DE1106453B

DE1106453B - Method for producing a cosynthetic factor

Info

Publication number: DE1106453B
Application number: DEA32280A
Authority: DE
Inventors: Jerry Robert Daniel Mccormick; Nancy Hazlett Arnold; Ursula Hirsch; Philip Andrew Miller; Newell Oscar Sjolander
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1958-06-20
Filing date: 1959-06-18
Publication date: 1961-05-10

Description

Verfahren zur Herstellung eines cosynthetischen Faktors Die Erfindung betrifft die Herstellung und Gewinnung einer neuen Substanz mit biologischer Wirksamkeit, die von verschiedenen Species des Genus Streptomyces gebildet wird. Die neue Substanz, die im folgenden als cosynthetischer Faktor-1 und an einigen Stellen als CF-1 bezeichnet wird, besitzt die Eigenschaft, die Bildung van Chlortetracyclin und weiterer Tetracyclinantibiotica in hohen Konzentrationen hervorzurufen, wenn sie bei einer Gärung mittels Stämmen von S. aurcofaciens zugesetzt wird, die nur geringe Mengen Chlortetracyclin erzeugen.Method of making a cosynthetic factor The invention concerns the production and extraction of a new substance with biological effectiveness, produced by various species of the genus Streptomyces. The new substance hereinafter referred to as cosynthetic factor-1 and in some places as CF-1 has the property of producing chlortetracycline and other tetracycline antibiotics in high concentrations when they are fermented by means of strains by S. aurcofaciens, which produce only small amounts of chlortetracycline.

So wurde festgestellt, daß bei Zugabe des cosynthetischen Faktors-1 zu einem beispielsweise mit S. aureofaciens-Stamm S 1308 (ATGC Nr. 12 748) beimpften Fermentationsmedium und Züchtung der Kultur unter üblichen aeroben Bedingungen die gebildete Chlortetracyclinmenge von etwa 100 bis 400 #tg/ml auf über 5000 #tg/ml gesteigert wird. In diesem Fall wird kein 5 a(11 a)-Dehydrotetracyclin mehr gebildet. Die Gründe, weshalb durch die Zugabe des cosynthetischen Faktors-1 bei der Fermentation eine derartig hohe Chlortetracyclinkonzentration gebildet wird, während bei der gleichen Fermentati.3n gewöhnlich nur minimale Chlortetracyclinrnengen entstehen, sind noch nicht geklärt, und es soll auch keine Theorie für diese Erscheinung angegeben werden. Es wird jedoch angenommen, daß CF-1 nicht als Precursor anzusehen ist, was sich daraus ergibt, daß die Zugabe von 1 fug CF-1 zu einer ausreichend-.n Menge von S. aureofaciens ATCC Nr. 12748 zu der Biosynthese von bis zu 57 mg Chlortetracydin mehr führt, als normalerweise unter den gleichen Bedingungen gebildet wird.It was found that when the cosynthetic factor-1 is added to a fermentation medium inoculated, for example, with S. aureofaciens strain S 1308 (ATGC No. 12 748) and the culture is grown under conventional aerobic conditions, the amount of chlorotetracycline formed is about 100 to 400% / ml is increased to over 5000 tg / ml. In this case, no more 5 a (11 a) -dehydrotetracycline is formed. The reasons why such a high concentration of chlorotetracycline is formed through the addition of cosynthetic factor-1 during fermentation, while the same fermentation usually produces only minimal amounts of chlorotetracycline, have not yet been clarified, and no theory should be given for this phenomenon will. It is believed, however, that CF-1 is not to be regarded as a precursor, as follows from the fact that the addition of 1 fug of CF-1 to a sufficient amount of S. aureofaciens ATCC No. 12748 for the biosynthesis of up to 57 mg of chlortetracydin more than is normally formed under the same conditions.

Die neue erfindungsgemäße Substanz besteht aus den Elementen Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff. Mit gereinigten Proben durchgeführte Elementaranalysen ergeben folgende Werte: Kohlenstoff 50,33%, Wasserstoff 5,00°/o, Stickstoff 12,18%, Sauerstoff (direkt) 32,58'%. Die Verbindung hat ein verhältnismäßig niedriges Nolekulargewicht von 340 bis 360. Die aus den Analysenwerten abgeleitete empirische Formel entspricht etwa C14-15 H17 N. 07. Das Produkt ist löslich in Wasser bei p$-Werten von über 6 und in Phenol. Es ist unlöslich in n-Butanol, Aceton, Äther und in Wasser bei px 1 bis 2.The new substance according to the invention consists of the elements carbon, Hydrogen, nitrogen and oxygen. Elemental analyzes carried out on cleaned samples result in the following values: carbon 50.33%, hydrogen 5.00%, nitrogen 12.18%, Oxygen (direct) 32.58%. The compound has a relatively low molecular weight from 340 to 360. The empirical formula derived from the analysis values corresponds to about C14-15 H17 N. 07. The product is soluble in water with p $ values of over 6 and in phenol. It is insoluble in n-butanol, acetone, ether and in water px 1 to 2.

Der cosynthetische Faktor-1 hat einen Rf-Wert von 0,07, wenn man das Papierchromatogramm mit n-Butanol-Wasser (1 :1) entwickelt und einen Rf-Wert von. 0,28 bis 0,35 hei der Entwicklung mit n-Butanöl-Essigsäure-Wasser (3 : 1 :4) und einen Rf-Wert von 0,30 bis 0,40 bei der Entwicklung mit Ammoniak-Wasser von pn 10. Die Chromatogramme werden bei 25° C unter Ve-wendung von Whatman-Papier Nr. 1 laufen gelassen, und die Gegenwart von CF-1 läßt sich durch seine charakteristische gelbgrüne Fluoreszenz unter ultraviolettem Licht feststellen.The cosynthetic factor-1 has an Rf value of 0.07 when you consider the Paper chromatogram developed with n-butanol-water (1: 1) and an Rf value of. 0.28 to 0.35 hot development with n-butane oil-acetic acid-water (3: 1: 4) and an Rf value of 0.30 to 0.40 when developing with ammonia water of pn 10. The chromatograms will run at 25 ° C using # 1 Whatman paper left, and the presence of CF-1 is indicated by its characteristic yellow-green Detect fluorescence under ultraviolet light.

Bei einer Gegenstromverteilung nach C r a i g mit 50 Rohren, Phenol-Chloroform (1 : 1) als organischer Phase und 0,1 n-HCl als wäßriger Phase, erscheint CF-1 als Einzelkomponente mit einer Spitzenkonzentration bei Rohr 31.With countercurrent distribution according to C r a i g with 50 tubes, phenol-chloroform (1: 1) as the organic phase and 0.1 n-HCl as the aqueous phase, CF-1 appears as Single component with a peak concentration at pipe 31.

Ein Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe der Verbindung, wie sie aus verdünnter Salzsäurelösung erhalten wird (Säure-Forrn), wird in üblicher Weise erhalten (Vermischen mit Kaliumbromidkristallen und Verpressen zu einer Scheibe). Die Säureform der Verbindung zeigt charakteristische Absorption im Infrarotgebiet des Spektrums bei den folgenden in Mikron angegebenen Wellenlängen: 2,84, 3,18, 3,35, 3,55, 5,91, 6,02, 6,27, 6,35, 6,49, 6,64, 6,72, 7,02, 7,18, 7,35, 7,49, 7,93, 8,16, 8,36, 8,69, 9,15, 9,30, 9,59, 9,77, 9,90, 10,11, 10,47, 11,40, 11,62, 11,81, 12,56, 12,83, 13,30, 14,48. Diese Infrarotkurve ist in der Fig.1 wiedergegeben.An infrared absorption spectrum of a sample of the compound, such as it from dilute hydrochloric acid solution (acid form) is obtained in the usual way obtained (mixing with potassium bromide crystals and pressing to form a disc). The acid form of the compound shows characteristic absorption in the infrared region of the spectrum at the following wavelengths in microns: 2.84, 3.18, 3.35, 3.55, 5.91, 6.02, 6.27, 6.35, 6.49, 6.64, 6.72, 7.02, 7.18, 7.35, 7, 49, 7.93, 8.16, 8.36, 8.69, 9.15, 9.30, 9.59, 9.77, 9.90, 10.11, 10.47, 11.40, 11.62, 11.81, 12.56, 12.83, 13.30, 14.48. This infrared curve is shown in FIG.

Die aus Ammoniumhydroxydlösung von PH 7 erhaltene Verbindung (\Teutralform) zeigt in einer Kaliumbromidscheibe charakteristische Absorption im Infrarotgebiet des Spektrums bei den folgenden in llikron angegebenen Wellenlängen: 3,12, 3,37, 3,55, 6,07, 6,33, 6,63, 7,00, 7,25, 7,-14, 7.88, 8,13, 8,35, 8,73, 9,25, 9,55, 9,63, 9,84, 10,28, 10,-12. 11,57, 11,75, 12,60, 12,96, 1-1,50. Diese Infrarotkurve ist in der Fig.2 wiedergegeben.The compound obtained from ammonium hydroxide solution of PH 7 (\ Teutralform) shows characteristic absorption in the infrared region in a potassium bromide disk of the spectrum at the following wavelengths in microns: 3.12, 3.37, 3.55, 6.07, 6.33, 6.63, 7.00, 7.25, 7, -14, 7.88, 8.13, 8.35, 8.73, 9.25, 9.55 , 9.63, 9.84, 10.28, 10, -12. 11.57, 11.75, 12.60, 12.96, 1-1.50. This infrared curve is shown in Fig.2.

Ein an einer Probe der Verbindung in 0,01 n-H Cl bei einer Konzentration von 10,7 f.g/ml bestimmtes Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt charakteristische Absorptionsmaxima bei 230, 250, 267 und 377 mu, denen folgende Extinktionskoeffizienten zugehören: (Ei m) = 1010, 580, 600 und 693. Diese U ltraviolettabsorptionskurve ist in der Fig. 3 wiedergegeben.An ultraviolet absorption spectrum determined on a sample of the compound in 0.01 nH Cl at a concentration of 10.7 fg / ml shows characteristic absorption maxima at 230, 250, 267 and 377 mu, to which the following extinction coefficients belong: (Ei m) = 1010, 580 , 600 and 693. This ultraviolet absorption curve is shown in FIG.

Ein an einer Probe derVerbindung in 0,01 n-N H¢ O H tnit einer Konzentration von 10,7 #tg/ml bestimmtes Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt charakteristische Absorptionsmaxima bei 2-18, 268, 295 und 419 m[t" denen folgende Extinktionskoeffizienten zugehören: (Ei ä) = 972, 684, 349 und 1215. Diese Kurve ist in der Fig. 4 wiedergegeben.One on a sample of the compound in 0.01 n-N H [O H] at a concentration Ultraviolet absorption spectrum determined from 10.7 # tg / ml shows characteristic Absorption maxima at 2-18, 268, 295 and 419 m [t "which have the following extinction coefficients belong to: (Ei ä) = 972, 684, 349 and 1215. This curve is shown in FIG.

Wie aus den weiter unten angegebenen Beispielen hervorgeht, wird der neue cosynthetische Faktor-1 von verschiedenen Organismen des Genus Streptomyces erzeugt, was sich aus der Förderung der Tetracyclinerzeugung ergibt, die eintritt, wenn derartige Gärmaischen zu einem Fermentationsmedium zugesetzt werden, das mit einer 5 a(11 a) -Dehydrotetracyclin erzeugenden Kultur von S. aureofaciens, z. B. des ATCC-Stamms 12 748, beimpft ist. Alle diese Organismen sind Species des Genus Streptomyces. Die folgenden Species von Mikroorganismen können mit Erfolg zur Erzeugung des cosynthetischen Faktors-1 verwendet werden. Der Vitamin-BR erzeugende S. albus ; S. rimosus, S. platensis und S. hygroscopicus, die- alle Oxytetracyclin bilden; die angeblich neue Species S.viridifaciens, die Chlortetracyclin und Tetracyclin erzeugt; der Chlortetracyclin und TetracYclin erzeugende S. aureofaciens; der Streptomycin erzeugende S. griseus und der Puromycin erzeugende S. albo-niger.As can be seen from the examples below, the new cosynthetic factor-1 from various organisms of the genus Streptomyces produces what results from the promotion of tetracycline production that occurs if such fermentation mashes are added to a fermentation medium that is mixed with a 5 a (11 a) dehydrotetracycline producing culture of S. aureofaciens, e.g. B. of ATCC strain 12,748. All of these organisms are species of genus Streptomyces. The following species of microorganisms can be successfully generated of the cosynthetic factor-1 can be used. The vitamin BR producing S. albus ; S. rimosus, S. platensis and S. hygroscopicus, all of which produce oxytetracycline; the supposedly new species S. viridifaciens, the chlortetracycline and tetracycline generated; the chlortetracycline and tetracycline producing S. aureofaciens; the streptomycin producing S. griseus and the puromycin producing S. albo-niger.

Der erfindungsgemäß für die Erzeugung des cosynthetischen Faktors-1 bevorzugt verwendete Organismus ist ein neuer Stamn: von S. aureofaciens. der W-5 genannt wird, da er die Fähigkeit besitzt, größere Mengen dieser neuen Substanz zu bilden.According to the invention for the generation of cosynthetic factor-1 The preferred organism is a new strain: from S. aureofaciens. the W-5 is called because it has the ability to process larger amounts of this new substance to build.

Der neue Stamm ist ein Mitglied der Species S. aureofaciens, da er ein direkter Abkömmling des Chlortetracyclin erzeugenden Stamms von S. aureofaciens A 377 ist, der aus einer Bodenprobe isoliert und in der USA.-Patentschrift 2 482 055 beschrieben wurde und dessen Kultur bei den Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, unter der Bezeichnung NRRL 2209 hinterlegt ist. Als mutagene und selektive Mittel für die Gewinnung dieses neuen Stamms wurden unter anderen verwendet: Ultraviolettbestrahlung, Behandlungen mit Nikotin und Stickstofflost und Einvirkung vor. Phagen. CF-1 kann von praktisch allen Stämmen von S. aureofaciens, von anderen Streptomycesstämmen sowie von anderen Mikroorganismen und von Mutanten dieser Stämme erzeugt werden. Die zur Untersuchung neuer Stämme auf ihr CF-1-Bildungsvermögen angewandte Methode ist in den Beispielen angegeben.The new strain is a member of the species S. aureofaciens since it a direct descendant of the chlortetracycline producing strain of S. aureofaciens A 377 which is isolated from a soil sample and is described in U.S. Patent 2,482 055 and its culture at Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, under the designation NRRL 2209. As mutagenic and selective means for obtaining this new strain have been used among others: Ultraviolet radiation, treatments with nicotine and nitrogen mustard and exposure before. Phages. CF-1 can be obtained from virtually all strains of S. aureofaciens, from others Streptomyces strains as well as from other microorganisms and from mutants of these strains be generated. To examine new strains for their ability to produce CF-1 method used is indicated in the examples.

Der für die Erzeugung der neuen Substanz bevorzugte neue Stamm besitzt die gleichen allgemeinen Charakteristika wie die die Tetracycline erzeugenden Stämme und unterscheidet sich von diesen in der gleichen allgemeinen Weise, wie sich die Tetracyclin und Chlortetracyclin erzeugenden Stämme von S. aureofaciens untereinander unterscheiden, wie dies in einer Anzahl wissenschaftlicher Veröffentlichungen beschrieben worden ist. Die im folgenden aufgeführten Daten dienen zur Erläuterung der Abweichungen des Stamms W-5 von dem ursprünglichen als IINIRRL 2209 erhältlichen Stamm A 377. Differenzierung von Streptomyces-aureofaciens-Stamm W-@ und Streptomyces-aureofaciens-Stamm A377 (I\TRRL2209) durch Beobachtung der Wachstumscharakteristika auf verschiedenen Mediei nach Bebrütung bei 26,5° C 1. Glycerin-Asparagin-Fleischextrakt-Agar Glycerin ........................................ 1,(% L-Asparagin ..................................... 0,(5% Fleischextrakt ................................... 0,:% K H2 P O4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,(51/o Bacto-Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.; 0/0 Destilliertes Wasser, q. s. . .. .. . . . . . . . . .. . . .. . . . . . 100,e0/0 Einstellung mit 500/0 K O H auf pg . . . . . . . . . . . . . . . 7,( px nach Sterilisation . .... .. . . .. . . .. .... .. . . . . . . . . 7'! Streptomyces aureofaciens Stamm W-5 Stamm A 377 Wachstum normal bis gut, hyalin bis semiopak,@ gut weiß Lufthyphen spärlich bis mäßig, weiß schwach bis normal, weiß bis hellgrau Sporulation spärlich, dunkelgrau hellgrau Diffundierbares Pigment keines I hellgelb Unterseite weiß, semiopak ,I gelb bis hell orangegelb 2. Dextrin-Czapek-Dox-Agar Dextrin ........................................ 1,0o/0 Na N 0a ....................................... 0,20% Fit H P 04 ........... ' .......................... 0,10/0 M9 S 04 ' 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,050/0 K C1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 II/o Fe S 04 ' 7 H2 O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0010/0 Bacto-Agar .................................... 1,50/0 Destilliertes Wasser, q. s. ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100,0% pH nach Sterilisation ............................ 7,2 Streptomyces aureofaciens Stamm W-5 1 Stamm A 377 Wachstum sehr dünn, klar hyalin bis durch- gut scheinend weiß Lufthyphen keine reichlich, mausgraue bis bleigraue, wasserhelle Oberflächenkügelchen Sporulation keine überreich Diffundierbares Pigment keines Spur, blaßgelb Unterseite klar hyalin bis durchscheinend weiß I kein Pigment, Spur rosa 1 Color Harmony Manual, 3. Auflage, Container Corporation of America. 3. AP 4-Maisquell-Agar Maisquell ...................................... 0,40/0 Saccharose ..................................... 1,00/0 Mg S 04 - 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0250/0 K H2P 04 ...................................... 0,2'% (N H4) 2 H P 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 °/o Bacto-Agar .................................... 2,0% Leitungswasser, q. s. . . . .. .. .. . . . . .. .. .. ...... .. . 100,0% pH nach Sterilisation ........................... 6,5 Streptomyces aureofaciens Stamm W-5 I Stamm A 377 Wachstum ausgezeichnet, weiß ausgezeichnet Lufthyphen überreich reichlich, rehfarben 1 Sporulation überreich, silbergraue bis beigegraue überreich gleichmäßig Diffundierbares Pigment keines hellgelb bis Bernstein Unterseite weiß bis Biber 1 bis Schokolade e hellederbraun 1 1 Color Harmony Manual, 3. Auflage, Container Corporation of America. 4. Andere Medien Medium Streptomyces aureofaciens Stamm W-5 I Stamm A 377 Nähr-Agar Semiopake weiße Wachstums Foki auf Gutes Wachstum, keine Lufthyphen. dünnem farblosem hyalinem Wachs- Unterseite: blaßgelb. Blaßgelbes lös- tum. Kein Luftmycel. Unterseite: klar liches Pigment. hyalin bis weiß. Keine löslichen Pigmente. Glucose-Asparagin-Fleisch Normales Wachstum: klar hyalin bis Gutes Wachstum. Lufthyphen weiß, die durchscheinend weiß. Kein bis spär- mit zunehmender Sporenbildung zu- liches Luftmycel : weiß bis Biber e. nehmend grau werden. Unterseite: Spärliche Sporulation. Unterseite: Hellgelb bis rosaorange. Spur: gelb- farblos bis weiß. Kein lösliches oranges lösliches Pigment. Pigment. 1 Color Harmony Manual, 3. Auflage, Container Corporation of America. Medium Streptomyces aureofaciens Stamm W-5 @ Stamm A 377 I AP 6-Maisquell-Agar2 Ausgezeichnetes Wachstum: weiß. Luft- Ausgezeichnetes Wachstum. Überreich- mycel; mäßig bis reichlich, silber- liches Luftmycel. Überreiche Sporu- graul. Mäßige bis reichliche Sporu- Tation: rehfarbenl. Unterseite: leder- lation. Unterseite: weiß bis biberl. farbeng. Hellbernsteinfarbenes lös- Kein lösliches Pigment. liches Pigment. Waksman's Agar Gutes Wachstum; weiß bis hellgelbe. ( Gutes Wachstum. Lufthyphen normal, Luftmycel: normal bis gut, weiß, das ' reichlich werdend: weiß bis taupe- biberl bis aschfarben' wird. Nor- braun e. Unterseite:Kamelhaarfarben e male Sporulation. Unterseite: hell- bis lehmziegelbraun 1. Hellgelbes lös- gelb' bis rosataupefarben' bis taupe- liches Pigment. farbenbraun'. Gelbes bis Bernstein- ; farbenes lösliches Pigment. Kartoffelschrägen Ausgezeichnetes,glattes,feuchtes,knoten- ' Überreiches, feuchtes, glattes, knoten- bildendes Wachstum: hellrehfarbene bildendes Wachstum: hellbraungelbe bis kupferbraun' bis ziegelrote. Kein bis beigel bis Cederfarbene. Kein Luftmycel. Hellrehfarbenes e lösliches lösliches Pigment. Pigment. Purpurmilch Schwacher, aber deutlicher Wachstums- Schwacher weißer bis blaßgelber Wachs- kragen, wenig signifikante pH-Ver- tumskragen. Wenig signifikante pH- änderung. Keine sichtbare Peptoni- Veränderung, noch sichtbare Pepto- sation in 14 Tagen. nisation in 14 Tagen. ' Color Harmony Manual, 3. Auflage, Container Corporation of America. = AP 6-Agar Saccharose .......................................... 1,0% Mg S 04 # 7 H.2 O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,025% K H2P 04 ........................................... 0,2% (N H2)3 P 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2% Maisquell ........................................... 0,6% Bacto-Agar (gereinigt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,00/0 H20 q.s. ........................................... 100,0 5. Mikroskopische Beobachtungen Streptomyces aureofaciens Medium Stamm W-5 Stamm A 377 Mycel I Sporen Mycel i Sporen lilvcerin- gekrümmt, konti- Spheroidal bis ovoidal gekrümmt, konti- Spheroidal bis ovoidal Asparagin- nuierlich verzweigt (@ 0,5 bis 1,0 u nuierlich verzweigt ; 1,2 bis 1,5 u Fleischextrakt- rfi 0,5 bis 1,0 u 1,0 bis 1,2 u Agar AP-4-1laisquell- gekrümmt, Konti- Spheroidal bis ovoidal gekrümmt, konti- Spheroidal bis ovoidal Agar nuierlich verzweigt 0,5 bis 1,0, u nuierlich verzweigt 1,2 bis 1,5 u " fi 0,5 bis 1,0 u 0,8 bis 1,0 u Waksman's gekrümmt, konti- I Spheroidal bis ovoidal gekrümmt, konti- Spheroidal bis ovoidal Agar nuierlich verzweigt 0,5 bis 1,0 @. nuierlich verzweigt j 0,5 bis 1.0 u 0,5 bis 1,0 u 0,5 bis 1,01 u Durchmesser. Mycel- und Sporeiimorphologie von Streptomycesatereofaciens-Stamm W-5 entspricht offenbar der des ursprünglichen Stamms A 377.The new strain preferred for the production of the new substance has the same general characteristics as the tetracycline producing strains and differs therefrom in the same general way that the tetracycline and chlortetracycline producing strains of S. aureofaciens differ from one another, as shown in FIG has been described in a number of scientific publications. The data listed below serve to explain the deviations of the strain W-5 from the original strain A 377 available as IINIRRL 2209. Differentiation of Streptomyces aureofaciens strain W- @ and Streptomyces aureofaciens strain A377 (I \ TRRL2209) by observation the growth characteristics on different media after incubation at 26.5 ° C 1. Glycerine-Asparagine-Meat Extract-Agar Glycerine ........................... ............. 1, (% L-asparagine .............................. ....... 0, (5% meat extract ................................... 0, :% K H2 P O4.......................................... 0, (51 / o Bacto agar....................................... 1 .; 0/0 Distilled water, qs. .. ........... .... ....... 100, e0 / 0 Setting with 500/0 KOH to pg.............. ... 7, (px after sterilization. .... .... .... .. .... ........... 7 '! Streptomyces aureofaciens Strain W-5 strain A 377 Growth normal to good, hyaline to semi-opaque, @ good White Aerial hyphae scanty to moderate, white weak to normal, white to light gray Sporulation sparse, dark gray light gray Diffusible pigment none I light yellow Underside white, semi-opaque, I yellow to light orange-yellow 2. Dextrin Czapek Dox Agar Dextrin ........................................ 1.0o / 0 Na N 0a ....................................... 0.20% Fit HP 04 ........... '.......................... 0.10 / 0 M9 S 04 '7 H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.050 / 0 K C1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.05 II / o Fe S 04 '7 H2 O. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.0010 / 0 Bacto agar .................................... 1.50 / 0 Distilled water, qs .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100.0% pH after sterilization ............................ 7.2 Streptomyces aureofaciens Strain W-5 1 strain A 377 Growth very thin, clearly hyaline to thoroughly good seemingly white Aerial hyphae none plentiful, mouse-gray to lead-gray, water-white surface spheres Sporulation not excessive No trace of diffusible pigment, pale yellow Underside clear hyaline to translucent white I no pigment, trace pink 1 Color Harmony Manual, 3rd Edition, Container Corporation of America. 3. AP 4-corn swell agar corn swell ...................................... 0.40 / 0 sucrose ..................................... 1.00 / 0 Mg S 04 - 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.0250 / 0 K H2P 04 ...................................... 0.2 ' % (N H4) 2 HP 04. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.2% Bacto agar .................................... 2.0% tap water , qs. . . .. .. ... . . . .. .. .. ...... ... 100.0% pH after sterilization ........................... 6.5 Streptomyces aureofaciens Strain W-5 I strain A 377 Excellent growth, excellent white Aerial hyphae abundant abundant, fawn-colored 1 Sporulation over abundant, silver-gray to beige-gray over abundant evenly Diffusible pigment none light yellow to amber Underside white to beaver 1 to chocolate e light brown 1 1 Color Harmony Manual, 3rd Edition, Container Corporation of America. 4. Other media Medium Streptomyces aureofaciens Strain W-5 I strain A 377 Nutrient Agar Semiopake White Growth Focuses on good growth, no aerial hyphae. thin, colorless hyaline wax- underside: pale yellow. Pale yellow soluble tum. No aerial mycelium. Underside: clear pigment. hyaline to white. Not soluble Pigments. Glucose-Asparagine-Meat Normal growth: clear hyaline to good growth. Aerial hyphae knows that translucent white. No to sparse with increasing spore formation aerial mycelium: white to beaver e. becoming gray. Bottom: Sparse sporulation. Underside: light yellow to pinkish orange. Trace: yellow colorless to white. No soluble orange soluble pigment. Pigment. 1 Color Harmony Manual, 3rd Edition, Container Corporation of America. Medium Streptomyces aureofaciens Strain W-5 @ Strain A 377 I. AP 6-Corn Stain Agar2 Excellent growth: white. Air- Excellent growth. Overreach mycelium; moderate to abundant, silvery aerial mycelium. Hand over Sporu- gray. Moderate to profuse sporulation: fawn-colored. Bottom: leather lation. Underside: white to beaver. colored Light amber colored No soluble pigment. pigment. Waksman's Agar Good Growth; white to light yellow. (Good growth. Air hyphae normal, Aerial mycelium: normal to good, white, that 'becoming abundant: white to taupe- beaver to ash-colored '. Norbraun e. Underside: camel hair colors e male sporulation. Underside: light to adobe brown 1. yellow 'to pinkish mauve' to taupe pigment. color brown '. Yellow to Amber; colored soluble pigment. Potato slants Excellent, smooth, moist, knot- 'Over-rich, moist, smooth, knot- Formative growth: light turning colored, formative growth: light brown-yellow to copper-brown to brick-red. None to medium to cedar colored. No Aerial mycelium. Light red-colored soluble soluble pigment. Pigment. Purple milk weak but clear growth - weak white to pale yellow wax - collar, little significant pH value collar. Little significant pH modification. No visible peptonic change, still visible peptonic sation in 14 days. nization in 14 days. 'Color Harmony Manual, 3rd Edition, Container Corporation of America. = AP 6 agar sucrose .......................................... 1, 0% Mg S 04 # 7 H.2 O. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.025% K H2P 04 ........................................... 0, 2% (N H2) 3 P 04. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.2% corn swell ........................................... 0, 6% Bacto agar (purified). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.00 / 0 H20 qs ........................................... 100.0 5. Microscopic observations Streptomyces aureofaciens Medium strain W-5 strain A 377 Mycelium i spores mycelium i spores lilvcerin- curved, conti- spheroidal to ovoidal curved, conti- spheroidal to ovoidal Asparagine- nuely branched (@ 0.5 to 1.0 u nuously branched; 1.2 to 1.5 u Meat extract rfi 0.5 to 1.0 u 1.0 to 1.2 u Agar AP-4-1laisquell- curved, conti- spheroidal to ovoidal curved, conti- spheroidal to ovoidal Agar branched 0.5 to 1.0, branched 1.2 to 1.5 u "fi 0.5 to 1.0 u 0.8 to 1.0 u Waksman's curved, conti- I spheroidal to ovoidal curved, conti- spheroidal to ovoidal Agar branched 0.5 to 1.0 @. nuierlich branches j 0.5 to 1.0 u 0.5 to 1.0 u 0.5 to 1.01 u Diameter. The mycelial and spore egg morphology of Streptomycesatereofaciens strain W-5 appears to be the same as that of the original strain A 377.

Lebensfähige Kulturen von S. aureofaciens-Stamm W-5, die den cosynthetischen Faktor-1 erzeugen, wurden bei der American Type Culture Collection in @Z'ashington DC. hinterlegt, wo dieser Stamm die ATCC-Eingangs-Nr. 13 190 erhalten hat.Viable cultures of S. aureofaciens strain W-5 harboring the cosynthetic Factor-1 producing have been obtained from the American Type Culture Collection at @ Z'ashington DC. stored, where this trunk has the ATCC entry no. 13 190 received.

Die Bedingungen für Fermentationen mit dem neuen Stamm von Streptomvces aureofaciens sind ganz allgemein die gleichen wie diejenigen, die zur Zeit für die Züchtung anderer S. aureofaciens-Stämme angewandt werden. Das Fermentationsmedium enthält die üblichen Nährstoffe und essentiellen Mineralstoffe.The conditions for fermentations with the new strain of Streptomvces aureofaciens are broadly the same as those currently used for the Breeding of other S. aureofaciens strains can be used. The fermentation medium contains the usual nutrients and essential minerals.

Zu geeigneten, die erforderlichen Nährstoffe liefernden Substanzen gehören Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Glukose, Melasse, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Hefe, Fleischextrakte, Pepton, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Maisquellwasser, distillers solubles, Fischmehl und andere übliche Stoffe. Zu den verwendbaren anorganischen Salzen gehören unter anderem Calciumcarbonat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid sowie die verschiedenen Spurenelemente, z. B. Mangan, Kobalt, Zink, Kupfer und Eisen. Die CF-1 erzeugende Kultur, z. B. der neue oben beschriebene Stamm, wird aerob in einem geeigneten Medium für das Inokulum gezüchtet. Das Inokulum wird dann in ein geeignetes Fermentationsmedium übergeführt und weitergezüchtet, und die Gärung wird bei einer Temperatur von etwa 22 bis 32° C zwischen 48 und 168 Stunden auf einer Rundschüttelvorrichtung geführt. Während der Gärung wird der PH-Wert gewöhnlich zwischen 5,5 und 7,5 gehalten. Nach Abschluß der Gärung liegt der pA Wert der Maische gewöhnlich zwischen 6 und 7. Die Maische wird dann ohne p$ Wert-Einstellung filtriert. Der CF-1 kann dann auf beliebige geeignete Weise extrahiert, isoliert und gereinigt werden.To suitable substances that provide the necessary nutrients include starch, dextrin, cane sugar, glucose, molasses, soybean meal, peanut meal, Yeast, meat extracts, peptone, ammonium sulfate, urea, corn steep liquor, distillers solubles, fish meal and other common substances. Among the usable inorganic Salts include calcium carbonate, ammonium sulfate, and ammonium chloride as well the various trace elements, e.g. B. manganese, cobalt, zinc, copper and iron. the CF-1 producing culture, e.g. B. the new strain described above, becomes aerobic in one grown in a suitable medium for the inoculum. The inoculum is then placed in a suitable Fermentation medium transferred and cultivated, and the fermentation is at a Temperature of about 22 to 32 ° C between 48 and 168 hours on a rotary shaker guided. During fermentation, the pH is usually kept between 5.5 and 7.5. After fermentation is complete, the pA value of the mash is usually between 6 and 7. The mash is then filtered without adjusting the p $ value. The CF-1 can then extracted, isolated and purified in any suitable manner.

Bei einem bevorzugten Extraktionsverfahren wird zunächst die Maische bei dem herrschenden pH Wert (6 bis 7) filtriert, dann der pH-Wert des Filtrats mit Ammoniumhydroxyd auf 8 bis 9 eingestellt und das Filtrat mit Ammoniumsulfat gesättigt. Nach Zugabe eines geeigneten Trägers, z. B. Arquad 16 eines Alkyltrimetl-iylammoniumchlorids, dessen Alkylgruppen zu 90% Hexadecylreste, zu 6% Octadecylreste und zu 4% Octadecenylreste sind, wird das Gemisch mit einem niederen Alkanol, z. B. n-Butanol, extrahiert. Dieser Alkanolextrakt wird dann mit konzentrierter Salzsäure auf pH 1,5 bis 2,0 eingestellt und wiederum mit Wasser extrahiert. Die den CF-1 enthaltende wäßrige Phase wird dann unter vermindertem Druck eingeengt. Das wäßrige Konzentrat wird in üblicher Weise an Diatomeenerde chromatographiert, wobei man die Säule mit einer gepufferten n-Butano-llösung entwickelt. Die an CF-1 reichen Fraktionen werden dann mit Wasser extrahiert, und der wäßrige Extrakt wird im Vakuum eingeengt und an einer Säule mit Florisil chromatographiert. Florisil ist ein, aktiviertes Magnesiumsilikat von etwa folgender Zusammensetzung: M-0 15,5%, ±0,50/0, SiO2 84,0%, ±0,5% und Na.@ S O4 0,5%. Der CF-1 wird mit eine kleine Menge Wasser enthaltendem Methylalkohol aus der Florisilsäule eluiert. Die an CF-1 reichen Fraktionen werden eingeengt, mit Salzsäure auf pg 1 eingestellt und filtriert. Das Filtrat wird abgekühlt und angeimpft. Die gebildeten CF-1-Kristalle werden abfiltriert, gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt kann in üblicher Weise durch Umkristallisieren aus 0,1 n-HCl gereinigt werden.In a preferred extraction process, the mash is first at the prevailing pH (6 to 7) filtered, then the pH of the filtrate adjusted to 8 to 9 with ammonium hydroxide and the filtrate with ammonium sulfate saturated. After adding a suitable carrier, e.g. B. Arquad 16 of an Alkyltrimetl-iylammoniumchlorids, 90% of its alkyl groups are hexadecyl groups, 6% octadecyl groups and 4% octadecenyl groups the mixture is made with a lower alkanol, e.g. B. n-butanol extracted. This alkanol extract is then brought to pH 1.5 to 2.0 with concentrated hydrochloric acid set and again extracted with water. The aqueous one containing the CF-1 Phase is then concentrated under reduced pressure. The aqueous concentrate is chromatographed in the usual way on diatomaceous earth, the column with a buffered n-butano-oil solution. The fractions rich in CF-1 are then extracted with water, and the aqueous extract is concentrated in vacuo and on a Column chromatographed with Florisil. Florisil is an activated magnesium silicate of approximately the following composition: M-0 15.5%, ± 0.50 / 0, SiO2 84.0%, ± 0.5% and Na. @ S O4 0.5%. The CF-1 is made with methyl alcohol containing a small amount of water eluted from the Florisil column. The fractions rich in CF-1 are concentrated, adjusted to pg 1 with hydrochloric acid and filtered. The filtrate is cooled and inoculated. The CF-1 crystals formed are filtered off, washed and in vacuo dried. The crude product can in the usual way by recrystallization from 0.1 n-HCl.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Bereitung des Inokulums Ein typisches für die Züchtung des primären Inokulums verwendetes Medium wird nach folgender Vorschrift bereitet: Saccharose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30,0 g Maisquellwasser . . . . . . . . . . . . . .. 16,5 ml Ammoniumsulfat . . . . . . . . . . . . . . 2,0 g Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . 7,0 g Wasser auf .................... 1000 ml Anteile dieses Mediums von jeweils 8 ml werden in eine Reihe von 20 cm (8 inch) Reagenzgläsern eingebracht und 20 Minuten unter einem Druck von etwa 1 atü im Autoklax sterilisiert. Sporen des Stamms S. aureofaciens W-5 werden mit sterilem destilliertem Wasser von einem Schrägagar weggewaschen, wobei eine Suspension erhalten wird, die etwa 60 - 100 Sporen je Milliliter enthält. 0,33 ml dieser Suspension werden zur Beimpfung eines jeden der 8 ml des oben beschriebenen Mediums enthaltenden Reagenzgläser verwendet. Das -beimpfte Schüttelrohr wird dann 24 Stunden bei 28° C auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung bei 116 Schwingungen je Minute inkubiert.The following examples illustrate the invention. Preparation of the inoculum A typical medium used to grow the primary inoculum is described in prepared according to the following instructions: sucrose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30.0 g corn steep liquor. . . . . . . . . . . . . .. 16.5 ml of ammonium sulfate. . . . . . . . . . . . . . 2.0 g calcium carbonate. . . . . . . . . . . . . . . 7.0 g water to .................... 1000 ml portions of this medium of 8 ml each are placed in a series of 20 cm (8 inch) test tubes and 20 minutes sterilized in an autoclave under a pressure of about 1 atm. Spores of the S. aureofaciens W-5 are washed away from an agar slant with sterile distilled water, whereby a suspension is obtained which contains about 60-100 spores per milliliter. 0.33 ml of this suspension is used to inoculate each of the 8 ml of the above Medium containing test tubes used. The -inoculated shaker tube is then 24 hours at 28 ° C on a shaker with a reciprocating motion 116 vibrations per minute incubated.

Fermentation Ein Fermantationsmedium wird nach folgender Vorschrift bereitet: (NH4)2S04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g CaC03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9,0 g N H4C1 ... ..................... 1,5 g Mg C12 . 6 H2 O . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 g FeS04-7H20 ................. 0,06g Mn S O4 # 4 H2 O . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 g C O C12 . 6 H2 O . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,005 g Zn S O4 - 7 H2 O . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g Maisquellwasser . . . . . . . . . . . . . . . . 25,0 g Baumwollsamenmehl . . . . . . . . . . . . 2,0 g Maisstärke ...................... 55,0 g Wasser auf ..................... 1000 ml Jeweils 25 ml des Mediums werden in 250-ml-Erlenmeyer-Kolben eingebracht und mit jeweils 0,5 ml Schmalzöl versetzt. Die das Fermentationsmedium und das Schmalzöl enthaltenden Kolben werden in einem Autoklav 20 Minuten unter einem Druck von etwa 1 atü sterilisiert. Nach der Sterilisation und dem Abkühlen wird 1 ml des nach Beispiel 1 bereiteten Inokulums zu jedem Kolben zugesetzt und die Fermentation auf einer Rundschüttelv orrichtung mit 180 Umdrehungen je Minute bei 25° C 120 Stunden geführt. Die Gehaltsprüfung der Maische ergibt 1 #tg cosynthetischem Faktors-1 je Milliliter. Extraktion aus der Gesamtmaische 2001 einer Gärmaische, die in einem halbtechnischen Fermentationstank mittels des CF-1 erzeugenden Stamms von S. aureofaciens W-5 in dem im Beispiel 2 beschriebenen Medium bereitet wurde und 1 gg CF-1 je Milliliter enthält, werden bei einem PH-Wert von 6 bis 7 unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflosupercel, Diatomeenerde) in einer Menge von etwa 15% des Maischevolumens filtriert. Der Filterkuchen wird mit so viel Wasser gewaschen, daß das Gesamtvolumen des vereinigten neutralen Filtrats dem Volumen der Ausgangsmaische gleich ist. Die CF-1-Wirksamkeit des vereinigten neutralen Filtrats beträgt etwa 1 gg/ml. Das vereinigte neutrale Filtrat wird im Vakuum bei einer Temperatur von unter 60° C auf etwa ein Viertel des Volumens der Ausgangsmaische eingeengt. Das Endvolumen des konzentrierten, vereinigten, neutralen Filtrats beträgt demnach 501.Fermentation A fermentation medium is prepared according to the following procedure: (NH4) 2S04. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.0 g CaCO3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.0 g N H4C1 ... ..................... 1.5 g Mg C12. 6 H2 O. . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.0 g FeS04-7H20 ................. 0.06 g Mn S O4 # 4 H2 O. . . . . . . . . . . . . . . . 0.05 g CO C12. 6 H2 O. . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.005 g Zn S O4 - 7 H2 O. . . . . . . . . . . . . . . . . 0.1 g corn steep water. . . . . . . . . . . . . . . . 25.0 g cottonseed flour. . . . . . . . . . . . 2.0 g corn starch ...................... 55.0 g water on ................. .... 1000 ml 25 ml of the medium are placed in 250 ml Erlenmeyer flasks and each time 0.5 ml of lard oil is added. The flasks containing the fermentation medium and the lard oil are sterilized in an autoclave for 20 minutes under a pressure of about 1 atm. After sterilization and cooling, 1 ml of the inoculum prepared according to Example 1 is added to each flask and the fermentation is carried out on a rotary shaker at 180 revolutions per minute at 25 ° C. for 120 hours. The content test of the mash results in 1 #tg cosynthetic factor-1 per milliliter. Extraction from the total mash 2001 of a fermentation mash, which was prepared in a semi-industrial fermentation tank by means of the CF-1 producing strain of S. aureofaciens W-5 in the medium described in Example 2 and contains 1 pg CF-1 per milliliter, are at a pH -Value from 6 to 7 filtered using a filter aid (Hyflosupercel, diatomaceous earth) in an amount of about 15% of the mash volume. The filter cake is washed with so much water that the total volume of the combined neutral filtrate is equal to the volume of the starting mash. The CF-1 potency of the pooled neutral filtrate is about 1 µg / ml. The combined neutral filtrate is concentrated in vacuo at a temperature below 60 ° C. to about a quarter of the volume of the starting mash. The final volume of the concentrated, combined, neutral filtrate is therefore 501.

Dieses Konzentrat wird mit konzentriertem Ammoniumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8 bis 9 eingestellt und dann mit Ammoniumsulfat gesättigt. Zu dieser Lösung gibt man Arquad 16 (Cetyltrimethylammoniumchlorid) im Verhältnis von 10m1 einer. 50%igen Arquad-16-Lösung in Isopropanol je Liter Konzentrat des vereinigten neutralen Filtrats und rührt das Gemisch '/z Stunde. Nach Zugabe eines gleichen Volumens an n-Butanol wird eine weitere halbe Stunde gerührt. Das gebildete Gemisch wird zur Trennung der Phasen zentrifugiert. Diese Extraktion wird wiederholt, wobei 10m1 50%iges Arquad 16 je Liter Konzentrat des vereinigten neutralen Filtrats und ein weiteres gleiches Volumen an n-Butanol verwendet werden. Die n-Butanolextrakte werden dann vereinigt, wodurch man ein Endvolumen von 1001 erhält. Die vereinigten n-Butanol-Extrakte werden im Vakuum bei einer Temperatur von unter 60° C auf ein Viertel des Ausgangsvolumens eingeengt. Das Endvolumen der konzentrierten, vereinigten :i-Butanol-Extrakte beträgt somit 25 1.This concentrate is made with concentrated ammonium hydroxide on one Adjusted pH from 8 to 9 and then saturated with ammonium sulfate. To this Solution is added to Arquad 16 (cetyltrimethylammonium chloride) in a ratio of 10m1 one. 50% Arquad-16 solution in isopropanol per liter of concentrate of the combined neutral filtrate and the mixture is stirred for 1/2 hours. After adding a same Volume of n-butanol is stirred for a further half an hour. The resulting mixture is centrifuged to separate the phases. This extraction is repeated, with 10m1 of 50% Arquad 16 per liter of concentrate of the combined neutral filtrate and another equal volume of n-butanol can be used. The n-butanol extracts are then combined to give a final volume of 1001. The United n-Butanol extracts are in a vacuum at a temperature of below 60 ° C on a Quarter of the original volume narrowed. The final volume the concentrated, combined: i-butanol extracts is therefore 25 l.

Der p1,-Wert dieser 25 1 an konzentrierten vereinigten li-Butanol-Extrakten wird mit konzentrierter Salzsäure auf 1,5 bis 2,0 eingestellt. Nach Zugabe von 5 1 Wasser und 2001 Methylenchlorid wird das Gemisch 1/Q Stunde gut gerührt. Die 5 1 ausmachende wäßrige Schicht wird von der organischen Schicht abgetrennt. Der p11-Wert der wäßrigen Schicht wird mit Ammoniumhydroxyd auf 7,0 eingestellt, wonach man im Vakuum bei einer Temperatur von unter 60' C auf 0.5 bis 1,0% des Volumens der Ausgangsgärmaische einengt. Dadurch erhält man 11 an konzentriertem wäßrigem Extrakt. Isolierung Der wie vorstehend beschrieben erhaltene, 1 1 ausmachende konzentrierte wäßrige Extrakt wird gründlich mit ungepuffertem »Celite 545« (Diatomeenerde) im Verhältnis von 2 g Celite 545 je Milliliter Konzentrat vermischt. Eine Säule mit Celite 545 wird auf folgende Weise bereitet: Man stellt eine Phosphatpufferlösung mit 10,75g X2HP04 je Liter Wasser her und bringt den pH-Wert mit H3 P 04 auf 8,0. Celite 545 wird gründlich mit der pH-8,0-Pufferlösung im Verhältnis von 2 g Celite 545 je Milliliter Pufferlösung vermischt. Eine Säule von etwa 23 cm Durchmesser wird bis zu einer Höhe von etwa 62 cm mit diesem gepufferten Celite 545 gepackt. Der die Lösung des rohen cosynthetischen Faktors-1 (Konzentrat des wäßrigen Extrakts) enthaltende Celite 545 wird auf das obere Ende der gepufferten Celite-545-Säule aufgebracht. Die Säule wird mit n-Butanol, das wie oben auf 8,0 gepuffert ist, entwickelt. Die vereinigten, an CF-1 reichen Fraktionen werden mit einem gleichen Volumen Wasser und 2 Volumina Methylenchlorid vermischt. Das Gemisch wird in einem Scheidetrichter geschüttelt. Die organische Schicht wird mit einem weiteren halben Volumen Wasser rückextrahiert. Das Gesamtvolumen der vereinigten wäßrigen Extrakte beträgt 81, die im Vakuum bei einer Temperatur von unter 40' C auf 200 ml eingeengt werden. Reinigung Eine Florisilsäule wird auf folgende Weise bereitet: Florisil wird in eine Säule von etwa 7,5 cm Durchmesser bis zu einer Höhe von etwa 46 cm gepackt. Diese Säule wird mit 0,01 normalem wäß rigem N1140 H, dann mit 100% Wasser enthaltendem Methylalkohol und schließlich erneut mit O,Olnormalem wäßrigem N H4 O H gewaschen. Die etwa 200 ml ausmachenden konzentrierten vereinigten wäßrigen Extrakte werden auf das obere Ende der gepackten und gewaschenen Florisilsäule aufgebracht und durchlaufen gelassen, wonach man 11 O,Olnormales wäßriges NH40H und 500 ml Wasser aufgibt. Zur Elution des cosynthetischen Faktors-1 aus dieser Säule verwendet man 10% Wasser enthaltenden Methylalkohol. Die vereinigten, an CF-1 reichen Fraktionen werden mit Kohlendioxyd auf pH 7,0 eingestellt und dann im Vakuum bei weniger als 40' C auf etwa 100 ml einer wäßrigen Lösung von CF-1 eingeengt.The p1, value of these 25 liters of concentrated, combined li-butanol extracts is adjusted to 1.5 to 2.0 with concentrated hydrochloric acid. After adding 5 l of water and 2001 methylene chloride, the mixture is stirred well for 1 / Q hour. The aqueous layer making up 5 liters is separated from the organic layer. The p11 value of the aqueous layer is adjusted to 7.0 with ammonium hydroxide, after which it is concentrated in vacuo at a temperature of below 60 ° C. to 0.5 to 1.0% of the volume of the initial fermentation mash. This gives 11 concentrated aqueous extract. Isolation The concentrated aqueous extract obtained as described above, making up 1 liter, is thoroughly mixed with unbuffered "Celite 545" (diatomaceous earth) in a ratio of 2 g Celite 545 per milliliter of concentrate. A column with Celite 545 is prepared as follows: A phosphate buffer solution is prepared with 10.75 g X2HPO4 per liter of water and the pH is brought to 8.0 with H3 P04. Celite 545 is thoroughly mixed with the pH 8.0 buffer solution in a ratio of 2 g of Celite 545 per milliliter of buffer solution. A column about 23 cm in diameter is packed with this buffered Celite 545 to a height of about 62 cm. The Celite 545 containing the solution of the crude cosynthetic factor-1 (concentrate of the aqueous extract) is applied to the top of the buffered Celite-545 column. The column is developed with n-butanol buffered to 8.0 as above. The combined fractions rich in CF-1 are mixed with an equal volume of water and 2 volumes of methylene chloride. The mixture is shaken in a separatory funnel. The organic layer is back extracted with another half volume of water. The total volume of the combined aqueous extracts is 81, which are concentrated in vacuo at a temperature of below 40 ° C. to 200 ml. Cleaning A Florisil column is prepared in the following manner: Florisil is packed into a column about 7.5 cm in diameter to a height of about 46 cm. This column is washed with 0.01 normal aqueous N1140 H, then with 100% water-containing methyl alcohol and finally again with 0.1 normal aqueous N H4 OH. The concentrated combined aqueous extracts, making up about 200 ml, are applied to the top of the packed and washed Florisil column and allowed to pass through, after which 11 O, normal aqueous NH 4 H and 500 ml of water are added. To elute cosynthetic factor-1 from this column, methyl alcohol containing 10% water is used. The combined fractions rich in CF-1 are adjusted to pH 7.0 with carbon dioxide and then concentrated in vacuo at less than 40 ° C. to about 100 ml of an aqueous solution of CF-1.

Das Konzentrat aus den vereinigten, an CF-1 reichen Fraktionen wird mit Salzsäure auf pH 1,0 eingestellt, auf 90' C erwärmt und durch Whatman-Filterpapier Nr. 4 filtriert. Das Filtrat wird abgekühlt, angeimpft und über Nacht bei 15' C stehengelassen. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert, zunächst mit 0,1 n-Salzsäure und dann mit Wasser und schließlich mit Aceton und anschließend mit Äther gewaschen und über Nacht im Vakuum bei 40'C getrocknet. Man erhält 92 mg Rohprodukt.The concentrate from the combined, CF-1-rich fractions is adjusted to pH 1.0 with hydrochloric acid, heated to 90 ° C. and filtered through No. 4 Whatman filter paper. The filtrate is cooled, inoculated and left to stand at 15 ° C. overnight. The crystals formed are filtered off, washed first with 0.1N hydrochloric acid and then with water and finally with acetone and then with ether and dried overnight in vacuo at 40.degree. 92 mg of crude product are obtained.

Die rohen Kristalle werden in 0,1 n-Salzsäure gelöst, auf 90' C erwärmt und in Eiswasser von etwa So C zur Förderung der Kristallisation abgekühlt. Die neugebildeten Kristalle werden zuerst mit kalter (10o C) 0,1 n-Salzsäure und mit kaltem Wasser gewaschen und 3 Stunden im Vakuum bei weniger als 40' C getrocknet. Dadurch erhält man 62 mg der Säureform des cosynthetischen Faktors-1, die bei 280 bis 285' C unter Zersetzung schmilzt. Die Neutralform des Produkts wird durch Auflösen von 5 mg der Säureform von CF-1 in 3 ml heißem Wasser und Zugabe von Ammoniumhydroxyd bis pH 7,5 erhalten. Die kristalline Neutralform fällt aus der Lösung beim Abkühlen aus. Die Kristalle werden mit kaltem Wasser gewaschen und dann im Vakuum bei 40' C getrocknet. Die Analysenwerte von CF-1 sowie seine weiteren chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften wurden bereits oben beschrieben. Testverfahren I Eine Standardprüfung auf CF-1 wird folgendermaßen durchgeführt: Nach der oben beschriebenen Arbeitsweise wird ein Inokulum von S. aureofaciens S 1308 (ATCC 12 748) bereitet. Anteile von kristallinem CF-1, das wie oben beschrieben erhalten wurde, werden zu einem Fermentationsmedium gegeben, das wie oben beschrieben aufgebaut ist, jedoch 0,1 lig/ml an Riboflavin enthält. Das Medium wird dann sterilisiert, mit dem 24stündigen vegetativen Inokulum von S. aureofaciens S 1308 beimpft, 120 Stunden bei 20' C inkubiert und auf seinen Gehalt an Chlortetracyclin geprüft. Zugesetzter CM Gebildetes Chlortetracyclin mcg/ml (Turbidimetrisdie Prüfung) mcg/ml 0 360 0,01 925 0,02 1500 0,04 2550 0,08 4270 0,16 5600 0,32 6200 Testverfahren II Nach der oben beschriebenen Arbeitsweise wird eine 120-Stunden-Fermentation mit S. aureofaciens W-5 durchgeführt. Die gebildete Maische wird ohne pH-Wert-Einstellung filtriert, wodurch man ein W-5-Filtrat erhält.The crude crystals are dissolved in 0.1 N hydrochloric acid, heated to 90 ° C. and cooled in ice water of around 50 ° C. to promote crystallization. The newly formed crystals are first washed with cold (10.degree. C.) 0.1N hydrochloric acid and with cold water and dried for 3 hours in vacuo at less than 40.degree. This gives 62 mg of the acid form of cosynthetic factor-1, which melts at 280 to 285 ° C. with decomposition. The neutral form of the product is obtained by dissolving 5 mg of the acid form of CF-1 in 3 ml of hot water and adding ammonium hydroxide to pH 7.5. The crystalline neutral form precipitates out of the solution on cooling. The crystals are washed with cold water and then dried in vacuo at 40.degree. The analytical values of CF-1 and its other chemical, physical and biological properties have already been described above. Test Procedure I A standard test for CF-1 is carried out as follows: An inoculum of S. aureofaciens S 1308 (ATCC 12 748) is prepared according to the procedure described above. Portions of crystalline CF-1 obtained as described above are added to a fermentation medium which is constructed as described above but contains 0.1 lg / ml of riboflavin. The medium is then sterilized, inoculated with the 24-hour vegetative inoculum of S. aureofaciens S 1308, incubated for 120 hours at 20 ° C. and checked for its chlorotetracycline content. Added CM Chlorotetracycline formed mcg / ml (Turbidimetric test) mcg / ml 0 360 0.01 925 0.02 1500 0.04 2550 0.08 4270 0.16 5600 0.32 6200 Test Method II Following the procedure described above, a 120 hour fermentation is carried out with S. aureofaciens W-5. The mash formed is filtered without adjusting the pH, whereby a W-5 filtrate is obtained.

Man führt eine S. aureofaciens-S-1308-Fermentation wie oben beschrieben durch, ersetzt jedoch den dort verwendeten kristallinen CF-1 durch 0,08 ml dieses neutralen W-5-Filtrats. Die erhaltene Maische liefert bei der Gehaltsprüfung folgende Werte: Milliliter neutrales W-5-Filtrat Gebildetes Chlortetracyclin je Milliliter S 1308 Maische (Turbidimetrisdle Prüfung) 0,00 150 0,08 3410 Durch einen Vergleich dieser Ergebnisse mit den bei Verwendung von reinem CF-1 bei Test I erhaltenen ergibt sich, daß die W-5-Maische 0,85 #tg CF-1 je Milliliter enthält.A S. aureofaciens S-1308 fermentation is carried out as described above, but the crystalline CF-1 used there is replaced by 0.08 ml of this neutral W-5 filtrate. The mash obtained provides the following values in the content test: Milliliters neutral W-5 Filtrate Formed Chlortetracycline per milliliter S 1 308 m a ical (Turbidimetrisdle test) 0.00 150 0.08 3410 A comparison of these results with those obtained using pure CF-1 in Test I shows that the W-5 mash contains 0.85 tg CF-1 per milliliter.

Beispiel Alle unten aufgeführten Streptomycesstämme werden in gesonderten Primärfermentationen gezüchtet, und nach dem Wachstum werden aliquote Anteile der erhaltenen Maischen in Erlenmeyerkolben gegeben, die das unter »Fermentation« angegebene Medium enthalten, und zwar in der Weise, daß das gesamte Volumen aus Primärfermentationsmaische und Medium in jedem Kolben 25 ml beträgt. Die Kolben werden dann im Autoklav 20 Minuten unter einem Druck von etwa 1 atü sterilisiert und anschließend auf 25 ± 5° C abgekühlt.Example All Streptomyces strains listed below are in separate Primary fermentations are grown, and after growth, aliquots of the The mashes obtained were placed in Erlenmeyer flasks that had the specified under "Fermentation" Contain medium in such a way that the entire volume of primary fermentation mash and medium in each flask is 25 ml. The flasks are then placed in the autoclave 20 Sterilized minutes under a pressure of about 1 atm and then to 25 ± Chilled 5 ° C.

Ein Inokulum von S. aureofaciens S 1308 (ATCC 12748) wird nach der unter »Bereitung des Inokulums« beschriebenen Arbeitsweise bereitet. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wird jeder der wie oben beschriebenen vorbereiteten 25 ml Fermentationsmaische -f- Medium enthaltenden Kolben mit 1,0 ml des S. aureofaciens S 1308 Inokulums beimpft. Diese beimpften Kolben werden bei 25' C auf einer Rundschüttelvorrichtung bei 180 Umdrehungen je Minute 120 Stunden bebrütet. Danach wird der Gehalt jeden Kolbens an Chlortetracyclin fluorometrisch bestimmt, und der CF-1-Gehalt jeder Primärfermentationsmaische wird berechnet, wobei die im folgenden wiedergegebenen Ergebnisse erhalten werden: CF-1 je Milliliter Für die Primärfermentation Primärfermen- verwendete Kulturen tationsmaisdze ug Streptomyces aureofaciens W-5 . . 1,37 Streptomyces albus . . . . . . . . . . . . . 0,38 Streptomyces rimosus . . . . . . . . . . . 0,05 Streptomyces platensis . . . . . . . . . . 0,37 Streptomyces hygroscopicus ..... 0,35 Streptomyces griseus . . . . . . . . . . . . 0,52 Streptomyces albo-niger . . . . . . . . . 0,7 An inoculum of S. aureofaciens S 1308 (ATCC 12748) is prepared according to the procedure described under "Preparation of the inoculum". After an incubation time of 24 hours, each of the flasks containing 25 ml of fermentation mash -f- medium prepared as described above is inoculated with 1.0 ml of the S. aureofaciens S 1308 inoculum. These inoculated flasks are incubated at 25 ° C. on a rotary shaker at 180 revolutions per minute for 120 hours. The chlorotetracycline content of each flask is then determined fluorometrically and the CF-1 content of each primary fermentation mash is calculated to give the results given below: CF-1 per milliliter For primary fermentation primary fermentation cultures used tationsmaisdze ug Streptomyces aureofaciens W-5. . 1.37 Streptomyces albus. . . . . . . . . . . . . 0.38 Streptomyces rimosus. . . . . . . . . . . 0.05 Streptomyces platensis. . . . . . . . . . 0.37 Streptomyces hygroscopicus ..... 0.35 Streptomyces griseus. . . . . . . . . . . . 0.52 Streptomyces albo-niger. . . . . . . . . 0.7

Claims

PATENT CLAIMS: 1. A process for the production and extraction of cosynthetic factor-1, characterized in that a microorganism of the genus Streptomyces is cultured in a known manner in an aqueous nutrient medium until it has an essential activity based on cosynthetic factor-1, then at a pH of about 6 to 7 and the cosynthetic factor-1 is obtained from the aqueous filtrate by conventional work-up.

2. The method according to claim 1, characterized in that one is used as the microorganism the strain Streptomyces aureofaciens No. ATCC 13190 or a mutant or variant of which used.