DE10361598A1

DE10361598A1 - Gefriergetrocknete Formulierung von Antikörperkonjugaten

Info

Publication number: DE10361598A1
Application number: DE2003161598
Authority: DE
Inventors: Stefan Bassarab; Christian Berger; Nicole Denkinger; Patrick Garidel
Original assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2003-12-24
Publication date: 2005-07-28

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft gefriergetrocknete (= lyophilisierte) pharmazeutische Zusammensetzungen von Antikörpern, bevorzugt von Antikörpern, die an ein Effektormolekül konjugiert sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung stabile gefriergetrocknete Formulierungen von Antikörper-DM1-Komplexen. Des weiteren betrifft diese Erfindung Verfahren zur Lyophilisation von Antikörper-DM1-Komplexen.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft gefriergetrocknete (= lyophilisierte) pharmazeutische Zusammensetzungen von Antikörpern, bevorzugt von Antikörpern, die an ein Effektormolekül konjugiert sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung stabile gefriergetrocknete Formulierungen von Antikörper-DM1 Komplexen. Desweiteren betrifft diese Erfindung Verfahren zur Lyophilisation von Antikörper-DM1 Komplexen.

Im Stand der Technik sind rekombinante Antikörpermoleküle seit längerer Zeit bekannt z.B. humanisierte Mausantikörper (Shin et al., 1989; Güssow et Seemann, 1991), bispezifische Antikörper (Weiner et al., 1993; Goodwin, 1989), single-chain-Antiköper (scFv, Johnson et Bird, 1991), komplette oder fragmentarische Immunglobuline (Coloma et al., 1992; Nesbit et al., 1992; Barbas et al., 1992) oder durch chain shuffling erzeugte Antikörper (Winter et al., 1994). Heutzutage können vollhumane Antikörper durch z.B. "phage display" Verfahren (Aujame et al., 1997; US 5,885,793 ; US 5,969,108 ; US 6,300,064 ; US 6,248,516 , US 6,291,158 ) oder mittels transgener Mäuse, die transgen für funktionelle humane Ig Gene sind, hergestellt werden ( EP 0 438 474 ; EP 0 463 151 ; EP 0 546 073 ).

Weiterhin sind Konjugate aus Antikörpern mit Effektormolekülen bekannt, wie z.B. single-chain-Antikörper/Toxin-Fusionsproteine (Chaudhary et al., 1990; Friedman et al., 1993); Konjugate aus Antikörpern mit radioaktiven Isotopen wie ¹³¹I, ¹¹¹In, ^99mTc oder radioaktiven Verbindungen (Larson et al., 1991; Thomas et al., 1989; Srivastava, 1988), Enzymen wie Peroxidase oder alkalischer Phosphatase (Catty et Raykundalia, 1989), mit Fluoreszenzfarbstoffen (Johnson, 1989) oder Biotinmolekülen (Guesdon et al., 1979); Toxinen (Vitetta et al., 1991; Vitetta et Thorpe, 1991; Kreitman et al., 1993; Theuer et al., 1993), Zytostatika (Schrappe et al., 1992), Prodrugs (Wang et al., 1992; Senter et al., 1989), radioaktiven Substanzen, mit einem Zytokin oder einem anderen immunmodulatorischen Polypeptid verknüpft sein, z.B. mit Tumornekrosefaktor oder Interleukin-2.

CD44 ist ein Protein, dass in verschiedenen Isoformen auf einer Vielzahl von Zellen exprimiert wird (siehe z.B. für weitere Information WO02/094879A1; WO02/094325A2). Die Expression der Spleißvarianten jedoch, die die Domäne v6 (CD44v6) in der extrazellulären Region enthalten, ist auf einen Teil von Epitheliengewebe beschränkt. CD44v6, ebenso wie andere variante Exons (CD44v3, CD44v5, CD44v7/v8, CD44v10) ist ein Tumor-assoziiertes Antigen mit einem günstigen Expressionsmuster bei humanen Tumoren und normalem Gewebe (Heider et al., 1995; Heider et al., 1996; Dall et al., 1996; Beham-Schmid et al., 1998; Tempfer et al., 1998; Wagner et al., 1998). Es sind im Stand der Technik Antikörper bekannt, die für bestimmte Spleißvarianten von CD44 (CD44v, CD44var), welche nur auf einer Untergruppe von Epithelzellen exprimiert werden, spezifisch sind. Beispielsweise seien die CD44v6-spezifischen Antikörper genannt (WO02/094879A1), insbesondere auch als Konjugate mit radioaktiven oder cytotoxischen Substanzen, und besonders als Konjugate mit Maytansinoiden (WO02/094325A2).

Zur Verabreichung besagter Antikörperkonjugate an Patienten ist es notwendig, stabile Formulierungen zu entwickeln.

Eine Nachteil im Stand der Technik stellt die Abspaltung dieses funktionellen, chemischen Molekülteils vom Antikörper während der Lagerung des Produktes in einem flüssigen Zustand.

Daher ist die Aufgabe der Erfindung, neue Formulierungen für Antikörperkonjugate bereitzustellen.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Aufgabe wurde im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und Ansprüche gelöst.

Die vorliegende Erfindung umfasst gefriergetrocknete pharmazeutische Zubereitungen von Antikörpern. Stabilität des Produktes kann man erhöhen durch die Zugabe von Cyclodextrinen und/oder niedrigem pH Wert, bevorzugt von Antikörpern, die an ein Effektormolekül konjugiert sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung stabile gefriergetrocknete Formulierungen von Antikörper-DM1 Komplexen und Verfahren zu deren Herstellung.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1: In 1 ist der Unterschied von freiem DM1 Gehalt dargestellt. Dargestellt ist der Unterschied von freiem DM1 zwischen dem Nullwert und dem 4-Wochenwert, und der Unterschied zwischen dem Nullwert und dem 8-Wochenwert.

2: Aus 2 geht hervor, dass der Gehalt an freiem DM1 für die Formulierungen D (Captisol) am geringsten ist. Der Vergleich von z.B. Formulierung D1 mit B1 (selber Gehalt an Cyclodextrin) zeigt, dass der freie DM1 Gehalt halbiert ist im Vergleich zu der Formulierung B1. Einige Formulierungen zeigen sogar einen destabilisierenden Effekt auf Antikörper-DM1 Komplexen im Vergleich zu der Formulierung ohne Cyclodextrin.

Ein Vergleich der Formulierungen D mit der Formulierung ohne Cyclodextrin (1) zeigt für letztere, erhöhte (Verdoppelung) Werte für den DM1 Gehalt in der Formulierung für die 8-Wochenwerte.

3: Lyophilisationsverlauf. In 3 ist erkennbar, dass die Trocknung noch nicht vollständig beendet scheint, wenn der Haupttrocknungsprozess endet.

4: Lyophilisationsverlauf. Die Veränderungen der Programmparameter zeigen in der Trocknung deutlich bessere Ergebnisse.

5: Die in den Lyophilisator eingebrachte Anordnung ist in 5 dargestellt.

6: Lyophilisationsverlauf

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Vor der Darstellung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sei angemerkt, dass in der Beschreibung und in den Ansprüchen die Verwendung des Singulars ("ein", "das" etc.) ebenso den Plural umfasst, falls sofern nicht ausdrücklich anders dargestellt oder offensichtlich aus dem Kontext. Alle verwendeten Begriffe haben die in der Fachwelt bekannte Bedeutung, sofern nicht anders definiert. Alle hier zitierten Publikationen und Patentschriften werden hiermit vollinhaltlich in die Beschreibung aufgenommen, insbesondere im referierten Kontext.

Gefriergetrocknete Formulierungen (=lyophilisierte Formulierungen, Lyophilisationsformulierungen, Lyophilisate) stellen eine vorteilhaft einfache, praktische und kostengünstige Darreichungsform dar.

Die momentan zur Verfügung stehenden flüssigen Formulierungen von Antikörperkonjugaten erlauben nur eine Laufzeit von 12 Wochen bei einer Lagertemperatur von 2-8 °C.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend stabile Formulierungen von Antikörper-Effektormolekülkonjugaten sowie Methoden zur Herstellung von stabilen Antikörper-Effektormolekülkonjugaten. Ziel ist es die Reduzierung der Entstehung von freiem Effektormolekül während der Lagerung des Produktes.

Dies wurde überraschenderweise durch die Entfernung von Wasser durch Gefriertrocknung, durch Verwendung einer speziellen Formulierung (4 w% Mannitol, 1 w% Saccharose, bei pH 6.5). Auch durch Erniedrigung des pH Wertes der Lösung wird besagte Stabilitätserhöhung erreicht.

Alternativ oder in Kombination mit der Erniedrigung des pH Wertes der Lösung erreicht man stabilere gefriergetrocknete Formulierungen in überraschend vorteilhafter Weise durch Zugabe eines Cyclodextrins oder eines ampiphilen Moleküls, wie unten detaillierter beschrieben.

Als besonders geeignet zur Stabilisierung des Komplexes im gefriergetrockneten Zustand haben sich:

1. eine Erniedrigung des pH Wertes auf pH 5-6, bevorzugt 5.5.
2. Zugabe des Cyclodextrins in Konzentrationen von 0.01 – ca. 40 Gewichtsprozent (w%), vorzugsweise 0.1–20 w%, besonders bevorzugt 0.1 – 10 w% erwiesen.
3. Verwendung von Mannitol und Saccharose als Gerüstbildner.

Die Formulierung mit erniedrigtem pH und/oder mit Cyclodextrin kann die Abspaltung des konjugierten Effektormoleküls vom Antikörper in überraschend vorteilhafter Weise verhindern.

Bei den erfindungsgemäß zu verwendenden Cyclodextrinen (CD) handelt es sich um zyklische Oligosaccharide oder zyklische Polymere, deren Ringsysteme aus sechs, sieben oder acht α-1,4-verknüpften Glucose-Einheiten bestehen, und entsprechend ihrer Anzahl an Monomeren als α-, β- bzw. γ-Cyclodextrine bezeichnet werden. Von den Cyclodextrinen ist bekannt, daß sie mit verschiedenen Biomolekülen, wie z.B. Fettsäuren oder Aminosäuren, Inklusionskomplexe bilden, bzw. diese bis zur Sättigung einschließen können. Die verschiedenen zur Verfügung stehenden Cyclodextrine unterscheiden sich in erster Linie durch unterschiedliche Ringgröße (α-Cyclodextrine, β-Cyclodextrine, γ-Cyclodextrine). Außerdem gibt es verschieden substituierte Cyclodextrine, deren Toxizität und Protein-Cyclodextrin-Wechselwirkungseigenschaften unterschiedlich sind.

Zu den geeigneten Cyclodextrinen gehören beispielsweise substituierte β-Cyclodextrine (bestehend aus 7 Glucopyranoseeinheiten), Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (HP-β-CD), Sulfobutylether-β-Cyclodextrin (SBE-β-CD), γ-Cyclodextrin (bestehend aus 8 Glucopyranoseeinheiten) und Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrin (HP-γ-CD).

Bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Cyclodextrine Sulfoalkylether-Cyclodextrine (SAE-CD) der folgenden Formel verstanden:

worin
n = 4, 5 oder 6
die Reste R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ und R₉ jeweils, unabhängig, -O- oder eine -O- (C₂-C₆ Alkylen)-SO₃-Gruppe ist,
worin mindestens einer der Reste R₁ und R₂ unabhängig eine -O-(C₂-C₆ Alkylen)-SO₃-Gruppe ist,
bevorzugt eine -O-(CH₂)_mSO₃-Gruppe,
worin m 4 ist, (z.B. -OCH₂CH₂CH₂SO₃ – oder -OCH₂CH₂CH₂CH₂SO₃-); und
S₁, S₂, S₃, S₄, S₅, S₆, S₇, S₈ und S₉ sind jeweils, unabhängig, ein pharmazeutisch akzeptables Kation, umfassend, z.B. H+, Alkalimetalle (z.B. Li⁺, Na⁺, K⁺), Erdalkalimetalle (z.B., Ca.⁺⁺, Mg⁺⁺), Ammoniumionen und Aminkationen wie z.B. die Kationen von (C1-C6) Alkylaminen, Piperidin, Pyrazin, (C1-C6) Alkanolamin und (C4-C8)-Cycloalkanolamin.

Besonders bevorzugte Cyclodextrine sind insbesondere gamma-Cyclodextrin (γ-CD), Hydroxypropyl-gamma-cyclodextrin (HP-γ-CD), Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-β-CD) oder Sulfobutylether-beta-cyclodextrin (SBE-β-CD).

Von der sehr großen Anzahl der bisher publizierten Literatur, die sich mit der Herstellung und Verwendung von Cyclodextrinen, insbesondere der β-Cyclodextrine, befaßt, sollen nur beispielhaft die folgenden Publikationen genannt werden: Manning, M. et al., Pharm. Res. 6, 1903-1918, 1989; Yoshida, A. et al., Int. J. Pharm. 461, 217-222, 1988; Brewster, M. et al., Int. J. Pharm. 59, 231-243, 1980; Pitha, J. et al., Int. J. Plaarm. 29, 73-82, 1986; Pitha, J. & Pitha J., J Pharm. Sci. 74, 987-990, 1985; Brewster, M. et al., J. Parent. Sci. Technol. 43, 231-240, 1978. Insbesondere wird von Pitha J. & Pitha, J., loc. cit. (1986) die Herstellung von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) beschrieben, und es wird berichtet, daß durch Verwendung von HP-β-CD die Wasserlöslichkeit der verschiedensten Wirkstoffe und biologischen Markromoleküle verbessert wird. Hinsichtlich der Verwendung der Cyclodextrine auf pharmazeutischem Gebiet sei auf die Übersichtsartikel von Pitha, J. et al., in: Controlled Drug Delivery [Bruck, S.D., Hrsg.] Vol. I, CRC Press, Boca Raton, Florida, 125-148, 1983, verwiesen, oder auf Uekama, K., et al., in: CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Vol. 3 (1), 1-40, 1987; bzw. auf Uekama, K., in: Topics in Pharmaceutical Sciences 1987 [Breimer, D.D. and Speiser, P., Hrsg.] Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical Division), 181-194, 1987). Die Verwendung von insbesondere 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin zur Solubilisierung und Stabilisierung von verschiedenen biologisch aktiven Proteinen wird von Brewster, M.E. et al., Pharm. Res. 8, 792-795, 1991, näher beschrieben.

Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Cyclodextrin ein Cyclodextrin ausgewählt aus der folgenden Tabelle.

Tabelle 1

Ein ganz besonders bevorzugtes Hydroxypropyl-γ-cyclodextrin mit einem molaren Substitutionsgrad von 0,5 bis 0,7 ist beispielsweise von der Firma Wacker-Chemie GmbH, D-Burghausen, unter dem Namen „CAVASOL^® W8 HP Pharma" im Handel.

Besonders überraschend vorteilhaft hat sich die Formulierung unter Verwendung des Cyclodextrins Sulfobutylether-beta-Cyclodextrin (SBE-β-CD), auch kommerziell unter dem Namen Captisol (Firma CyDex, USA) erhältlich, erwiesen.

Das besagte ganz besonders bevorzugte Cyclodextrin ist in den bevorzugten erfindungsgemäßen Formulierungen in Gewichtsprozenten pro Volumen (w%) von 0.001 bis ca. 40 w %, vorzugsweise 0.1-20 w%, besonders bevorzugt 0.1 – 10 w% oder 1-5 w% vorhanden. Ganz besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Cyclodextrin zu ca. 1, 5 oder 15 w% vorhanden. Besonders bevorzugt ist SBE-β-CD zu ca. 1, 5 oder 15 w% vorhanden.

Die Erfindung betrifft Formulierungen von Antikörperkonjugaten. Die Begriffe „Antikörper" und „Antikörpermolekül" sind gleichbedeutend. Antikörper können vollständige Immunglobuline sein, enthaltend zwei schwere und zwei leichte Ketten, Fragmente solcher Immunglobuline wie z.B. Fab, Fab', or F(ab)₂ Fragmente, rekombinant hergestellte Antikörpermoleküle wie chimäre, humanisierte oder ganz humane Antikörper. Unter Antikörperkonjugat wird ein Komplex aus Antikörper und Effektormolekül verstanden.

Beispielsweise seien als erfindungsgemäße Antikörper genannt: HER2 Antikörper wie z.B. Herceptin^® (trastuzumab, Genentech, Inc.), VEGF spezifische Antikörper wie Bevacizumab (Genentech, Inc.); Rituxan (rituximab), Anti-EFGR Antikörper ABX-EGF; Antikörper ABX-CBL (Abgenix); Antikörper ICR-62 (ICR, Sutton, England Xolair (omalizumab), C242 (cantuzimab, ImmunoGen), Erbitux (Cetuximab, LMC-C225, ImClone Systems); monoklonaler Antikörper 425 (Merck KGaA); Mitumomab (Imclone Systems and Merck KGaA); Antegren (natalizumab). Ein erfindungsgemäßes Antikörperkonjugat kann aus einem der erfindungsgemäßen Antikörper und einem Effektormolekül hergestellt werden, optional in Kombination mit einem verbindenden Molekül, einem sog. Linker.

Beispielsweise für ein Effektormolekül seien genannt: Toxine, wie auch die weiter unten bevorzugten Maytansionoide oder das beispielhaft genannte DM1, radioaktive Isotope wie ¹³¹I, ¹¹¹In, ^99mTc, Enzyme wie Peroxidase oder alkalischer Phosphatase, Fluoreszenzfarbstoffe oder Biotinmoleküle, Zytostatika (Doxorubicin, Taxane wie Taxotere^®, ( EP 0 253 738 , US 4,814,470 ) Docetaxel, Daunorubicin, Dactinomycin, Plicamycin, Mitomycin, Bleomycin, Idarubicin, Cyclophosphamid, Mechlorethamin, Melphalan, Chlorambucil, Procarbazin, Dacarbazine, altretamine, Cisplatin, Carboplatin, Oxaliplatin, Iproplatin, Ormaplatin, Tetraplatin), Methotrexat, Mercaptopurin, Thioguanin, Fludarabinphosphat, Cladribin, Pentostatin, Fluorouracil: 5-FU, Cytarabin, Azacytidin), Prodrugs, Zytokin, immunmodulatorisches Polypeptid wie z.B. Tumornekrosefaktor oder Interleukin-2.

Beispielsweise für erfindungsgemäße Antikörperkonjugate seien die Antikörperkonjugate AS 1406 (Antisoma); der humanisierte Antikörper HMFGI, der an das Enzym RNase gebunden ist; Zevalin (Ibritumomab tiuxetan); Bexxar (Corixa, iodine I-131 tositumomab); oder die unten genannten Maytansinoid- oder DM1-Konjugate genannt.

Die erfindungsgemäße Konzentration des Antikörperkonjugat Komplexes beträgt zwischen 0.01 und 40 mg/ml, vorzugsweise zwischen 0.1 – 20 mg/ml, insbesondere zwischen 0.1 – 10 mg/ml.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Komplexierung des Antikörperkonjugates mit Cyclodextrinen und Hydroxysäuren. Dabei kann die benötigte Menge an Cyclodextrin durch die Bildung eines ternären Komplexes bestehend aus dem Antikörper-Konjugat, dem jeweiligen Cyclodextrin und einer Hydroxysäure reduziert werden. Zu den geeigneten Cyclodextrinen gehören beispielsweise, HP-β-CD, SBE-β-CD, γ-CD und HP-γ-CD. Neben dem Wirkstoff und dem Cyclodextrin können die zur parenteralen Anwendung bestimmten erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen daher Hydroxysäuren wie beispielsweise Äpfelsäure, Milchsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure oder Zitronensäure enthalten.

Als erfindungsgemäße Gerüstbildner kommen Zucker und deren Kombinationen wie Mannitol und Saccharose, Trehalose, Lactose und Maltose in Frage oder aber Aminosäuren wie Arginin, Glycin oder Proteine selbst wie HSA (humane serum albumine oder bovines).

Das Gewichtsverhältnis von Mannitol zu Saccharose kann 1 bis 100 bzw 100 bis 1, bevorzugt 1 bis 60 bzw, 60 bis 1, insbesondere 4 bis 1 bzw, 1 bis 4 w% betragen.

Das molare Verhältnis von Wirkstoff zu Cyclodextrin liegt erfindungsgemäß zwischen 1:1 und 1:3300. Bevorzugt ist ein molares Verhältnis von 1 : 100 bis 1 1500, insbesondere 1:100 bis 1:600. In Gegenwart von Hydroxysäure liegt das molare Verhältnis von Wirkstoff zu Cyclodextrin erfindungsgemäß wie vorgenannt vor.

Geeignete Amphiphile, die statt der erfindungsgemäßen Cyclodextrine verwendet werden für die erfindungsgemäßen pharmazeutische Zusammensetzungen sind beispielsweise Cholinderivate (C6-C20), natürlich vorkommende Choline (Ei- und Soja-Lecithin) beispielsweise wie Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC), Dipalmitoyl- phosphatidylcholin (DPPC), Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) oder Ethanolamin-derivate (C6 bis C20) natürlich vorkommende Ethanolamine (Ei- und Soja-Ethanolamine) beispielsweise wie Dimyristoylphosphatidylethanolamin (DMPE), Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE), Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), wobei DOPE besonders bevorzugt ist.

Desweiteren können als weitere Phospholipide die entsprechenden Glycerolderivate (C6-C20) oder Phosphatid-Säuren (C6-C20) mit gesättigten und ungesättigten Fettsäuren eingesetzt werden.

Gegebenenfalls enthalten die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen ferner übliche Hilfs- und Trägerstoffe wie beispielsweise die Isotonanzien Glucose, Mannitol oder Natriumchlorid oder Natriumacetat bzw. Natriumacetat-Trihydrat als Puffer in Verbindung mit Essigsäure oder einen Zitronensäure/Phosphat-Puffer bestehend z.B. aus Zitronensäure und Dinatriumhydrogenphosphat bzw. Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat. Als Lösungsmittel dient üblicherweise Wasser für Injektionszwecke.

Die Konzentrationen solcher Hilfs- und Trägerstoffe sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise aus Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 18th ed. Mack Publ., Easton, zu entnehmen.

Der pH kann mit folgenden Agenzien erniedrigt werden (sauer werden, je nach StartpH Wert) werden: HCl, H₃PO₄ und andere Derivate der Phosphorsäure, HNO₃, H₂SO₄, CH₃COOH, oder alle pharmazeutisch akzeptablen, hierfür bekannten Säuren, oder durch Auswahl geeigneter Puffersysteme ausgewählt aus der Gruppe von Puffersystemen auf der Grundlage von monobasichen Säuren: Essig-, Benzoe-, Glucon-, Glycerin-, Lactat-; dibasische Säuren: Aconit-, Adipin-, Ascobin-, Karbon-, Glutamin-, Apfel-, Bernstein-, Tartrat-; polybasische Säuren: Citrat-, Phosphat-, oder Basen: Ammoniak, Diethanolamine, Glycine, Triethanolamine, Tromethamine und deren Salze eingestellt werden. Sollte wegen zu niedrigem pH Wert dieser erhöht werden müssen, kommen die einschlägig bekannten Substanzen bzw. Lösungen hiervon wie NaOH, KOH, Ammoniaklösung etc. in Frage.

Als weitere Inhaltsstoffe, als zusätzliche Stabilisatoren, kann die pharmazeutische Zusammensetzung auch Salze bzw. Salzlösungen enthalten, insbesondere pharmazeutisch akzeptable Salze, wie zum Beispiel anorganische Salze wie Chloride, Sulfate, Phosphate, di-Phosphate, Hydrobromide und/oder Nitrat-Salze. Ferner kann die Lipidsuspension auch organische Salze beinhalten, wie z.B. Malate, Maleate, Fumarate, Tartrate, Succinate, Ethylsuccinate, Citrate, Acetate, Lactate, Methansulfonate, Benzoate, Ascorbate, Paratoluensulfonate, Palmoate, Salicylate, Stearate, Estolate, Gluceptate oder Labionat-Salze.

Als weitere Hilfsstoffe kann die pharmazeutische Zusammensetzung verschiedene Aminosäuren wie Arginin und Glycin enthalten. Weitere geeignete Aminosäuren sind dem Fachmann bekannt.

Beispiele für optional in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Polymere umfassen Polyvinylpyrrolidone, derivatisierte Zellulosen, wie z.B. Hydroxymethyl-, Hydroxyethyl-, oder Hydroxypropyl-ethylzellulose, polymere Zucker wie z.B. Ficoll oder Dextran, Stärke wie z.B. Hydroxyethyl- oder Hydroxypropylstärke, Dextrine wie z.B. Cyclodextrine (2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, Sulfobutylether-β-cyclodextrin), Polyethylene, Glykole, Chitosan, Collagen, Hyaluronsäure, Polyacrylate, Polyvinylalkohole und/oder Pektine.

Beispiele für optional in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Zucker sind Mono-, Di-, Oligo- oder Polysaccharide oder eine Kombination hieraus. Beispiele für Einfachzucker sind vorzugsweise die Aldohexosen, Ketohexosen und ihre Derivate und optischen Isomere, Fruktose, Maltose, Galaktose, Glucose, D-Mannose, Sorbose, D(+)-Glucose, D(+)-Mannose, D(+)-Galactose, D(–)-Fructose, D(+)-Sorbose, und der gleichen.

Zweifachzucker sind beispielsweise Laktose, Saccharose, Sucrose, Trehalose, Cellobiose, und dergleichen.

Als Mehrfachzucker oder Polysaccharide eignen sich insbesondere Raffinose, Melezitose, Dextrin, Stärke und dergleichen.

Beispiele für optional in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Zuckeralkohole sind neben Mannitol, bzw. D-Mannitol (D-Mannit), Xylitol, Maltitol, Galaktitol, Arabinitol, Adonitol, Laktitol, Sorbitol (Glucitol), Pyranosylsorbitol, Inositol, Myoinositol und dergleichen.

Als weitere Inhaltsstoffe kann die pharmazeutische Zusammensetzung auch Detergenzien enthalten, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe von Tween 20, Tween 60, Tween 80 (Polysorbat 20, 60, 80 Poloxamere (Pluronic) im Konzentrationsbereich von 0,01-5 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,01-0,1 Gewichtsprozent, besonders bevorzugt 0,02-0,04 Gewichtsprozent.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können im Rahmen der Erfindung zur parenteralen systemischen, z.B. intravenösen, intravaskulären, intramuskulären, intraarteriellen, intraperitonealen, oder intrathekalen Applikation verwendet werden. Eine lokalere Darreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen kann subkutan, intrakutan, intrakardiell, intralobal, intramedullär, intrapulmonar oder direkt in oder nahe dem zu behandelnden Organ erfolgen (Bindegewebe, Knochen, Muskel, Nerven- oder epitheliales Gewebe). Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung kann für alle Arten der klinischen oder nicht-klinischen Anwendung genutzt werden, worin die toxischen Verbindungen auf Zellen, die CD44 exprimieren, gerichtet werden sollte.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung betrifft die Erfindung ein Behandlungsverfahren von Krebs, indem eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung einem bedürftigen Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung verabreicht wird. Bevorzugt ist der Krebs Plattenepithelkarzinom (z.B. „Head and Neck Squameous Cell Carcinoma (SCC)", Ösophagus SCC, Lungen SCC, Haut SCC, Brustadenocarcinom, Lungenadenocarcinom, Cervix SCC, Pankreasadenocarcinom, Colonadenocarcinom, Magenadenocarcinom).

In der klinischen Behandlung von Krebs wird die erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung z.B. nach folgenden Protokollen verabreicht, z.B. wöchentlich 1 bis 6 Wochen lang als i.v. Bolus oder kontinuierliche Infusion über 5 Tage.

Die Bolusdosis kann in 50 bis 100 ml normaler Saline verabreicht werden, zu der 5 bis 10 ml von humanem Serumalbumin hinzugefügt werden. Kontinuierliche Infusionen können in 250 bis 500 ml normaler Saline verabreicht werden, zu der 25 bis 50 ml von humanem Serumalbumin hinzugefügt werden pro 24 Stunden. Die Antikörperkonjugatdosis ist im Allgemeinen 10 mg to 400 mg/m² Körperoberfläche pro Applikation. Die Dosis muss einerseits hoch genug sein, um effektiv zu sein, aber auch unterhalb der sog. „dose limiting toxicity" (DLT). Eine tolerierte, maximale Dosis unterhalb der DLT ist die "maximum tolerated dose" (MTD). Der Fachmann kennt die Bestimmung der MTD (Lambert et al., 1998). Für wöchentliche Darreichungen ist die MTD vermutlich im Bereich von 100 bis 200 mg/m². Alternativ können die Abstände zwischen Verabreichungen länger sein, z.B. zwei bis vier Wochen, bevorzugt drei Wochen. In diesem Fall ist die zu erwartende MTD im Bereich von 200 bis 300 mg/m². Alternativ kann die Darreichung in 5 täglichen Dosen, gefolgt von einer Pause von mehreren Wochen stattfinden. Dann ist die erwartende MTD niedriger als 100 mg/m². Beispielsweise kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung als einzelne i.v. Infusion mit einer Rate von 3 mg/min alle 21 Tage erfolgen. Bis zu 7 Behandlungszyklen werden angewandt. Die angewandten Dosen können sich auch außerhalb der o.g. Bereiche bewegen, wenn die klinische Situation es erfordert. Beispielsweise, wenn die MTD als höher als dargestellt gefunden wird, so kann eine einzelne Gabe auch eine höhere Dosis als 400 mg/m² sein, oder die wöchentliche Dosis höher als 200 mg/m².

Eine erfindungsgemäße Ausführung einer parenteralen Zusammensetzung von Antikörperkonjugat enthält den Wirkstoff in Dosierungen von 1 mg/kg Körpergewicht bis 40 mg/kg Körpergewicht täglich, vorzugsweise im Bereich 3-15 mg/kg Körpergewicht. Bevorzugt sind auch Dosierungen ausgedrückt in [mg/m²]: 10 [mg/m²] bis 200 [mg/m²]; besonders bevorzugt 20 bis 100 [mg/m²], ganz besonders bevorzugt 10, 20, 40 oder 50 mg/m².

Die Anwendung erfolgt in einer vorzugsweisen Ausführungsform über eine kontinuierliche Infusion über 0.5 bis hin zu 24 Stunden oder gegebenenfalls über mehrere Tage, um einen Steady-State Plasmaspiegel aufrechtzuerhalten. Die Applikationsvolumina liegen im Bereich von 50 bis 500 ml, vorzugsweise bei 100 bis 250 ml, d.h. die Anwendungskonzentrationen des Wirkstoffs liegen im Bereich 80 mg/500 ml = 0,16 mg/ml (0,015 %) bis 1500 mg/100 ml = 15 mg/ml (1,5 %). Bevorzugt ist eine Wirkstoffkonzentration von 0,5 mg/ml = 0,05 % (g/v) bis 3,5 mg/ml = 0,35 % (g/v).

Ein Schwerpunkt der Erfindung sind Formulierungen bzw. pharmazeutische Zusammensetzungen von Antikörperkonjugaten aus Antikörpern gekoppelt an Maytansinoide. Ganz besonders bevorzugt sind Antikörper-DM1 Konjugate. Beispiele für erfindungsgemäße Antikörper-DM1 Konjugate sind das Antikörperkonjugat MLN2704 bestehend aus einem monoklonalen Antikörpervehikel T-MAV, das spezifisch an Prostata-spezifisches Membranprotein bindet, konjugiert an das Maytansinoid DM1; das C242/CanAg-spezifische humanisierte monoklonale Antikörper-DM1 Konjugat cantuzumab-DM1 (Liu et al., 1996; Lambert et al., 1998); das humanisierte monoklonale Antikörper-DM1 Konjugat „huN901-DM1" spezifisch für das CD56 antigen (Chari et al., 2000); das humanisierte monoklonale Antikörper-DM1 Konjugat My9-6-DM1 spezifisch für das CD33 antigen (Aventis); humanisierte monoklonale Antikörper-DM1 Konjugate spezifisch für den IGF-1 receptor „anti-IGF1 hu MAbs" (MorphoSys/ImmunoGen); humanisierte monoklonale Antikörper-DM1 Konjugat anti-EGFRvIII-DM1 mit Zielmolekül EGFR (Abgenix).

Besonders bevorzugt sind pharmazeutische Zusammensetzungen von Antikörperkonjugaten der Formel A(LB)_n worin
A ein Antikörpermolekül ist;
L eine Linkersubstanz ist;
B eine für Zellen toxische Verbindung ist; und
n eine Dezimalzahl n = 1 bis 10 ist.

Besonders bevorzugt sind weiterhin pharmazeutische Zusammensetzung der oben beschriebenen Formel, worin die Linkersubstanz eine chemische Bindung enthält, die innerhalb einer Zelle abgespalten werden kann. Besonders bevorzugt sind weiterhin pharmazeutische Zusammensetzung der oben beschriebenen Formel, worin die chemische Bindung eine Disulfidbindung ist.

Besagte Antikörper-DM1 Konjugate können in vorteilhafter Weise in jeder der oben genannten Weisen mit oben genannten Hilfsstoffen etc. formuliert werden.

Das Antikörpermolekül A hat eine Bindungsspezifizität für CD44, bevorzugt variantes CD44.

„Spezifisch für CD44" bedeutet, dass der Antikörper spezifisch an ein Epitop in der CD44 Region bindet. Bevorzugt bindet der erfindungsgemäße Antikörper an eine Aminosäuresequenz, die von dem varianten Exon v6 des humanen CD44 Gens kodiert ist. Ein bevorzugtes Antikörpermolekül bindet spezifisch an Peptide enhaltend oder bestehend aus der Sequenz SEQ ID NO: 1 des anliegenden Sequenzprotokolls, oder einer allelen Variante besagter Sequenz. Besonders bevorzugt bindet das erfindungsgemäße Antikörpermolekül spezifisch an die of Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3. Derartige Antikörper können mit Methoden aus dem Stand der Technik hergestellt werden (WO 95/33771, WO 97/21104), z.B. durch Immunsierung von Labortieren mit chemisch synthetisierten Peptiden der o.g. Sequenzen.

Bevorzugt ist der Antikörper der murine monoklonale Antikörper VFF-18, der durch die hinterlegte Hybridomzelllinie (hinterlegt 07. Juni 1994, Zugangsnummer DSM ACC2174 bei der DSM-Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland). Ebenso bevorzugt sind humanisierte rekombinante Antikörper, bei denen die sog. „complementarity determining regions" (CDR's) von VFF-18 auf entsprechende Regionen von humanen leichten und schweren Ketten Immunglobulingenen aufgebracht wurden. "Complementarity determining regions" sind definiert analog Kabat et al., 1991, in Zusammenhang mit Chothia and Lesk, 1987.

Besonders bevorzugt ist der Antikörper A ein Antikörper enthaltend die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 und die schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6. Besagter Antikörper wird als BIWA4 bezeichnet und ist eine humanisierte Variante von VFF-18. Ebenso besonders bevorzugt ist der Antikörper A ein Antikörper enthaltend die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 8 und die schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6. Besagter Antikörper wird als BIWAB bezeichnet und ist eine humanisierte Variante von VFF-18. Die Produktion der erfindungsgemäßen Antikörper kann analog WO 02/094879A1 und WO 02/094325A2 durchgeführt werden mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 (BIWA4) und SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 7 (BIWA8), respektive. Auch die Bindung an erfindungsgemäße Toxine ist in WO 02/094325A2 ausführlich dargestellt und hiermit vollinhaltlich in die gegenwärtige Anmeldung aufgenommen.

„Toxisch" ist eine Substanz, die die Funktion von Zellen inhibiert oder vollig verhindert und/oder Zellzerstörung verursacht. Toxische Substanzen als Liganden können entweder cytostatisch oder cytotoxisch agieren und führen zu Zellcyclusarrest oder Zelltod. Diese Substanzen können an verschiedenen Punkten in den Zellzyklus eingreifen, durch Interaktion mit der Nukleinsäuresynthese, Inaktivierung von Nukleinsäuren, oder durch Tubulinbindung.

Bevorzugt ist die toxische Verbindung B ein Maytansinoid, d.h. ein Derivat von Maytansin (CAS 35846538). Bevorzugt ist B ein C-3 Ester von Maytansinol. Maytansinoide, die an Antikörper gekoppelt warden können, sind vorbeschrieben (Chari et al., 1992; Liu et al., 1996; U.S. Patent No. 5,208,020). Diese Maytansinoid können in der gegenwärtigen Erfindung benutzt werden. Bevorzugt ist die toxische Verbindung B N^2'-deacetyl-N^2'-(3-mercapto-1-oxopropyl)-Maytansin (CAS Number 139504-50-0), auch als DM1 bezeichnet. Bevorzugt ist besagtes Maytansinoid ein Maytansinol Derivat, dass an den Antikörper mit einer Disulfidbrücke an der C-3 Position von Maytansinol gekoppelt ist. Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Antikörper/Maytansinoidkonjugat aus einem Maytansinoid der folgenden Formel hergestellt

worin
R₁ bedeutet H oder SR₄, worin R₄ Methyl, Ethyl, linearer Alkyl, verzweigter Alkyl, Cycloalkyl, einfacher oder substituierter Aryl, oder heterocyclisch bedeutet;
R₂ bedeutet Cl oder H;
R₃ bedeutet H oder CH₃; und
m bedeutet 1, 2, or 3.

Bevorzugt ist R₁ H, CH₃, oder SCH₃, R₂ ist Cl, R₃ ist CH₃, und m = 2.

Die Verbindung mit R₁ = H, R₂ = Cl, R₃ = CH₃, und m = 2 wird in der Literatur als DM1 bezeichnet.

In einer bevorzugten Ausführungsform, hat die erfindungsgemäße Verbindung die Formel III

worin
A ein Antikörpermolekül ist, das spezifisch für CD44 ist, bevorzugt spezifisch für das variante Exon v6, bevorzugt spezifisch für die Aminosäure Sequenz SEQ ID NO: 3;
(L') ein optionales Linkermolekül ist
p eine Dezimalnummer mit p = 1 to 10 ist.

Bevorzugt ist p = 3 bis 4, besonders bevorzugt ca. 3.5.

Verfahren zur Herstellung besagter Maytansinoide sind im Stand der Technik bekannt (insbesondere US 5,208,020 , Beispiel 1; WO 02/094325A2).

In einer bevorzugten Ausführungsform, ist die Verbindung der Formel (I) weniger toxisch als die Verbindungen B, B-X oder B-L''-X, die nach intrazellulärer Abspaltung freigesetzt werden.

Bevorzugt werden mittels Disulfidbindungen verbundene Antikörper/Maytansinoidkonjugate, die Maytansinoidmoleküle freisetzen können. Derartige zellbindende Konjugate werden gemäß Verfahren im Stand der Technik hergestellt ( US 5,208,020 ; WO02/094325A2).

In einem weiteren Aspekt besteht das Konjugate aus einem CD44v6-spezifischen Antikörpermolekül und einem Maytansinoid. „CD44v6 spezifisch" bedeutet, dass der Antikörper eine spezifische Bindungsaffinität für ein Epitop hat, das in einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die durch das variante Exon v6 von CD44 kodiert wird, bevorzugt humanes CD44. Ein bevorzugtes Antikörpermolekül der Erfindung bindet spezifisch an Peptide oder Polypeptide umfassend oder genau mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder eine allele Variante besagter Sequenz. Bevorzugt bindet besagtes Antikörpermolekül spezifisch an ein Epitop in dieser Sequenz. Besonders bevorzugt bindet das erfindungsgemäße Antikörpermolekül spezifisch an die of Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3.

Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Antikörpermolekül in besagtem Konjugat der monoklonale Antikörper VFF-18 (DSM ACC2174) oder ein rekombinanter Antikörper mit den Komplementbindungsregionen (CDRs) von VFF-18. Besonders bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Antikörpermolekül die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 und die schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6. Ebenso besonders bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Antikörpermolekül die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 8 und die schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6. Das Maytansinoid ist bevorzugt an den Antikörper über eine Disulfidbindung gekoppelt und hat die Formel
Formel (IV)

worin die Verknüpfung mit dem Antikörper über das Schwefelatom in Formel IV an ein weiteres Schwefelatom im Antikörpermolekül erfolgt. Um ein solches Schwefelatom für eine Bindung im Antikörpermolekül zu erhalten, kann das Antikörpermolekül durch einen geeigneten Linker modifiziert warden, wie in WO 02/094325A2 dargestellt. Vorzugsweise ist das Maytansinoid an das Antikörpermolekül durch eine S-CH₂CH₂-CO-, eine -S-CH₂CH₂CH₂CH₂-CO-, oder eine -S-CH(CH₃)CH₂CH₂-CO- Gruppe gebunden. Das Schwefelatomatom in einer derartigen Linkergruppe bildet die Disulfidbindung mit dem Maytansinoid, wohingegen die Carbonylfunktion an eine Aminfunktion, die in einer Aminosäureseitenkette vorhanden sein kann, binden kann.

Auf diese Art und Weise können mehrere Maytansinoidreste an ein Antikörpermolekül gebunden werden. Bevorzugt sind 3 bis 4 gebundene Maytansinoid-Reste pro Antikörpermolekül.

Am bevorzugtesten ist ein Konjugat aus einem CD44v6-spezifischen Antikörpermolekül und einem Maytansinoid, worin das Antikörpermolekül die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 und die schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 enthält, und worin das Maytansinoid die Formel

Formel (IV)
hat und an den Antikörper über eine Disulfidbindung gekoppelt ist.

Bevorzugt ist die Linkergruppe -S-CH₂CH₂CH₂CH₂-CO- oder -S-CH(CH₃)CH₂CH₂-CO-, und die Anzahl von gebundenen Maytansinoid-Resten pro Antikörpermolekül ist 3 bis 4.

Daher bestand eine bevorzugte Aufgabe der vorliegenden Erfindung folglich darin, die Reduzierung der chemischen, bevorzugt hydrolytischen, Abspaltung des Maytansinoid bzw. DM1 Molekülteils vom Antikörper-Maytansinoid bzw. -DMI Komplex und somit zur Vermeidung von freiem Maytansinoid bzw. DM1 in der Formulierung.

Somit waren verschiedene physikalische und chemische Bedingungen zur Verfügung zu stellen, die eine hohe Lagerstabilität des Antikörper-DM1 Komplexes aufweisen. Dies wurde realisiert durch die zur Verfügungstellung von Lyophilisations-Formulierungen, durch den Einsatz von neuen Hilfsstoffen und durch die Entwicklung einer Verfahrens zur Lyophilisation von Antikörper-Maytansinoid bzw. -DM1 Komplexen.

Die vorliegende bevorzugten Methoden zur Herstellung von stabilen Antikörper-Maytansinoid bzw. -DM1 Komplexen führen zu einer Reduzierung der Entstehung von freiem Maytansinoid bzw. DM1 und deren Derivate während der Lagerung des Produktes.

Dies wird überraschenderweise durch Entfernung des Wassers durch Gefriertrocknung und Verwendung von ausgewählten Hilfsstoffen erreicht. Desweiteren ist die Erniedrigung des pH Wertes vorteilhaft.

erreicht durch Erniedrigung des pH Wertes. Alternativ oder in Kombination mit der Erniedrigung des pH Wertes der Lösung erreicht man stabilere gefriergetrocknete Formulierungen in überraschend vorteilhafter Weise durch Zugabe eines oder mehrerer der oben beschriebenen Cyclodextrine oder eines ampiphilen Moleküls, wie oben detaillierter beschrieben.

Bevorzugte Cyclodextrine sind insbesondere gamma-Cyclodextrin (γ-CD), Hydroxypropyl-gamma-cyclodextrin (HP-γ-CD), Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-β-CD) oder Sulfobutylether-beta-cyclodextrin (SBE-β-CD).

Besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung des Cyclodextrin Captisol (SBE-β-CD: Sulfobutylether-β-Cyclodextrin) (0.001 bis 40.69 w%) erwiesen. Diese Änderungen der Formulierung sind auch wichtig für die Prozessschritte vor und während der Lyophilisation. In überraschend vorteilhafter Weise kann durch entsprechende Kombination der oben erwähnten Methoden die Laufzeit einer Lyophilisations-Formulierung (gelagert bei 2-8°C) um den Faktor 6 bis 8 verlängert werden kann im Vergleich zu einer Referenzformulierung (flüssige Form) (vergleiche experimenteller Teil).

1. eine Erniedrigung des pH Wertes auf pH 5-6, bevorzugt 5.5, besonders bevorzugt durch Natriumsuccinatpuffer gepuffert.
2. Zugabe des Cyclodextrins in Konzentrationen von 0.01 – ca. 40 Gewichtsprozent. (w%), vorzugsweise 0.1–20 w%, besonders bevorzugt 0.1 – 10 w% erwiesen.
3. bei Verwendung von Mannitol und Saccharose als Gerüstbildner. Nach einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration des Antikörperkonjugat Komplexes zwischen 0.01 und 40 mg/ml, vorzugsweise zwischen 0.1 – 20 mg/ml, insbesondere zwischen 0.1–10 mg/ml.

In überraschend vorteilhafter Weise kann durch entsprechende Kombination der oben erwähnten Methoden die Laufzeit einer Lyophilisations-Formulierung (gelagert bei 2-8°C) um den Faktor 6 bis 8 verlängert werden kann im Vergleich zu einer Referenzformulierung (flüssige Form) (vergleiche experimenteller Teil). Nach einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur Stabilisierung von Antikörper-DM1 Komplexen in einer gefriergetrockneten Formulierung durch Kombination der beiden oben genannten Stabilisierungsmethoden: pH Erniedrigung und Anwesenheit von Captisol in der Formulierung.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es gelungen, Methoden zur Vermeidung der DM1 Abspaltung vom Antikörper in einer gefriergetrockneten Formulierung zur Verfügung zu stellen. Die erfindungsgemäße Methoden zeichnet sich durch ein hohes Maß an Stabilität des Antikörper-DM1 Komplexes aus. Die Laufzeit liegt bei 2-8 °C bei 18 bis 24 Monaten. Nach Rekonstitution der gefriergetrockneten Darreichungsform mit Wasser (WFI water for injection) oder einer Salzlösung erhält man eine flüssige Darreichungsform für die parenterale Verabreichung, bevorzugt die intravenöse Applikation.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass eine pH Erniedrigung und/oder die Anwesenheit von Captisol zur Stabilisierung von gefriergetrocknet formulierten Antikörper-DM1 Komplexen führt.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration des Antikörper-DM1 Komplexes zwischen 0.01 und 40 mg/ml, vorzugsweise zwischen 0.1–20 mg/ml, insbesondere zwischen 0.1 – 10 mg/ml. Als besonders geeignet zur Stabilisierung des Komplexes im gefriergetrockneten Zustand haben sich:

1. eine Erniedrigung des pH Wertes auf pH 5-6, bevorzugt 5.5.
2. Zugabe von Captisol (0.01 – ca. 40 w%), vorzugsweise 0.1–20 w%, besonders bevorzugt 0.1 – 10 w% erwiesen.
3. Verwendung von Mannitol und Saccharose als Gerüstbildner, bevorzugt im Gewichtsverhältnis von Mannitol zu Saccharose 4 : 1 w/w.

Eine bevorzugte Formulierung enthält einen Phosphatpuffer, Kochsalz, Tween 20, Mannitol zu Saccharose 4 : 1 w/w sowie eines der oben beschriebenen Antikörperkonjugate, besonders bevorzugt das oben beschriebene Antikörperkonjugat aus CD44v6-spezifischem Antikörper gekoppelt an das Maytansinoid DM1. Besonders bevorzugt ist eine Formulierung enthaltend ein Phosphatpuffer aus 1-1,9 mM NaH₂PO₄ × H2O; 4-5 mM KH2PO4; 3,5-4,5 mM Na2HPO4, weiterhin enthaltend Mannitol zu Saccharose 4 : 1 w/w, 30-100 mM NaCl; 0,01-0,05 w% Tween 20 und Antikörperkonjugat, bevorzugt Antikörper-DM1 Konjugat, besonders bevorzugt das oben beschriebene Antikörperkonjugat aus CD44v6-spezifischem Antikörper gekoppelt an das Maytansinoid DM1, in Konzentration von 1-5 mg/mL bei einem pH von 5-6. Besonders bevorzugt ist der pH 5,5.

Ganz besonders bevorzugt ist eine Formulierung enthaltend einen Phosphatpuffer aus ca. 1,45 mM NaH₂PO₄ × H2O, ca. 4,19 mM KH2PO4, ca. 3,91 mM Na2HPO4, Mannitol zu Saccharose 4 : 1 w/w, sowie ca. 60 mM NaCl, sowie ca. 0,02 w% Tween 20 und Antikörperkonjugat, bevorzugt Antikörper-DM1 Konjugat, besonders bevorzugt das oben beschriebene Antikörperkonjugat aus CD44v6-spezifischem Antikörper gekoppelt an das Maytansinoid DM1, in einer Konzentration von 1-2,5 mg/ml, bevorzugt 1.8 mg/ml bei einem pH von 6,5, bevorzugt pH von 5,5.

Ganz besonders bevorzugt ist eine Formulierung aus 10mM Succinatpuffer, beispielsweise Natriumsuccinatpuffer, pro 2mg/ml Antikörperkonjugat, sowie Mannitol zu Saccharose 4 : 1 w/w, wobei das Antikörperkonjugat bevorzugt Antikörper-DM1 Konjugat ist, besonders bevorzugt das oben beschriebene Antikörperkonjugat aus CD44v6-spezifischem Antikörper gekoppelt an das Maytansinoid DM1 ist. Weitere optionale Bestandteile dieser besonders bevorzugten pharmazeutischen Zubereitung sind NaCl im Bereich von 30-100 mM NaCl, bevorzugt 60 mM NaCl, und/oder Tween 20 im Bereich von 0,01-0,05 w% Tween 20, bevorzugt 0,02 w%. Der pH wird auf 5-6 eingestellt, besonders bevorzugt 5,5.

Die folgenden Beispiele dient der weiteren Illustration der Erfindung, beschränken jedoch den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise.

Ausführungsbeispiele
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Illustration der erfindungsgemäßen Gegenstände und Verfahren. Es werden sowohl Flüssigformulierungen hergestellt (als Vergleichsformulierungen) als auch ein gefriergetrocknete Formulierung.
Material und Methoden:
Chemikalien:
Die verwendeten Hilfsstoffe entsprechen den Anforderungen an pharmazeutisch zugelassene Hilfsstoffe. In Tabelle 2 sind die verwendeten Hilfsstoffe zusammengefasst. WFI (water for injection) wird von Boehringer Ingelheim, Biberach, DE bezogen.
Tabelle 2

HP:: Hydroxy-Propyl
SBE:: Sulfobutylether
CD:: Cyclodextrin

Alle verwendeten Cyclodextrine sind käuflich erhältlich (vergleiche Tabelle 1). Der verwendeten Antikörper-DM1 Komplex ist ein Konjugat aus einem CD44v6-spezifischen Antikörpermolekül und dem Maytansinoid DM1, worin das Antikörpermolekül die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 und die schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 enthält, und worin das Maytansinoid die Formel
hat und an den Antikörper über eine Disulfidbindung gekoppelt ist.
A. Formulierungsarbeiten an Antikörper-DM1 Komplexen
Herstellung einer Antikörper-DM1 Formulierungen:
Zur Herstellung einer 1.8 mg/ml Antikörper-DM1 Lösung wird die Ausgangslösung in die neu zu testenden Lösungen umgepuffert (nach Standardverfahren) oder die entsprechenden Hilfsstoffe zusammen gegeben. Zusätzlich wird die Proteinkonzentration auf 4-5 mg/ml erhöht. Die genaue Zusammensetzung dieser Formulierungen wird in den Beispielen beschrieben.
Analytische Messmethoden:

– Die Bestimmung des pH-Wertes, der Osmolalität, Aussehen, Farbe und Klarheit wird nach den gültigen PharmEu und USP Vorschriften durchgeführt.
– HP-SEC (high performance exclusion chromatography). Mittels HP-SEC wird der Gehalt an Monomer in der Lösung bestimmt. T2 wird isokratisch von der SEC-Säule eluiert, und der Monomerpeak integrativ ausgewertet.
– RP-HPLC (reversed phase high peformance liquid chromatography): Mittels RP-HPLC wird der Gehalt an freiem DM1 bestimmt. Diese Analysemethode beruht auf einer Kombination von HPLC mit einer „shieled" reversed-phase Kolonne, die es erlaubt kleine chemische Moleküle, die UV absorbierend sind in Gegenwart von Proteinmolekülen zu diskriminieren. Diese Kombinationsmethode vereint den Vorteil der „size-exlusion" und der Reversen-Phasen Chromatography. Grosse Moleküle können nicht in die poröse Kolonnenmatrix eindringen und somit können grosse Moleküle nicht im hydrophoben Inneren der Matrix binden. Kleine Moleküle dagegen können in die Kolonnenmatrix eindringen und an den hydrophoberen Innenraum binden. Die Antikörper-DM1 Komplex („gross") Lösung in Anwesenheit von freiem DM1 („klein") wird auf die Kolonne aufgetragen. Nur freies DM1 kann gebundne werden, der Antikörper-DM1 Komplex wird eluiert. Mittels eines Acetonitrilgradienten wird DM1 und entsprechende Ansamitocine-Derivate von der Säule eluiert.

Verwendete Primärpackmittel für die Stressstabilitäts-Studien
Flüssig-Formulierungen:

Vial: 20/25 ml Standard Vial (20R), farblos, GA1 Inj. (Firma Schott, DE)
Stopfen: Gusto WS 579, W 1888 grau, Teflon (Firma West, USA)
Bördelkappe: Kombika/Alu-KU (Firma West, DE)

Lyophilisations-Formulierungen:

Vial: 20/25 ml Standard Vial (20R), farblos, GA1 Inj. (Firma Schott, DE)
Stopfen: Gusto 1797 PH 4023/50, grau, coat (Firma West, USA)
Bördelkappe: Kombika/Alu-KU (Firma West, DE)

Durchführung der Stressstabilitäts-Studien
Die verschiedenen zu testenden Formulierungen werden über einen Sterilfilter (0.22 micrometer, Firma Millipore) sterilfiltriert und in die Vials abgefüllt. Das Füllvolumen beträgt 20 ml für die Flüssig-Formulierungen, 10 ml für die Lyophilisations-Formulierung.
Die abgefüllten 10 ml Lyophilisations-Formulierung werden anschliessend gefrier getrocknet. Die Vials werden mittels Stopfen und Bördelkappe verschlossen und über Kopf gelagert.
Die Lagertemperature für die Stressstabilitäts-Studien beträgt 40 °C. Die Probenziehungszeitpunkte betragen: 0, 4, und 8 Wochen.
Beispiel 1: Einfluss des pH Wertes und der Lyophilisation auf die Stabilität von Antikörper-DM1 Komplexen
Die Proteinkonzentration (Antikörper-DM1 Komplex) beträgt 1.8 mg/ml für alle Flüssig-Formulierungen und 4.65 mg/ml für die Lyophilisations-Formulierungen. Die Proteinmenge pro Vial ist somit ähnlich: 1.8 mg/ml × 20 ml = 36 mg/vial (Flüssig-Formulierung), 4.65 mg/ml × 10 ml = 46.5 mg/vial (Lyophilisations-Formulierung).
Die Vergleichsformulierung (Tabelle 3) besteht aus folgenden Hilfsstoffen:
Tabelle 3:
Der pH Wert der verschiedenen zu untersuchenden Formulierungen wurden ausgehend von der Vergleichsformulierung (Tabelle 3) mit 1 N Phosphorsäure auf pH 6.0 und 5.5 eingestellt.
20 ml der jeweiligen Formulierung wurde in ein 20 R Vial abgefüllt und die Vials kopfüber bei 40 °C gelagert.
Die Lyophilisations-Formulierung besteht aus (Tabelle 4):
Tabelle 4:
Die Ergebnisse der Stress-Studie sind in 1 sowie in Tabelle 5 zusammengefasst.
Tabelle 5:
In 1 ist der Unterschied von freiem DM1 Gehalt dargestellt. Dargestellt ist der Unterschied von freiem DM1 zwischen dem Nullwert und dem 4-Wochenwert, und der Unterschied zwischen dem Nullwert und dem 8-Wochenwert.
Beschreibung der Auswertung DM1 Gehaltsbestimmung: Die für die verschiedenen DM1-Moleküle gemessenen Flächen wurden für jeden Ziehungszeitpunkt addiert. Somit erhält man eine Flächensumme für DM1-Derivate in den einzelnen Proben. Die Grafiken zeigen den Anstieg dieser Flächen (den Anstieg an freien Maytansinoiden in der entsprechenden Formulierung) zwischen 0 und 4 Wochen (hell) und den Anstieg dieser Flächen zwischen 0 und 8 Wochen (dunkel) für jede Formulierung. Überraschenderweise wurde gefunden, dass der pH Wert einen erheblichen Einfluss hat auf die Stabilität des Antikörper-DM1 Komplex.
Aus 2 ist der Effekt des pH Wertes deutlich. Der Gehalt an freien DM1 ist um den Faktor 2-3 geringer bei Formulierungen mit pH 5.5 als bei pH 6.5.
Noch drastischer ist es bei der Untersuchung der DM-1 Daten der Lyophilisations-Formulierung. Eindeutig kann gezeigt werden, das Gefriertrocknung die Stabilität von Antikörper-DM1 Komplexen deutlich stabilisiert. Das entwickelte Verfahren zur Gefriertrocknung und die verwendete Formulierung führen zu einem stabilen Produkt.
Der Monomergehalt ist um 2-6 % höher für pH 5.5 als für Formulierungen bei pH 6.5. Einen vorteilhaften Einfluss hat die pH Erniedrigung auch auf den AFK (Aussehen, Farbe Klarheit) Parameter (vergleiche Tabelle 4). Über einen Zeitraum von 8 Wochen (bei 40°C gelagert) nimmt der Monomergehalt um 12 % ab (Formulierung bei pH 6.5). Die entsprechende Lyophilisations-Formulierung zeigt keine Abnahme des Monomergehaltes.
Zusammenfassend kann man festhalten, dass eine Erniedrigung des pH Wertes von pH 6.5 auf pH 5.5 einen positiven Einfluss hat bezüglich der Stabilisierung von Antikörper-DM1 Komplexen. In Vergleich zu der Formulierung mit pH 6.5 kann man erwarten, dass die Laufzeit der Lagerung bei 2-8 °C um den Faktor 2-3 verlängert werden kann.
Einen deutlich stabilisierenden Effekt erreicht man aber durch Entfernung des Wassers durch Gefriertrocknung. Die vorgestellten Stressstabilitätsdaten der Lyophilisations-Formulierung (Tabelle 4) zeigen eindeutig, den stabilisierenden Effekt der Gefriertrocknung auf den DM1 Wert als auch auf einen unveränderten Monomergehalt.
Einen weiteren vorteilhaften Einfluss wird erwartet, durch Kombination der Resultate aus der Flüssig-Formulierungsstudie, das bedeutet Erniedrigung des pH Wertes der Lyophilisations-Formulierung auf pH 5.5.
Beispiel 2: Einfluss von Cyclodextrinen auf die Stabilität von Antikörper-DM1 Komplexen
In einem 2. Versuch wurde der Einfluss von Cyclodextrinen auf die Stabilität von Antikörper-DM1 Komplexen in einer Stress-Studie evaluiert.
Es wurden 4 verschiedenen Cyclodextrine getestet:

• Hydroxy-Propyl-beta-Cyclodextrin (HP-β-CD)
• Hydroxy-Propyl-gamma-Cyclodextrin (HP-γ-CD)
• Gamma-Cyclodextrin (HP-γ-CD)
• Sulfobutylether-beta-Cyclodextrin (SBE-β-CD, Captisol)

Die Grundformulierung besteht aus folgenden Hilfsstoffen (Tabelle 6):
Tabelle 6:
Bei allen CD-Formulierungen wurde der pH Wert konstant auf pH 6.5 gehalten.
Die Cyclodextringehalt wurde zwischen 1 und 15 w% variiert (Tabelle 7).
Tabelle 7:
Basierend auf der Grundformulierung aus Tabelle 6 wurde durch Zugabe der entsprechenden Menge an Cyclodextrin, die in Tabelle 7 dargestellten 11 CD-Flüssig-Formulierungen hergestellt. 20 ml wurden jeweils in eine Vial (Röhrchen, n = 2) angefüllt, die Vials verschlossen und über Kopf bei 40 °C gelagert. Die Bezeichnungen der jeweiligen Formulierungen findet man in Tabelle 6. Formulierung D1 bedeutet: 1 w% Cyclodextrin D (SBE-β-CD, Captisol).
Die Ergebnisse aus der Stressstudie sind in 2 sowie Tabellen 8-11 zusammengefasst. (zu der Darstellung der Ergebnisse vergleiche Beispiel 1).
Tabelle 8
Tabelle 9:
Tabelle 10:
Tabelle 11:
Aus 2 geht hervor, dass der Gehalt an freiem DM1 für die Formulierungen D (Captisol) am geringsten ist. Der Vergleich von z.B. Formulierung D1 mit B1 (selber Gehalt an Cyclodextrin) zeigt, dass der freie DM1 Gehalt halbiert ist im Vergleich zu der Formulierung B1. Einige Formulierungen zeigen sogar einen destabilisierenden Effekt auf Antikörper-DM1 Komplexen im Vergleich zu der Formulierung ohne Cyclodextrin.
Ein Vergleich der Formulierungen D mit der Formulierung ohne Cyclodextrin (1) zeigt für letztere, erhöhte (Verdoppelung) Werte für den DM1 Gehalt in der Formulierung für die 8-Wochenwerte.
Die Monomergehalte der verschiedenen Cyclodextrin-Formulierungen sind vergleichbar mit der Vergleichsformulierung bei pH 6.5 (Tabelle 3). Die Cyclodextrin-Formulierungen C (gamma-CD) scheiden aufgrund ihrer extrem erhöhten AFK Werte aus.
Zusammenfassend kann man sagen, das die Formulierungen mit Cyclodextrinen, insbesondere Captisol zur Stabilisierung des Antikörper-DM1 Komplexes verhelfen. Die Laufzeit des Produktes kann somit verlängert werden im Vergleich zur Vergleichsformulierung.
Bei Verwendung von Captisol in einer Lyophilisations-Formulierung wird ebenfalls erwartet, dass dieser Hilfsstoff Antikörper-DM1 Komplexe im gefriergetrockneten Zustand stabilisieren.
B. Lyophilisation von Antikörper-DM1 Komplexen
Im weiteren werden Verfahren dargestellt die es erlauben Antikörper-DM1 Komplexen zu lyophiliseren. Produkte bestehend aus Antikörper-DM1 Komplexen sind toxische Produkte mit gewissen Risiken bei der Verarbeitung behaftet. Im den vorgestellten Versuchen sollen den Prozess der Lyophilisation sowie die dazu notwendigen Schritte dahingehend entwickelt werden, dass eine Gefährdung von Mitarbeitern durch Produktkontamination während des Lyophilisationsprozesses ausgeschlossen ist.
Es wird erreicht, indem die Vials während des gesamten Lyophilisations-Prozesses in einem dicht schließenden Autoklavierbeutel eingeschweißt werden. Alle Schritte, bei denen kein Beutel um das Produkt ist, werden im Isolator durchgeführt. Der Prozess wurde dahingehend optimiert, dass das fertige Produkt – der Lyophilisationskuchen – nur geringe Abweichungen von Produktkuchen zeigt, die ohne Beutel gefertigt wurden.
Die vorgestelletn Versuchen werden in einem TINY Lyophilisator durchgeführt.
Als Primärpackmittel wird verwendet:
Vial: 20/25 ml Standard Vial (20R), farblos, GA1 Inj. (Firma Schott, DE)
Stopfen: Gusto 1797 PH 4023/50, grau, coat (Firma West, USA)
Bördelkappe: Kombika/Alu-KU (Firma West, DE)
Es werden jeweilige Lyophilisations-Formulierung mit und ohne Wirkstoff getestet
1. Lyophilisations mit Mannitol Puffer
Es werden zwei Bleche mit je 64 Vials beladen. Pro Vial werden 10 ml Puffer (Tabelle 12) eingefüllt.
Tabelle 12:
Ein Blech wird in der Kammer belassen und in einen Autoklavierbeutel der Firma Sengewald (Medipeel) eingeschweißt. Die Nähte am Beutel werden mit einem normalen Folienschweißgerät gesetzt. Es werden drei Nähte parallel gesetzt. Folgende weitere Parameter werden angesetzt:
Das verwendete Lyophilisations-Programm ist in Tabelle 13 zusammengefasst Dieses wird im Laufe der Untersuchungen noch optimiert (siehe später). Es beinhaltet einen Temperschritt (–12°C/Σ: 3h 45min) und dauert insgesamt ≈ 56h.
Tabelle 13:
Der Beutel scheint während des Prozesses unter einem gewissen Überdruck zu stehen (bläht sich leicht auf). Deshalb erfolgt in einem Folgeversuch eine Optimierung des Lyophilisationsprogramms.
Folgende Beobachtungen wurden gemacht:

– Das Produkt im Beutel trocknet scheinbar deutlich langsamer, als ohne Beutel.
– Das Produkt im Beutel zieht sich am Glasrand empor.
– Das Produkt im Beutel bildet eine konkave Oberfläche, und scheint in sich zusammenzufallen.

Die Lyophilisation verläuft bei beiden Ansätzen (mit und ohne Beutel) sehr unterschiedlich. Im Ergebnis weisen alle Lyophilisate im Beutel eine groß-löchrige Struktur auf, welche bei geringster Berührung zerfällt. Dagegen zeigen die nicht eingebeutelteten Proben einen optimalen Kuchen. Auch dieser zerfällt jedoch sehr leicht bei Berührung. Die Ursache hierfür liegt in einem sehr geringen Feststoffgehalt der Proben.
Die Rekonstitution einiger Proben (Tabelle 14) ergab im Mittel eine Verlängerung der Lösezeit der Proben. Zwar bleibt die aktivste Phase subjektiv gleich, bis jedoch alle Rückstände komplett gelöst sind, dauert es bei den Produkten im Beutel erkennbar länger bis alle Rückstände gelöst sind.
Tabelle 14:
Zur Ermittlung der Restfeuchte nach Karl-Fischer werden einige Vials zur Restfeuchteanalyse herangezogen. Dem Ergebnis nach sind die Produkte jeweils in einem übereinstimmenden Trocknungszustand und enthalten im Mittel 0,23% Restfeuchte (Tabelle 15).
Tabelle 15:
Aus dem Versuch kann man folgendes schliessen:
Der Druck im Beutel deutet darauf hin, dass das sublimierende Wasser schwer aus dem Beutel entweichen kann. Ursache hierfür ist, dass die Kunststofffolie für Wasserdampf undurchlässig ist. Der erhöhte Druck im Beutel ist seinerseits Ursache für die Kollapsähnlichen Strukturen, die sich ausbilden.
In 3 ist erkennbar, dass die Trocknung noch nicht vollständig beendet scheint, wenn der Haupttrocknungsprozess endet. Daher wird die Trocknungszeit von 30 auf 60 Stunden verdoppelt.
Gleichzeitig wird um einer Druckerhöhung im Beutel entgegenzuwirken versucht den Systemdruck von 44% auf 37,5% abzusenken.
2. Lyphilisations mit Mannitol/Saccharose Puffer

In einem weiteren Versuch wurden gleich mehrere Parameter gleichzeitig geändert/getestet. Es handelt sich dabei um Beutelart, Blecheinfluss, Änderung einiger Lyophilisationsparameter und Änderung der Formulierung. Die Änderungen sind aus Überlegungen zum Resultat des ersten Versuches heraus entstanden. Es werden drei Bleche á 64 Vials besetzt.

Einfüllmenge: 10 ml

Einfüllhöhe: 16 mm

Autoklavierbeutel 1:	Medipeel (Firma Sengewald) nach DIN 58953 30 × 6,5 × 58
Alternativer Beutel 2:	Ultraclean Cleansteam BAGS, newform (B-3320 Hoegaarden)
pH-der Lösung:	6,78 (Messung über pH-Meter)
Gerüstbilder:	4% Mannitol und 1% Saccharose

Tabelle 16:
Das verwendete Lyophilisationsprogramm ist in Tabelle 17 zusammen gefasst:
Tabelle 17:
Das Lyo-Programm wurde an zwei Punkten optimiert. Die Trocknungszeit wurde verdoppelt, das Vakuum von 0,3 mbar auf 0,15 mbar halbiert.
Ein Überdruck im Beutel ist diesmal nicht nach außen hin zu erkennen.
Mit dem so verlaufenen Prozess erhält man in allen drei Ansätzen (ohne Beutel, Beutel 1 und 2) des Versuchs überzeugende, vergleichbare Ergebnisse.
Die Lyophilisation im Beutel funktioniert mit diesem optimierten Lyophilkisationsverfahren.
Beide Beutel untereinander scheinen ebenfalls keine Unterschiede aufzuweisen, was das Produkt angeht.
Das Blech unter den Vials hat sich im veränderten Programm nicht als störend erwiesen. Daher wird es weiterhin während des gesamten Prozesses unter den Vials im Beutel belassen.
Die Veränderungen der Programmparameter zeigen in der Trocknung deutlich bessere Ergebnisse (4). So ist für alle drei Ansätze im Lyophilisationsprogramm die Trocknung als beendet zu erkennen (Produkttemperatur steigt in allen Ansätzen über Stellfläche).
3. Lyophilisations von Antikörper-DM1 Komplexen
Gemäß den Ergebnissen aus den vorgestellten Lyophilisationsversuchen wird der Prozess im Beutel (Medipeel) durchgeführt. Die in den Lyophilisator eingebrachte Anordnung ist in 6 dargestellt:
Insgesamt werden so 70 Vials lyophilisiert. Die fertige Formulierung hat eine Proteinkonzentration von 4,65 mg/ml. Pro Vial werden 10 ml Lösung eingefüllt.
Die verwendete Formulierung (Tabelle 18) lautet wie folgt:
Tabelle 18:
Das Lyophilisationsprogramm (Tabelle 19) des zweiten Versuchs hat gute Ergebnisse geliefert und wird somit unverändert eingesetzt.
Tabelle 19:
Der Verlauf des Lyophilisationsprozess ist in 6 dargestellt.
Die nach Versuch 3 gefriergetrockneten Antikörper-DM1 Komplexe wurden analytisch untersucht (Stressstudie bei 40 °C über 8 Wochen). Die Stabilitäts-Daten sind im Teil A beschrieben.
Zusammenfassend kann man festhalten:
Eine Lyophilisation von Antikörper-DM1 Komplexe unter Zuhilfenahme eines Autoklavierbeutels brachte vergleichbare Ergebnisse zu Produkten die durch Lyophilisation ohne Beutel erzielt wurden.
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Gemisch aus einem Antikörperkonjugat und mindestens einem Cyclodextrin, worin die pharmazeutische Zusammensetzung gefriergetrocknet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Cyclodextrin ein β-Cyclodextrin ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Cyclodextrin ein γ-Cyclodextrin ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Cyclodextrin ein Sulfoalkylether-Cyclodextrin ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4, worin das Cyclodextrin ausgewählt aus der Gruppe von Sulfobutylether-β-Cyclodextrin, Hydroxy-Propyl-β-Cyclodextrin, Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrin und γ-Cyclodextrin ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Cyclodextrin in 0,01-40 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,1-20 Gewichtsprozent, besonders bevorzugt 0,1-10 Gewichtsprozent, ganz besonders bevorzugt 1 Gewichtsprozent enthalten ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, enthaltend einen Puffer ausgewählt aus der Gruppe der Phosphat-, Acetat-, Succinatpuffer.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie auf einen pH Wert von 5-6 eingestellt ist, bevorzugt ein pH Wert von 5,5.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, enthaltend Zucker ausgewählt aus der Gruppe der Mannitole, Saccharose.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, zusätzlich enthaltend NaCl.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, enthaltend ein Detergenz ausgewählt aus der Gruppe von Tween 20, Tween 80.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, zusätzlich enthaltend das Detergenz nach Anspruch 11 in einer Konzentration von 0,01-1 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,01-0,1 Gewichtsprozent, besonders bevorzugt 0,02-0,04 Gewichtsprozent.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Antikörperkonjugat ein Konjugat aus einem CD44v6 spezifischen Antikörpermolekül und einem Maytansinoid ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin das Antikörpermolekül spezifisch für ein Epitop innerhalb der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin das Antikörpermolekül der monoklonale Antikörper VFF-18 (DSM ACC2174) oder ein rekombinanter Antikörper mit den Komplementbindungsstellen („complementary determining regions" –CDRs) von VFF-18 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin das Antikörpermolekül die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4, oder SEQ ID NO: 8, und die die schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin das Maytansinoid an das Antikörpermolekül mit einer Disulfidbindung gekoppelt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin das Maytansinoid die Formel
hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, worin das Antikörpermolekül die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4, und die schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 umfaßt, und worin das Maytansinoid die Formel
hat und an den Antikörper durch eine Disulfidbindung gebunden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, worin ein oder mehrere Maytansinoidreste an das Antikörpermolekül gebunden sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, worin 3 bis 4 Maytansinoidreste an das Antikörpermolekül gebunden sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin die Zusammensetzung Mannitol und/oder Saccharose enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, worin die Zusammensetzung Mannitol und Saccharose enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, worin die Zusammensetzung 4 w% Mannitol und 1w% Saccharose enthält.