DE10329195A1

DE10329195A1 - Objektträger für fluoreszenzbasierte Analysegeräte

Info

Publication number: DE10329195A1
Application number: DE2003129195
Authority: DE
Inventors: Peter Dr. Westphal
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG
Priority date: 2003-06-28
Filing date: 2003-06-28
Publication date: 2005-01-13

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Objektträger für fluoreszenzbasierte Analysegeräte. Ein solcher Objektträger umfaßt ein dielektrisches Substrat (1) mit einer Oberfläche und eine auf der Oberfläche aufgebrachte dielektrische Schicht, in der eine Vielzahl von Metallteilchen (2) enthalten sind, wodurch die Fluoreszenz von mit Fluoreszenzmolekülen markierten Proben verstärkt wird.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen Objektträger für fluoreszenzbasierte Analysegeräte und betrifft das Problem der geringen Lichtausbeute, d. h. das in der Regel sehr kleine Verhältnis der abgestrahlten zu den eingefangenen Photonen.

Bei der Untersuchung der Fluoreszenz von Objekten, beispielsweise von mit Fluoreszenzmolekülen – sogenannten Fluorophoren, Licht spezifischer Wellenlängen absorbierende und als Fluoreszenz abgebende Moleküle – markierten Proben in der Fluoreszenzmikroskopie oder -spektroskopie, oder beim optischen Auslesen von fluoreszenzbasierten, biospezifischen Sensorchips besteht prinzipiell das Problem, daß nur sehr wenig von dem eingestrahlten Anregungslicht. von den Fluorophoren absorbiert und in Fluoreszenz umgewandelt wird.

Im Stand der Technik wird dieses Problem dadurch gelöst, daß man Detektierungsoptiken mit hohen numerischen Aperturen verwendet. Neben hohen Herstellungskosten muß man dabei den Nachteil eines kleinen Bildfeldes, einer geringen Schärfentiefe und eines geringen Arbeitsabstandes in Kauf nehmen. Bei optoelektronischer Detektierung kann man alternativ auch die Integrationszeit erhöhen, um die notwendige Anzahl von Fluoreszenzphotonen zu registrieren. Dies erhöht allerdings den Zeitaufwand für eine Messung. Außerdem ergibt sich das zusätzliche Problem, daß das – weder spektral noch räumlich vollständig unterdrückbare – Anregungslicht zu einem störenden Untergrundsignal führt. Ebenso störend macht sich die Eigenfluoreszenz von Substraten, d. h. Objektträgern, und Optiken bemerkbar. Zur Anregung der Fluoreszenz werden die Objekte mit Licht von Quecksilberhöchstdrucklampen beleuchtet, deren Leistung in der Regel 100 Watt nicht überschreitet. Theoretisch denkbar wäre eine Steigerung der Lampenleistung um ca. 5 bis 6 Größenordnungen, bis eine Anregungssättigung der Fluorophore erreicht ist; dieser Ansatz ist jedoch aufgrund der hohen zu erwartenden Wärmeentstehung nicht praktikabel.

Aus dem Stand der Technik ist weiterhin bekannt, daß die Bestrahlung von Metallteilchen, mit sichtbarem Licht zu einer Verstärkung des elektromagnetischen Feldes um das Metallteilchen herum führt, wenn die Dimensionen der Metallteilchen klein im Verhältnis zur Wellenlänge des zur Bestrahlung verwendeten Lichts sind. Dies ist im Detail beispielsweise bei A. Wokaun, „Surface enhancement of optical fields – Mechanisms and applications", Molecular Physics, 1985, Vol. 56(1), Seiten 1–33 beschrieben.

Ursache für die Feldverstärkung, die um so größer ist, je stärker die Krümmung der Oberfläche der Metallteilchen ist, sind Kollektivschwingungen der Leitungsbandelektronen dieser Metallteilchen, sogenannte Oberflächenplasmonen. Bringt man nun Fluorophore in die Nähe – etwa in einen Abstand, der dem doppelten der Molekülgröße entspricht – dieser Metallteilchen, so werden sie als Folge der Feldverstärkung durch das Plasmonenfeld zu verstärkter Absorption und folgender Emission von Fluoreszenzphotonen angeregt.

Dieser Effekt wird z. B. in der Schrift US 5,449,918 ausgenutzt. Dort wird ein die Fluoreszenzverstärkung ausnutzender chemischer Sensor beschrieben. Dieser Sensor umfaßt ein Substrat, auf dessen Oberfläche eine Schicht metallischer Inseln aufgebracht ist. Das Ganze wird von einer chemisch selektiven Schicht, die Fluorophore enthält und dünner als 20 nm ist, bedeckt. Diese Konstruktion ist gewollt anfällig gegen äußere chemische Einflüsse, auch der Schutz vor durch Temperatur hervorgerufenen oder mechanischen Beanspruchungen, wie beispielsweise Reiben oder Spülen, ist sehr gering.

In einer Presseinformation der Max-Planck-Gesellschaft (PRI B12/C7/T6/2003 (21), ISSN 0170-4656) vom 27. März 2003 wird eine mögliche Kombination der Anregung von Oberflächenplasmonen mit der Fluoreszenzmikroskopie in bezug auf Anwendungen für biospezifische Sensorchips beschrieben: Ein Glasträger wird mit einer ca. 50 nm dicken Goldschicht überzogen, auf diese wird eine ca. 100 nm dicke Interaktionsschicht aus Thiol und einem Protein aufgebracht. Letzteres dient als Matrix, an die DNS-Stränge mit einer Köderfunktion für mit Farbstoff markierte Target-Sequenzen andocken können. Der Aufbau dieser Anordnung ist sehr kompliziert und ihr Einsatzgebiet eng begrenzt. Auch ist sie kaum vor äußeren chemischen oder mechanischen Einflüssen geschützt. Zudem werden in der ausgedehnten flächigen Goldschicht Oberflächenplasmonen nur erzeugt, wenn die Schicht mit Licht unter einem zur Totalreflexion führenden Winkel beleuchtet wird.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen fluoreszenzverstärkenden Objektträger für fluoreszenzbasierte Analysegeräte zu entwickeln, bei dem die Fluoreszenz gegenüber herkömmlichen Objektträgern verstärkt wird.

Diese Aufgabe wird durch einen Objektträger gelöst, welcher ein dielektrisches Substrat mit einer Oberfläche und eine auf der Oberfläche aufgebrachte dielektrische Schicht umfaßt, wobei in der Schicht eine Vielzahl von Metallteilchen enthalten sind. Auf diese Weise wird die Fluoreszenz von mit Fluorophoren markierten Proben verstärkt. Die Fluorophore sind dabei nicht in der Schicht enthalten. Die Einfallsrichtung des Lichtes ist dabei nicht entscheidend für die Erzeugung von Oberflächenplasmonen, welche die Ursache für die Fluoreszenzverstärkung sind.

Eine gute Fluoreszenzverstärkung erhält man, wenn die Dimensionen eines jeden Metallteilchens in jeder Raumrichtung 200 nm nicht überschreiten, beste Ergebnisse werden für Ausdehnungen zwischen 20 und 80 nm erzielt. Das Absorptionsspektrum der Metallteilchen überlappt sich bei diesen Dimensionen mit den spezifischen Absorptions- und Emissionslinien der meisten Fluorophore. Die Metallteilchen können alle möglichen Formen annehmen, z. B. kugelförmig oder quaderförmig ausgebildet sein, bevorzugt weisen sie jedoch die Form von Ellipsoiden mit einem Achsenverhältnis zwischen 1 : 2 und 1 : 5 auf. An den langen Enden der Ellipsoide ist die Krümmung besonders hoch, die Fluoreszenzverstärkung fällt daher in der Nähe besonders stark aus.

Als Material für die Metallteilchen ist vorzugsweise Gold, Silber, Kupfer oder Aluminium vorgesehen. In Frage kommt auch eine Legierung, die wenigstens eines dieser Metalle zu 50% enthält. Die Metallteilchen können beispielsweise auf das Substrat aufgedampft oder mittels Sputtern aufgebracht werden. Dabei können auch Selbstorganisationsmechanismen, die zur Inselbildung führen, ausgenutzt werden.

Das Substrat selbst muß dielektrische Eigenschaften besitzen. Vorzugsweise ist als Material für das Substrat Glas, Silizium oder ein Polymer vorgesehen.

Die Schicht weist oberhalb der Metallteilchen zweckmäßig eine Dicke zwischen 1 nm und 10 nm, bevorzugt von 2 nm auf, dies entspricht etwa dem doppelten Moleküldurchmesser eines Fluorophores. Kommen die Fluorophore zu nah an die Oberfläche der Metallteilchen heran, so sinkt der fluoreszenzstärkende Effekt, gleiches gilt bei zu großer Entfernung von der Oberfläche der Metallteilchen.

Die Metallteilchen können einerseits vollständig von der Schicht umschlossen sein oder aber auch teilweise mit der Oberfläche des Substrates in Kontakt stehen, dies hängt von der Art der Schicht sowie der Art des Aufbringens ab. Bringt man beispielsweise erst die Metallteilchen auf die Oberfläche und überzieht diese anschließend mit der Schicht, so werden die Metallteilchen immer mit der Oberfläche des Substrates in Kontakt stehen.

In einer zweckmäßigen Ausgestaltung der Erfindung ist die Oberfläche des Substrates plan, dies ermöglicht eine einfachere Herstellung des Objektträgers.

In einer anderen zweckmäßigen Ausführung weist die Oberfläche des Substrates zueinander parallele, stegförmige Erhebungen auf und zwischen diesen Zwischenräume. Diese Strukturen können beispielsweise durch Ätzen, Prägen, Spritzprägen oder Spritzgießen erzeugt werden, der Abstand zwischen den Erhebungen ist frei wählbar und keinen Beschränkungen unterworfen.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung sind nur oder überwiegend über den stegförmigen Erhebungen Metallteilchen in der Schicht enthalten. Erreichen läßt sich dies beispielsweise durch schräges Bedampfen, hier werden hauptsächlich die stegförmigen Erhebungen mit Metallteilchen versehen. Diese Erhebungen geben auch Größe und Form der Metallteilchen vor. Auf diese Weise kann eine einheitliche Größe von Metallteilchen hergestellt werden. Bei der Verwendung von Erhebungen verschiedener Breite können auch mehrere diskrete Metallteilchengrößen hergestellt werden. Der wesentliche Vorteil dieser Ausgestaltung liegt darin, daß die Größen der Metallteilchen genau auf die Absorptionsmaxima bestimmter Fluorophore abgestimmt werden können.

In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung sind nur in den Zwischenräumen Metallteilchen in der Schicht enthalten.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist die Schicht nur in den Zwischenräumen aufgebracht. Diese Ausgestaltung ist insbesondere für die Verwendung zur Herstellung von fluoreszenzbasierten, biospezifischen Sensorchips vorteilhaft, da auf diese Weise definiert voneinander getrennte Bereiche auf den Objektträger hergestellt werden können. Dabei kann es zweckmäßig sein, statt einer Anordnung mit zueinander parallelen stegförmigen Erhebungen beispielsweise auch eine gitter- oder wabenförmige Struktur für die Erhebungen vorzusehen.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die Schicht als für eine Vielzahl biologischer Moleküle durchlässige Polymermatrix ausgestaltet, beispielsweise als Dextran-Matrix. Diese Ausgestaltung ist besonders im Hinblick auf die Verwendung zur Herstellung fluoreszenzbasierter, biospezifischer Sensorchips vorteilhaft, da sehr viele Metallteilchen und biologische Moleküle in die Dextran-Matrix eingebettet werden können. Das Fluoreszenzsignal wird dadurch wesentlich erhöht.

In einer anderen bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die Schicht als Schutzschicht ausgestaltet, so daß die Metallteilchen vor äußeren chemischen und mechanischen Einflüssen, wie beispielsweise Spülen oder Reiben, geschützt sind. Dies ist nur möglich, da die Fluorophore nicht in die Schicht eingebettet sind. Bevorzugte dielektrische, d.h. isolierende Materialien sind Siliziumoxidverbindungen, wie beispielsweise SiO₂, oder Siliziumnitridverbindungen, wie beispielsweise Si₃N₄. Diese sind chemisch und mechanisch sehr widerstandsfähig. Auch Polymere, d.h. Kunststoffe, kommen als Schutzschicht in Frage. Verwendet man eine Schutzschicht aus einer Siliziumverbindung, so kann diese beispielsweise durch Verdampfen oder Sputtern aufgebracht werden. Dem mit einer solchen Schutzschicht versehene Objektträger steht ein breites Einsatzgebiet offen, er be sitzt eine hohe Stabilität gegenüber äußeren chemischen und mechanischen Einflüssen.

Zur Verbesserung der Anbindung von Biomolekülen ist in einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung die Schicht an ihrer Oberfläche chemisch funktionalisiert, beispielsweise mit Epoxy-, Amino- oder Aldehydgruppen.

Die Erfindung soll im folgenden an einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. In den dazugehörigen Zeichnungen zeigen
1 die einfachste Ausführung eines erfindungsgemäßen Objektträgers mit einer Schutzschicht aus Siliziumdioxid;
2 bis 4 Abwandlungen davon,
5 einen Objektträger, bei dem Metallteilchen in eine Polymermatrix eingebettet sind, und
6 den Ausschnitt eines Objektträgers aus den 1–5 in der Draufsicht bei der Verwendung zur Herstellung von biospezifischen fluoreszenzbasierten Sensorchips.
1 zeigt einen erfindungsgemäßen Objektträger in der einfachsten Ausführung. Als Substrat 1 wird Glas verwendet, auf dem Substrat 1 sind Metallteilchen 2 aufgebracht, die von einer als Schutzschicht 3 ausgestalteten Schicht bedeckt sind. Der Durchmesser der Metallteilchen 2 in der Ebene des Substrates liegt dabei zwischen 20 und 80 nm. Die Schutzschicht 3 oberhalb der Metallteilchen 2 ist etwa 2 nm dick. Sie besteht aus Siliziumdioxid, auch andere Siliziumverbindungen sind jedoch denkbar.
In 2 weist die Oberfläche des Substrates 1 stegförmige, zueinander parallele Erhebungen 4 auf. Zwischen den Erhebungen 4 befinden sich Zwischenräume 5. Die Metallteilchen 2, bevorzugt aus Edelmetallen wie Gold oder Silber, befinden sich auf der Oberfläche des Substrates 1 sowohl auf den Erhebungen 4 als auch in den Zwischenräumen 5. Alle Metallteilchen 2 werden von einer durchgehenden Schutzschicht 3 bedeckt. Dabei ist nicht zwingend, daß die stegförmigen Erhebungen 4 zueinander parallel angeordnet sind. Je nach Anwendung kann auch eine andere Anordnung, beispielsweise eine gitterförmige, vorteilhaft sein. Die Erhebungen 4 können beispielsweise hergestellt werden, indem Substratmaterial aus den Zwischenräumen 5 weggeätzt wird.
In 3 ist ein Objektträger gezeigt, bei dem die stegförmigen Erhebungen 4 enger zusammenstehen und nur auf diesen Metallteilchen 2 aufgebracht sind, was beispielsweise durch schräges Bedampfen erreicht werden kann. Die oberen Flächen der Stege geben also die Form und Größe der Metallteilchen 2 vor. Auf diese Weise kann die Größe der Metallteilchen 2 durch die Vorgabe der Steggröße genau auf die Absorptionsmaxima spezifischer Fluorophore, die verwendet werden sollen, abgestimmt werden.
In 4 befinden sich die Metallteilchen 2 in der Schutzschicht 3 und sind von dieser vollständig umschlossen. Darüberhinaus sind nur in den Zwischenräumen 5 Metallteilchen 2 enthalten, auf diese Weise sind die Metallteilchen 2 durch die stegförmigen Erhebungen 4 gut vor mechanischen Einflüssen wie Reiben oder Spülen geschützt.
In der in 5 gezeigten Ausgestaltung der Erfindung wird als Schicht ein Polymer in Gestalt einer Polymermatrix 6 verwendet. In Frage kommt hier beispielsweise Dextran. Die Metallteilchen 2 sind in dieser für fluoreszenzmarkierte Biomoleküle durchdringbaren Polymermatrix 6 eingebettet, wobei der mittlere Abstand zwischen den – statistisch in der Polymermatrix verteilten – Metallteilchen und im Verlaufe der Anwendung auf den Objektträger aufgebrachten fluoreszenzmarkierten Biomolekülen ebenfalls etwa 2 nm beträgt. Als Material für die Metallteilchen 2 kommt hier wegen seiner chemischen Resistenz vorzugsweise Gold in Frage. Die Metallteilchen sind so für die Fluorophore sehr gut zugänglich.
In 6 ist gezeigt, wie ein fluoreszenzverstärkender Objektträger für die Herstellung von fluoreszenzbasierten, biospezifischen Sensorchips verwendet werden kann. Gezeigt ist ein Ausschnitt aus der Draufsicht auf einen Objektträger. Die Areale D1–D6 haben etwa eine Größe von 20 μm × 20 μm – die Abstände zwischen den Erhebungen 4 sind in der Regel wesentlich kleiner, können aber auch entsprechend der Maße der Areale gewählt werden – und sind jeweils einer Sorte von Molekülen mit Köderfunktion, beispielsweise ausgewählten DNS-Sequenzen, zugeordnet.

1: Substrat
2: Metallteilchen
3: Schutzschicht
4: Erhebungen
5: Zwischenräume
6: Polymermatrix
D1, ..., D6: Areale

Claims

Objektträger für fluoreszenzbasierte Analysegeräte, umfassend – ein dielektrisches Substrat (1) mit einer Oberfläche und – eine auf der Oberfläche aufgebrachte dielektrische Schicht, in der eine Vielzahl von Metallteilchen (2) enthalten sind, wodurch die Fluoreszenz von mit Fluoreszenzmolekülen markierten Proben verstärkt wird.
Objektträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die größte Ausdehnung eines jeden Metallteilchens (2) in jeder Raumrichtung nicht mehr als 200 nm beträgt.
Objektträger nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausdehnung eines jeden Metallteilchens (2) in jeder Raumrichtung zwischen 20 nm und 80 nm liegt.
Objektträger nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallteilchen (2) die Form von Ellipsoiden aufweisen.
Objektträger nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis der Achsen eines jeden Ellipsoids zwischen 1:2 und 1:5 liegt.
Objektträger nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Material für die Metallteilchen (2) Gold (Au), Silber (Ag), Kupfer (Cu), Aluminium (Al) oder eine Legierung, die mindestens eines der vorgenannten Metalle zu 50% enthält, vorgesehen ist.
Objektträger nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Material für das Substrat (1) Glas, Silizium oder ein Polymer vorgesehen ist.
Objektträger nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht oberhalb der Metallteilchen (2) eine Dicke zwischen 1 nm und 10 nm, bevorzugt 2 nm aufweist.
Objektträger nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallteilchen mit der Oberfläche des Substrats (1) in Kontakt stehen.
Objektträger nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht die Metallteilchen (2) vollständig umschließt.
Objektträger nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Substrats (1) plan ist.
Objektträger nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Substrats (1) zueinander parallele, stegförmige Erhebungen (4) und zwischen diesen Zwischenräume (5) aufweist.
Objektträger nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß nur über den Erhebungen (4) Metallteilchen (2) in der Schicht enthalten sind.
Objektträger nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß nur in den Zwischenräumen (5) Metallteilchen (2) in der Schicht enthalten sind.
Objektträger nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht nur in den Zwischenräumen (5) aufgebracht ist.
Objektträger nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht als Schutzschicht (3) ausgestaltet ist, wobei die Metallteilchen (2) durch die Schutzschicht (3) vor äußeren chemischen Einflüssen geschützt sind.
Objektträger nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Material für die Schutzschicht (3) eine Siliziumoxid-Verbindung, eine Siliziumnitrid-Verbindung oder ein Polymer vorgesehen ist.
Objektträger nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht als für eine Vielzahl biologischer Moleküle durchlässige Polymermatrix (6) ausgestaltet ist.
Objektträger nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß als Material für die Polymermatrix (6) Dextran verwendet wird.
Objektträger nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht an ihrer Oberfläche chemisch funktionalisiert ist.
Verwendung eines Objektträgers gemäß einem der vorgenannten Ansprüche zur Herstellung fluoreszenzbasierter, biospezifischer Sensorchips.