DE10318009A1

DE10318009A1 - Mittel zur Inaktivierung infektiöser Prionen

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Publication number: DE10318009A1
Application number: DE2003118009
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Zerling; Eugen Nevermann; Michael Dr. Baier; Jan Nevermann
Original assignee: MENNO CHEMIE VERTRIEBSGES MBH
Current assignee: MENNO CHEMIE VERTRIEBSGES MBH
Priority date: 2003-04-19
Filing date: 2003-04-19
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2023-04-20
Also published as: DE10318009B4

Abstract

Beschrieben wird ein Mittel zur Inaktivierung von infektiösem Prionenmaterial (Erreger von vCJK, BSE, Kuru etc.), bestehend aus synergistisch wirksamen Kombinationen von Phenol, substituierten Phenolen sowie Mono-, Di- oder Trihydroxybenzoesäuren. Wegen materialverträglicher Eigenschaften geeignet zur Anwendung auf kontaminierten Instrumenten, Geräten, Flächen und auch in Flüssigkeiten.

Description

Eine bisher unbekannte Bedrohung stellt – seit dem Auftreten von BSE und der nachgewiesenen Übertragbarkeit dieser Tierkrankheit auf den Menschen – die neue Variante der Creutzfeldt-Jacob-Krankheit (vCJK) dar. Vor kurzer Zeit wurde bekannt, das es gelungen ist nachzuweisen, dass auch die klassische Variante von CJK die Folge einer Infektion mit dem BSE-Erreger sein kann. Der Erreger der Transmissiblen Spongiformen Enzephalophatien (TSEs = CJK, vCJK, Kuru etc.) gilt bezüglich der Inaktivierung als eine besondere Herausforderung.

Ursache der TSE-Erkrankungen sind fehl gefaltete Glykoproteine, die von ihrem Entdecker S. Prusiner als Prion(en) bezeichnet wurden (proteinaceus infectious only). Zur pathologischen Variante des Prions existiert ein physiologisches Gegenstück, das auch als Prion Isoform bezeichnet und als PrP^c (c = cell) abgekürzt wird. Für die pathologische Variante finden sich in der Literatur die Bezeichnungen PrP^Sc,BSE,CJD als Kurzform.

Die veränderten chemischen und physikalischen Eigenschaften der falsch gefalteten Prionen werden in diagnostischen Untersuchungsverfahren zur Differenzierung zwischen infektiösen und physiologischen Proteinen genutzt. Die infektiöse Form der Prionen zeigt aufgrund der Sekundärstruktur eine partielle Resistenz gegenüber Proteasen. Die Prion Isoform PrP^c (c = cell) wird hingegen vom Enzym vollständig verdaut.

Aus der beta-Faltblattstruktur erklärt sich u. a. auch die Widerstandsfähigkeit gegen hohe Temperaturen, UV-Strahlen, Säuren und Desinfektionsmittel sowie die Unlöslichkeit in Wasser.

Die Ausdünnbarkeit der Infektiosität fehlgefalteter Prionen lässt den Grad der Infektiosität im Tiermodell titrierbar werden.

Bei der chirurgischen Behandlung von CJK-Verdachtsfällen konnte bisher das verwendete Gerät (OP-Besteck, Endoskope etc.) nur entsorgt werden, um das Risiko einer iatrogenen Übertragung durch chirurgische Instrumente auf den Menschen zu vermeiden.

Mit dem Auftreten von CJK und vCJK, als BSE-Infektion des Menschen, hat sich die Situation in Europa und neuerdings auch in den USA und Japan nachhaltig geändert. Anstelle weniger CJK-Fälle ist auch auf Grund epidemiologischer Hochrechnungen von einer unbekannten, ungleich größeren Anzahl infizierter Personen auszugehen, die über viele Jahre asymptomatisch sein werden, d. h. die nicht als vCJK-Verdachtsfälle eingeordnet werden können, dennoch als Träger der Krankheit diese, im Falle einer Behandlung mit chirurgi schen Instrumenten oder Endoskopen, weiter verbreiten können.

Eine ähnliche Problematik ergibt bei der Erzeugung von Lebensmitteln aus tierischem Material. Zur Unterbrechung von BSE-Infektionsketten – deren Wege nur unvollständig bekannt sind – erscheint die Anwendung eines Mittels zur Inaktivierung infektiöser Prionen für den gesamten Bereich der Nahrungsmittelerzeugung – von der Nutztierhaltung bis hin zur Erzeugung von Fleisch- und Wurstwaren – dringend geboten. Die Indikation für ein solches Mittels ergibt sich für alle Bereiche, die mit infektiösem Material kontaminiert sein können, dazu zählen bauliche Einrichtungen (Flächen, Böden) ebenso wie Werkzeuge, Instrumente oder Flüssigkeiten.

Derzeit stehen als anerkannt wirksame Inaktivierungsmittel von PrP^res lediglich Alkalien (z. B. Natronlauge; Kalilauge) und Hypochloritverbindungen (Chlorbleichlauge; Chlorabspalter) zur Verfügung. Beide Verbindungsklassen bewirken in hinreichend hoher Konzentration Hydrolyse oder Denaturierung des Proteinanteils im Prion.

Eine Verwendung dieser Chemikalien zur ständigen Desinfektion von chirurgischen Instrumenten oder Endoskopen verbietet sich, da aufgrund der aggressiven Eigenschaften mit einer baldigen Unbrauchbarkeit des Instrumentariums zu rechnen wäre.

Dies gilt aus gleichem Grunde auch für Bereich der Lebensmittelherstellung aus tierischem Material.

Daraus ergab sich die Notwendigkeit nach Verbindungen oder Verbindungsklassen zu suchen, die einerseits im Hinblick auf ihre korrosiven Eigenschaften (Metallkorrosion, Spannungsrisskorrosionen etc.) beherrschbar sind und andererseits eine ausreichend inaktivierende Wirkung gegenüber pathogenen Prionen aufweisen.

Bei der Suche nach Desinfektionsmitteln mit materialverträglichen Eigenschaften wurde nun überraschend gefunden, dass Gemische aus Phenolen und Hydroxybenzoesäuren infektiöse Prionen derart zu denaturieren vermögen, dass deren Infektiosität aufgehoben wird.

Nachfolgend aufgeführte Beispiele und Tabellen dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung und dem Nachweis des Synergismus.

Gemäß F.C. Kull und P.C. Eisman, Applied Microbiology 9,538–41(1946) gilt ein Synergismus als nachgewiesen, wenn durch Anwendung der nachstehenden Berechnungsformel das Ergebnis F < 1 zustande kommt.

F = QA/Qa + QB/Qb (Gl. 1)wobei die Zeichen bedeuten:
F < 1 Synergismus
F = 1 Additive Wirksamkeit
F > 1 Antagonismus
Qa = Menge von A allein zum Endpunkt
Qb = Menge von B allein zum Endpunkt
QA = Menge von A in der Mischung mit B
QB = Menge von B in der Mischung mit A

Bei der Untersuchung der Synergisten als Einzelsubstanz konnte nicht immer ein Endpunkt gefunden werden, weil eine beliebige Konzentrationserhöhung wegen Methodik und/oder physikalischen Eigenschaften der jeweiligen Substanzen nicht realisierbar war. Die im Test verwendete höchste Konzentration wurde in diesen Fällen als die Konzentration zum Endpunkt angenommen und zur Berechnung in Gleichung (1) eingesetzt.

Zum Nachweis der Wirksamkeit und des synergistischen Effektes durch die erfindungsgemäßen Gemische wurden die Formulierungsbeispiele 1–6 verwendet. Beispiele Beispiel 1

	Gew. Teile
Alkyl(C10-C13)sulfat-Na-Salz	10,00
4-Chlor-3-methylphenol	15,00
2-Hydroxybenzoesäure	10,00
2-Propylalkohol	25,00
Wasser entionisiert	40,00

Beispiel 2

	Gew. Teile
Alkyl(C10-C13)sulfat-Na-Salz	10,00
2-Hydroxybenzoesäure	10,00
2-Propylalkohol	25,00
Wasser entionisiert	55,00

Beispiel 3

	Gew. Teile
Alkyl(C8-C14)sulfonat-Na-Salz	10,00
4-Chlor-3-methylphenol	15,00
2-Propylakohol	25,00
Wasser entionisiert	50,00

Beispiel 4

	Gew. Teile
Alkyl(C10-C13)sulfat-Na-Salz	10,00
Phenol	20,00
4-Hydroxybenzoesäure	10,00
2-Propylalkohol	25,00
Wasser entionisiert	35,00

Beispiel 5

	Gew. Teile
Alkyl(C10-C13)sulfat-Na-Salz	10,00
4-Hydroxybenzoesäure	10,00
2-Propylalkohol	25,00
Wasser entionisiert	55,00

Beispiel 6

	Gew. Teile
Alkyl(C10-C13)sulfat-Na-Salz	10,00
Phenol	20,00
2-Propylalkohol	25,00
Wasser entionisiert	45,00

In vitro Prüfung

Das als Western-Blot bekannte in vitro Testverfahren ermöglicht es, die Inaktivierung von Prionen über die Denaturierung/Zerstörung von PrP^res qualitativ zu bestimmen.

Alle Substanzen bzw. Substanzgemische wurden zunächst mittels Blot-Methode untersucht. Konnte auf diesem Weg kein Abbau des infektiösen Hirnhomogenats durch Protease K festgestellt werden, so wurde die Formulierung als unwirksam verworfen.

Gemische die dazu führten, dass nach Einwirkung auf das infektiöse Material ein proteolytischer Abbau durch das Enzym wieder möglich war, wurden als potentiell wirksam eingestuft und einer quantitativen Untersuchung im Tiermodell zugeführt.

Ausgangsmaterial für den Test waren 100 μl – Ansätze eines 5%igen Hirnhomogenats. Zur Infektion wurde der Scrapie-Stamm 263 K verwendet.

Aus einem Hamsterhirn (mit ca. 1 g Gewicht) ergibt sich ca. 1 mg Hirngewebe im 20 μl Ansatz mit einer durchschnittlichen Infektiosität von 10⁶–10⁷ infektiösen Einheiten (LD₅₀). Zur Kontrolle wird das Hirn von gesunden Hamstern verwendet.

Jeder Testansatz enthielt:
20 μl Hirnhomogenat
30 μl H₂O
50 μl Testsubstanz (diverse Konz.)

Jeder Kontrollansatz enthielt:
20 μl Hirnhomogenat
80 μl H₂O

Nach 30-minütiger Inkubation der Ansätze bei der gewünschten Temperatur von 37°C auf einem Schüttler, wurden diese zur Neutralisierung (Inaktivierung) der sauren Testsubstanzen auf pH 7,0 eingestellt. Der Kontrollansatz wurde mit dem gleichen Neutralisierungspuffer versetzt, der Neutralisierungspuffer für den Kontrollansatz wurde jedoch zuvor auf pH 7,0 eingestellt. Zur Neutralisierung der Säuren wurden durchschnittlich 2,5 mM–1000 mM Tris-Base eingesetzt. Das Volumen aller auf pH 7.0 eingestellten Ansätze ergab 150 μl.

Jeweils 2 μl Ansatz (Testansatz bzw. Kontrollansatz) wurden anschließend mit 18 μl H₂O und 2 μl Proteinase K-Stammlösung (1 mg/ml) (Boehringer Mannheim) versetzt.

Der enzymatische Abbau durch Proteinase K erfolgte über 1 Stunde bei 37°C.

Als Kontrolle dienten Ansätze denen statt 2 μl Proteinase K 2 μl H₂O zugegeben wurde und die ebenfalls 1 Stunde bei 37 C inkubiert wurden.

Abschließend wurde jeder Ansatz mit 5 μl Eiweiß-Solubilisierungspuffer versetzt. 20 μl von jedem Ansatz wurden zur SDS-Gelelektrophorese verwendet. Die Gele werden auf PVDF¹-Membranen (0,45 μm) geblottet.

Analyse des Blots mit spezifischen Antikörpern:

Die Blotfolie wurde zur Vermeidung unspezifischer Bindungen auf der PVDF-Membran mit Milcheiweiß behandelt (Blockierung der Bindungsstellen) und diversen Spülvorgängen unterzogen, danach mit dem primären monoklonalen anti-Prion-protein Antikörper 3F4 inkubiert. Nach weiteren Vorbehandlungen und Spülungen wurde dann mit dem sekundären Antikörper – AP-konjugiertes anti Maus IgG aus der Ziege – inkubiert.

Nach erneutem Spülen wurde mit einem Lumineszenzpuffer inkubiert (Eine Lichtemission wird dadurch an den Stellen der Membran erzeugt, an denen sich die Prionproteine befinden). Nach dem Entfernen von überschüssiger Lösung wurde die Membran in eine Expositionsbox verbracht und auf Röntgenfilm entwickelt.

Die Auswertung des Blots lässt zweifelsfrei erkennen, ob eine Wirkung durch Agenzienaktivität auf das infektiöse Material stattgefunden hat. Dennoch gibt dieses Verfahren keine sichere Auskunft über den Umfang einer Inaktivierung und die mögliche verbleibende Restinfektiosität.

Die in vitro Methode ermöglicht – nach internationalen Maßstäben – lediglich eine qualitative Aussage zur Wirksamkeit und gilt erst dann als validiert, wenn durch die quantitative in vivo Methode (Tiermodell) ein bestätigendes Ergebnis erzielt werden kann.

In vivo Prüfung (Tiermodell)

Zur Durchführung der Versuche im Tiermodell wurden Hamster mit 20 μl der neutralisierten Proben und der Kontrollen intrazerebral beimpft (Lösungen wie bei der Blot-Methode). Für jede Probe wurde eine Zahl von mehr als 8 Hamstern verwendet, um zu einer statistisch belastbaren Aussage zu gelangen.

Tiere bei denen statt einer inaktivierenden Substanz nur Wasser verwendet wurde, starben im statistischen Mittel 85 Tage nach Inokulation an Scrapie.

Durch Anwendung der erfindungsgemäßen Gemische ist eine Verzögerung des Krankheitseintritts der Tiere von 135 Tagen und mehr erreichbar. Infektionsdosis und Inkubationszeit korrelieren miteinander, daher kann unter Einbeziehung entsprechender Titrationsex perimente für die Inkubationszeit eine damit einhergehende Titerreduktion angegeben werden Grafik (1). Eine Verzögerung von z. B. 85 Tagen auf 125 Tage entspricht einer Titerreduktion von mehr als 4 logarithmischen Einheiten oder einer Reduktion der Infektiosität um 99,99%.

Die Infektiosität der Hirnhomogenate (Zahl der infektiösen Einheiten/Partikel) wurde durch Verdünnung zum Endpunkt bestimmt. Die gemittelten Ergebnisse aus den Verdünnungsreihen stehen halblogarithmisch in linearer Beziehung zu den Inkubationszeiten. Aus diesen Untersuchungen resultiert die graphische Darstellung Grafik (1) und die Regressionsfunktion (Gleichung 2), die zur Berechnung der Untersuchungsergebnisse aus den Tabellen 1–3 diente.

Grafik (1) log(ILD) = –0,1007 × Id + 15,115 (Gl. 2)log(ILD) = infektiöse Einheiten
I_d = Inkubationszeit in Tagen Regressions-Statistik:

Die gemittelten Ergebnisse der Beispielformulierungen 1–9 sind in den Tabellen 1–3 dargestellt. Die angegebenen Zahlenwerte bedeuten soweit nicht anders bezeichnet den Infektionstiter (log LD₅₀) der reduzierten infektiösen Dosis, deren Differenz zur Ausgangsdosis den Reduktionsfaktor ergibt.

Tabelle 1

Tabelle 2

Das Ergebnis ist als ausreichend wirksam zu bewerten, wenn der Infektionstiter um 4 log-Stufen reduziert wurde, d. h. wenn eine 99,99%ige Reduktion der Infektiosität erreicht ist.

Aus Tabelle 1 folgt, dass mit der Säurekomponente aus Beispiel 2 und der Komponente aus Beispiel 3 keine ausreichende Wirksamkeit erzielt werden konnte. Formulierungsbeispiel 1 hingegen enthielt beide Komponenten und zeigte bereits bei 0,5%iger Konzentration eine ausreichende Inaktivierung infektiöser Prionen.

Setzt man diese Ergebnisse in die Formel von Kull und Eisman ein (Gl. 1), so erhält man
F = 0,5 × 15/5 × 15 + 0,5 × 10/5 × 10 = 0,20

Der Zahlenwert 0,20 erbringt somit einen eindeutigen Nachweis für das Vorliegen eines synergistischen Effektes.

Für die Tabelle 2 ergibt sich für F = 0,20 als Zahlenwert.

Demzufolge ist die Wirksamkeit gegen pathogene Prionen und der synergistische Effekt der erfindungsgemäßen Gemische durch die dargestellten Ergebnisse bewiesen.

Claims

Desinfektionsmittel zur Inaktivierung von infektiösen Prionen auf Flächen, Instrumenten und in Flüssigkeiten auf Basis eines synergistisch wirksamen Gemisches von Mono- Di- und Trihydroxybenzoesäuren und Phenolen, die anionaktive und nichtionogene Tenside als Netzmittel, Hydrotropierungsmittel, primäre und sekundäre Alkohole als Lösungsmittel und aliphatische Carbonsäuren und Hydroxycarbonsäuren- als pH-Regulatoren sowie Sequestriermittel enthalten können, dadurch gekennzeichnet, dass a) sie synergistisch wirksame Kombinationen aus aromatischen Monohydroxycarbonsäuren wie den 2-; 3-; 4-Hydroxybenzoesäuren, den Dihydroxybenzoesäuren, 2,3-; 2,4-; 2,5-; 2,6-; 3,4-; 3,5-Dihydroxybenzoesäure, oder den Trihydroxybenzoesäuren, 2,3,4-Trihydroxybenzoesäure, 2,4,6-Trihydroxybenzoesäure, 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure, einzeln oder gemischt und Phenol oder substituierten Phenolen wie z.B. 2-Iso-propyl-5-methylphenol, 2-; 3- oder 4-Methyl-phenol, Hexylresorcin, 2-Phenylphenol, 3-Methyl-4-chlor-phenol, 3,5-Dimethyl-4-chlorphenol, 2-Benzyl-4-chlorphenol, mono-, di- und trihalogenierten Phenolen wie 2-; 3-; 4-Chlorphenol, 2-; 3-; 4-Bromphenol, 2-; 4-Jodphenol, 2,4-Dichlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4,6-Tri chlorphenol einzeln oder gemischt, in Verbindung mit Alkylsulfonaten, Alkylsulfaten und/oder Alkylarylsulfonsäure und/oder Alkylarylsulfonaten und/oder Alkylarylethersulfaten mit 1-3 EO-Gruppen und/oder Alkylethersulfaten mit 1-3 EO-Gruppen deren Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze, mit primären oder verzweigten Retten der Länge C8-C18 als anionische Tenside enthalten, sowie nichtionogene Tenside vom Typus der Alkylpolyethylenqlykolether mit 3-11 EO-Gruppen enthalten können. b) sie Butylmonoglykolsulfat, Cumolsulfonat, Toluolsulfonat, Xylolsulfonat, als Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalz einzeln oder als Gemisch als Hydrotropierungsmittel und aliphatische Alkohole und/oder Glykole der Kettenlänge C2-C12 als Lösungsmittel einzeln oder als Gemisch und aliphatische Carbon- und/oder Hydroxycarbonsäuren der Kettenlänge C1 bis C6 einzeln oder als Gemisch als pH-Regulatoren enthalten können.
Desinfektionsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis der Hydroxybenzoesäuren (A) zu den Phenolen (B) zwischen 1:99 und 99:1 betragen kann.
Desinfektionsmittel nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis der Alkylsulfonate oder -sulfate und/oder Alkylarylsulfate und/oder Ethersulfate und deren Salze (C) mit den Säuren und Phenolen (A + B) im Verhältnis C: (B + A) = 1:99 und 99:1 liegen kann.
Desinfektionsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis der Hydrotropierungsmittel und deren Salze, einzeln oder im Gemisch miteinander zwischen 0,1 und 70 Gew.% bezogen auf das Gesamtgewicht des Desinfektionsmittelkonzentrats liegen kann.
Desinfektionsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis der Alkohole einzeln oder im Gemisch miteinander zwischen 1 und 90 Gew.% bezogen auf das Gesamtgewicht des Desinfektionsmittelkonzentrates liegen kann.
Desinfektionsmittel nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass zwischen 0,1–30 Gew.% eines oder mehrerer Sequestriermittel vom Typus der Aminoessigsäuren oder Phosphonsäuren und deren jeweilige Derivate enthalten kann.
Verwendung der Desinfektionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Inaktivierung von Prionen auf Flächen, Instrumenten und Flüssigkeiten im Bereich der Medizin sowie aller technischer Einrichtungen zur Lebensmittelerzeugung aus tierischer Veredlung.
Verwendung der Desinfektionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in wässrigen, verdünnten Lösungen.