en) * 2017-12-23 2020-12-22 Lumacyte, LLC Microfluidic chip device for optical force measurements and cell imaging using microfluidic chip configuration and dynamics
EP3728107A4 (de) * 2017-12-23 2021-08-04 Lumacyte LLC Mikrofluidische chipvorrichtung für optische kraftmessungen und zellbildgebung mit mikrofluidischer chipkonfiguration und dynamik
US11041797B2 (en) * 2017-12-23 2021-06-22 Lumacyte, LLC Microfluidic chip device for optical force measurements and cell imaging using microfluidic chip configuration and dynamics
US10844430B2 (en) 2018-01-24 2020-11-24 Qiagen Sciences, Llc DNA sequencing reaction additive
US20210078003A1 (en) 2018-01-26 2021-03-18 Qiagen Gmbh Sequencing flowcells
CZ308044B6 (cs) * 2019-07-09 2019-11-13 Botanický ústav Akademie věd ČR, v.v.i. Mobilní zařízení pro nedestruktivní fluorescenční rozlišení, zobrazení a kvantifikaci mikroorganismů na povrchu materiálů

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE462408B (sv) 1988-11-10 1990-06-18 Pharmacia Ab Optiskt biosensorsystem utnyttjande ytplasmonresonans foer detektering av en specific biomolekyl, saett att kalibrera sensoranordningen samt saett att korrigera foer baslinjedrift i systemet
EP0834758B1 (de) 1994-07-01 1999-09-01 Jeffrey H. Price System zur kontinnierlichen räumlichen Abbildung für Abtastmikroskopie
JP2002503331A (ja) 1995-12-05 2002-01-29 ガメラ バイオサイエンス コーポレイション 機内に搭載された情報科学を備えた超微量液体素子工学システムにおいて液体移動を推進するために求心性加速を使用するための装置及び方法
US6558916B2 (en) * 1996-08-02 2003-05-06 Axiom Biotechnologies, Inc. Cell flow apparatus and method for real-time measurements of patient cellular responses
WO1998013683A1 (en) * 1996-09-26 1998-04-02 Sarnoff Corporation Massively parallel detection
US6097025A (en) * 1997-10-31 2000-08-01 Ljl Biosystems, Inc. Light detection device having an optical-path switching mechanism
US6999165B2 (en) * 1998-06-26 2006-02-14 Aspectrics, Inc. Method and apparatus for radiation analysis and encoder
AU3498900A (en) * 1999-02-23 2000-09-14 Caliper Technologies Corporation Sequencing by incorporation
EP1202803A2 (de) * 1999-12-22 2002-05-08 Gene Logic, Inc. Durchfluss-chip-kassette, chip-halter sowie system und verwendungsverfahren
US6566143B2 (en) * 2000-02-25 2003-05-20 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Multiple label fluorescence polarization assay system and method
US6586750B2 (en) * 2000-08-03 2003-07-01 Perlegen Sciences High performance substrate scanning
US6546758B1 (en) * 2000-08-16 2003-04-15 Alcatel Multi-chamber fiber cooling apparatus
US6545758B1 (en) 2000-08-17 2003-04-08 Perry Sandstrom Microarray detector and synthesizer
US6934408B2 (en) 2000-08-25 2005-08-23 Amnis Corporation Method and apparatus for reading reporter labeled beads
US7265833B2 (en) * 2001-07-25 2007-09-04 Applera Corporation Electrophoretic system with multi-notch filter and laser excitation source
US6856390B2 (en) 2001-07-25 2005-02-15 Applera Corporation Time-delay integration in electrophoretic detection systems
DE50211516D1 (de) 2002-03-18 2008-02-21 Ibidi Gmbh Probenträger mit integrierter Optik
WO2003091713A2 (en) * 2002-04-26 2003-11-06 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University System and method of measuring molecular interactions
WO2003100474A2 (en) * 2002-05-28 2003-12-04 Autogenomics, Inc. Microarray detector and methods
AU2003243945A1 (en) * 2002-06-24 2004-01-06 Sysmex Corporation Method of classifying and counting leucocytes
NL1021258C2 (nl) 2002-08-12 2004-02-17 Tno Werkwijze en inrichting voor het bepalen van het aantal levende cellen in een testvloeistof en toepassing daarvan.
CA2517566C (en) * 2002-11-29 2016-01-05 Zeev Smilansky Protein synthesis monitoring (psm)
US20050042639A1 (en) * 2002-12-20 2005-02-24 Caliper Life Sciences, Inc. Single molecule amplification and detection of DNA length
US7147362B2 (en) * 2003-10-15 2006-12-12 Agilent Technologies, Inc. Method of mixing by intermittent centrifugal force
AU2003284487A1 (en) * 2003-11-28 2005-06-17 Olympus Corporation Biosubstance testing apparatus and reaction stage thereof
US20050157299A1 (en) * 2004-01-15 2005-07-21 Heffelfinger David M. Optical analysis systems
US8105849B2 (en) 2004-02-27 2012-01-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements
JP2005295877A (ja) 2004-04-09 2005-10-27 Taiyo Yuden Co Ltd 核酸分析方法、分析装置及び分析用ディスク
US20060012793A1 (en) * 2004-07-19 2006-01-19 Helicos Biosciences Corporation Apparatus and methods for analyzing samples
KR100601964B1 (ko) * 2004-09-07 2006-07-19 삼성전자주식회사 다채널 다중 컬러 측정을 위한 광검출장치 및 이를 채용한다채널 시료 분석기
EP1787106A1 (de) * 2004-09-10 2007-05-23 Wallac Oy An die optische messung eines amplified luminescent proximity homogeneous assay angepasstes gerät und verfahren
KR100647317B1 (ko) * 2005-02-03 2006-11-23 삼성전자주식회사 다채널 형광 측정용 광학계 및 이를 채용한 다채널 형광시료 분석 장치
US20070131870A1 (en) 2005-12-12 2007-06-14 Combisep Multiplexed CE fluorescence system
US7813013B2 (en) * 2006-11-21 2010-10-12 Illumina, Inc. Hexagonal site line scanning method and system
US8481259B2 (en) * 2007-02-05 2013-07-09 Intelligent Bio-Systems, Inc. Methods and devices for sequencing nucleic acids in smaller batches
CA2891142C (en) * 2007-02-05 2018-10-09 Intelligent Bio-Systems, Inc. A method of nucleic acid sequencing comprising first and second flow cells
JP5305361B2 (ja) * 2007-05-04 2013-10-02 オプコ・ダイアグノスティクス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 流体コネクタおよびマイクロ流体システム
DE102007021544A1 (de) 2007-05-08 2008-11-13 Siemens Ag Messeinheit und Verfahren zur optischen Untersuchung einer Flüssigkeit auf eine Analytkonzentration
JP4509166B2 (ja) * 2007-11-02 2010-07-21 ソニー株式会社 微小粒子の測定方法、及び測定装置

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bruchez et al. (1998) Science, 281: 2013-2016
Hermanson, G. T., BIOCONJUGATE TECHNIQUES (Academic Press, San Diego, 1996)
Warren and Nie (1998) Science, 281: 2016-2018
William A. Pratt mit dem Titel "Digital Imaging Processing", 1978, John Wiley & Sons, Inc., New York

Also Published As

Publication number Publication date
DE112008000363B4 (de) 2021-12-02
CA2891142C (en) 2018-10-09
US20150159211A1 (en) 2015-06-11
WO2008097455A1 (en) 2008-08-14
CA2677216C (en) 2015-10-20
CA2891142A1 (en) 2008-08-14
US20160369337A1 (en) 2016-12-22
GB2458855A (en) 2009-10-07
GB0913585D0 (en) 2009-09-16
US20100152050A1 (en) 2010-06-17
US11371092B2 (en) 2022-06-28
CA2677216A1 (en) 2008-08-14
GB2458855B (en) 2011-06-08
US8940481B2 (en) 2015-01-27
US9828632B2 (en) 2017-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE112008000363B4 (de) Vorrichtung zur Detektion und ihre Verwendung
US11501544B2 (en) Deep learning-enabled portable imaging flow cytometer for label-free analysis of water samples
CN102023148B (zh) 荧光纳米显微方法
CN106461540B (zh) 发色团标记样本的自动成像的系统和方法
CN102792151B (zh) 用于2d和3d成像的超分辨率光流体显微镜
US20020146734A1 (en) Method and apparatus for labeling and analyzing cellular components
US20060275847A1 (en) Method for assessing biofilms
DE60014188T2 (de) Verfahren zum screening von chemischen verbindungen
Haustein et al. Trends in fluorescence imaging and related techniques to unravel biological information
Acuña-Rodriguez et al. Live-cell fluorescence spectral imaging as a data science challenge
CN105044066A (zh) 一种基于宽带受激辐射的纳米oct成像方法及系统
Gong et al. A fully water coupled oblique light-sheet microscope
US20130217596A1 (en) Detection Device And Methods Of Use
EP3977091A1 (de) Zytometriesystem zur hyperspektralen quantitativen bildgebung
EP4253942A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur optischen abbildung mit einer hohen anzahl von bildgebungsproben
EP4253941A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur optischen abbildung mit einer hohen anzahl von bildgebungsproben
RABHA et al. Affordable and Adaptable Oled Display Illumination for One-Shot Multimodal Imaging Both on Smartphone and Optical Microscope
Wang et al. SHy-Cam: a Single-shot Hyperspectral Phasor Camera for fast, multi-color fluorescence microscopy
Villegas et al. Photonic-chip: a multimodal imaging tool for histopathology
Villegas-Hernández et al. Photonic-chip: a multimodal imaging tool for histopathology
河野芳弘 Development of a darkfield internal reflection illumination (DIRI) microscopy for biomedical applications
Novak et al. Next Generation SICM Allows Nanoscale Imaging Of Biological Processes In Real-time
Kuehnemuth et al. Multiparameter Spectroscopy For Single-Molecule Fluorescence And Confocal Imaging
Mudrakola Dynamic Object Tracking (DOT) Microscopy To Image Endosomal Transport On Individual Microtubules In An Axon
Ram et al. Dual Objective Multifocal Plane Microscopy for Single Particle/Molecule Imaging Applications

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
R016 Response to examination communication
R081 Change of applicant/patentee

Owner name: QIAGEN SCIENCES, LLC (N.D.GES.D. STAATES DELAW, US

Free format text: FORMER OWNER: INTELLIGENT BIO-SYSTEMS, INC., WALTHAM, MASS., US

R082 Change of representative

Representative=s name: GLAWE DELFS MOLL PARTNERSCHAFT MBB VON PATENT-, DE

R016 Response to examination communication
R018 Grant decision by examination section/examining division
R020 Patent grant now final
R081 Change of applicant/patentee

Owner name: ISOPLEXIS CORP., BRANFORD, US

Free format text: FORMER OWNER: QIAGEN SCIENCES, LLC (N.D.GES.D. STAATES DELAWARE), GERMANTOWN, MD, US

R082 Change of representative

Representative=s name: GLAWE DELFS MOLL PARTNERSCHAFT MBB VON PATENT-, DE