DE10335114A1

DE10335114A1 - Verfahren und Kit zur Bestimmung der metabolischen Stabilität von Testsubstanzen

Info

Publication number: DE10335114A1
Application number: DE10335114A
Authority: DE
Inventors: Niels KREBSFÄNGER; Johannes DÖHMER
Original assignee: GENPHARMTOX BIOTECH AG
Current assignee: GENPHARMTOX BIOTECH AG, 82152 PLANEGG, DE
Priority date: 2003-07-31
Filing date: 2003-07-31
Publication date: 2005-02-17
Also published as: WO2005015181A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der enzymatischen Oxidation eines ersten Reaktanden, einer Testsubstanz durch einen zweiten Reaktanden, nämlich Sauerstoff, durch zeitaufgelöste Messung der Sauerstoffkonzentration in einer Lösung, die neben dem Enzym zu Beginn der Messung beide Reaktanden aufweist, durch Messung des lumineszenten Leuchtsignals zweier oder mehrerer verschiedener Leuchtstoffe (flu, ref).

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der metabolischen Stabilität einer Testsubstanz, eine Vorrichtung und die Verwendung einer Vorrichtung im Rahmen dieses Verfahrens.

Die Entwicklung neuer Arzneimittel, Herbizide oder Insektizide sowie vieler anderer Stoffe umfaßt pharmakokinetische Studien, um die Verweilzeit im menschlichen und tierischen Körper zu bestimmen und um daraus Rückschlüsse über die Wirksamkeit und Toxizität der jeweiligen Testsubstanz auf den menschlichen Körper zu ziehen.

Bei der Umsetzung von Substanzen zum Zwecke der Ausscheidung (Entgiftung) spielen unter anderem Enzymsysteme eine Rolle, die unter dem Namen Cytochrom-P450-Oxidase (CYP; EC 1.14.14.1) subsummiert werden.

Diese Enyzymsysteme katalysieren die Funktionalisierung einer Testsubstanz unter Verbrauch von Sauerstoff z.B. nach folgender Reaktion: Testsubstanz + O₂ + NADPH + H⁺ → Testsubstanz-OH + NADP⁺+ H₂O

Bisher wird dabei der enzymatische Abbau (die sogenannte "Metabolische Stabilität" und abgeleitet "Speziesunterschiede" sowie "CYP Profiling") der jeweiligen Testsubstanz (Substrat) durch direkte Messung der Substanz mittels LC-MS (Massenspektrometrie) bestimmt ("Loss of Parent Compound"). Dieses Verfahren benötigt eine jeweils Substanz-spezifische LC-MS Analytik, die den Durchsatz beim Screening hinsichtlich Zeit und Kosten limitiert bzw. den Einsatz bei größeren Substanzbibliotheken (Millionen von Compounds) nicht als praktikabel gilt. Da jedoch bei dem CYP-abhängigen Metabolismus jeder Substanz NADPH und Sauerstoff verbraucht werden, läßt sich durch Messung eines oder beider dieser Parameter die Limitierung der Substanz-spezifischen Analytik umgehen.

In der Praxis liegt die Problematik dieses Ansatzes sowohl in der nicht immer stöchiometrischen Reaktion der CYPs (in Leerlauf-/Parallelreaktionen entsteht ein gewisser Anteil H₂O₂ und Wasser) als auch in der zuverlässigen Detektion des NADPH bzw. O₂, weshalb mit den bisher getesteten Verfahren keine praxistauglichen Ergebnisse erzielt werden konnten.

Es wurde zum Beispiel die Bestimmung der metabolischen Stabilität von Diclofenac mit Hilfe von CYP2C9 beschrieben, einem rekombinant exprimierten humanen CYP Enzym (Laura E. Dike, Richard Guarino, Darwin Asa, Mark Timmins: „Development of an Automatible, Hich Thoughput Method for Rapid Analysis of Drug Metabolism" Versuchsdaten wurden auf der ISSX in Nashville, TN, USA am 19.10.1999 gezeigt). Dabei wurde eine Mikrotiterplatte von BD Vias-Sante^® benutzt, die einen sauerstoffempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff, nämlich tris-1,7-Diphenyl-1,10-phenanrtholin-ruthenium(II)chlorid, in einer gaspermeablen und hydrophoben Matrix auf dem Boden der Multititerplatte eingebettet aufweist, wobei der Sauerstoff in Nachbarschaft des Farbstoffes mit dem in flüssiger Phase im Gleichgewicht steht. Gemessen wird das Fluoreszenzlicht, das durch die Quenchprozesse durch Sauerstoff vermindert wird.

Die Erfinder haben festgestellt, daß das beschriebene Meßsystem jedenfalls bei dem Vergleich anderer Substrate als Diclofenac, oder beim Einsatz anderer Cytochrom-P450-Systeme als dem oben aufgeführten (CYP2C9) und vor allem bei dem Einsatz von zellulären Systemen oder beim Einsatz von (Leber-)Mikrosomen als Quelle für CYP-Enzymsysteme keine brauchbaren Ergebnisse liefert.

Im Stand der Technik werden zwar auch zelluläre Systeme aufgeführt. Dies erfolgt allerdings nicht im Zusammenhang mit der Messung des Umsatzes anhand der vorstehend aufgeführten Reaktionsgleichung sondern in einem anderen Zusammenhang, nämlich für zytotoxische Tests, bei denen die Toxizitäts-bedingte Reduktion des Sauerstoffverbrauchs durch die Zellen und nicht die durch den Metabolismus bedingte Reduktion des Sauerstoffverbrauchs durch die Fremdstoff-metabolisierenden Cytochrome P450 detektiert wird.

Damit stellten sich die Erfinder sich die Aufgabe, ein Verfahren zur Messung der enzymatischen Oxidation einer Testsubstanz durch Sauerstoff zur Verfügung zu stellen,

• das universell anwendbar ist, bei dem die Enzymquelle sowohl ein isoliertes möglicherweise rekombinantes Enzym, eine Mikrosomenpräparation, eine S9-Fraktion oder ein Homogenat aus einer Zellkultur oder einem tierischen Organ oder auch eine Zellsuspension sein kann,
• das sich für die Untersuchung einer Vielzahl von Testsubstanzen eignet,
• das den aparativen Aufwand und die damit verbundenen Kosten eines LC-MS Verfahrens vermeidet,
• das einfach durchzuführen und zuverlässig ist,
• das sich für automatisierte Hochdurchsatzverfahren eignet.

Es wurde gefunden, daß sich das in WO 99/06821 beschriebene Verfahren und die dort beschriebene Vorrichtung zur Lösung der Aufgabe sehr gut eignet, weswegen WO 99/06821 durch Bezugnahme Teil dieser Anmeldung wird.

Die dort beschriebene Erfindung betrifft ein Verfahren und eine in einem Spektralphotometer verwendbare Vorrichtung zur fluormetrischen Bestimmung eines biologischen, chemischen oder physikalischen Parameters einer Probe unter Verwendung zumindest zweier verschiedener Leuchtstoffe, deren erster zumindest in der Lumineszenzintensität auf den Parameter anspricht und deren zweiter zumindest in der Lumineszenzintensität und der Abklingzeit auf den Parameter nicht anspricht.

Insbesondere betrifft WO 99/06821 ein neues Konzept zur optischen Detektion von chemischen Parametern mit Hilfe von optischen Sensoren, auf der Basis von Phasenverschiebungs- und zeitaufgelösten Messungen. Die verwendeten Modulationsfrequenzen liegen zwischen 0,5 und 5 MHz und sind mit preiswerten optischen Halbleiterbauteilen erfaßbar.

Aus der Literatur und der Praxis optischer Sensoren ist bekannt, daß bei Lumineszenzmessungen die Bestimmung der Abklingzeit anstelle der Intensität als Meßgröße entscheidende praktische Vorteile auf weist. Diese Größe wird durch Schwankungen des optischen Systems nur unwesentlich oder im besten Fall überhaupt nicht beeinflußt. Sowohl Veränderungen der Intensität der Lichtquelle und der Empfindlichkeit des Photodetektors als auch Signalverluste durch Biegung von Fasern oder Beeinflussung der Signalintensität durch Veränderung der Geometrie des Sensors haben keine Auswirkungen auf das Meßsignal. Dies gilt auch für undefinierte optische Eigenschaften der Probe (wie Trübung, Eigenfärbung und Brechungsindex), die zu Problemen bei Intensitätmessungen führen können. Desweiteren gibt es in vielen Fällen eine weitgehende Unabhängigkeit des Meßsignals von der Konzentration des Indikators in der sensitiven Schicht. Deswegen sind Photozersetzungen und Auswaschen in geringem Maßen wenig kritisch.

In der Literatur wurden eine Vielzahl von Meßprinzipien vorgeschlagen, um chemische Parameter auf Abklingzeitbasis zu messen. Eine der am häufigsten angewendeten Methoden ist die dynamische Lumineszenzlöschung, wobei der angeregte Zustand eines Lumineszenzindikators durch den Analyten strahlungslos deaktiviert wird. Auf dieser Grundlage erfolgt die optische Messung von molekularen Sauerstoff, sowie der Nachweis von Halogenid- und Schwermetallionen (1)

Eine weitere Möglichkeit der Deaktivierung nutzt den photoinduzierten Elektronentransfer in einem einzelnen Indikatormolekül. Bei diesem Effekt (kurz PET genannt) liegt der Lumineszenzindikator in verschiedenen Formen vor, von denen nur eine (saure Form oder mit gebundenem Metallion) hoch lumineszierend ist und eine lange Lebensdauer aufweist. In der zweiten Form (basische Form oder ohne gebundenes Metallion) besitzt der Indikator ein freies Elektronenpaar, welches den angeregten Zustand strahlungslos deaktivieren kann. Als Folge verringert sich sowohl die Abklingzeit als auch die Lumineszenzquantenausbeute. Dieses Prinzip kann Anwendung finden für die optische Bestimmung des PH-Wertes oder in der optischen Ionensensorik (2).

Eine weitere vorgeschlagene Möglichkeit der Abklingzeitmessung besteht darin, daß bestimmte pH-Indikatoren im protonierten und deprotonierten Zustand mit unterschiedlicher Intensität und unterschiedlicher, aber definierter Abklingzeit lumineszieren. Aus dem jeweiligen (pH-abhängigen) Verhältnis der beiden Intensitäten ergibt sich dabei eine mittlere Abklingzeit, die gemessen werden kann (3). Voraussetzung bei dieser Methode ist, daß beide Formen eines Indikators lumineszieren, und ihre Absorptions- und Emissionsspektren deutliche Überlappungsbereiche aufweisen.

Es ist wichtig anzumerken, daß bei den meisten der bisher zitierten Meßprinzipien die gemessenen Abklingzeiten in der Regel im Bereich von wenigen Nanosekunden liegen. Die genaue Messung von Abklingzeiten im unteren Nanosekundenbereich ist aber instrumentell sehr aufwendig und erfordert neben sehr schnellen Schaltungen und hohen Modulationsfrequenzen auch schnelle Lichtquellen und Detektoren. Die Entwicklung von preiswerten Meßgeräten für diese Art von Sensoren, auf der Basis von optischen Halbleiterkomponenten wie Leuchtdioden und Photodioden scheint deswegen in naher Zukunft ziemlich ausgeschlossen. Preiswerte Meßgeräte sind aber für eine weitgefächerte Anwendung optischer Sensoren unabdingbar. Deswegen besteht ein großes Interesse an Abklingsensoren, deren Meßbereich sich im Bereich von Mikrosekunden oder sogar Millisekunden bewegt. Solche Sensoren wurden bisher fast ausschließlich für die optische Sauerstoffmessung bis zur Praxisreife entwickelt, wobei Indikatoren mit Abklingzeiten bis zu einigen Millisekunden zum Einsatz kommen.

Ein kürzlich eingeschlagener Weg, neue langlebige Abklingzeitsensoren zu entwickeln, nutzt den strahlungslosen Energietransfer zwischen einem lumineszierenden Donormolekül, dessen photophysikalische Eigenschaften durch den Analyten nicht beeinflußt werden, auf einen für den Analyten sensitiven Farbindikator, der als Akzeptor bezeichnet wird. Dessen Absorptionsspektrum muß abhängig von der jeweiligen Analytkonzentration unterschiedlich stark mit dem Emissionsspektrum des Donors überlappen. Als lumineszierender Donor können Übergangsmetallkomplexe mit Ruthenium (II), Ruthenium (I) oder Osmium und Iridium als Zentralatom eingesetzt werden. Diese Verbindungen zeichnen sich durch lange Lebenszeiten (einige 100 nsec. bis wenige Mikrosekunden) und hohe Quantenausbeuten aus. Dieser Weg wurde erstmalig von Lakowicz vorgeschlagen und kürzlich für optische pH-Sensoren umgesetzt, wobei die analoge Realisierung von Optoden für die pCO₂, NH₃- und die Ionendetektion grundsätzlich möglich ist. (4,5).

Ein gravierendes Problem beim praktischen Einsatz solcher Sensoren besteht darin, daß die Rate des Energietransfers und damit die meßbare mittlere Abklingzeit zum einen signifikant vom Abstand und der Positionierung von Donor und Akzeptormolekül abhängig ist, zum anderen aber auch von der Konzentration des Akzeptors in der Matrix. Aus diesem Grund führt jede Veränderung der Verteilung und des Abstands der Indikatoren in der Matrix zur Veränderungen in der Kennlinie der Sensoren. Insbesondere die Quellung der Matrix stellt ein erhebliches Problem dar.

Ein weiteres Problem ist der Einfluß von Sauerstoff auf die Sensoren. Da die Lumineszenz der eingesetzten langlebigen Donoren von Sauerstoff zum Teil beträchtlich gelöscht wird, muß die Sauerstoffkonzentration mit gemessen und das Meßsignal korrigiert werden. Zusätzlich entsteht bei diesem Prozess in der Membran reaktiver Singulettsauerstoff, der die Photozersetzung der immobilisierten Indikatoren beschleunigt. Damit wird sowohl die Lager als auch die Langzeitstabilität der Sensoren herabgesetzt. Damit geht natürlich auch einer der klassischen Vorteile der Abklingzeitmessung verloren.

Aus der US 5,102,625 ist eine Vorrichtung der eingangs genannten Art bekannt. Dort werden mittels zweier separater Meßkanäle die Intensitäten zweier Leuchtstoffe separat gemessen. Deren Intensitätsverhältnis wird als Endsignal für die Messung des Parameters verwendet. Die Abklingzeiten der Leuchtstoffe gehen in die Messung nicht ein. Die beiden Leuchtstoffe haben unterschiedliche Spektralbereiche.

Aufgabe von WO 99/06821 ist es daher, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur fluorometrischen Bestimmung des Parameters einer Probe anzugeben, das bei hoher Meßgenauigkeit mit geringerem apparativen Aufwand auskommt.

WO 99/06821 beschreibt ein neues Meßprinzip, welches die fluormetrische Bestimmung verschiedener chemischer, physikalischer und biologischer Parameter mit Hilfe von zeitgelösten und Phasenmodulationstechniken ermöglicht. Die Erfindung erlaubt es, das Intensitätssignal der meisten in de Literatur beschriebenen Fluoreszenzsensoren durch Zumischen eines langlebigen Leuchtstoffs sehr effektiv zu referenzieren. Dazu werden zwei verschiedene Leuchtstoffe gemeinsam im Sensor co-immobilisiert. Die Summe aus einem Lumineszenzsignal mit konstanter langlebiger Abklingzeit (mind einige hundert Nanosekunden) und einem kurzlebigen Fluroeszenzsignal wird gemessen. Während die langlebige Lumineszenz in ihren Parametern vom Analyten nicht beeinflußt wird, verändert sich die Intensität des co-immobilisieren kurzlebigen Leuchtstoffs in Abhängigkeit von der jeweiligen Analytkonzentration. Da die durch Phasenmodulationstechniken ermittelte Phasenverschiebung Φm nur vom Verhältnis der Intensitätsanteile der beiden einzelnen Leuchtstoffe abhängt, spiegelt sich in diesem Parameter direkt die Intensität des auf den Parameter ansprechenden Leuchtstoffs wieder. Damit handelt es sich bei der Erfindung um ein Neues Verfahren der internen Referenzierung der Signalintensität von Fluoreszenzleuchtstoffen, ohne dass eine zweite Lichtquelle oder ein zweiter Photodetektor benötigt wird. Unter der Voraussetzung, daß die Verteilung der beiden Leuchtstoffe beim Herstellungsprozess konstant gehalten wird, ist Φm ausschließlich vom zu bestimmenden physikalischen oder chemischen Parameter abhängig, während Schwankungen im optoelektronischen System, Verlusten in den Lichtleitern und den optischen Eigenschaften der Probe das Signal nicht beeinflussen.

Bevorzugt ist, daß beide Leuchtstoffe im gleichen Wellenlängenbereich Licht absorbieren und damit mit der gleichen Lichtquelle zur Lumineszenz angeregt werden können. Bevorzugt liegen die Emissionsspektren im gleichen Spektralbereich. So ist es z.B. möglich, beide Leuchtstoffe mit blauem Licht bei einer Wellenlänge von 450 nm anzuregen, wobei ein Leuchtstoff grünes Licht bei 520 nm und der zweite ein rotes Licht bei 600 nm emittiert, da beide Signale trotzdem mit dem selben Detektor gemessen werden können. Es ist aber auch möglich, die Lumineszenz zweier Leuchtstoffe simultan zu messen, die sich in ihren Emissionsspektren deutlich voneinander unterscheiden.

Das beschriebene Meßverfahren hat den Vorteil, daß der langlebige Leuchtstoff keine analytspezifische Reaktion aufweisen muß, sondern einzig als Träger eines konstanten Untergrundsignals mit langer Abklingzeit fungiert, welches durch den kurzlebigen Leuchtstoff moduliert wird. Aus diesem Grund kommt eine Vielzahl von in der Literatur beschriebenen phosphoreszierenden Verbindungen für diesen Zweck in Frage.

Der langlebige Leuchtstoff braucht nicht mit der Probe, dem Analyten und dem Fluoreszenzindikator in Wechselwirkung zu treten und kann deswegen in einer Form immobilisiert werden, in de er für sämtliche Probenkomponenten inert ist und damit potentielle Interferenzen durch chemische Parameter von vornherein ausgeschlossen sind.

WO 99/06821 wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen erläutert.

1 zeigt die Abhängigkeit des gemessenen Phasenwinkels Φm von dem Verhältnis de Intensität des Fluoreszenzindikators und des Referenzleuchtstoffes: A hohes Fluoreszenzsignal, B niedrigeres Fluoreszenzsignal. Es bezeichnen: flu = variables Flureszenszsignal; ref = konstantes Referenzsignal; ges= gemessenes Gesamtsignal;

2 zeigt einen berechneten Zusammenhang zwischen dem gemessenen Phasenwinkel Φm sowie cot (Φm) und dem Amplitudenverhältnisses R der beiden Leuchtstoffe;

3 zeigt spektrale Eigenschaften eines geeigneten Paares von Fluoreszenzindikator und Referenzleuchtstoff. Die optimalen spektralen Fenster für die Anregung des Lumineszenzsignals und die Messung des emittierten Lichtes sind schraffiert;

4 zeigt eine zeitaufgelöste Messung des Verhältnisses der Signalintensität während des Anregungsimpulses (I1) und während des Abklingens der Lumineszenz (I2), wobei das Verhältnis R von der Gesamthöhe des Signals unabhängig ist und nur eine Funktion des zu bestimmenden chemischen Parameters darstellt;

5 zeigt pH-Calibrierkurven eines PH-Sensors nach Beispiel 1 mit unterschiedlicher Menge an HPTS (: wenig HPTS; B: viel HPTS), gemessen als Phasenverschiebung bei einer Modulationsfrequenz von 880 kHz. Als Lichtquelle dient hier eine blaue LED und als Detektior eine Photodiode; und

6 zeigt vier Kombinationsmöglichkeiten des kurzlebigen chemisch sensitiven Leuchtstoffs (A) und des inerten langlebigen Leuchtstoffs (B) in einem optischen Sensor;
Als für den Analyten inerte Leuchtstoffe mit langen Abklingzeiten kommen z.B. in Frage:

– Übergangsmetallkomplexe mit Ruthenium (II), Rhenium (I) oder Osmium und Iridium als Zentralatom und Diiminlinganden,
– phosphoreszierende Porphyrine mit Platin, Palladium, Lutetium oder Zinn als Zentralatom;
– phosphoreszierende Komplexe der Seltenerden wie Europium, Dysprosium oder Terbium;
– phosphoreszierende Kristalle wie Rubin, Cr-YAG, Alesandrit oder phosphorezierende Mischoxide wie Magnesiumfluorogermanat

Als kurzlebige fluoreszierende Leuchtstoffe kommen alle Farbstoffe in Frage, deren Anregungs- und Emissionsspektrum mit einem der oben zitierten langlebigen Leuchtstoffe überlappt und deren Fluoreszenzintensität vom zu bestimmenden Parameter abhängig ist.

Beispiele für potentiell mögliche Leuchtstoff- bzw. Luminophor/Fluorophorpaare sind:
Ruthenium(II)-(tris-4,7-diphenyl-1,10 pheanthrolin)/HPTS
Ruthenium(II)-(tris-4,7-diphenyl-1,10 pheanthrolin)/Fluorescein
Ruthenium(II)-(tris-4,7-diphenyl-1,10 pheanthrolin)/Rhodamin B
Ruthenium(II)-(tris-4,7-diphenyl-1,10 pheanthrolin)/Rhodamin B-octadecylester
Ruthenium(II)-(tris-4,7-diphenyl-1,10 pheanthrolin)/Heyadecyl-Arcidinorange
Europium(III)-tris-theonyl-Trifluormethylacetonat/Hydroxymethylcoumarin
Platin(II)-tetraphenylporphyrin/Rhodamin B
Platin(II)-tetraphenylporphyrin/Sulforhodamin 101
Platin(II)-octaethylporphyrin/Eosin
Platin(II)-octaethylporhyrin/Thionin
Platin(II)-octaethylkeotporphyrin/Nilblau

Der langlebige Leuchtstoff kann auf unterschiedliche Weise in den Sensor integriert werden (6):

– durch direktes Lösen des Leuchtstoffs in de analytsensitiven Schicht (6, Bsp. 3)
– durch Einbau in ein Polymer, welches als Grundierung für die Sensorschicht dient (6, Bsp.1)
– durch Einbau in ein Polymer, welches in Mikro- oder Nanopartikeln in die sensitive Schicht dispergiert wird (6, Bsp 2)
– durch Einbau von lumineszierenden Farbstoffen in Sol-Gel Glas mit anschließendem Sintern, Pulverisieren und Dispergieren des Glases in der Sensorschicht (6, Bsp. 2)
– durch Verwendung pulverisierter Phosphor, die in de sensitiven Schicht dispergiert werden (6; Bsp.2)
– durch Beschichtung der Außenseite mit einer Sensorfolie, ohne Kontakt zur Probe (6; Bsp. 4)
– durch kovalente oder elektrostatische Bindung des Fluoreszenzindikators an die Oberfläche von Leuchtstoffpartikeln, die entweder in eine Polymerschicht dispergiert werden oder direkt in der Probe verteilt werden
– durch Dispersion von Partikeln in die Probe, in welcher der Flureszenzindikator in gelöster Form vorliegt.

Es ist wichtig zu erwähnen, daß mit Hilfe von Phasenmodulationstechniken bei Frequenzen im kHz-Bereich bei dieser Art von Sensoren immer nur eine mittlere Phasenverschiebung ermittelt werden kann. Ein Aufsplitten in beide Abklingzeit komponenten ist zwar prinzipiell möglich, durch die benötigten hohen Frequenzen aber meßtechnisch aufwendig. Aufgrund der deutlichen Unterschiede in den Abklingzeiten der beiden co-immobilisierten Indikatoren ergibt sich die zeitaufgelöste Messung, bei der nach einem Anregungslichtimpuls ausschließlich das Abklingverhalten des Lumineszenzsignals nach ausschalten des Anregungspulses ermittelt wird, in vielen Fällen keinen nutzbringenden Parameter, da die kurzlebige Komponente zu schnell abklingt und meßtechnisch nur mit hohem Aufwand erfaßt werden kann.

Auch ist es möglich, die Signalintensität während des Anregungspulses und in der Abklingphase separat zeitaufgelöst zu messen und das Verhältnis dieser beiden Signale R zu berechnen. Wie aus 4 hervorgeht, hängt dieses Verhältnis ausschließlich vom Intensitätsverhältnis R der beiden Lumineszenzkomponenten ab und ist vollständig unabhängig von der Gesamtintensität des Signals.

Desweiteren kann mit Phasenmodulationstechniken die mittlere Phasenverschiebung des Lumineszenzsignals gemessen werden. Die Meßfrequenz wird dabei auf die Abklingzeit des Leuchtstoffs abgestimmt und liegt zwischen 0,5 und 100 kHz. Wie im folgenden gezeigt wird, geht aus der Gleichung (1) hervor, daß der gemessene Phasenwinkel Φm nur vom Verhältnis der beiden Signalintensitäten, aber nicht von der Absoluthöhe des Signal abhängt und somit die Referenzierung der Intensität des kurzlebigen Fluoreszenzanteils ermöglicht.

Es liegt eine additive Überlagerung der Signale (Index ref = Referenzsignal, Index flu = Fluoreszenzsignal; Index m = Meßgröße vor.

Rahmenbedingungen

Nr. 1

Die längere Abklingzeit ist sehr viel größer als die kürzere Abklingzeit

Wenn die Modulationsfrequenz so gewählt ist, daß sie für T_ref optimal ist, d.h. tanΦref = 2π∙fmod∙τref = 1ergibt sich für Φ_flu

mit der Voraussetzung ergibt sich für den Winkel Φ_flu:

Nr. 2

Die Abklingzeit des Farbstoffs mit der längeren Abklingzeit ist für die interessierenden Messung konstant:

Damit vereinfachen sich die additive Gleichungen zu: Am∙cosΦm = Aref∙cosΦref + Aflu Am∙sinΦm = Aref∙sinΦref

Teilt man die erste Gleichung durch eine zweite, ergibt sich

Da die Auftragung von cot Φm linear das Amplitudenverhältnis widerspiegelt, ergibt sich ein linearer Zusammenhang zwischen dem Cotangens des gemessenen Phasenwinkels Φm und dem Amplitudenverhältnis R (und damit auch Intensitätsverhältnis) der beiden Leuchtstoffe (siehe 2).

cot Φm drückt ein Intesitätsverhältnis aus, ohne daß zwei Intensitätssignale separat gemessen werden müssen.

Wesentliche Vorteile von WO 99/06821 sind:

– Ein sehr geringer Synthese- und Optimierungsaufwand bei der Herstellung neuer Sensoren.
– Einfache Umstellung bereits optimierter Fluoreszenzsensoren auf Abklingzeitmessung durch einfaches Zumischen des langlebigen Leuchtstoffs.
– Für ein Feld von Sensoren für unterschiedliche Analyten kann problemlos immer der gleiche langlebige Leuchtstoff verwendet werden. Damit lassen sich verschiedene Sensoren mit demselben optoelektronischen System auswerten.
– Da die Form der Kalibrierkurve nur vom Verhältnis der beiden Intensitäten abhängt, kann der Empfindlichkeitsbereich eines einzelnen Sensors allein schon durch Veränderung der zugegebenen Menge an Leuchtstoff optimiert werden.
– Dasselbe kann durch eine optimale Auswahl der spektralen Fenster sowohl auf der Seite der Anregung, als auch der Emission realisiert werden.
– Die Querempfindlichkeit langlebiger Lumineszenz gegenüber Sauerstoff kann ausgeschaltet werden, indem die Indikatoren in Materialien eingebaut werden, die für Gase nicht zugänglich sind.
– Werden phosphoreszieriende Faststoffe oder in Glas eingebaute Leuchtstoffe verwendet, wird jegliche Beeinflussung des Signals durch chemische Leuchtstoffparameter in der Probe vollständig ausgeschlossen.
– Weil Sauerstoff die Lumineszenz nicht löschen kann, entsteht in der Membran kein reaktiver Singlettsauerstoff. In der Folge verringert sich die Photozersetzung und die Stabilität der Sensoren verbessert sich.
– Der Einbau der langlebigen Leuchtstoffe in eine Glasmatrix oder als Feststoff verhindert deren auswaschen vollständig. Desweiteren ist ihre Photostabilität außergewöhnlich hoch.
– Während bei Meßprinzipien, bei denen der Analyt den angeregten Zustand des langlebigen Leuchtstoffs deaktiviert (wie PET-Effekt, dynamischer Löschung oder Energietransfer), die Abnahme der mittleren Abklingzeit, immer parallel mit einer Abnahme der Signalintensität verbunden ist, was zu einer Verschlechterung des Signal/Rausch Verhältnisses führt, wird bei dieser Art von Sensoren bei Abnahme der Abklingzeit die Signalintensität größer Die Folge ist ein wesentlich besseres Signal/Rausch Verhältnis über den gesamten Meßbereich.

Da die Kennlinie dieser Sensoren einzig vom Verhältnis der Signalanteile beider Indikatoren abhängt, sollen jedoch folgende Bedingungen erfüllt sein:

1) keiner der beiden Indikatoren darf im Verlauf der Messung auswaschen;
2) die beiden Indikatoren dürfen während der Messung nicht unterschiedich schnell durch die Lichteinwirkung zersetzt werden;
3) das Konzentrationsverhältnis der beiden Indikatoren muß man beim Herstellen der Membranen konstant gehalten werden;
4) die Abklingzeit des langlebigen Leuchtstoffs muß immer konstant sein.

Für viele Sensoren können diese Bedingungen problemlos erfüllt werden.

Der erfindungsgemäß zu verwendende Sauerstoffsensor ist ähnlich wie folgende Systeme aufgebaut, die zur Illustration angegeben werden:

pH-Sensor

– HPTS absorbiert an Zellulose mit quarternären Ammoniumgruppen und eingebaut in Poly-hydroxyethylmethacrylat (HEMA) Hydrogel
– Ru(phen)₃CI₂ in Sol-Gel (gesintert, gemahlen und im Hydrogel dispergiert) 5 zeigt die Kalibrierkurve dieses Sensors, gemessen als Phasenverschiebung bei einer Frequenz von 80 kHz)

pH-Sensor

– Aminofluorescein kovalent gekoppelt an Sol-Gel Partikel mit eingebautem Ru(phen)₃CI₂ (gesintert, gemahlen und im Hydrogel dispergiert).

CO₂-Sensor

– HPTS-CTA₃ Ionenpaar in Ethylcellulose gelöst mit Tetraoctylammoniumhydroxid als Puffer (nach 6)

NH₃Sensor

– Rhodamin B gelöst in PVC mit NPOE (nach 7)
– Pt(II)-tetra-pentafluorophenyl-porphyrin in PVC als äußere Beschichtung einer Sensorfolie

Kalium-Sensor

– lipophilisiertes Nilblau gelöst in PVC mit Weichmachern (nach 8)
– Pt(II)-octaethylketoporphyrin in PVC als äußere Beschickung

WO 99/06821 erlaubt somit eine optische Bestimmung eines chemischen biologischen oder physikalischen Parameters einer Probe mit Hilfe eines optischen Sensors. Im Sensor liegen zwei Lumineszenzindikatoren co-immobilisiert vor, von denen der eine Indikator als Träger eines Untergrundlumineszenzsignals fungiert, welches durch eine lange Lumineszenzlebenszeit (vorzugsweises im Bereich von mindestens 100 Nanosekunden bis zu einigen Millisekunden) gekennzeichnet ist, und welches weder in seiner Intensität noch in seiner Abklingzeit vom zu messenden Parameter beeinflußt wird. Der zweite Indikator weist eine kürzerlebige Fluoreszenz vorzugsweise im Bereich von einigen Nanosekunden auf, welche das langelebige Lumineszenzsignal überlagert, und deren Intensität auf eine Funktion des zu messenden Parameters ist. Mit Hilfe von Phasenmodulations- oder zeitaufgelöstens Meßmethoden wird dabei eine Referenzgröße bestimmt, welche das Verhältnis der beiden Lumineszenzintensitätsanteile ausdrückt, wobei diese Referenzgröße unabhängig von der Gesamtintensität des Lumineszenzsignals ist, und damit die Referenzierung der kurzlebigen vom Analyten abhängigen Fluoreszenzkomponente ermöglicht.

Zitate

1. O.S. Wolfbeis, Fiber Optic Chemical Sensors and Biosensors Vol II CRC pres 1991
2. S. Draxler, M.E. Lippitsch, Sens. Actuators B29, 199, 1995
3. J.R. Lakowicz, H. Szmacinski, Sens. Actuators B11, 133, 1993
4. J.R. Lakowicz, H. Szmacinski, M. Karakelle Ana. Chim Acta 272,197, 1993
5. J. Sipior, S. Bambot, M. Romauld, G.M. Carhter, J.R. Lakowicz, G. Rao, Anal. Biochem 227,309, 1995
6. A. Mils, Q. Chang, Analyst, 118, 839, 1993
7. C. Preinigner, G.J. Mohr, I.Klimant, O.S. Wolfbeis, Anal. Chim. Acta 334,113,1996
8. E.E. Spichinger, D. Freiner, E. Bakker, T. Rosatzin, W. Simon, Sens. Actuators B11, 262, 1993

Die Lösung der Aufgabe der vorliegenden Erfindung basiert auf einem Verfahren nach Anspruch 1, einer Verwendung nach Anspruch 24 und auf einem Kit nach Anspruch 29.

Die Lösung der Aufgabe ist ein Verfahren zur Messung der enzymatischen Oxidation eines ersten Reaktanden, einer Testsubstanz durch einen zweiten Reaktanden, nämlich Sauerstoff, durch zeitaufgelöste Messung der Sauerstoffkonzentration in einer Lösung, die neben dem Enzym zu Beginn der Messung beide Reaktanden aufweist, durch Messung des lumineszenten Leuchtsignals zweier oder mehrerer verschiedener Leuchtstoffe (flu, ref), wobei unter den gewählten Meßbedingungen,

(a) mindestens die Leuchtintensität des ersten Leuchtstoffes (flu) durch die Sauerstoffkonzentration beeinflußt wird und wobei ferner
(b) die Leuchtintensität oder die Leuchtintensität und die Abklingzeit des zweiten Leuchtstoffen (ref) durch die sich im Verlaufe der Messung einstellende Sauerstoffkonzentration nicht oder im Rahmen der Meßgenauigkeit nur unwesentlich beeinflußt wird und wobei ferner
(c) die Intensität der Leuchtsignale beider Leuchtstoffe entweder jeweils getrennt oder in Form eines Gesamtsignals durch ein oder mehrere Detektoren gemessen wird und daraus Sauerstoffkonzentration ermittelt wird.

Dabei meint der Begriff unter den gewählten Meßbedingungen, daß die Eigenschaften der Leuchtstoffe unter verschiedenen Bedingungen unterschiedlich sein können und es im Rahmen der Erfindung hinreichend ist, daß sie die vorstehend aufgeführten Kriterien unter den Meßbedingungen erfüllen.

Eine zeitaufgelöste Messung der Sauerstoffkonzentration ist die Bestimmung der Sauerstoffkonzentration (oder eines dazu proportionalen Parameters) als Funktion der Zeit.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß die Abklingzeit ersten Leuchtstoffes (flu) länger ist als die Abklingzeit des zweiten Leuchtstoffes (ref).

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß in Schritt (c) das Zeit- oder Phasenverhalten gemessen wird und der zweite Leuchtstoff so ausgewählt wird, daß sich sowohl die Leuchtintensität als auch die Abklingzeit des zweiten Leuchtstoffen (ref) durch die sich im Verlaufe der Messung einstellende Sauerstoffkonzentration nicht oder im Rahmen der Meßgenauigkeit nur unwesentlich beeinflußt wird.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß eine von der Gesamtintensität beider Leuchtstoffe in der jeweiligen Lösung unabhängige Referenzgröße aus dem gemessenen Zeit- oder Phasenverhalten erhalten wird und die Sauerstoffkonzentration unter Verwendung der Referenzgröße bestimmt wird.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß die Abklingzeit des zweiten Leuchtstoffs (ref) länger ist als die des ersten Leuchtstoffs (flu).

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß die Anregungs- oder/und Emissionsspektren der Leuchtstoffe (flu, ref) einander überlappen.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß die Leuchtstoffe (flu, ref) durch eine einzige Lichtquelle gemeinsam erregt werden.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß die Leuchtstoffe (flu, ref) gleichzeitig, insbesondere mit gleichzeitigem Erregungsanfang und gleicher Erregungsdauer, erregt werden.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß als Referenzgröße eine gemessene Phasenverschiebung (Φm) der Phasen des Summensignals (ges) beider Leuchtstoffe verwendet wird.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß als Referenzgröße ein Verhältnis beider Intensitäten 11 und 12 über die Zeit verwendet wird, wobei 11 die gemessene Intensität über die Zeit des emittierten Lichtes beider Leuchtstoffe (flu, ref) bei eingeschalteter Lichtquelle bedeutet und 12 die gemessene Intensität über die Zeit des emittierten Lichtes des Referenzfarbstoffes (ref) nach Abschalten der Belichtung bedeutet.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß der kurzlebige Leuchtstoff an der Oberfläche von Partikeln, die den langlebigen Leuchtstoff enthalten, fixiert ist und die Partikel ohne zusätzlichen Träger direkt in die Probe eingebracht werden.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß es sich bei dem Enzym um eine Cytochrom P450-Oxidase, umfassend alle Familien, Subfamilien und Isoen zyme sowie Varianten aller Spezies sowie alle artifiziellen rekombinanten Varianten handelt.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß es sich bei dem Enzym um EC 1.14.14.1 handelt

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß das Enzym in in tierischen Zellen eingeschlossener Form zur Lösung gegeben wird, wobei die mitochondriale Atmung unterdrückt wird.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß das Enzym in Form subzellulärer Systeme zur Verfügung gestellt wird, z.B. ein Protein, eine Mikrosomenfraktion, ein S9-Mix oder ein Homogenat, wobei die Präparationen von tierischen Zellkulturen oder von tierischen Organen, wie der Leber, oder von Mikroorganismen, umfassend Bakterien oder Hefen, stammen.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß der Sauerstoffeintrag aus der Umgebung in die Lösung vermieden wird.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß die Vermeidung durch Schutzgas oder durch Versiegelung mit einer Flüssigkeit, in welcher Sauerstoff sich nur in Spuren löst, bewerkstelligt wird.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß die Lösung mit Silikonöl überschichtet wird.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß durch Bestimmung des während der enzymatischen Oxidation gebildeten Wasserstoffperoxids und durch die Korrektur der Stöchiometrie der enzymatischen Oxidation um die Wasserstoffperoxid ergebende Nebenreaktion, der Meßfehler bei Messung der Sauerstoffabnahme verringert wird.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß der Lösung Katalase oder ein Enzym mit gleicher Katalyseaktivität zugesetzt wird.

Ferner betrifft die Erfindung auch Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer der pharmakokinetischen Charakteristika einer Testsubstanz, umfassend:

– die Metabolischen Stabilität, das heißt die Messung der Metabolismusbedingten Abnahme der Substanzmenge,
– die Speziesabhängigkeit der metabolischen Stabilität einer Testsubstanz bei Vergleich des gleichen Testsystems aus verschiedenen Spezies,
– die Kinetik der metabolisierenden Enzyme, das heißt die Untersuchung der Substrat-Konzentrations- und Zeitabhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion bezüglich der Metabolisierung der Testsubstanz,
– die Bestimmung der CYP-Inhibition/CYP-Inhibitionskonstante, das heißt die CYP-Inhibition/CYP-Inhibitionskonstante der Hemmung der CYP-Aktivität im Hinblick auf den Metabolismus einer Testsubstanz durch Referenzinhibitoren oder von Referenz-Substraten durch andere (neue) Substrate.
– CYP-Profiling, das heißt die Identifizierung, welches CYP ein bestimmtes Substrat metabolisie,

wobei es die Merkmale eines oder mehrerer der vorangegangenen Verfahren umfaßt.

Ferner betrifft die Erfindung auch Verfahren, wobei es sich bei einem Leuchtstoff um ein Platinporphyrin, insbesondere um ein C1-, C2-, C3-, C4-, C5-, C6-, bis C12- Tetra bis Octa Alkylderivat von Platin(II)porphyrin, insbesondere um Platin(II)-tetraphenylporphyrin oder Platin(II)-octaethylporphyrin handelt.

Eine Modifikation des Verfahrens besteht darin, daß es sich bei zwei der Leuchtstoffe um Platin(II)-tetraphenylporphyrin/Rhodamin B oder um Platin(II)-tetraphenylporphyrin/Sulforhodamin 101 handelt.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Vorrichtung umfassend ein Sensormittel, das zumindest zwei verschiedene Leuchtstoffe (flu, ref) ausweist, wobei

• mindestens die Leuchtintensität des ersten Leuchtstoffes (flu) durch die Sauerstoffkonzentration beeinflußt wird und wobei ferner
• die Leuchtintensität oder die Leuchtintensität und die Abklingzeit des zweiten Leuchtstoffen (ref) durch die sich im Verlaufe der Messung einstellende Sauerstoffkonzentration nicht oder im Rahmen der Meßgenauigkeit nur unwesentlich beeinflußt wird,

zur Messung der enzymatischen Oxidation eines ersten Reaktanden, einer Testsubstanz durch einen zweiten Reaktanden, nämlich Sauerstoff in einer Lösung.

Der Verwendungszweck kann sich auch auf die Bestimmung der metabolischen Stabilität einer Testsubstanz beziehen.

Der Verwendungszweck kann sich auch auf die Bestimmung eines oder mehrerer der pharmakokinetischen Charakteristika einer Testsubstanz beziehen, umfassend:

– die Metabolischen Stabilität, das heißt die Messung der Metabolismusbedingten Abnahme der Substanzmenge,
– die Speziesabhängigkeit der metabolischen Stabilität einer Testsubstanz bei Vergleich des gleichen Testsystems aus verschiedenen Spezies,
– die Kinetik der metabolisierenden Enzyme, das heißt die Untersuchung der Substrat-Konzentrations- und Zeitabhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion bezüglich der Metabolisierung der Testsubstanz,
– die Bestimmung der CYP-Inhibition/CYP-Inhibitionskonstante, das heißt die CYP-Inhibition/CYP-Inhibitionskonstante der Hemmung der CYP-Aktivität im Hinblick auf den Metabolismus einer Testsubstanz durch Referenzinhibitoren oder von Referenz-Substraten durch andere (neue) Substrate.
– CYP-Profiling, das heißt die Identifizierung, welches CYP ein bestimmtes Substrat metabolisiert, insbesondere durch zeitaufgelöste Messung der Sauerstoffkonzentration.

Es handelt sich bei einer Modifikation der Verwendung bei einem Leuchtstoff um ein Platinporphyrin, insbesondere um ein C1-, C2-, C3-, C4-, C5-, C6-, bis C12-Tetra bis Octa Alkylderivat von Platin(II)porphyrin, insbesondere um Platin(II)-tetraphenylporphyrin oder Platin(II)-octaethylporphyrin, noch stärker bevorzugt um Platin(II)-tetraphenylporphyrin/Rhodamin B oder um Platin(II)-tetraphenylporphyrin/Sulforhodamin 101 handelt.

Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der zur Verwendung in einem der vorstehend aufgeführten Verfahren gedacht ist. Dieser Kit umfaßt als ersten Bestandteil ein Sensormittel, das zumindest zwei verschiedene Leuchtstoffe (flu, ref) ausweist, wobei

und als zweiten Bestandteil eine biologische Probe, enthaltend ein Enzym geeignet zur Oxidation eines ersten Reaktanden, einer Testsubstanz durch einen zweiten Reaktanden, nämlich Sauerstoff, mit der Maßgabe, daß es sich dabei um keine atmungsaktiven pflanzliche oder tierische Zelle oder einen atmungsaktiven Mikroorganismus handelt.

Der zweite Bestandteil ist bevorzugt ein subzelluläres System, z.B. eine Protein, eine Mikrosomenfraktion, ein S9-Mix oder ein Homogenat, wobei die Präparationen von tierischen Zellkulturen oder von tierischen Organen, wie der Leber, oder von Mikroorganismen, umfassend Bakterien oder Hefen, stammen.

Subzelluläre Systeme entstehen in der Regel aus Zellen, die lysiert wurden. Sie stellen demnach keine lebenden Zelle dar.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Kits ist der zweite Bestandteil lyophilisiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Kits stellen beide Bestandteile eine Einheit dar. Zum Beispiel kann der erste Bestandteil eine Miktotiterplatte mit eingebauten Sensor darstellen, in deren Vertiefungen der zweite Bestandteil enthalten ist, und zwar bevorzugt in lyophilisierter Form, so daß beide Bestandteile eine Einheit bilden.

Sauerstoffsensor

Im folgenden wird ein Sauerstoffsensor beschrieben, der eine Ermittlung der Sauerstoffkonzentration auch ohne zeitaufgelöste Messung des lumineszenten Leuchtsignal ermöglicht.

Ein Sauerstoffsensor kann in Form einer Mikrotiterplatte in 96er oder anderem (z. B. 384er) Format zur Verfügung gestellt werden, wobei jede Vertiefung einen integrierten Sensor enthält. Vorteilhafterweise ist dieser auf dem Boden jeder Platte immobilisiert wie in 7 beschrieben. Der Sensor

kann wie in 7 beschrieben, ebenso wie die Quelle für das Anregungslicht

am Boden angeordnet sein. Diese Anordnung ist in einem kommerziell erhältlichen Fluoreszenreader, der Lumineszenzsignale vermessen kann, realisiert oder realisierbar.

Der Sensor enthält zwei verschiedene Farbstoffe. Ein Farbstoff/Leuchtstoff ist ein Sauerstoffindikator. Seine lumineszente Leuchtintensität I_IN, bei der es sich vorteilhafterweise um Phosphoreszenz handelt, ist abhängig von der Konzentration des Sauerstoffs in der Flüssigkeit, welche in der Vertiefung vorliegt. Bevorzugt handelt es sich bei dem Sauerstoffsensor um ein Platinporphyrin, insbesondere ausgewählt aus Platin(II)-tetraphenylporphyrin,
Platin(II)-tetraphenylporphyrin,
Platin(II)-octaethylporphyrin,
Platin(II)-octaethylporphyrin,
Platin(II)-octaethylkeotporphyrin.

Der andere Leuchtstoff/Farbstoff stellt die Referenz dar. Seine lumineszente Leuchtintensität I_RF, bevorzugt handelt es sich dabei um Fluoreszenz, ist unabhängig von der Sauerstoffkonzentration. Dabei handelt es sich bei dem Leuchtstoff bevorzugt um ein Rhodamiderivat, bevorzugt um Rhodamin insbesondere ausgewählt aus Rhodamin B, Rhodamin B-octadecylester, Sulforhodamin 101.

Ausgehend von diesen zwei lumineszenten Leuchtsigalen also Lumineszenzintensitäten kann das folgende Verhältnis I_R berechnet werden. Dieses Signal I_R korreliert mit der Konzentration von Sauerstoff. Die Ansprechzeiten sind in der Regel sehr kurz, wenn der Sensor auch für nicht gasförmige Stoffe permeabel ist, was besonders bevorzugt ist.

Die Kalibration des Lesegerätes bei dem es sich um einen konventionellen Lumineszenzreader handeln kann, erfolgt in der Regel durch die Bestimmung zweier Gerätekonstanten durch Messung der Lumineszenz von 8 Vertiefungen. Die nachfolgende Messung mit Hilfe von anderen Sensorplatten ist kalibrationsfrei. In Folge der Drift der Optik des Fluoreszenz-Lesegerätes kann es notwendig sein, daß Lesegerät von Zeit zu Zeit neu zu kalibrieren.

Zur Vermessung der Sensorplatte kann ein kommerziell erhältliches Lumineszenz-Lesegerät benutzt werden, welches vom Boden der Sensorplatte her die Fluoreszenzintensität bestimmt. Weil der Sensor der oben beschriebenen Platte zwei verschiedene Farbstoffe aufweist, deren Leuchtsignale, ohne auf zeitaufgelöste Messungen zurückzugreifen, vermessen werden sollen, muss das Lesegerät in der Lage sein, im dualen kinetischen Betriebszustand (dual kinetic mode) zu arbeiten. Dies bedeutet, dass zwei Messwerte mit Hilfe von zwei verschiedenen Filterpaaren oder Gittern pro betreffenden Zeitpunkt (Messpunkt) aufgenommen werden können.

In der Regel werden in diesem Fall zwei Filterpaare (4 Filter) zur Messung der Sauerstoffkonzentration in einer Vertiefung der Sensorplatte benötigt.

Bevorzugt wird folgendes System eingesetzt:
Filterpaar 1: 544/650 nm
Filterpaar 2. 544/590 nm

Natürlich können aber auch aquivalente Mittel wie Gitter verwendet werden, wie dem Fachmann bekannt ist. Das erste Filterpaar (Filterpaar 1) ermöglicht die Messung der Lumineszenz des Leuchtstoffes I_IN, das zweite Filterpaar (Filterpaar 2) misst die Lumineszenz des Referenzfarbstoffes I_RF. Obwohl diese Kombination geeignet sind, sind andere Filterkombinationen denkbar.

Die Kalibration des Fluoreszenz Lesegerätes

Das Verhältnis I_R korreliert mit der Sauerstoffkonzentration in jeder Vertiefung. Weil die absolute Lichtintensität des Fluoreszenz-Lesegerätes nicht bekannt ist, wird diese zum Beispiel mit Hilfe einer Zweipunkt-Kalibration des Lesegerätes bestimmt.

Vorbereitung der Kalibrierungsstandards

Die Kalibrierung des benutzten Fluoreszenz-Lesegerätes wird zum Beispiel durch eine konventionelle Zweipunkt-Kalibration unter Verwendung sauerstofffreien Wassers („cal 0") und von luft-gesättigtem Wasser („cal 100") durchgeführt.

Die Herstellung der cal 0 Lösung (sauerstoffreies Wasser)

Zum Beispiel wird ein Gramm Natriumsulfit (Na₂SO₃) oder ein halbes Gramm Natriumdithionit (Na₂S₂O₄) in ein geeignetes Gefäß gegeben und in 100 ml Wasser aufgelöst. Das Gefäß wird nach der Kalibration geschlossen um den Sauerstoffeintrag zu minimieren. Nach Zugabe des Natriumsulfits wird eine Minute gewartet, bis sich alles Natriumsulfit bzw. Natriumdithionit aufgelöst hat, um sicherzustellen, dass das Wasser sauerstofffrei ist. Vorausgesetzt, dass das Gefäß, in welchem die cal 0 Lösung aufbewahrt wurde, geschlossen worden ist, kann die Standardlösung über 24 Stunden benutzt werden.

Herstellung der Kalibrationslösung cal 100 (sauerstoffgesättigtes Wasser)

Zum Beispiel werden 100 ml Wasser in ein geeignete Gefäß gegeben. Dieses wird geschlossen und zwei Minuten heftig geschüttelt, bis der Inhalt sauerstoffgesättigt ist. Die Kalibrationslösung „cal 100" kann 3 Tage benutzt werden, vorausgesetzt, dass die Temperatur konstant gehalten wird und das Gefäß fest verschlossen wurde.

Da die Sauerstoffsättigung salz- und temperaturabhängig ist, ist es vorteilhaft, darauf zu achten, dass die Kalibration bei den Temperaturen und Ionenstärke-Bedingungen durchgeführt wird, bei welchem auch später die Messung erfolgen soll.

Zweipunkt-Kalibration des Messgerätes

Das Signal I_R für Lösung cal 0 und Lösung cal 100, die in die Vertiefung der Sensorplatte eingefüllt wurden, muss bestimmt werden, um die unten definierten Gerätekonstanten k₀ und k₁₀₀ zu erhalten. Falls die Kalibration unter Verwendung von 8 Vertiefungen in der Sensorplatte einmal durchgeführt worden ist, können weitere Sensorplatten ohne neue Kalibration durchgeführt werden, d.h. diese sind dann kalibrationsfrei. Allerdings kann in Folge von Drift-Phänomenen eine abermalige Kalibration etwa jede Woche notwendig sein. Zum Zwecke der Kalibration kann die Lösung cal 100 in die Vertiefung A1 – D1 gefüllt werden. Die Lösung cal 100 kann in die Vertiefung E1 – H1 gefüllt werden.

Jedesmal sind für eine Mikrotiterplatte im 96'iger Format 100–200 Mikroliter der Lösung notwendig. Um weiteren Sauerstoffeintrag zu vermeiden, kann die Überschichtung mit einer versiegelnden Lösung wie z.B. Öl oder das Abdecken mit einer Folie oder das Arbeiten unter Schutzgasatmosphäre (z.B. Stickstoff) notwendig sein. Für jede Vertiefung wird das Signal I_R unter Verwendung der Gleichung

bestimmt.

Die Gerätekonstante k₁₀₀ wird bestimmt durch folgende Gleichung: k100 = ¼∙[IR(A1) + IR(B1) + IR(C1) + IR(D1)]

Die Gerätekonstante k₀ wird nach Bestimmung der jeweiligen Werte I_R folgender Gleichung ermittelt: k0 = ¼∙[IR(E1) + IR(F1) + IR(G1) + IR(H1)]

Der Sauerstoffpartialdruck beziehungsweise die Sauerstoffkonzentration in einer Messlösung ergibt sich unter Verwendung der vorstehend bestimmten Gerätekonstanten aus der folgenden Gleichung: pO2 = 100∙(k0/IR – 1)/(k0/k100 – 1)

Dieser Wert kann in andere Einheiten wie Torr, hPa, g/l, mol/l oder ppm bei gegebener Temperatur und Luftdruck umgewandelt werden, wie dem Fachmann bekannt ist.

Auch andere Meßverfahren sind denkbar. Wird nur die Gesamtintensität des lumineszenten Leuchtsignals gemessen, so kann natürlich auf eine komplizierte Optik zur Trennung der Leuchtsignale beider Leuchtstoffe (doppeltes Filter- oder Gitterpaar) verzichtet werden. Die Bestimmung der Gesamtintensität erfolgt dann zeitaufgelöst, entweder nach regelmäßiger Anregung indirekt über den Phasenwinkel mit Hilfe von Phasenmodulationstechniken, wie oben beschrieben, oder durch direkte (Echt)Zeitmessung, was auch bei einmaliger oder unregelmäßiger Anregung die Bestimmung der Sauerstoffkonzentration ermöglicht.

Im folgenden werden die Systeme beschrieben, die sich als Quelle für das die Testsubstanz umsetzende Enzym besonders eignen.

(I) Nicht-rekombinante Enzyme: subzelluläre Präparationen aus mikrobiologischen Kulturen (z.B. Bakterien- oder Hefepräparationen), Zellkulturen (z.B. SF9-Insektenzellen oder Säugerzellen wie V79-Zellen) oder tierischen Organen, wie insbesondere der Leber, die diese Enzyme enthalten. Bei den subzelluläre Präparationen kann es sich um Supersomen^®, Bactosomen^®, Mikrosomen, Zellhomogenate oder einen S9-Mix handeln. Außerdem können auch zellulare Systeme eingesetzt werden, sofern zumindest durch entsprechende Inhibititoren die mitochondriale Atmung unterdrückt wird, so daß der Sauerstoffverbrauch infolge der Oxidation der Testsubstanz meßbar bleibt. Zum Begriff S9-Mix: Insbesondere S9-Mix der Leber wird zur Bestimmung der metabolischen Stabilität von Substanzen eingesetzt. Dabei handelt es sich um die 9.000 × g Fraktion nach differentieller Zentrifugation von homogenisiertem (Leber)Gewebe, siehe z.B. Maron, D. and Ames B. (1983) Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutat. Res. 113, 173–215, http://mutage.oupjournals.org/cgi/external_ref?access_num=6341825&link_type=MED; Atsushi Hakura, Satoshi Suzuki, Shigeki Sawada, Satoru Motooka, Tetsuo Satoh, An improvement of the Ames test using a modified human liver S9 preparation, Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 46 (3);(2001) pp. 169–172; http://www.elsevier.com/cdweb/journals/10568719/viewer.htt?vol=46&viewtype=issue&iss=3#S105687190200186. Zum Begriff Mikrosomen: Mikrosomen, insbesondere Lebermikrosomen werden klassisch zur Bestimmung der mikrosomalen metabolischen Stabilität von Substanzen eingesetzt. Dabei handelt es sich um die 100.000 × g Fraktion nach differentieller Zentrifugation von homogenisiertem (Leber)Gewebe, siehe z.B. Gill HJ, Tingle MD and Park BK (1995) N-Hydroxylation of dapsone by multiple enzymes of cytochrome P450: Implications for inhibition of haemotoxicity. Br J Clin Pharmacol 40:531–538; http://dmd.aspetjournals.org/cgi/external_ref?access_num=8703658&link_type=MED; R.J. Riley, D.Howbrook, In vitro Analysis of the Activity of the Major Human Hepatic CYP Enzyme (CYP3A4) Using [N-Methyl-¹⁴C]-Erythromycin, Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 38 (4)(1997) pp. 189–193; http://www.elsevier.com/cdweb/journals/10568719/viewer.htt?vol=38&viewtype=issue&iss=4#S105687199700103;
(II) Rekombinante Enzyme insbesondere CYPs, die rekombinant in Säuger- oder Insektenzellen exprimiert wurden, können ebenfalls verwendet werden. Im Verfahren können subzelluläre Präparationen dieser Expressionssysteme wie Supersomen^®, Mikrosomen, Zellhomogenate, S9-Mix sowie die oben beschriebenen zellulären Systeme eingesetzt werden.

Rekombinante und Nichtrekombinante Enzyme, zum Beispiel auch in Form von Mikrosomen und des S9-Mix lassen sich bevorzugt aus tierischen Spezies und Organen gewinnen. Besondere Bedeutung für das Verfahren hat die Leber von Mensch, Affe, Hund, Schwein, Ratte, Maus, Kaninchen und Hamster. Daneben lassen sich entsprechende Enzympräparationen auch aus mikrobilogischen Kulturen oder Pflanzenzellkulturen oder Pflanzen gewinnen.

Beispiel A
Versuchsprotokoll zu Bestimmung der metabolischen Stabilität

– Vorbereitung "Mastermix" auf Eis: Wäßriger Puffer (50 mM Kaliumphosphat, pH 7.4), Testsystem (menschliche Lebermikrosomen, 1.25 mg microsomales Protein/ml), Elektronendonor (1 mM NADPH)
– Pipettieren der Kontrollen oxidierte Kontrolle: Wasser; reduzierte Kontrolle: 1 % Natriumsulfit in Wasser oder 0,5 % Natriumdithionit in Wasser
– Verteilung des Mastermixes auf die oben beschriebene Mikrotiterplatte im 96'iger Format, 100 μl pro Vertiefung
– Zugabe der zu testenden Substanzen: als 100fach konzentrierte Stammlösung in DMSO
– Überschichtung mit Silikonöl (etwa 2 Tropfen pro Vertiefung) verringert die Sauerstoffresaturierung durch Lufteintrag; alternativ kann unter Stickstoffatmosphäre gearbeitet werden
– Auslesen der Platte mit einem Fluoreszenz-Mikrotiterplattenreader von Labsystems durch Messen der Fluoreszenz aus der Richtung des Plattenboden; Dauer z.B. 20–40 min
– Datenprozessierung mit Gerätesteuersoftware und Excel (Microsoft)

Das Beispiel wird nachfolgend durch die 7b bis 17 beschrieben.
Dabei zeigt:
7b: die wichtigste Reaktionsgleichung und mögliche Anwendungen,
8a: die nach 60 Minuten Sauerstoffmessung erhaltenen Rohdaten,
8b: die nach Zweipunktkalibrierung mit sauerstoffgesättigter Kontolle (Ox. Control) und sauerstofffreier Kontrolle (Red. Control), Kontrolle ohne Testsubstanz (TI blank), mit 100 μM Coumarin, Midazolam, Testosteron, Paclitaxel, Bufuralol, Tamoxifen und Verapamil aus den Rohdaten aus 8a ermittelten Daten,
9: eine Zusammenfassung zu betrachtender Parameter,
10: eine weitere Zusammenfassung zu betrachtender Parameter,
11: eine Demonstration des Einflusses von Öl auf die Sauerstoffresaturierung mit 10 μM Bufuralol mit und ohne Öl,
12: das ermittelte Optimum der Meßparameter, wobei sich die Mikrosomenkonzentration auf die korrespondierende Proteinkonzentration bezieht, die Testsubstanzkonzentration bei 100 μM optimal ist, wenn verschiedene Substanzen verglichen werden sollen, und das optimale Inkubationsvolumen auf eine 96er Platte bezogen ist,
13: ein Screeningverfahren nach dem Stand der Technik mit LC-MS/MS,
14: eine Messung des Sauerstoffverbrauchs für 100 μM Coumarin, Midazolam, Testosteron, Paclitaxiel, Bufuralol, Tamoxifen, Verapamil und Gruppierung in schnellen Metabolismus (fast), mittel schneller (i.m.), langsamer Matabolismus (slow),
15: einen Vergleich von LC-MS/MS nach dem Stand der Technik mit Sauerstoffverbrauch gemäß der Erfindung (gute Übereinstimmung);
16: ein Beispiel für den Einsatz rekombinanter Enzyme, hier humanes CYP2DG, zur Darstellung des langsamen Metabolismus von Tamoxifen und des schnellen von Bufuralol, jeweils 30 μM, im Vergleich zu den mit HPLC-FLD/LC-MS erhaltenen Meßwerten (gute Übereinstimmung);
17: Maßnahmen zur Verbesserung der Meßgenauigkeit.

Claims

Verfahren zur Messung der enzymatischen Oxidation eines ersten Reaktanden, einer Testsubstanz durch einen zweiten Reaktanden, nämlich Sauerstoff, durch zeitaufgelöste Messung der Sauerstoffkonzentration in einer Lösung, die neben dem Enzym zu Beginn der Messung beide Reaktanden aufweist, durch Messung des lumineszenten Leuchtsignals zweier oder mehrerer verschiedener Leuchtstoffe (flu, ref), wobei unter den gewählten Meßbedingungen, (d) mindestens die Leuchtintensität des ersten Leuchtstoffes (flu) durch die Sauerstoffkonzentration beeinflußt wird und wobei ferner (e) die Leuchtintensität oder die Leuchtintensität und die Abklingzeit des zweiten Leuchtstoffen (ref) durch die sich im Verlaufe der Messung einstellende Sauerstoffkonzentration nicht oder im Rahmen der Meßgenauigkeit nur unwesentlich beeinflußt wird und wobei ferner (f) die Intensität der Leuchtsignale beider Leuchtstoffe entweder jeweils getrennt oder in Form eines Gesamtsignals durch ein oder mehrere Detektoren gemessen wird und daraus Sauerstoffkonzentration ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Abklingzeit ersten Leuchtstoffes (flu) länger ist als die Abklingzeit des zweiten Leuchtstoffes (ref).
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) das Zeit- oder Phasenverhalten gemessen wird und der zweite Leuchtstoff so ausgewählt wird, daß sich sowohl die Leuchtintensität als auch die Abklingzeit des zweiten Leuchtstoffen (ref) durch die sich im Verlaufe der Messung einstellende Sauerstoffkonzentration nicht oder im Rahmen der Meßgenauigkeit nur unwesentlich beeinflußt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine von der Gesamtintensität beider Leuchtstoffe in der jeweiligen Lösung unabhängige Referenzgröße aus dem gemessenen Zeit- oder Phasenverhalten erhalten wird und die Sauerstoffkonzentration unter Verwendung der Referenzgröße bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Abklingzeit des zweiten Leuchtstoffs (ref) länger ist als die des ersten Leuchtstoffs (flu).
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungs- oder/und Emissionsspektren der Leuchtstoffe (flu, ref) einander überlappen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Leuchtstoffe (flu, ref) durch eine einzige Lichtquelle gemeinsam erregt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Leuchtstoffe (flu, ref) gleichzeitig, insbesondere mit gleichzeitigem Erregungsanfang und gleicher Erregungsdauer, erregt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Referenzgröße eine gemessene Phasenverschiebung (Φm) der Phasen des Summensignals (ges) beider Leuchtstoffe verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Referenzgröße ein Verhältnis beider Intensitäten 11 und 12 über die Zeit verwendet wird, wobei 11 die gemessene Intensität über die Zeit des emittierten Lichtes beider Leuchtstoffe (flu, ref) bei eingeschalteter Lichtquelle bedeutet und 12 die gemessene Intensität über die Zeit des emittierten Lichtes des Referenzfarbstoffes (ref) nach Abschalten der Belichtung bedeutet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der kurzlebige Leuchtstoff an der Oberfläche von Partikeln, die den langlebigen Leuchtstoff enthalten, fixiert ist und die Partikel ohne zusätzlichen Träger direkt in die Probe eingebracht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Enzym um eine Cytochrom P450-Oxidase, umfassend alle Familien, Subfamilien und Isoenzyme sowie Varianten aller Spezies sowie alle artifiziellen rekombinanten Varianten handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Enzym um EC 1.14.14.1 handelt
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in in tierischen Zellen eingeschlossener Form zur Lösung gegeben wird, wobei die mitochondriale Atmung unterdrückt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in Form subzellulärer Systeme zur Verfügung gestellt wird, wie ein Protein, eine Mikrosomenfraktion, ein S9-Mix oder ein Homogenat, wobei die Präparationen von tierischen Zellkulturen oder von tierischen Organen, wie der Leber, oder von Mikroorganismen, umfassend Bakterien oder Hefen, stammen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Sauerstoffeintrag aus der Umgebung in die Lösung vermieden wird.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Vermeidung durch Schutzgas oder durch Versiegelung mit einer Flüssigkeit, in welcher Sauerstoff sich nur in Spuren löst, bewerkstelligt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung mit Silikpnöl überschichtet wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß durch Bestimmung des während der enzymatischen Oxidation gebildeten Wasserstoffperoxids und durch die Korrektur der Stöchiometrie der enzymatischen Oxidation um die Wasserstoffperoxid ergebende Nebenreaktion, der Meßfehler bei Messung der Sauerstoffabnahme verringert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche i bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösung Katalase oder ein Enzym mit gleicher Katalyseaktivität zugesetzt wird.
Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer der pharmakokinetischen Charakteristika einer Testsubstanz, umfassend: – die Metabolischen Stabilität, das heißt die Messung der Metabolismusbedingten Abnahme der Substanzmenge, – die Speziesabhängigkeit der metabolischen Stabilität einer Testsubstanz bei Vergleich des gleichen Testsystems aus verschiedenen Spezies, – die Kinetik der metabolisierenden Enzyme, das heißt die Untersuchung der Substrat-Konzentrations- und Zeitabhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion bezüglich der Metabolisierung der Testsubstanz, – die Bestimmung der CYP-Inhibition/CYP-Inhibitionskonstante, das heißt die CYP-Inhibition/CYP-Inhibitionskonstante der Hemmung der CYP-Aktivität im Hinblick auf den Metabolismus einer Testsubstanz durch Referenzinhibitoren oder von Referenz-Substraten durch andere (neue) Substrate. – CYP-Profiling, das heißt die Identifizierung, welches CYP ein bestimmtes Substrat metabolisiert, dadurch gekennzeichnet, daß es die Merkmale eines oder mehrerer der vorangegangenen Ansprüche umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei es sich bei einem Leuchtstoff um ein Platinporphyrin, insbesondere um ein C1-, C2-, C3-, C4-, C5-, C6-, bis C12- Tetra bis Octa Alkylderivat von Platin(II)porphyrin, insbesondere um Platin(II)-tetraphenylporphyrin oder Platin(II)-octaethylporphyrin handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei zwei der Leuchtstoffe um Platin(II)-tetraphenylporphyrin/Rhodamin B oder um Platin(II)-tetraphenylporphyrin/Sulforhodamin 101 handelt.
Verwendung einer Vorrichtung umfassend ein Sensormittel, das zumindest zwei verschiedene Leuchtstoffe (flu, ref) ausweist, wobei • mindestens die Leuchtintensität des ersten Leuchtstoffes (flu) durch die Sauerstoffkonzentration beeinflußt wird und wobei ferner • die Leuchtintensität oder die Leuchtintensität und die Abklingzeit des zweiten Leuchtstoffen (ref) durch die sich im Verlaufe der Messung ein stellende Sauerstoffkonzentration nicht oder im Rahmen der Meßgenauigkeit nur unwesentlich beeinflußt wird, zur Messung der enzymatischen Oxidation eines ersten Reaktanden, einer Testsubstanz durch einen zweiten Reaktanden, nämlich Sauerstoff in einer Lösung.
Verwendung nach Anspruch 24 zur Bestimmung der metabolischen Stabilität einer Testsubstanz.
Verwendung nach Anspruch 24 zur Bestimmung eines oder mehrerer der pharmakokinetischen Charakteristika einer Testsubstanz, umfassend: – die Metabolischen Stabilität, das heißt die Messung der Metabolismusbedingten Abnahme der Substanzmenge, – die Speziesabhängigkeit der metabolischen Stabilität einer Testsubstanz bei Vergleich des gleichen Testsystems aus verschiedenen Spezies, – die Kinetik der metabolisierenden Enzyme, das heißt die Untersuchung der Substrat-Konzentrations- und Zeitabhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion bezüglich der Metabolisierung der Testsubstanz, – die Bestimmung der CYP-Inhibition/CYP-Inhibitionskonstante, das heißt die CYP-Inhibition/CYP-Inhibitionskonstante der Hemmung der CYP-Aktivität im Hinblick auf den Metabolismus einer Testsubstanz durch Re- ferenzinhibitoren oder von Referenz-Substraten durch andere (neue) Substrate. – CYP-Profiling, das heißt die Identifizierung, welches CYP ein bestimmtes Substrat metabolisiert, insbesondere durch zeitaufgelöste Messung der Sauerstoffkonzentration.
Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei es sich bei einem Leuchtstoff um ein Platinporphyrin, insbesondere um ein C1-, C2-, C3-, C4-, C5-, C6-, bis C12- Tetra bis Octa Alkylderivat von Platin(II)porphyrin, insbesondere um Platin(II)-tetraphenylporphyrin oder Platin(II)-octaethylpoiphyrin handelt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei zwei der Leuchtstoffe um Platin(II)-tetraphenylporphyrin/Rhodamin B oder um Platin(II)-tetraphenylporphyrin/Sulforhodamin 101 handelt.
Kit umfassend als ersten Bestandteil ein Sensormittel, das zumindest zwei verschiedene Leuchtstoffe (flu, ref) ausweist, wobei • mindestens die Leuchtintensität des ersten Leuchtstoffes (flu) durch die Sauerstoffkonzentration beeinflußt wird und wobei ferner • die Leuchtintensität oder die Leuchtintensität und die Abklingzeit des zweiten Leuchtstoffen (ref) durch die sich im Verlaufe der Messung einstellende Sauerstoffkonzentration nicht oder im Rahmen der Meßgenauigkeit nur unwesentlich beeinflußt wird, und als zweiten Bestandteil eine biologische Probe, enthaltend ein Enzym geeignet zur Oxidation eines ersten Reaktanden, einer Testsubstanz durch einen zweiten Reaktanden, nämlich Sauerstoff, mit der Maßgabe, daß es sich dabei um keine atmungsaktiven pflanzliche oder tierische Zelle oder einen atmungsaktiven Mikroorganismus handelt.
Kit nach Anspruch 29, wobei der zweite Bestandteil ein subzelluläres System z.B. eine Protein, eine Mikrosomenfraktion, ein S9-Mix oder ein Homogenat darstellt, wobei die Präparationen von tierischen Zelkulturen oder von tierischen Organen, wie der Leber, oder von Mikroorganismen, umfassend Bakterien oder Hefen, stammen.
Kit nach Anspruch 30, wobei der zweite Bestandteil lyophilisiert vorliegt.
Kit nach Anspruch 29 oder 30, bei welchem beide Bestandteile eine Einheit bilden.