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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum selektiven Nachweis bestimmter
Wellenlängenanteile
eines Lichtstrahls, umfassend ein Element zum spektralen Auffächern des
Lichtstrahls und ein dem Element nachgeschaltetes Detektorarray.
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Ferner
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Unterdrückung von Anregungslinien im
Detektionslichtstrahl eines Mikroskops, insbesondere zur Anwendung
in einem Fluoreszenzmikroskop, bei dem im Strahlengang des Detektionslichtstrahls
ein Element zum spektralen Auffächern
des Detektionslichtstrahls und ein dem Element nachgeschaltetes
Detektorarray angeordnet wird.
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Vorrichtungen
zum selektiven Nachweis bestimmter Wellenlängenanteile eines Lichtstrahls
sind aus der Praxis seit geraumer Zeit bekannt, wobei lediglich
beispielhaft auf die
DE
101 02 033 A1 hingewiesen sei. Die dortige
2 zeigt eine Vorrichtung, bei der ein
zu detektierender Lichtstrahl mittels eines Prismas spektral aufgespalten
wird. Hinter dem Prisma befindet sich eine Selektionseinrichtung
in Form einer Spaltblende. Bestimmte Wellenlängenanteile werden von der
Spaltblendenbacke ausgeblendet, während andere Wellenlängenanteile
die Spaltblende passieren und in einem ersten Detektor nachgewiesen
werden und wiederum andere Wellenlängenanteile von der Spaltblendenbacke
mittels einer total reflektierenden Beschichtung reflektiert und
sodann in einem zweiten Detektor nachgewiesen werden. Diese Anordnung
ist mit einer Vielzahl von Bauteilen äußerst aufwendig und zudem wenig
flexibel im Hinblick auf eine veränderte Zusammensetzung der nachzuweisenden
Spektralbereiche.
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Verfahren
zur Unterdrückung
von Anregungslinien im Detektionslichtstrahl eines Mikroskops der
eingangs genannten Art sind ebenfalls aus der Praxis bekannt. Bei
den bekannten Verfahren werden zur Ausblendung der Anregungslinien
im Allgemeinen spezielle – beispielsweise
elektrooptische – Filter
eingesetzt, die für
die Wellenlängen
der Anregungslinien absorbierend wirken. Nachteilig ist in diesem
Zusammenhang, dass die Absorption in der Regel nicht vollständig ist,
so dass trotz der Filterung noch Anregungslicht auf den Detektor
trifft. Dies ist insbesondere dann problematisch, wenn die Intensität der Anregungslinie
die Intensität
des eigentlichen Detektionslichts um ein Vielfaches übersteigt,
wie dies in der Fluoreszenzmikroskopie typischerweise der Fall ist.
Darüber
hinaus ist nachteilig, dass im Allgemeinen auch das Detektionslicht
durch die Filterung beeinflusst wird und das Messergebnis somit verfälscht wird.
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Der
Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zum
selektiven Nachweis bestimmter Wellenlängenanteile eines Lichtstrahls der
eingangs genannten Art sowie ein Verfahren zur Unterdrückung von
Anregungslinien im Detektionslichtstrahl eines Mikroskops derart
auszugestalten und weiterzubilden, dass bei einfachem und flexiblem
Aufbau die Detektion unerwünschter
Wellenlängenanteile
eines zu detektierenden Lichtstrahls möglichst vollständig unterdrückt ist.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
der gattungsgemäßen Art
löst die
voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1.
Danach ist eine solche Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass
das Element und das Detektorarray derart aufeinander abgestimmt
sind, dass bestimmte vorgebbare Wellenlängenanteile des Lichtstrahls
auf lichtunempfindliche und die übrigen
Wellenlängenanteile des
Lichtstrahls auf lichtempfindliche Bereiche des Detektorarrays treffen.
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Erfindungsgemäß ist erkannt
worden, dass es zur Vermeidung des Nachweises unerwünschter Wellenlängenanteile
eines Lichtstrahls nicht zwingend notwendig ist, die Wellenlängenanteile
vor Erreichen eines Detektors in aufwendiger Weise aus dem Strahlengang
des Lichtstrahls auszublenden. Vielmehr werden das Element zum spektralen
Auffächern
des Lichtstrahls und der Detektor in Form eines Detektorarrays in
erfindungsgemäßer Weise
derart aufeinander abgestimmt, dass die unerwünschten Wellenlängenanteile
auf lichtunempfindliche Bereiche des Detektorarrays treffen. Die
Erfindung macht sich folglich die spezielle Bauweise des Detektorarrays
zunutze, das zwischen den eigentlichen photosensitiven Bereichen – den so
genannten Kanälen – herstellungs-
bzw. funktionsbedingt lichtunempfindliche Bereiche aufweist. Durch
eine Justierung, bei der diese photoinaktiven Bereiche mit den unerwünschten
Wellenlängenanteilen
zusammenfallen, können letztere
somit in einfacher Weise bei der Detektion unterdrückt werden.
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Im
Konkreten könnte
es sich bei dem Element zum spektralen Auffächern bspw. um ein Prisma,
ein Gitter oder ein diffraktives optisches Element, etwa in Form
eines Hologramms, handeln. Im Hinblick auf eine hochpräzise Justierung
erweisen sich elektrooptische Elemente oder mikromechanische Scanner
als vorteilhaft.
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Vor
dem Detektorarray könnte
in vorteilhafter Weise eine Maske angeordnet sein, mit der auf künstliche
Weise – unabhängig von
der konkreten Bauweise des Detektorarrays – zusätzliche photoinaktive Bereiche
auf dem Detektorarray erzeugt werden könnten. Zusätzlich oder alternativ zu einer
Maske könnte
ein mikrooptisches Element, bspw. in Form eines Mikrolinsenarrays
oder eines Polarisationsarrays, vor dem Detektorarray angeordnet
sein.
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Zur
Erhöhung
der Variabilität
der Vorrichtung könnte
vorgesehen sein, dass das Detektorarray, die Maske und/oder das
mikrooptische Element – jeweils unabhängig voneinander – bewegbar
sind. Für
die Feinjustage der einzelnen Bauteile ist es dabei von Vorteil,
wenn eine Bewegbarkeit der einzelnen Bauteile in drei translatorischen
und drei rotatorischen Freiheitsgraden gegeben ist.
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Als
konkrete Verwendungsmöglichkeit
der Vorrichtung bietet sich insbesondere der Einsatz in einem Fluoreszenzmikroskop
an. Beim Fluoreszenzmikroskop wird ein Anregungslichtstrahl einer
Beleuchtungslichtquelle mittels einer Mikroskopoptik auf eine Probe
geführt,
von der ein Detektionslichtstrahl ausgeht. Das im Detektionslichtstrahl
enthaltene Anregungslicht, das von der Probe reflektiert wurde,
könnte
dabei – zumindest
teilweise – auf
die lichtunempfindlichen Bereiche des Detektorarrays treffen, während das
in der Probe entstandene Fluoreszenzlicht auf lichtempfindliche
Bereiche trifft. Auf diese Weise können die Anregungslinien in
besonders raffinierter Weise von der Detektion ausgeschlossen werden.
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In
verfahrensmäßiger Hinsicht
wird die eingangs genannte Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs
8 gelöst.
Hiernach ist ein Verfahren zur Unterdrückung von Anregungslinien im
Detektionslichtstrahl eines Mikroskops der eingangs genannten Art
dadurch gekennzeichnet, dass das Element und das Detektorarray derart
aufeinander abgestimmt werden, dass die Anregungslinien zumindest
teilweise auf lichtunempfindliche und die übrigen Wellenlängenanteile
des Detektionslichtstrahls auf lichtempfindliche Bereiche des Detektorarrays
treffen.
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Erfindungsgemäß ist erkannt
worden, dass durch eine Abstimmung des Elements zur spektralen Auffächerung
des Detektionslichtstrahls und des Detektorarrays aufeinander, durch
die die Anregungslinien auf lichtunempfindliche Bereiche des De tektorarrays
treffen, ein Nachweis der Anregungslinien vermieden werden kann.
Das Detektorarray „sieht" somit eine verminderte
Lichtintensität,
nämlich
im Wesentlichen nur noch das eigentliche Detektionslicht, insbesondere
Fluoreszenzlicht, und die Anzahl elektronischer Kanalübersprecher
ist deutlich reduziert.
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Bei
gegebenem Aufbau des Detektorarrays könnten die Anregungslinien derart
ausgewählt
werden, dass sie mit den unempfindlichen Bereichen des Detektorarrays
zusammenfallen. Dabei könnten
die Anregungslinien entweder – bspw.
durch Filterung – aus
einer Weißlichtquelle
ausgeschnitten werden oder mit einer durchstimmbaren Laserlichtquelle
erzeugt werden.
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Die
Abstimmung zwischen dem Element zum spektralen Auffächern des
Detektionslichtstrahls und dem Detektorarray kann bei fest vorgegebenen Anregungslinien
auf unterschiedliche Weise erfolgen. So kann z. B. bei fester Einstellung
des Elements zum spektralen Auffächern
das Detektorarray so lange verschoben werden, bis die Anregungslinien
auf lichtunempfindliche Bereiche des Detektorarrays treffen. Umgekehrt
ist es möglich,
bei fest vorgegebener Stellung des Detektorarrays die Einstellung des
Elements zum spektralen Auffächern
zu verändern.
Die genannten Einstellungen könnten
in vorteilhafter Weise sogar während
einer Messung durchgeführt
werden.
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Für konkrete
Einsätze,
bspw. bei einem Mikroskop mit fest vorgegebenen Anregungslinien, könnte das
Detektorarray bereits im Rahmen der Fertigung derart manipuliert
werden, dass an den Stellen, an denen die Anregungslinien bei einer
späteren Anwendung/Messung
auftreffen, lichtunempfindliche Bereiche erzeugt werden.
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Zur
Vermeidung von Wiederholungen sei im Übrigen auch auf den auf die
erfindungsgemäße Vorrichtung
bezogenen Teil der Beschreibung verwiesen.
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Es
gibt nun verschiedene Möglichkeiten
die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten
und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die den Patentansprüchen 1 und
8 nachgeordneten Patentansprüche
und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele
der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit
der Erläuterung
der bevor zugten Ausführungsbeispiele
der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im allgemein bevorzugte
Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In
der Zeichnung zeigt
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1 in einer schematischen
Darstellung ein erstes Ausführungsbeispiel
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung
zum selektiven Nachweis bestimmter Wellenlängenanteile eines Lichtstrahls,
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2 in einer schematischen
Darstellung die Vorrichtung aus 1 zusammen
mit einem Diagramm, das die Nachweisempfindlichkeit entlang des Detektorarrays
zeigt,
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3 in Diagrammform das Ergebnis
einer Faltung des Spektrums des Anregungs- und Fluoreszenzlichts
mit der räumlichen
Empfindlichkeit des Detektorarrays,
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4 ein zweites Ausführungsbeispiel
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung
zum Einsatz in einem Fluoreszenzmikroskop,
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5 ein weiteres Ausführungsbeispiel
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
bei der die Abstimmung der unempfindlichen Bereiche des Detektorarrays
auf die Wellenlängen
des Anregungslichtstrahls durch ein verschiebbares (Mikro-) Linsenarray
erfolgt, und
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6 noch ein weiteres Ausführungsbeispiel
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
bei der die Abstimmung der unempfindlichen Bereiche des Detektorarrays
und der diskreten Wellenlängen
einer Anregungslichtquelle durch verschiebbare Masken erfolgt.
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1 zeigt in schematischer
Darstellung ein Ausführungsbeispiel
einer Vorrichtung zum selektiven Nachweis bestimmter Wellenlängenanteile
eines Lichtstrahls 1. Zur spektralen Auffächerung
tritt der Lichtstrahl 1 zunächst durch ein Prisma 2,
und der aufgefächerte
Lichtstrahl 3 trifft sodann auf ein Detektorarray 4.
Bei dem Detektorarray 4 handelt es sich um einen handelsüblichen
CCD-Zeilendetektor oder um ein handelsübliches PMT-Array, der oder das
zwischen den einzelnen, in 1 hell dargestellten
photosensitiven Bereichen 5 – Kanäle – dunkel dargestellte „photoinaktive" Bereiche 6 aufweist.
Diese für
Licht unempfindlichen Bereiche 6 sind grundsätzlich durch
die Fertigung und die Bauweise des Detektorarrays 4 bedingt,
können
jedoch auch nachträglich
künstlich
erzeugt werden.
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Erfindungsgemäß sind das
Prisma 2 und das Detektorarray 4 derart aufeinander
abgestimmt, dass diejenigen Wellenlängenteile des Lichtstrahls 1, 3, die
nicht nachgewiesen werden sollen, auf unempfindliche Bereiche 6 des
Detektorarrays 4 treffen, während die übrigen Wellenlängenanteile
des Lichtstrahls 1, 3, deren Nachweis erwünscht ist,
auf photosensitive Bereiche 5 des Detektorarrays 4 treffen.
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In 2 ist die Vorrichtung aus 1 dargestellt, wobei gleiche
Bezugszeichen gleiche Bauteile kennzeichnen. Zusätzlich ist in einem Diagramm
die Empfindlichkeit E, d.h. die Photosensitivität, entlang des Detektorarrays 4 aufgetragen.
Das zinnenförmige
Muster spiegelt dabei exakt die Struktur des Detektorarrays 4 wieder:
In den photosensitiven Bereichen 5 ist die Empfindlichkeit
hoch und in den unempfindlichen Bereichen 6 zwischen den
einzelnen Kanälen 5 vernachlässigbar.
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3 zeigt drei Diagramme,
wobei in dem oberen Diagramm ein charakteristisches Anregungs- und
Fluoreszenzspektrum aufgetragen ist, wie es in der Fluoreszenzmikroskopie
typischerweise auftritt. Zu erkennen sind zwei scharfe Anregungslinien 7,
die durch entsprechende Filter aus einer Weißlichtquelle ausgeschnitten
oder mittels durchstimmbaren Laserlichtquellen erzeugt sind. Das
von der angeregten Probe ausgesendete Fluoreszenzlicht 8 ist
zu höheren
Wellenlängen λ hin verschoben.
Deutlich zu erkennen ist die im Allgemeinen niedrige Intensität 1 des
Fluoreszenzlichts 8 im Vergleich zur Intensität der Anregungslinien 7.
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Im
mittleren Diagramm von 3 ist
wiederum die Empfindlichkeit E entlang des Detektorarrays 4 dargestellt.
Das Ergebnis einer Faltung des Anregungs- und Fluoreszenzspektrums
aus dem oberen Diagramm mit der Empfindlichkeit aus dem mittleren Diagramm
ist in dem unteren Diagramm dargestellt. Wie leicht zu erkennen
ist, sind die beiden Anregungslinien 7 nahezu vollständig verschwunden, während die
beiden Wellenlängenbereiche
mit dem Fluoreszenzlicht 8 nahezu unverändert wiedergegeben werden.
Das Messergebnis wird insofern nicht durch eine Vielzahl von elektronischen Übersprechern
zwischen den einzelnen Kanälen 5 des Detektorarrays 4 gestört. Darüber hinaus
kann das Detektorarray 4 in einem Bereich weit unterhalb
seiner Sättigungsschwelle
betrieben werden bzw. die Anregungsintensität erhöht werden, um so die Messung mit
einer ausreichenden Photonenstatistik in einer kürzeren Zeit durchzuführen.
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4 zeigt in schematischer
Darstellung die erfindungsgemäße Vorrichtung
in Zusammenhang mit einem Fluoreszenzmikroskop. Ein von einer Weißlichtquelle 9 ausgesendeter
Lichtstrahl 1 wird auf einen AOTF (Acousto Optical Tunable
Filter) 10 gelenkt. Mit diesem schnellen akoustooptischen
Bauteil kann die Lichtleistung für
die auftreffenden Wellenlängen
geschaltet und somit ein Anregungslichtstrahl 11 mit einer
oder mehreren scharfen Anregungslinien erzeugt werden. Der Anregungslichtstrahl 11 wird über einen
Strahlteiler 12 und eine entsprechende Mikroskopoptik auf
eine Fluoreszenzprobe 13 geleitet. Die Mikroskopoptik ist
einem auf diesem Gebiet tätigen
Fachmann hinlänglich
bekannt ist und aus Gründen
der Übersichtlichkeit
in 4 nicht dargestellt.
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Der
Detektionslichtstrahl 14, der sowohl in der Probe 13 erzeugtes
Fluoreszenzlicht als auch von der Probe 13 reflektiertes
Anregungslicht enthält, wird über den
Strahlteiler 12 auf ein Prisma 2 gelenkt. Der
von dem Prisma 2 aufgefächerte
Detektionslichtstrahl 15 trifft auf das Detektorarray 4,
wobei das Prisma 2 und das Detektorarray 4 in
erfindungsgemäßer Weise
derart aufeinander abgestimmt sind, dass die Anregungslinien auf
unempfindliche Bereiche 6 des Detektorarrays 4 treffen.
Die Abstimmung kann dabei durch Verschieben des Detektorarrays 4 entlang
der durch die Doppelpfeile angedeuteten Richtungen erfolgen. Prinzipiell
ist zur Feinabstimmung eine Bewegbarkeit des Detektorarrays 4 in
allen sechs Freiheitsgraden (3 Translation, 3 Rotation)
denkbar. Insbesondere kann die Abstimmung durch Verschieben des
Detektorarrays 4 auch während
einer Messung vorgenommen werden. Zusätzlich oder alternativ kann
die Abstimmung durch Drehen des Prismas 2 durchgeführt werden.
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5 zeigt in einer schematischen
Darstellung eine erfindungsgemäße Vorrichtung,
bei der vor dem Detektorarray 4 ein (Mikro-)Linsenarray 16 angeordnet
ist. Das Linsenarray 16 ist in den durch die Doppelpfeile
angedeuteten Richtungen verschiebbar und dient zur Anpassung der
unempfindlichen Bereiche 6 des Detektorarrays 4 auf
die Anregungswellenlängen.
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6 zeigt schließlich – schematisch – eine erfindungsgemäße Vorrichtung,
bei der die Abstimmung zwischen dem Prisma 2 und dem Detektorarray 4 mittels
verschiebbarer Masken 17 durchführbar ist. Die Masken 17 sind
entlang der durch die Doppelpfeile angezeigten Richtungen parallel
zur Oberfläche
des Detektorarrays 4 verschiebbar und erzeugen auf künstliche
Weise unempfindliche Detektorbereiche 6. Je näher eine
Maske 17 dabei an der Oberfläche des Detektorarrays 4 angeordnet
ist, desto schmaler ist der von der Maske 17 ausgeblendete Spektralbereich.
Das bedeutet, dass zum Ausblenden einer unscharfen, d. h. breiten
Anregungslinie die entsprechende Maske 17 in entsprechend
größerer Entfernung
von der Oberfläche
des Detektorarrays 4 angeordnet werden muss.
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Abschließend sei
ganz besonders darauf hingewiesen, dass die voranstehend erörterten
Ausführungsbeispiele
lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese
jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele
einschränken.