DE10329844B3

DE10329844B3 - Überwachung des Teilungsverhältnisses von durch einen Stromteiler erzeugter Volumenströme für die Mikro- und Kapillar-Säulen-Chromatographie

Info

Publication number: DE10329844B3
Application number: DE10329844A
Authority: DE
Inventors: Thomas Preiswerk; Klaus Kaiser; Herbert Funke
Original assignee: FLUX INSTR AG BASEL; FLUX INSTRUMENTS AG
Current assignee: FLUX INSTR AG BASEL; FLUX INSTRUMENTS AG
Priority date: 2003-03-10
Filing date: 2003-07-02
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2023-07-03

Abstract

Vorgeschlagen wird ein Überwachungsverfahren für ein Teilungsverhältnis von Volumenströmen in der Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), wobei ein - einer Förderpumpe (BP) für eine mobile Phase nachgeschalteter - Stromteiler (R) mehrere Volumenströme (2, 3) erzeugt. Das zugehörige Analysensystem weist für zumindest einen der Teilströme einen Flussmessfühler (10, 20, 30) auf und dessen Messsignal wird während zumindest eines Zeitabschnittes in einem jeweiligen Analysenlauf mit Daten eines vorhergehenden Referenzlaufes desselben Analysensystems verglichen, um bei Passieren zumindest bei einem von vorgegebenen Schwellenwerten (automatisch) eine Überwachungsmaßnahme auszulösen. Damit kann während eines Analysenlaufs auf einen ungeregelten hydraulischen Widerstand, aber reproduzierten Vorlumenstrom über die Trennsäule bzw. den Ablaufpfad des Stromteilers, eine Flow-Splitting-Technik zur Verfügung gestellt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überwachung der Versorgung flüssigkeits-chromatographischer Trennsäulen mit der mobilen Phase in Anwendung der Mikro- oder Nano-HPLC-Methodik auf der Grundlage von Volumenströmen unter 25 bzw. 5 μl/min. Die Technik des Stromsplittings umfasst die in Verbindung mit üblichen oszillierenden Hochdruck-Kurzhub-Pumpen mit einem Förderraten-Optimum im ml-Bereich.
Sowohl für die qualitative wie für die quantitative Richtigkeit von Analysenergebnissen in der HPLC ist hinsichtlich der mobilen Phase die Bereitstellung eines konstanten Massenstroms prinzipielle Forderung.

Ein "Constant Pressure Splitting" (CPS) nach DE-C 101 32 097 (Flux) wird erreicht, wenn ein Ventil am Ausgang den Druck in einem Verteilerrohr regelt. Das Verändern des Stömungsdrucks (Staudrucks) in einer von mehreren Kapillaren kann so den Volumenstrom in den anderen Kapillaren nicht beeinflussen.

Grundsätzlich ist das Splittingverfahren geeignet, für die klassische HPLC gebaute Pumpen auch für die Mikro und Nano-HPLC einzusetzen. Das Splitten ist in der Praxis nicht ohne technische Tücken. Nicht zuletzt, weil sich die Trennsäulen in einem einschlägigen HPLC-System im Betrieb zusetzen können. Um die sich aus diesem Umstand ergebenden Schwierigkeiten zu vermeiden, wurden über die Jahre hin verschiedene Vorrichtungen und Verfahren entwickelt, bspw. entsprechend der DE-C 199 14 358 (Agilent). Hier liegt das Konzept zugrunde, einen "Arbeitsstrom" (→ der die Trennsäule durchläuft) mittels eines Messfühlers (dort 40) über einen Restriktor (Stromteiler) hinsichtlich seines fluidischen Widerstands nachzuregeln und fortlaufend auf einen veränderlichen Säulenrückdruck abzustimmen. Als Meßfühler dient ein kalorischer Flow Sensor (neuester Generation; nach dem hegt sink-Prinzip arbeitend); wie dort in Spalte 7, Zeile 39ff beschrieben. Der Strömungs-Widerstand im "Überschusspfad" wird vom Messfühler beeinflusst verändert, vgl. dort den Regler 50 mit Meßgröße 40,70 und Stellgröße 48,46 nach dortiger Spalte 8, Zeile 5 bis 16.

Nach gleichem Funktionsprinzip arbeiten Schutzrechte für eine Flow-Feedback Antriebsregelung bei (HPLC)-Pumpen zur automatischen Kompensation des Abfalls des Pumpwirkungsgrades in Abhängigkeit der Kompressibilität des Fördermediums.

Aktuellem theoretischen und praktischem Verständnisstand entsprechend, steht einer wirklich befriedigenden Nutzung der bekannten Vorrichtungen und Verfahren grundsätzlich das Problem einer Artefaktempfindlichkeit (momentane Druckstöße; Luftblasen) und einer stets nicht ausreichend schnell – will heißen in Echtzeit – möglichen Nachregelbarkeit entgegen.

Diese Umstände sind insofern kritisch als die Packungen von HPLC-Trennsäulen infolge der kleinen Partikelgröße (kleiner 5μm Größe) Rückdrücke bis 400bar bewirken, was selbst bei optimaler Kolbenabdichtung und sicher ausgeschlossener Elastizität im Verdrängersystem aufgrund der spezifischen Kompressibilität der geförderten mobilen Phase zu einem Abfall des Pumpwirkungsgrades in Abhängigkeit vom Systemdruck führt.

Hinzu tritt, daß sich im Niederdruck-Gradientenbetrieb, d.h. einer zur Steigerung der Trennleistung an der Säule vorwiegend üblichen, auf der Saugseite der Pumpe kontrolliert veränderten Zusammensetzung des Stroms der mobilen Phase, der Systemdruck abhängig von wechselnder Viskosität verändert und mithin auch temperaturabhängig wird.

Um unbeeinflußt von den genannten Störgrößen den vollen Pumpwirkungsgrad zu erhalten, wurden HPLC-Pumpen mit Feedback-Regelungen auf der Basis einer Rückkopplung des momentanen Förderdruck-Meßsignals als mittelbare Regelgröße oder des Meßsignals eines Flußmeßfühlers als unmittelbare Regelgröße in die Antriebsregelung von Pumpen entwickelt.

In beiden Fällen fehlt eine grundsätzliche Lösung des Problems einer an sich notwendigen Nachregelung in Echtzeit bzw. des Ausschaltens von Störungen durch die hydraulischen Impedanz des Gesamtsystems und des Einflusses veränderter Zusammensetzung der mobilen Phase.

Artefakte durch Viskositätspropfen können bei der Probenaufgabe auftreten.

Die genannten Einflüsse gelten ebenso für die in der DE-C 199 14 358 beschriebene Vorrichtung eines in Bezug auf die Restriktionswirkung proportional zum Signals eines Flußmeßfühlers "modulierbaren Stromteilers". Hinsichtlich einer überschießenden Regelung ist das System eher noch anfälliger.

Technische Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren für die Mikro und Nano-HPLC in Verbindung mit bekannter Flow-Splitting-Technik anzubieten, das während eines Analysenlaufs auf ungeregeltem hydraulischen Widerstand, aber reproduzierten Volumenstrom über die Trennsäule bzw. den Ablaufpfad des Stromteilers beruht, jedoch zugleich auf einfache und zuverlässige Weise erlaubt, im Vergleich zu einem einer Probenserie vorgeschalteten Referenzlauf von Analysenlauf zu Analysenlauf zu prüfen, ob eine Einbuße an Trennleistung, insbesondere durch Zusetzen der Trennsäule infolge Veränderungen in der Säulenpackung und/oder durch Eintrag von Substrat aus biologischen Probenmaterial, eingetreten ist (Anspruch 1, 2 oder 10).

Einer derartigen Überwachung kommt insofern spezielle Bedeutung zu, als sie dazu geeignet ist, bei automatischer Aufgabe einer Vielzahl von Proben unwiederbringliches oder unter hohem Kostenaufwand isoliertes Probenmaterial vor Verlust infolge (bevorstehender) Fehlfunktion zu bewahren.

Die Erfindung sieht hingegen für einen Meßfühler nach dem kalorischen Meßprinzip einen auch praktische sehr wohl vorteilhaften Einsatz zur Funktionsüberwachung von Analysensystemen einschlägiger Art in der Weise vor, wie sie in den Ansprüchen umschrieben ist (Anspruch 1, Anspruch 2).

Im Falle der Anwendung der Niederdruck-Gradienten-Methode beruht die fortlaufende analysenzyklus-aufgelöste Funktionsüberwachung im Sinne der Erfindung auf der Messung eines oder beider Teilströme (Anspruch 3) hinter dem Stromteiler in der dem eigentlichen Analysenverlauf stets vorangehenden Äquilibrationsphase oder während eines in isokratischem Fördermodus verlaufenden Abschnitts (Anspruch 13).

In der zugehörigen Überwachung erfolgt einerseits ein Ablegen der relevanten Parameter bei Referenzläufen (Anspruch 5, Anspruch 6) nach dem Selbstlernprinzip und andererseits, unter Berücksichtigung der (als Systemparameter getrennt ermittelten) Ansprechzeiten der Proportionierventile am Pumpeneinlaß, ein Rückrechnen auf die tatsächlichen erzeugte Gradientenformung, nötigenfalls unter nachfolgendem Auslösen einer automatischen Korrektur in Bezug auf den Betätigungszyklus der beteiligten Proportionierventile.

Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung.
1 ist ein Aufbau mit HPLC Trennsäule, Pumpe P und Splitter R.
2 veranschaulicht die Wirkungsweise der Flussmessung trotz Störeinflüsse durch Druckschwankungen (Pulsation des Förderstroms).
In 1 wird ein Analysensystem gezeigt, mit Pumpe P, Zuleitung 1 und Splitter R (Restrictor). Von letzterem gehen mehrere Teilströme 2,3 aus, wobei der Nutzstrom 2 einen wesentlich geringeren Volumenstrom besitzt als die "Waste line" 3 (der verworfene Anteil).
Der größte Teil des Förderstroms entlang der Förderlinie 1, ausgehend von der Pumpe P, wird über die "Wasteline" 3 abgeführt. Ein nur kleiner Teil gelangt über den Stromteiler 2 zum Probenaufgabe-Ventil 4 und zur Trennsäule 5.
Anhand der 2 kann nachvollzogen werden, welch hohe Druckschwankungen sich in Folge der spezifischen Fördermedium-Kompressibilität in Abhängigkeit vom Förderdruck aufbauen können (pulsierende Kurve), und welcher tatsächliche Gradient am Detektor 51 nach dem Durchschleusen durch die Pumpe gemessen werden kann, wenn der programmierte Gradient A(t) entsprechend der punktierten Linie im Systemprogramm 100 vorgegeben wird. Dieser tatsächliche Gradient wird im Beispiel durch Öffnen zweier Proportionierventile vorgegeben, welche mit 50 bezeichnet, vor dem Splitter R und vor der Pumpe gelegen sind. Die Pumpe P selbst hat einen Auslaß 51, von dem ausgehend die Förderleitung 1 zum Stromteiler R führt.
Die schematisch eingezeichneten Messwerte der Flussmessung mit einem kalorischen Flow-Sensor (neuester Generation, nach dem Heat-Sink-Prinzip arbeitend) geben Messsignale proportional zum Volumenstrom (dem Flow) ab. Nur eine der drei eingezeichneten Stellen 10, 20 oder 30 wird benötigt, um während eines Referenzlaufes Daten rf(t) vorzugeben und vergleichbare Daten während des tatsächlichen Analysenlaufes erneut zur Verfügung zu stellen. Es bietet sich als besonders vorteilhaft der kalorische Flow-Sensor 10 am Ausgang der Säule 5, nach dem optischen Detektor 51 an. Geeignet ist auch die Anordnung an der Stelle 20 im Druckbereich nach dem Stromteiler und vor der Säule 5. Ebenso geeignet ist eine Anbringung des kalorischen Flow-Sensors 30 im Zweig 3, der den Überschuß des Volumenstroms aus der Hauptleitung 1 aufnimmt. Auch eine Kombination von zwei oder mehr Flow-Sensoren 10,20,30 ist realisierbar, wenn in der vorgelagerten Referenzphase (Referenzlauf) die entsprechenden Werte aufgezeichnet werden und dann in der nachgeschalteten Analysenphase (Analysenlauf) die erfassten Messwerte mit den aufgezeichneten Referenzwerten verglichen werden.
Die Steuerung der Pumpe und die Erzeugung von Gradienten geschieht über die symbolisch eingezeichnete Steuerleitung 60, welche die Proportionierventile 50 vor der Pumpe steuert.
Mit dem vorgeschlagenen Konzept der 1 wird weder die Pumpe nachgeregelt, noch der Splitter über eine Regelung in seinem Teilerverhältnis beeinflusst (moduliert). Es wird auch keine Veränderung des Strömungswiderstandes im Ablaufzweig 3 (dem Ablaufpfad des Stromteilers) vorgenommen, um eine Veränderung der Aufteilung zu erzielen. Mit den beschriebenen Signalen der Messung des Flusses wird lediglich ein Vergleich vorgenommen. Verglichen wird mit Signalwerten derselben Sensoren, die zuvor in einer Referenzphase (einem Referenzlauf) aufgezeichnet und gespeichert worden sind. Eine solche Speicherung kann beispielsweise der "kreuzweise" (mit Kreuzsymbolen) gezeichnete Verlauf der 2 sein, der als "measured flow" oberhalb aller anderen drei Kurven dargestellt ist. Dieser Verlauf ist trotz starker Schwankungen des Drucks im dargestellten Fall bei starker Pulsation und fehlendem hydraulischen Dämpfer nur wenig beeinflusst. Er bietet demnach eine genaue Möglichkeit der Nachmessung bei großer Störungsfreiheit.
Mit dem beschriebenen Vergleich der im Analysenlauf gemessenen Flusswerte cf₁₀(t), cf₂₀(t) oder cf₃₀(t) gegenüber den zuvor gemessenen (und gespeicherten) Flusswerten rf(t) kann auf eine Einbuße an Trennleistung, insbesondere durch Zusetzen der Trennsäule in Folge Veränderungen in der Säulenpackung geschlossen werden. Auch ein Eintrag aus Substrat aus biologischem Probenmaterial kann durch Veränderung der Messwerte erfasst werden, wobei die Veränderung eine deutliche Abweichung der Messwerte des Analysenverlaufes (der aktuellen Werte) von denjenigen Werten ist, die im Referenzlauf zuvor aufgezeichnet wurden.
Es wird bei einer Erkennung einer zu großen Abweichung, beispielsweise bei einem Verlassen eines Toleranzbandes von ±5% oder ±10% darauf geschlossen, dass einer der beschriebenen Fehler (Zusetzen der Trennsäule oder Eintrag von biologischem Probenmaterial) stattgefunden hat, und weitere Analysenläufe nicht zuverlässig durchgeführt werden können. Insbesondere sollen keine weiteren Proben unwiederbringlich verlorengehen, wenn eine automatisierte Messung vorgegeben ist. Um das zu verhindern, wird eine automatische Überwachungsmaßnahme eingeleitet. Eine solche Überwachungsmaßnahme kann ein Abschalten des Analysenystems ebenso sein, wie ein Auslösen einer programmierten Kaskade von Funktions- und Warnbefehlen.
Unter einer "Stimmigkeit" wird eine gewisse Toleranz verstanden, die man den aktuellen Messwerten aus dem Analysenlauf gegenüber den Vergleichswerten aus dem Referenzverlauf zugestehen kann. Innerhalb dieses zuzustehenden Stimmigkeits-Toleranzbandes braucht noch nicht auf eine Fehlfunktion, oder ein Zusetzen der Säule geschlossen zu werden. Außerhalb dieses Bereiches empfiehlt es sich, das Analysensystem in einen Alarmzustand zu schalten, der beispielsweise in einer Wartestellung (stand by-Modus) liegen kann.
Es sollte erwähnt sein, dass das Drucksignal p₅₁(t) der 2, welches die starken Pulsationen aufweist, am Auslaß der Pumpenanordnung P gemessen ist. Der Auslaß ist mit 51 bezeichnet, vorgelagert (stromaufwärts) ist die Pumpe P als serielle Förderpumpe, weiter stromaufwärts sind die Proportionierventile 50/51.
Ausgehend von einem genauen Splitten mit dem Splitter R versucht die Steuerungstechnik gemäß 1 nicht, dieses Teilungsverhältnis durch Veränderung ihres Umfeldes zu beeinflussen, sondern vergleicht den Ist-Zustand des Analysensystems während der Analyse mit einem zeitlich vorgelagerten Referenzlauf. Bei Feststellung von zu deutlichen Abweichungen, die vom Stimmigkeitserfordernis abgehen, werden weitere Proben oder Läufe gesperrt. Diese Handhabung der Analyse kann als ein System-Health-Check angesehen werden, das dauernd während einer Analysenserie stattfindet.
Der Zeitpunkt, zu dem der Vergleich in 100 tatsächlich durchgeführt wird, kann auch eingeschränkt sein. Er kann zu einem bestimmten Zeitbereich stattfinden, welcher diagrammatisch in 2 zwischen 0 min und 40 min dargestellt ist. Beispielsweise kann ein Vergleich nur während kurzer Zeitspannen, aber wiederholt stattfinden. Ein Vergleich kann beispielsweise zwischen 10 und 15 Minuten vorgesehen sein.
Ein Vergleich der gemessenen Daten des Analysenlaufs mit aufgezeichneten (diskreten) Referenzdaten rf(z) kann aber auch durchgängig vorgenommen werden, im Sinne von Abtastvergleichen, die zu einem bestimmten Abtastraster passen, das klein gegenüber der Gesamtzeit der Analyse ist. Der hydraulische Widerstand wird dabei nicht aktiv von der Steuerseite 100, 60 aus beeinflusst.
Die Referenzmessung kann vorteilhaft in die einer eigentlichen Analyse regelmäßig vorangehende Äquiliberationsphase gelegt werden. Sie kann alternativ dazu auch in den Bereich eines isokratischen Fördermodus gelegt werden.

Claims

Verfahren zur Überwachung des Teilungsverhältnisses von durch einen der Förderpumpe für die mobile Phase nachgeschalteten Stromteiler erzeugten Volumenströmen für die (Kapillar-) Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), dadurch gekennzeichnet, dass das HPLC-Analysensystem für einen oder beide Teilströme einen kalorischen Flussmessfühler aufweist, um dessen/deren Meßsignal(e) während definierbarer Zeitabschnitte in jedem Analysenlauf mit Hilfe eines Software-Programms auf Stimmigkeit mit den Daten eines Referenzlaufes zu überwachen und bei Überschreiten vorgegebener Schwellenwerte (automatisch) eine Korrekturmaßnahme auszulösen.
Überwachungsverfahren für ein Teilungsverhältnis von Volumenströmen in der Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), wobei ein – einer Förderpumpe (BP) für eine mobile Phase nachgeschalteter – Stromteiler (R) mehrere Volumenströme (2,3) erzeugt; wobei das HPLC-Analysensystem für zumindest einen der Teilströme einen Flussmessfühler (10,20,30) aufweist und dessen Meßsignal während zumindest eines Zeitabschnittes in einem jeweiligen Analysenlauf mit Daten eines vorhergehenden Referenzlaufes desselben Analysensystems verglichen wird, um bei Passieren zumindest eines von vorgegebenen Schwellenwerten (automatisch) eine Korrekturmaßnahme auszulösen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei von dem Stromteiler (R) zwei Teilströme (2,3) erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei dem einen oder dem anderen der beiden Teilströme (2,3) im Analysensystem ein kalorischer Flussmessfühler (20,30) zugeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei eines der beiden Messsinale (cf₃₀(t), cf₁₀(t)) eines der beiden Messfühler der Überwachung (100) zugeführt wird und mit den Referenzdaten (rf(t)) verglichen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Vergleich der Messwerte mit den Daten des Referenzlaufs (Referenzdaten) eine Überwachung auf Stimmigkeit ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Korrekturmaßnahme ein Abschalten der Pumpe (P) oder des Analysensystems ist oder eine anderweitige Schaltmaßnahme ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der eine Teilstrom (2) unter 25μl/min oder unter 5μl/min liegt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 oder 8, wobei die Förderrate der Förderpumpe (P) im ml-Bereich gelegen ist, welcher Volumenstrom dem Stromteiler (R) zugeführt wird (1).
Verfahren für die Mikro- und Kapillar-Säulen-Chromatographie (Mikro- und Nano-HPLC) nach der Niederdruck-Gradienmethode zur fortlaufenden Überwachung des Stromteilungsverhältnises, das durch einen der Förderpumpe (P) für die mobile Phase nachgeschalteten, einschlägig üblichen Stromteiler erzeugt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Analysensystem für einen oder beide Teilströme einen kalorischen Flussmessfühler (10) aufweist, dessen/deren Meßsignal(e) zu bestimmter(n) Analysenzykluszeit(en), die über eine Steuersoftware definierbar sind, auf Stimmigkeit mit in einem Referenzlauf gewonnen Flussmesswerten (rf) geprüft werden, und beim Über- oder Unterschreiten von im Steuerprogramm vorzugebender Schwellenwerte für das Analysensystem eine Korrekturmaßnahme veranlasst wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Steuerprogramm das Analysensystem in eine Wartestellung (Stand-by Mode) schaltet, um bei automatischer Probenaufgabe Probenverluste zu verhindern.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Steuerprogramm eine programmierte Kaskade von Funktions- und Warnbefehlen ausgibt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die im Referenzlauf aufgezeichneten Flusswerte aufgezeichnet werden (i) während der Äquiliberationsphase des Gradientenbetriebes; oder (ii) während eines isokratischen Fördermodus oder Abschnitts nach einem Analysenlauf; oder (iii) in einem Zeitbereich mit sich nicht verändernder Zusammensetzung der mobilen Phase.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Zeiten während der Äquilibrationsphase des Gradientenbetriebes und/oder in Zeitbereichen mit nicht veränderter oder veränderter Zusammensetzung der mobilen Phase liegen.