Verfahren zur Herstellung von Ferrioxamin E.
In Patent Nr. 413 853 sind neue Wuchsstoffe, die Ferrioxamine, beschrieben. Sie werden u. a. durch Fermentation von Actinomyceten gewonnen. Dabei wird gewöhnlich ein Gemisch verschiedener Komponenten erhalten, beispielsweise aus Streptomyces pilosus Ettlinger et al. NRRL 2857 (ETH 21748) die Ferrioxamine A, B, C, Dl, D2, E, F und G.
Es wurden nun überraschenderweise neue Actino myceten-Stämme gefunden, die ausschliesslich Ferri oxamin E produzieren. Darin liegt ein grosser Vorteil, denn wegen ihrer nahen Verwandtschaft sind die Ferrioxamine relativ schwer voneinander zu trennen.
Aus Gründen der genauen Dosierung und der Wiederholbarkeit ist es aber wünschenswert, für die Herstellung von Heilmitteln eine einheitliche Verbindung zur Verfügung zu haben.
Ferrioxamin E ist eine Verbindung der Formel
EMI1.1
Bei der Papierelektrophorese in 0, 33-n. Essigsäure bei 220 V. wandert sie innert 4t/2 Stunden 3, 9 cm (Fruktose ebenfalls 3, 9 cm). Das Papierchromato- gramm im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (4 : 1 : 5) weist einen Rf-Wert von 0, 68 auf, im System tert. Butanol-Wasser-gesättigte wässrige Natriumchlorid- lösung-0, 1-n. Salzsäune (50 : 25 : 25 : 1), Papier imprägniert mit Acetom-Wasser-gesättigte wässrige Natriumchloridlösung (6 : 3 : 1) einen Rf-Wert von 0, 59.
Der Verteilungskoeffizient im System n-Butanol-Benzyl- alkohol-Wasser gesättigte wässrige Natriumchlorid- lösung-0, 1-n. Salzsäure (200 : 100 : 300 : 60 : 3) ist 1, 593.
Ferrioxamin E ist ein Wuchsstoff für verschiedene Mikroorganismen und kann daher bei der Züchtung dieser Organismen zur Steigerung der Ausbeute verwendet werden. Als Beispiel ist in Fig. 1 die Wuchsstoffwirkung von Ferrioxamin E auf Mikrobacterium lactium ATCC 8181 dargestellt. Auf der Abszisse ist die Inkubationszeit in Stunden, auf der Ordinate die Extinktion der Kulturlösung aufgetragen. Kurve I zeigt das Wachstum ohne Zusatz von Ferrioxamin E (Kontrolle), Kurven II, III und IV das Wachstum bei Zusatz von 10 y/Liter, 31, 6 y/Liter und 100 ;'/Liter Ferrioxamin E.
Es besitzt ferner ausgeprägte anti anämische Eigenschaften und kann dementsprechend in Form von Präparaten als Heilmittel in der Human und Veterinärmedizin verwendet werden.
Die neuen Ferrioxamin E produzierenden Stämme sind Streptomyces antibioticus (Waksmanet Woodruff) Waksman et Henrici ETH 27083 und Nocardia brasiliensis (Lindenberg) Castellani et Chalmers ETH 27413. Sie werden in den Laboratorien der Ciba, Basel, und in der. Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter der ange gebenen Bezeichnung aufbewahrt.
Streptomyces antibioticus 27083 wurde aus einer Bodenprobe aus dem argentinischen Gran Chaco isoliert. Der Organismus weist folgende Charakteristika auf :
1. Die Sporen sind glatt, ellipsoid, 0, 7 bis 2, 2X 0, 4 bis 0, 8, u gross ; im Elektronenmikroskop sieht man zahlreiche degenerierte, hantelförmige Sporen, die einzeln oder in Ketten zusammen mit gesunden Sporent auftreten können.
2. Das Luftmycel ist anfangs weissgrau oder braugrau, in ausgereiftem. zustand aschgrau (cinereus).
3. Die Sporenketten sind monopodial verzweigt, mit langen, geraden oder mehr oder weniger gewell- ten Zweigen ; es wunden keine Spiralen beobachtet.
4. Auf peptonhaltigen Nährböden tritt Melaninbildung auf ; die Tresner-Danga-Reaktion (Tresner und Danga, J. Bacteriol. 76, 239 [1958]) ist positiv.
5. Das Subtratmycel ist, je nach Nährboden, hell- gelb, gelbbraun, goldgelb bis dunkelbraun wit wenig grünlich-brauner Tönung.
Zur weiteren Chanakteris. ierung wird im folgenden das Wachstum von S. antibioticus 27083 auf ver schiedenen Nährmedien beschrieben.
Die Nähmiedien 1-5 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, 361 (1952) hergestellt ; Nährmedium 6 nach H. D. Tresner. und F. Danga, J. Bacteriol. 76, 239 (1958) ; 7 und 8 nach T. G.
Pro. dam et al., Antibiotiecs Annual 1956-1957, Seite 947 ; 10 nach Manual of Methods of Pure Culture Study of Bacteria, Committee on @ Bacteriolgical Technic of S. A. B. Biotechn. Publications, Geneva N. Y. 44-9-10 (1946) ; Nährmedium 9 hat folgende Zusammensetzug : 1 g Trypton, 1 g Hofeextrakt (Difco), 1 g Fleischextrakt (Lab-Lemco), 8, 5 g Na triumchlorid, 17 g Agar, 1000 ml a. d.
1. Synthetischer Agar: Wachstum dünn schlierartig bis runzelig, gelbbraun bis goldgelb ; mit wenig staubigem, kreideweissem Luftmycel ; Substrat wird nicht verfärbt.
2. Glukose-Asparagin-Agar : Wachstum dünn schleierartifg, grünlichgelb bis olivgrun ; Luftmycel staubig oder sammetig, seltener wenig wollig, hellgrau oder weissgelb ; Substrat wird nicht verfärbt.
3. Gelatinestich (27 C) : Anfangs pusteliges, hell- braunes Oberflächenwachstum (Pellikula und Ring), späte, r Gnund : wachstum hellbraun oder hellgelb ; Substrat dunkelbraun ! verfärbt und Gelatine verflüssigt bis zu 25 mm nach, 10 Tagen ; Luftmycel fehlt.
4. Stärkeplatte : Wachstum dünn schleierartig, weissgelb bis gelbbraun oder hellbraun ; Luftmycel staubig, kreideweiss oder milchweiss ; Substrat wird nicht verfärbt ; Stärkehydroxys 2 mm nach 5 Tagen, 5-15 mm nach 10 Tagen.
5. Lackmusmilch : Anfangs weissgelbes, später dunkelbraunes bis blauschwarzes Ringwachstum ; Luftmycel fehlt ; Substrat dunkelbraun verfärbt ; pH nach 5 Tagen und nach 10 Tagen 8, 1.
6. Pekton-Eisen-Agar : Wachstum dünn schleierartig, weissgelb ; kein Luftmycel ; sehr starke positive Reaktion (schwarze Verfärbung des Mediums).
7. Hefeextrakt-Agar : Wachstum dünn schleierarig bis wenig runzelig, dunkelbraun ; Luftmycel sammetig, aschgrau ; Substrat dunkelbraun verfärbt.
8. Carvajal's Hafermehl-Agar : Wachstum dünn schloierarttg oder wenig runzelig, grünlichgelb oder hell rötlichlbraun ; Luftmycel sammetig oder wollig, aschgrau ; Substrat wird nicht verfärbt.
9. Chromogen-Agar : Wachstum diinn schleierartig oder pustelig, weissgelb, mit staubigem, kreideweissem Luftmycel ; Substrat wird durkelbraun verfärbt (Melaniaildung).
10. Nitratbrühe : Oberflächenwachstum und flokkiges Sediment, weissgelb ; gelegentlich punktförmige, bellgelbe Kolonien mit wenig staubigem, aschgrauem Luftmyoel im Ring ; Substrat gelbbraun bis hellbraun verfärbt ; Nitratreduktion ziemlich schwach.
Nocardia brailiensis 27413 wurde aus einer auf der Gesellschaftsinsel Bora-Bora (Franz. Ozeanien) gesammelten Bodenprobe isoliert.
Morphologisch zeichnet sich der Stamm durch ein stark verzweigtes, gewelltes, anfänglich nicht seg mentientes, ca. 0, 6 bis 1, 1, It breites Substratmycel aus. Erst nach einigen Tagen-je nach Kulturbedin- gungen-entwickelt sich daraus ein monopodial ver zweigtes Luftmycel, das allmählich zu einem wol- ligen Ueberzug auswächst. Das Substratmycel zerfällt in verschieden lange Teile von l bis 15, Länge und beildet auch 1, 2 bis 1, 5, lange Segmentationssporen ; im Luftmycel konnten lange Ketten ebensolcher Segmentationssporen festgestellt werden.
Von den bei Waksman (Bergey's Manual VII, 713 [1957]) und bei Krassilnikow (Diagnostik der Bakterien und Actinomyceben, Jena 1959) erwähnten Arten der Gattung Nocardia (bzw. Proactinomyces Jensen 1934) stimmt keine mit den Stamm 27413 überein. Hingegen weist der Stamm die charakteri- stischen Eigenschlaften der Nocardia brasai- liensis (Lindenberg) Castellani et Chalmers 1913 auf (vgl. Gordon et al., J. Bacteriol. 73, 15 [1957] ; Bojalil et al., J.
Bacteriol. 78, 852 [1959] ; Bojalil et al., Mycopathologia et Mycologia Appl. 11, 287 [1957] ; Burns et al., Mycopathologia et Mycologia Appl. 11 297 [1957]) und wird daher dieser Species zugezählt.
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von Nocardia brasiliensis 27413 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Herstellung der Nährmedien ist dieselbe wie für S. anti bioticus 27083 oben angegeben.
1. Synthetischer Agar : Wachstum anfangs dünn schleierartig, weissgelb, später etwas runzelig und hellgelb oder gelbbraun ; mit reichlichem sammetigem, am Ende wolligem, schneeweissem Luftmycel.
2. Glukose-Asparagin-Agar : Wachstum djinn schleierartig, weissgelb bis hellgelb, später runzelig und goldilgelb ; Luftmycel wollig, schneeweiss bis beilweise weissgrau.
3. Gelatinestich (27 C) : Wachstum oberflächlich, hellbraun bis roHbraun ; Gelatine wird rasch verflüssigt (2 cm in 7 Tagen).
4. Stärkeplatte : Wachstum punktförmig, hellgelb ; Hydrolyse 0, 9 cm nach 5 Tagen.
5. Lackmusmilch : Punktförmiges, farbloses bis weissgelbes Ringwachstum ; Peptonisierung und Koa- gulation ; pH nach 7 Tagen 7, 25.
6. Pepton-Eisen-Agar : Wachstum Idünn schleierartig, weissgelb bis hellgelfb ; negative Reaktion.
7. Hefeextrakt-Agar : Wachstum runzelig, selten dünn schleierartig, goldgelb bis hellbraun ; mit reichlichem wolligem, schneeweissem bis weissgelbem Luftmycel.
8. Carvajal's Hafermehl-Agar : Wachstum dünn schleierartig, anfangs hellbraun, später hellgelbrot und schliesslich rotbraun ; Luftmycel wollig, schneeweiss bis weissgelb.
9. Chromogen-Agar : Wachstum diinn schleier artig, hellgellb ; keine Melaninbildung.
10. Nitratbrühe : Anfangs Sediment Flooken und weissgelbes Ringwachstum, später runzelige Pellikula ; Nitrate werden zu Nitriten reduziert.
Zur Herstellung von Ferrioxamin E können nicht nur die genannten Stämme verwendet werden, sondern auch Varianten dieser Organismen, wie sie durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere infolge Einwirkung von Ultraviolett-ader Röntgenstrahlen, oder von Stickstoffölen, gewonnen werden.
Zur Gewinnung von Ferrioxamin E wird einer der genannten Mikroorganismen in wässriger, eine Koh lenstoff-und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze und gegebenenfalls wachstumfördemde Stoffe enthal- tender Nährlösung aerob gazüchtet, bis diese eine wesentliche Ferrioxamin-Wirkunig zeigt und Ferrioxamin E hierauf isoliert. Für die Züchtung der genannten Mikroorganismen kommen als assimilierbare Kohlenstoffquelle Kohlenhydrate, z. B. Glukose, Saccharose, Laktose, Mannit, Stärke sowie Glycerin, in Frage.
Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebe nenfalls wachstumsfördernde Stoffe seien genannt : Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Ab bauprodukte, wie Pepton odes Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von DestiHationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Samen, insbesonder. der Raps-und Soyapflanze, der Baumwollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von Al- kalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich beispiels- weise eine solche zwischen 18 und'40 . Eine wesent- liche Ferrioxamin-Wirkung zeigt die nahlösung dabei im allgemeinen nach 2-10 Tagen. Zur Kultur gibt man z. B. 0, 1 % Ferichlorid zu und trennt das Mycel vom Kulturgut ab, wonach die Hauptmenge des Ferrioxamins im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen davon am Mycel absorbiert. Es ist diaher vojcteilihait, letzteres gut auszuwaschen.
Dazu eignen sich beispielsweise Wasser undl/oder wässrige organische Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. wässriges Methanol.
Für die Isolierung von Ferrioxamin E aus de ; m Kulturfiltrat kann man nach an sich bekannten Methoden vorgehen und z. B. eine der nachfolgend ange gebenen Arbeitsweisen oder Kombinationen davon verwenden.
1. Maan kann Adsorptionsmittel verwenden, z. B.
Aktivkohlen, wie Norit , aktiverit Erden, wie Fankonti , Fullererde oder Floridin , oder Harzadsorber, wie Asmit . Die Elution der Adsorbate erflogt zweckmässig mit Geniischenvon)mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln mit Wasser, z. B. mit Wasser-Methanol-, Wasser-Pyridiin-, verdünnte Essigsäure-Methanol- oder Wasser-Methanol Eisessig-Butanol-Gemischen. Als besonders vorteilhaft für die Elution eines Frankonit -oder Norit - adsorbates hat sich das Gemisch von Wasser (4 Vo lumteile) und Pyridin (1 Volumteil) erwiesen.
2. Eine zweite Methode zur Abtrennung des Ferrioxamins besteht darin, dass man es an Kationenaustauschem adsorbiert, wobei besonders Säuregruppen enthaltende Harze, wie Dowex 50 geeignet sind.
Letzteres kann sowohl in der Säureform als auch in der Natriumform verwendet werden, doch hat sich auch ein Gemisch dieser beiden Formen bewährt. Die Elution geschieht zweckmässig mit sauren Agentien, z. B. mit methanolischer Salzsäure oder sauren Pufferlösungen.
3. Weiter kann das Ferrioxamin einer wässrigen Lösung mittels organischen Lösungsmitteln entzogen werden. Für diese Extraktionsrerfahreni haben sich höhere organische Alkohole, z. B. Benzylalkohol oder Isopropylalikohol, besonders bewährt. Zweckmassiger- weise wird dabei der wässrigen Phase ein anorgani sches Salz, z. B. Ammoniumsulfat oder Natriumchlo- rid, zugesetzt. Aus den erhaltenen organischen Extrakten kann das Ferrioxamin entweder durch Ab dampfen des Lösungsmittels oder durch Ausfällung mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels, z. B. Äther, Petroläther oder Äthylacetat, in ange reicherter Form erhalten werden.
4. Eine weitere Methode der Anreicherung des Ferrioxamins besteht darin, dass man es zwischen einer wässrigen Lösung und einer Lösung von Phenol in Chloroform verteilt, wobei sowohl das pH der wässrigen Losung als auch der Phenolgehalt der Chloroformlösung variiert werden.
Versteht man unter dem Verteilerkoeffizienten von Ferrioxaminen das Verhältnis von Koneentration in der organischen Phase zur Konzentration in der wässrigen, so ergibt sich, dass der Verteilungskoeffizient mit steigendem Phenolgehalt der organischen Phase zunimmt und mit sinkendem pH der wässrigen Phase abnimrnt. Da es somit möglich ist, jeden beliebigen Verteilungskoeffizienten von Ferrioxaminen in diesem System einzustellen, kanni man durch Kombination von wenigen Verteilungsoperationen einen Grossteil inlaktiver Verunreinigungen abtrennen.
5. Eine andere Methode zur Anreicherung und/ oder Abtrennung des Fenioxamins stellt die Chromatographie dar, wie Adsorptionschromatographie an verschiedenen Materialien, z. B. an Norit , Alumi- niumoxyd, magnesiumsilkaten, Silicagel , Calciumsulfat, sowie Verteilungschromatographie mit Cellulose, Stärke, Silicagel , Celite u. dO. als Trägersubstanzen, oder aber Chromatographie an lonenaustauscherharzen, z. B. an Dowex 50p, Amberlite TRC-5 u. dgal.
6. Weiter kann das Ferrioxamin durch Gegenstromverteilung nach Craig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmittelphasen angereichert werden.
Folgende Lösungsmittelsysteme haben sich dabei besonders bewährb : a) Benzylakohol-20 /oige wässrige Lösung von Ammoniumsulfat. b) n-Butanol (100 Vorlumeteil) - Benzylakohol (200 Volumteile)-l-n. Salzsäune (6 Volumteile)- Wasser (300 Volumteile)-wässrige, bei 19 gesättigte Natriumchloridlösung (60 Volumteille).
Die Temperaturen sind in den folgenden Beispielen in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1
Der Stamm Nocardia brasilionsis (Lindenberg) Castellani et Chalmers 27413 wird in gut belüfteter Submerskultur bei 27 gezüchtet. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Soya bohnenmehl (vollfett) und 20 g Mannit enthält. Das pH wind mit Kaliumhydroxyd auf 7, 8 eingestellt. Nach 6 Tagen wird den rohe Kulturen 1 # Ferrichlorid zugesetzt und unter Zusatz von Celit abfiltriert.
Dem Kulturfiltrat werden pro Liter 20 g Kochsalz zugefügt. Die klare Lösung wird mehrmals mit einem Chloroform-Phenol-Gemisch (l ml : l g) extrahiert.
800 mg Chlordoform-Phenol-Extrakt (aus 1 Liter Kulturfiltrat) werden einer Gegenstromverteilung nach Craig unterzogen. Man verwendet dadfür ein Lösungsmittelsystem aus 3 Liter n-Butylalkohol, 1, 5 Liter Benzylakohol, 4, 5 Liter 0, 001-n. Salzsäure und 0, 9 Liter gesättigter wässriger Natriumchloridlösung. Die Substanz wird in die ersten beiden Gläser der Apparatur eingafüllt und die Verteilung über 60 Stufen durchgeführt. In den Fraktionen 0 bis 2 und 51 bis 60 reichern sich braune, inaktive Verunreinigungen an, während sich mit Maximum in Stufe 37 eine einheit- liche rote Zone ausbildet.
Die kolorimetrische Auswertung bei 430 m, u ergibt eine einer einheitlichen Verbindung entsprechende Kurve. Antisideromycin Aktivität lösst sich in den Stufen 25 bis 45 (Maximum 316-39) nachweisen (modifizierter Bonifas-Test).
Das Verteilungsmaximum entspricht einem Verteilungskoeffizienten K = 1, 593.
Die Fraktionen 30-43 der Verteilung wenden ver einigt. Die untere Phase wird abgetrennt und zweimal mit Ather gewaschen. Die obere Phase versetzt man mit Ather und schüttelt dreimal mit Wasser aus. Die mit Äther gewaschenen Auszüge vereinigt man mit der vorher abgetrennten unteren Phase.
Nun werden die vereinigten Auszüge mit Kochsalz gesättigt und mit einer Mischung aus gleichen Teilen Phenol und Chloroform ausgszogen. Der Extrakt wird mit Natriumsulfat getrocknet, mit dem dreifachen Volumen an Äther versetzt und dreimal mit Wasser ausgeschüttelt. Dabei geht das rotbraune Ferrioxamin E vollständig in die wässrige Phase über. Daraus lässt sich praktisch reines Ferrioxamin E durch Eindamp- fen im Vakuum gewinnen. Der Rückstand wird in ca.
20 ml heissem Methanol gelöst und auf 4-5 ml eingedampft. Beim Stehen in der Kälte kristallisiert reines Ferrioxamin E in sehr feinen rotbraunen glänzenden Nädelchen aus, die ihre Doppelbrechung brei 280 verlieren und beim weiteren Erhitzen verkohlen, ohne zu schmelzen. Die Ausbeute beträgt 28 mg.
Beispiel 2
Der Stamm Streptomyces antibioticus (Waksman et Woodruff) Waksman et Henrici 27083 wird in gut belüfteter Submerskultur bei 27 gezüchtet. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Rapsextraktionsschrot und 20 g Malzextrakt enthält. Das pH wird mit Kaliumhydroxyd auf 7, 5 eingestellt. Nach 6 Tagen wird der rohen Kultur 1 ! oo Ferrichlorid zugesetzt und unter Zusatz von Celit abfiltriert. Die Kulturflüssigkeit wird in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise aufgearbeitet. Sie enthält keine anderen Ferrioxamine als Ferrioxamin E.
Dieses wird wie in Beispiel l beschrieben isoliert.
Beispiel 3
Der Stamm Streptomyces antibioticus (Waksman et Woodruff) Waksman et Henrici 27083 wird in gut belüfteter Submerskultur bei 27 gezüchtet. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter 20 g Glukose,
5 g l-Asparagin, 1 g Magnesiumsulfat, 0, 5 g Calciumchlorid und 1 g sekundäres Kaliumphosphat enthält.
Nach 8 Tagen wird der rohen Kultur 1 # Ferrichlorid zugesetzt und unter Zusatz von Celit abfiltriert. Die Kulturfüssigkeit wird in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise aufgearbeitet. Sie enthält keine anderen Ferrioxamine als Ferrioxamin E. Dieses wird wie in Beispiel 1 1 beschrieben isoliert.
In gleicher Weise wird Ferrioxamin E durch
Züchtung von Nocardia brasiliensis (Linderberg)
Castellani et Chalmers ETH 27413 auf obiger synthe tischer Nährlösung erhalten.
Process for the production of ferrioxamine E.
In patent no. 413 853 new growth substances, the ferrioxamines, are described. You will u. a. obtained by fermentation of actinomycetes. A mixture of different components is usually obtained, for example from Streptomyces pilosus Ettlinger et al. NRRL 2857 (ETH 21748) the ferrioxamines A, B, C, Dl, D2, E, F and G.
Surprisingly, new Actino myceten strains that exclusively produce ferric oxamine E have now been found. This is a great advantage, because because of their close relationship, the ferrioxamines are relatively difficult to separate from one another.
For reasons of exact dosage and repeatability, however, it is desirable to have a uniform compound available for the production of medicinal products.
Ferrioxamine E is a compound of the formula
EMI1.1
In paper electrophoresis in 0.33-n. Acetic acid at 220 V. It migrates 3.9 cm within 4t / 2 hours (fructose also 3.9 cm). The paper chromatogram in the n-butanol-glacial acetic acid-water system (4: 1: 5) has an Rf value of 0.68, in the tert. Butanol-water-saturated aqueous sodium chloride solution-0, 1-n. Salt sauna (50: 25: 25: 1), paper impregnated with acetome-water-saturated aqueous sodium chloride solution (6: 3: 1) an Rf value of 0.59.
The partition coefficient in the system n-butanol-benzyl-alcohol-water saturated aqueous sodium chloride solution-0.1-n. Hydrochloric acid (200: 100: 300: 60: 3) is 1.593.
Ferrioxamine E is a growth substance for various microorganisms and can therefore be used in the breeding of these organisms to increase the yield. As an example, the growth substance effect of ferrioxamine E on Microbacterium lactium ATCC 8181 is shown in FIG. The incubation time in hours is plotted on the abscissa and the extinction of the culture solution is plotted on the ordinate. Curve I shows the growth without the addition of ferrioxamine E (control), curves II, III and IV the growth with the addition of 10 μ / liter, 31.6 μ / liter and 100% / liter ferrioxamine E.
It also has pronounced anti-anemic properties and can accordingly be used in the form of preparations as medicinal products in human and veterinary medicine.
The new ferrioxamine E producing strains are Streptomyces antibioticus (Waksmanet Woodruff) Waksman et Henrici ETH 27083 and Nocardia brasiliensis (Lindenberg) Castellani et Chalmers ETH 27413. They are used in the laboratories of Ciba, Basel, and in the. Eidg. Technische Hochschule, Institute for Special Botany, Zurich, kept under the name given.
Streptomyces antibioticus 27083 was isolated from a soil sample from the Argentine Gran Chaco. The organism has the following characteristics:
1. The spores are smooth, ellipsoidal, 0.7 to 2, 2X 0.4 to 0.8, u large; In the electron microscope one sees numerous degenerate, dumbbell-shaped spores, which can appear individually or in chains together with healthy spores.
2. The aerial mycelium is initially white-gray or brown-gray in maturity. ash gray (cinereus).
3. The spore chains are monopodially branched, with long, straight or more or less wavy branches; no spirals were observed.
4. Melanin formation occurs on peptone-containing culture media; the Tresner-Danga reaction (Tresner and Danga, J. Bacteriol. 76, 239 [1958]) is positive.
5. The substrate mycelium is, depending on the nutrient medium, light yellow, yellow-brown, golden-yellow to dark brown with a little greenish-brown tint.
For further chances. The following describes the growth of S. antibioticus 27083 on different nutrient media.
The sewing mitts 1-5 were according to W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, 361 (1952); Nutrient medium 6 according to H. D. Tresner. and F. Danga, J. Bacteriol. 76: 239 (1958); 7 and 8 according to T. G.
Per. dam et al., Antibiotiecs Annual 1956-1957, page 947; 10 according to Manual of Methods of Pure Culture Study of Bacteria, Committee on @ Bacteriolgical Technic of S. A. B. Biotechn. Publications, Geneva N.Y. 44-9-10 (1946); Nutrient medium 9 has the following composition: 1 g tryptone, 1 g farm extract (Difco), 1 g meat extract (Lab-Lemco), 8.5 g sodium chloride, 17 g agar, 1000 ml a. d.
1. Synthetic agar: growth thinly streaky to wrinkled, yellow-brown to golden yellow; with a little dusty, chalk-white aerial mycelium; The substrate is not discolored.
2. Glucose-asparagine-agar: growth thin veiled, greenish-yellow to olive-green; Aerial mycelium dusty or velvety, less often not very woolly, light gray or white yellow; The substrate is not discolored.
3. Gelatin sting (27 C): initially pustular, light-brown surface growth (pellicle and ring), later, lower: growth light brown or light yellow; Substrate dark brown! discolored and gelatin liquefied up to 25 mm after 10 days; Aerial mycelium is absent.
4. Starch plate: growth thin, veil-like, white-yellow to yellow-brown or light brown; Aerial mycelium dusty, chalk white or milky white; Substrate is not discolored; Starch hydroxys 2 mm after 5 days, 5-15 mm after 10 days.
5. Litmus milk: initially white-yellow, later dark brown to blue-black ring growth; Aerial mycelium is absent; Substrate discolored dark brown; pH after 5 days and after 10 days 8, 1.
6. Pecton iron agar: growth thin, veil-like, white-yellow; no aerial mycelium; very strong positive reaction (black discoloration of the medium).
7. Yeast extract agar: growth thinly veiled to slightly wrinkled, dark brown; Aerial mycelium velvety, ash gray; Substrate discolored dark brown.
8. Carvajal's oatmeal agar: growth thinly streaked or slightly wrinkled, greenish-yellow or light reddish-brown; Aerial mycelium velvety or woolly, ash gray; The substrate is not discolored.
9. Chromogen agar: growth thin veil-like or pustular, white-yellow, with dusty, chalk-white aerial mycelium; The substrate is discolored to a solid brown (melania formation).
10. Nitrate broth: surface growth and flaky sediment, white-yellow; occasional punctiform, pale yellow colonies with a little dusty, ash-gray air myeloid in the ring; Substrate discolored yellow-brown to light brown; Nitrate reduction pretty weak.
Nocardia brailiensis 27413 was isolated from a soil sample collected on the society island of Bora-Bora (French Oceania).
Morphologically, the trunk is characterized by a strongly branched, wavy, initially not segmented, about 0.6 to 1.1, It wide substrate mycelium. Only after a few days - depending on the culture conditions - does a monopodially branched aerial mycelium develop from this, which gradually grows into a woolly covering. The substrate mycelium breaks down into parts of different lengths from 1 to 15, and also forms 1, 2 to 1, 5, long segmentation pores; Long chains of the same segmentation pores could be found in the aerial mycelium.
None of the species of the genus Nocardia (or Proactinomyces Jensen 1934) mentioned by Waksman (Bergey's Manual VII, 713 [1957]) and by Krassilnikow (Diagnosis of Bacteria and Actinomycebes, Jena 1959) correspond to the strain 27413. On the other hand, the trunk has the characteristic sleep properties of Nocardia braziliensis (Lindenberg) Castellani et Chalmers 1913 (cf. Gordon et al., J. Bacteriol. 73, 15 [1957]; Bojalil et al., J.
Bacteriol. 78, 852 [1959]; Bojalil et al., Mycopathologia et Mycologia Appl. 11, 287 [1957]; Burns et al., Mycopathologia et Mycologia Appl. 11 297 [1957]) and is therefore included in this species.
For further characterization, the growth of Nocardia brasiliensis 27413 on various nutrient media is described below. The preparation of the nutrient media is the same as given for S. anti bioticus 27083 above.
1. Synthetic agar: initially thin, veil-like, white-yellow, later somewhat wrinkled and light-yellow or yellow-brown; with abundant velvety, at the end woolly, snow-white aerial mycelium.
2. Glucose asparagine agar: growth djinn like a veil, white-yellow to light yellow, later wrinkled and golden-yellow; Aerial mycelium woolly, snow-white to occasionally white-gray.
3. Gelatin tint (27 C): growth on the surface, light brown to raw brown; Gelatin is rapidly liquefied (2 cm in 7 days).
4. Starch plate: growth point-like, light yellow; Hydrolysis 0.9 cm after 5 days.
5. Litmus milk: Point-shaped, colorless to white-yellow ring growth; Peptonization and coagulation; pH after 7 days 7, 25.
6. Peptone-Iron-Agar: Growth thin, veil-like, white-yellow to light-yellow; negative reaction.
7. Yeast extract agar: growth wrinkled, rarely thin, veil-like, golden yellow to light brown; with abundant woolly, snow-white to white-yellow aerial mycelium.
8. Carvajal's oatmeal agar: growth thinly veil-like, initially light brown, later light yellow-red and finally red-brown; Aerial mycelium woolly, snow-white to white-yellow.
9. Chromogen agar: growth thin, haze-like, light yellow; no melanin formation.
10. Nitrate broth: initially flooken sediment and white-yellow ring growth, later wrinkled pellicle; Nitrates are reduced to nitrites.
For the production of ferrioxamine E, not only the strains mentioned can be used, but also variants of these organisms, such as those obtained by selection or mutation, in particular as a result of the action of ultraviolet and X-rays, or of nitrogen oils.
To obtain ferrioxamine E, one of the mentioned microorganisms is aerobically cultivated in an aqueous nutrient solution containing a carbon and nitrogen source as well as inorganic salts and possibly growth-promoting substances until it shows a substantial ferrioxamine activity and ferrioxamine E is isolated on it. For the cultivation of the mentioned microorganisms come as an assimilable carbon source carbohydrates, z. B. glucose, sucrose, lactose, mannitol, starch and glycerin in question.
Nitrogen-containing nutrients and possibly growth-promoting substances are: amino acids, peptides and proteins as well as their breakdown products such as peptone or tryptone, also meat extracts, water-soluble parts of cereal grains such as maize and wheat, of distillation residues from alcohol production, of yeast, seeds, in particular . the rapeseed and soya plants, the cotton plant, etc., but also ammonium salts and nitrates. The nutrient solution can contain other inorganic salts, for example, chlorides, carbonates, sulphates of alkalis, alkaline earths, magnesium, iron, zinc and manganese.
The cultivation takes place aerobically, for example in resting surface culture or preferably submerged with shaking or stirring with air or oxygen in shaker bottles or the known fermenters. A suitable temperature is, for example, between 18 and 40. The close-up solution generally shows a significant ferrioxamine effect after 2-10 days. For culture one gives z. B. 0.1% ferichloride and separates the mycelium from the cultural property, after which the majority of the ferrioxamine is found in the culture filtrate. Nevertheless, significant amounts of it remain absorbed by the mycelium. It is therefore vojcteilihait to wash out the latter well.
For example, water and / or aqueous organic solvents, such as alcohols, e.g. B. aqueous methanol.
For the isolation of Ferrioxamine E from de; m culture filtrate can be followed by methods known per se and z. B. use one of the following working methods or combinations thereof.
1. Maan can use adsorbents, e.g. B.
Activated carbons such as Norit, active earths such as Fankonti, Fullererde or Floridin, or resin adsorbers such as Asmit. The elution of the adsorbates expediently takes place with mixtures of) water-miscible organic solvents with water, e.g. B. with water-methanol, water-pyridine, dilute acetic acid-methanol or water-methanol glacial acetic acid-butanol mixtures. The mixture of water (4 parts by volume) and pyridine (1 part by volume) has proven to be particularly advantageous for the elution of a Frankonite or Norit adsorbate.
2. A second method for separating the ferrioxamine is that it is adsorbed on cation exchangers, resins containing acid groups such as Dowex 50 being particularly suitable.
The latter can be used both in the acid form and in the sodium form, but a mixture of these two forms has also proven useful. The elution is conveniently done with acidic agents, e.g. B. with methanolic hydrochloric acid or acidic buffer solutions.
3. Furthermore, the ferrioxamine can be removed from an aqueous solution by means of organic solvents. For these Extraktionsrerfahreni have higher organic alcohols, z. B. benzyl alcohol or isopropyl alcohol, particularly proven. Appropriately, the aqueous phase is an inorganic cal salt, z. B. ammonium sulfate or sodium chloride, added. From the organic extracts obtained, the ferrioxamine can either by evaporating the solvent from or by precipitation using a suitable organic solvent, e.g. B. ether, petroleum ether or ethyl acetate, can be obtained in enriched form.
4. Another method of enriching ferrioxamine is to distribute it between an aqueous solution and a solution of phenol in chloroform, both the pH of the aqueous solution and the phenol content of the chloroform solution being varied.
If one understands by the distribution coefficient of ferrioxamines the ratio of concentration in the organic phase to the concentration in the aqueous phase, it follows that the distribution coefficient increases with increasing phenol content of the organic phase and decreases with decreasing pH of the aqueous phase. Since it is thus possible to set any desired distribution coefficient of ferrioxamines in this system, a large number of inactive impurities can be separated off by combining a few distribution operations.
5. Another method for the enrichment and / or separation of the fenioxamine is chromatography, such as adsorption chromatography on various materials, e.g. B. Norit, aluminum oxide, magnesium silicate, silica gel, calcium sulfate, and partition chromatography with cellulose, starch, silica gel, Celite and the like. do. as carrier substances, or chromatography on ion exchange resins, e.g. On Dowex 50p, Amberlite TRC-5 and the like. dgal.
6. Furthermore, the ferrioxamine can be enriched by countercurrent distribution according to Craig between two immiscible solvent phases.
The following solvent systems have particularly proven themselves: a) Benzyl alcohol-20% aqueous solution of ammonium sulfate. b) n-butanol (100 parts by volume) - benzyl alcohol (200 parts by volume) -l-n. Salt sauna (6 parts by volume) - water (300 parts by volume) -aqueous, at 19 saturated sodium chloride solution (60 parts by volume).
The temperatures are given in degrees Celsius in the following examples.
Example 1
The strain Nocardia brasilionsis (Lindenberg) Castellani et Chalmers 27413 is grown in well-ventilated submerged culture at 27. A nutrient solution is used which contains 20 g soya bean meal (full fat) and 20 g mannitol per liter of tap water. The pH is adjusted to 7.8 with potassium hydroxide. After 6 days, 1 # ferric chloride is added to the crude cultures and the mixture is filtered off with the addition of Celite.
20 g of common salt per liter are added to the culture filtrate. The clear solution is extracted several times with a chloroform-phenol mixture (1 ml: 1 g).
800 mg of chlorodoform phenol extract (from 1 liter of culture filtrate) are subjected to a countercurrent distribution according to Craig. A solvent system consisting of 3 liters of n-butyl alcohol, 1.5 liters of benzyl alcohol, 4.5 liters of 0.001-n is used for this. Hydrochloric acid and 0.9 liters of saturated aqueous sodium chloride solution. The substance is poured into the first two glasses of the apparatus and distributed over 60 stages. Brown, inactive impurities accumulate in fractions 0 to 2 and 51 to 60, while at the maximum in level 37 a uniform red zone forms.
The colorimetric evaluation at 430 m, u gives a curve corresponding to a uniform connection. Antisideromycin activity can be detected in levels 25 to 45 (maximum 316-39) (modified Bonifas test).
The distribution maximum corresponds to a distribution coefficient K = 1.593.
The parliamentary groups 30-43 in the distribution are united. The lower phase is separated off and washed twice with ether. The upper phase is mixed with ether and extracted three times with water. The extracts washed with ether are combined with the previously separated lower phase.
Now the combined extracts are saturated with table salt and extracted with a mixture of equal parts of phenol and chloroform. The extract is dried with sodium sulfate, mixed with three times the volume of ether and extracted three times with water. The red-brown ferrioxamine E is completely converted into the aqueous phase. Practically pure ferrioxamine E can be obtained from this by evaporation in a vacuum. The residue is in approx.
Dissolve 20 ml of hot methanol and evaporate to 4-5 ml. When standing in the cold, pure ferrioxamine E crystallizes out in very fine, red-brown, shiny needles that lose their birefringence and, when heated, char without melting. The yield is 28 mg.
Example 2
Streptomyces antibioticus (Waksman et Woodruff) Waksman et Henrici 27083 strain is grown in well-ventilated submerged culture at 27. A nutrient solution is used which contains 20 g of rapeseed meal and 20 g of malt extract per liter of tap water. The pH is adjusted to 7.5 with potassium hydroxide. After 6 days the raw culture becomes 1! oo ferric chloride added and filtered off with the addition of Celite. The culture liquid is worked up in the manner described in Example 1. It does not contain any ferrioxamine other than ferrioxamine E.
This is isolated as described in Example 1.
Example 3
Streptomyces antibioticus (Waksman et Woodruff) Waksman et Henrici 27083 strain is grown in well-ventilated submerged culture at 27. A nutrient solution is used which contains 20 g of glucose per liter,
Contains 5 g of l-asparagine, 1 g of magnesium sulfate, 0.5 g of calcium chloride and 1 g of secondary potassium phosphate.
After 8 days, 1 # ferric chloride is added to the crude culture and filtered off with the addition of Celite. The culture liquid is worked up in the manner described in Example 1. It does not contain any other ferrioxamine than ferrioxamine E. This is isolated as described in Example 11.
In the same way, Ferrioxamine E is through
Breeding of Nocardia brasiliensis (Linderberg)
Castellani et Chalmers ETH 27413 obtained on the above synthetic nutrient solution.