DE10315031A1

DE10315031A1 - In vitro detection of systemic inflammatory response syndrome and related conditions, for e.g. monitoring progression, comprises detecting abnormal expression of disease-related genes

Info

Publication number: DE10315031A1
Application number: DE2003115031
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. Rußwurm; Hans-Peter Prof. Saluz; Konrad Prof. Dr. Reinhart; Peter Franz Prof. Dr. Zipfel; Eberhard Prof. Dr. Straube
Original assignee: SIRS Lab GmbH
Current assignee: Analytik Jena AG
Priority date: 2003-04-02
Filing date: 2003-04-02
Publication date: 2004-10-14
Anticipated expiration: 2023-04-03
Also published as: DE10315031B4

Abstract

In vitro detection of a systemic inflammatory response syndrome (SIRS) comprises detecting abnormal expression of disease-related genes. Method for in vitro detection of systemic inflammatory response syndrome (SIRS) comprises: (1) isolating sample RNA from a mammal; (2) labeling the RNA and/or at least one DNA that is a SIRS-specific gene (or its fragment) with a detectable marker (M); (3) contacting sample RNA and the DNA under hybridization conditions; (4) contacting control RNA (representing a non-pathological state) with the DNA under similar conditions; (5) quantitative detection of the signals from (M); and (6) comparing the signals to determine if SIRS-specific genes are expressed more strongly or more weakly in the sample, relative to control. Independent claims are also included for the following: (1) similar method for in vitro detection of (severe) sepsis or sepsis-like conditions, where the DNA used is a gene (or fragment) specific for these diseases; (2) similar method for in vitro detection of SIRS, (severe) sepsis or sepsis-like conditions based on isolation and labeling of peptides, reaction with antibodies (Ab) specific for these diseases and comparing levels of peptides with those found in healthy controls; and (3) use of recombinant or synthetic nucleic acid (partial) sequences, or derived proteins or peptides, alone or in mixtures, as calibrants in assays for the specified diseases, for evaluating activity or toxicity in screening for active agents, and/or for preparation of agents for treatment or prevention of the specified diseases. ACTIVITY : Antibacterial; Immunosuppressive; Antiinflammatory. No details of tests for these activities are given. MECHANISM OF ACTION : None given.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Erkennung von Sepsis und/oder sepsisähnlichen Zuständen gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 26, sowie die Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten Nukleinsäuresequenzen oder davon abgeleiteten Peptidsequenzen gemäß Anspruch 49.The The present invention relates to a method for in vitro detection of sepsis and / or sepsis-like states according to claim 1 or claim 26, and the use of recombinant or synthetic prepared nucleic acid sequences or peptide sequences derived therefrom according to claim 49.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Genaktivitätsmarker für die Diagnose und Therapieoptimierung von Sepsis und sepsisähnlichen akuten entzündlichen Zuständen sowie systemischen Infektionen. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Erkennung von Sepsis und sepsisähnlichen akuten entzündlichen Zuständen sowie systemischen Infektionen ebenso wie zur entsprechenden Therapieoptimierung.In particular The present invention relates to gene activity markers for diagnosis and therapy optimization of sepsis and sepsis-like acute inflammatory states as well as systemic infections. In addition, the present concerns Invention Method for the detection of sepsis and sepsis-like acute inflammatory states as well as systemic infections as well as for the corresponding therapy optimization.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung neue Diagnosemöglichkeiten, die sich aus experimentell abgesicherten Erkenntnissen im Zusammenhang mit dem Auftreten von Änderungen der Genaktivitäten (Transkription und nachfolgende Proteinexpression) bei gefährdeten Patienten mit Sepsis, sepsis-ähnlichen systemischen Infektionen und klinischen Zuständen mit deutlich erhöhtem Sepsisrisiko (z.B. nach schweren Traumata, Organtransplantationen, offenenen operativen Eingriffen, Hyperthermibehandlungen etc.) ableiten lassen.Farther The present invention relates to new diagnostic options, which are based on experimentally proven knowledge with the appearance of changes of gene activities (Transcription and subsequent protein expression) in those at risk Patients with sepsis, sepsis-like systemic infections and clinical conditions with a significantly increased risk of sepsis (e.g. after severe trauma, organ transplant, open surgical interventions, hyperthermia treatments etc.).

Trotz großer Fortschritte im pathophysiologischen Verständnis und der supportiven Behandlung von Infektionserkrankungen bilden Sepsis und konsekutives Multiorganversagen heute die Haupttodesursache auf nichtkardiologischen Intensivstationen [1–3]. Man nimmt an, daß in den U.S.A. jährlich ca. 400.000 Patienten an einer Sepsis erkranken [4]. Die Letalität beträgt ca. 40 % und steigt bei Entwicklung eines Schocks auf 70–80 % an [5,6]. Die von der Grunderkrankung der Patienten und der zugrundeliegenden Infektion unabhängige Exzessletalität beträgt bis zu 35 % [8].Despite greater Advances in pathophysiological understanding and supportive care of infectious diseases form sepsis and consecutive multi-organ failure today the main cause of death in non-cardiological intensive care units [1-3]. It is believed that in the U.S. annually approximately 400,000 patients develop sepsis [4]. The lethality is approximately 40 % and increases to 70-80% when a shock develops [5,6]. That of the underlying disease of the patient and the underlying Infection independent Exzessletalität is up to 35% [8].

Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag der Sepsis ist von fachübergreifender Bedeutung. In den letzten Jahrzehnten veränderte sich die Letalität der Sepsis nur unwesentlich. Im Vergleich dazu stieg die Inzidenz kontinuierlich an (z.B. zwischen 1979 und 1987 um 139 % von 73,6 auf 176 pro 100.000 Krankenhauspatienten) [7]. Dadurch werden in zunehmenden Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten oder experimentellen Therapieverfahren zahlreicher Fachgebiete (Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/Onkologie) gefährdet, da diesen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Sepsisrisikos immanent ist. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Prophylaxe, Behandlung und insbesondere der Diagnose der Sepsis gebunden.The morbidity and lethal contribution sepsis is interdisciplinary Importance. The mortality rate of sepsis has changed in recent decades only insignificant. In comparison, the incidence increased continuously (e.g. between 1979 and 1987 by 139% from 73.6 to 176 per 100,000 Hospital patients) [7]. As a result, the success of treatment is increasing of the most advanced or experimental therapy methods numerous Specialty (visceral surgery, transplantation medicine, hematology / oncology) endangered, since this is an increase without exception is inherent to the risk of sepsis. Lowering morbidity and lethality A large number of seriously ill patients are therefore at the same time Progress in prophylaxis, treatment and especially diagnosis the sepsis bound.

Sepsis ist ein Ergebnis von stark heterogenen molekularen Vorgängen, die gekennzeichnet sind durch eine Einbeziehung von vielen Komponenten und deren Wechselwirkungen auf jeder organisatorischen Ebene des menschlichen Körpers:
Gene, Zellen, Gewebe, Organe. Die Komplexität der zugrundeliegenden biologischen und immunologischen Prozesse haben viele Arten von Forschungsstudien hervorgerufen, die einen weiten Bereich klinischer Aspekte umfassen. Eines der hieraus zu erkennenden Ergebnisse war, daß die Bewertung neuer Sepsis-Therapien durch relativ unspezifische, klinisch-basierte Einschlusskriterien, welche die molekularen Mechanismen in nicht ausreichender Weise wiedergeben, erschwert wird [9].Sepsis is a result of highly heterogeneous molecular processes, which are characterized by the inclusion of many components and their interactions at every organizational level of the human body:
Genes, cells, tissues, organs. The complexity of the underlying biological and immunological processes has generated many types of research studies that span a wide range of clinical aspects. One of the results to be recognized from this was that the evaluation of new sepsis therapies is made more difficult by relatively unspecific, clinically-based inclusion criteria which do not adequately reflect the molecular mechanisms [9].

Daher ist ein dringender Bedarf für innovative diagnostische Mittel entstanden, welche die Fähigkeit des Fachmanns verbessern sollten, Patienten mit Sepsis frühzeitig zu diagnostizieren, die Schwere einer Sepsis auf molekularer Ebene messbar zu machen und im klinischem Verlauf vergleichbar zu gestalten, und bezüglich der individuellen Prognose und dem Ansprechen auf spezifische Behandlungen Aussagen abzuleiten.Therefore is an urgent need for innovative diagnostic tools have emerged that enhance the ability of the Specialist should improve patients with sepsis early diagnose the severity of sepsis at the molecular level to make it measurable and to make it comparable in the clinical course, and regarding the individual prognosis and the response to specific treatments To derive statements.

Technologische Fortschritte, insbesondere die Entwicklung der Mikroarray-Technologie, versetzen den Fachmann nun in die Lage, 10 000 oder mehr Gene und deren Genprodukte gleichzeitig zu vergleichen. Die Anwendung solcher Mikroarray-Technologien kann nun Hinweise auf den Status von Gesundheit, Regulationsmechanismen, biochemischer Wechselwirkungen und Signalisierungsnetzwerken geben. Das Verbessern des Verständnisses darüber, wie ein Organismus auf Infektionen reagiert, sollte die Entwicklung von verstärkten Erkennungs-, Diagnose- und Behandlungsmodalitäten für Sepsis-Erkrankungen erleichtern.technological Advances, especially the development of microarray technology, are shifting the Those skilled in the art are now able to find 10,000 or more genes and their gene products to compare at the same time. The application of such microarray technologies can now indications of the status of health, regulatory mechanisms, give biochemical interactions and signaling networks. Improving understanding about that, How an organism responds to infections should develop of reinforced Facilitate detection, diagnosis and treatment modalities for sepsis diseases.

Mikroarrays stammen vom „Southern blotting" [10] ab, was die erste Herangehensweise darstellt, DNA-Moleküle in einer räumlich ansprechbaren Art und Weise auf einer festen Matrix zu immobilisieren. Die ersten Mikroarrays bestanden aus DNA-Fragmenten, oft mit unbekannter Sequenz, und wurden auf eine poröse Membran (normalerweise Nylon) punktweise aufgebracht. Routinegemäß wurden cDNA, genomische DNA oder Plasmid-Bilbliotheken verwendet, und das hybridisierte Material wurde mit einer radioaktiven Gruppe markiert (11–13].Microarrays are derived from "Southern blotting" [10], which is the first approach to immobilize DNA molecules in a spatially responsive manner on a solid matrix. The first microarrays consisted of DNA fragments, often with an unknown sequence, and were spotted on a porous membrane (usually nylon), and cDNA, genomic DNA or plasmid libraries were used and the hybridized material was labeled with a radioactive group (11-13).

Kürzlich hat es die Verwendung von Glas als Substrat und Fluoreszenz zur Detektion zusammen mit der Entwicklung neuer Technologien für die Synthese und für das , Aufbringen der Nukleinsäuren in sehr hohen Dichten erlaubt, die Nukleinsäurearrays zu miniaturisieren bei gleichzeitiger Erhöhung des experimentellen Durchsatzes und des Informationsgehaltes [14–16].Has recently there is the use of glass as a substrate and fluorescence for detection along with the development of new technologies for synthesis and for that, applying the nucleic acids allowed to miniaturize the nucleic acid arrays in very high densities while increasing experimental throughput and information content [14–16].

Weiterhin ist aus WO 03/002763 bekannt, dass Microarrays grundsätzlich für die Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen verwendet werden können.Farther it is known from WO 03/002763 that microarrays are generally used for diagnosis of sepsis and sepsis-like states can be used.

Eine Begründung für die Anwendbarkeit der Mikroarray-Technologie wurde zunächst durch klinische Untersuchungen auf dem Gebiet der Krebsforschung geliefert. Hier haben Expressionsprofile ihre Nützlichkeit bei der Identifizierung von Aktivitäten einzelner Gene oder Gengruppen gezeigt, die mit bestimmten klinischen Phänotypen korrelieren [17]. Durch die Analyse vieler Proben, die von Individuen mit oder ohne akute Leukämie oder diffuse Lymphome großer B-Zellen stammten, wurden Genexpressionsmarker (RNA) gefunden und auf die Klassifizierung dieser Krebsarten angewandt [17,18]. Golub et al. haben herausgefunden, daß verläßliche Vorhersagen nicht aufgrund von irgendeinem einzelnen Gen gemacht werden können, aber daß Vorhersagen, die auf den Expressionsspiegeln von 53 Genen (ausgewählt aus über 6000 Genen, die auf den Arrays vertreten waren) basieren, sehr genau sind [17].A Reason for the Applicability of microarray technology was initially through clinical studies in the field of cancer research. Here, expression profiles are useful for identification of activities individual genes or gene groups shown with certain clinical phenotypes correlate [17]. By analyzing many samples from individuals with or without acute leukemia or large diffuse lymphomas B cell origin, gene expression markers (RNA) were found and on the classification of these cancers was applied [17,18]. Golub et al. have found reliable predictions cannot be made due to any single gene, however that predictions that on the expression levels of 53 genes (selected from over 6000 Genes that were represented on the arrays) are very accurate are [17].

Alisadeh et al. [18] untersuchten große B-Zell Lymphome (DLBCL). Die Autoren erarbeiteten Expressionsprofile mit einem „Lymphochip", einem Mikroarray, der 18 000 Klone komplementärer DNA trug und entwickelt worden war, um Gene zu überwachen, die in normale und abnormale Lymphozytenentwicklung involviert sind. Unter Verwendung von Cluster-Analyse waren sie in der Lage, DILBCL in zwei Kategorien einzuteilen, welche starke Unterschiede bezüglich der Überlebenschancen der Patienten aufzeigten. Die Genexpressionsprofile dieser Untergruppen entsprachen zwei bedeutsamer Stadien der B-Zelldifferenzierung.Alisadeh et al. [18] examined large ones B-cell lymphoma (DLBCL). The authors developed expression profiles with a "lymph chip", a microarray, of the 18,000 clones more complementary DNA was carried and had been designed to monitor genes found in normal and abnormal lymphocyte development are involved. Under use By cluster analysis, they were able to classify DILBCL into two categories classify the major differences in patient survival aufzeigten. The gene expression profiles of these subgroups corresponded two significant stages of B cell differentiation.

Besonders wertvoll hat sich die Bestimmung von Genexpressionsprofilen zur differentialdiagnostischen Unterscheidung von Krankheitserscheinungen, die auf systemische mikrobielle Infektionen zurückzuführen sind, von anderen Krankheitserscheinungen nichtinfektiöser Ätiologie erwiesen, die aufgrund ihres, klinischen Erscheinungsbildes auf eine Sepsis hindeuten könnten, jedoch in Wirklichkeit nicht auf eine systemische mikrobielle Infektion zurückzuführen sind, z.B. von Krankheitserscheinungen, die auf nicht-infektiöse Entzündungen einzelner Organe zurückzuführen sind (20,21, 22). Die Messung von Genexpressionprofilen zur Diagnose einer Sepsis oder sepsisähnlicher Zustände aus Körperflüssigkeiten wurde noch nicht beschrieben.Especially The determination of gene expression profiles has become valuable differential diagnosis of disease symptoms, which are due to systemic microbial infections, from other symptoms non-infectious aetiology proven on the basis of their clinical appearance could indicate sepsis however, in reality not a systemic microbial infection are attributable e.g. of symptoms that are related to non-infectious inflammation of individual organs (20, 21, 22). Measurement of gene expression profiles for diagnosis a sepsis or sepsis-like conditions from body fluids has not been described yet.

Ausgangspunkt für die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarten Erfindung ist die Erkenntnis, daß vor der Diagnose von Sepsis, bei Sepsis und sepsisähnlichen systemischen Infektionen in biologischen Proben eines Individuums sich von normalen Werten unterscheidende RNA-Spiegel, bzw. sich davon ableitbare Peptid- und Teilpeptid-Spiegel in einem Serum oder Plasma eines Patienten, bei dem ein Sepsisrisiko besteht bzw. bei dem sepsistypische Krankheitserscheinungen festgestellt werden, feststellbar sind.starting point for the in the present patent application is the invention Realizing that before the diagnosis of sepsis, sepsis and sepsis-like systemic infections in biological samples of an individual differ from normal values differing RNA levels, or derived peptide and partial peptide levels in a patient's serum or plasma at risk of sepsis exists or in which symptoms typical of sepsis are found are noticeable.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Erkennung, die Beurteilung des Schweregrads und/oder die therapiebegleitende Verlaufsbeurteilung von Sepsis und schweren Infektionen, insbesondere sepsisähnlichen systemischen Infektionen, ermöglicht.The The present invention is therefore based on the object of a method to disposal to provide the detection, severity assessment and / or the therapy-accompanying assessment of the course of sepsis and severe Infections, especially sepsis-like systemic infections.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 oder 26 gelöst.This The task is carried out using a method with the characteristic features of claim 1 or 26 solved.

Weiterhin liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Verwendungsmöglichkeit von Markern in einem Verfahren gemäß Anspruch 1–48 zur Verfügung zu stellen.Farther is the object of the present invention, a possible use of markers in a method according to claims 1-48 for disposal to deliver.

Diese Aufgabe wird durch die Verwendung gemäß Anspruch 49 gelöst.This The object is achieved by the use according to claim 49.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit eines Individuums die Aktivität eines oder mehrerer Markergene bestimmt und aus der festgestellten Anwesenheit und/oder Menge des bestimmten Genprodukts Sepsis oder sepsisähnliche systemische Inflammationen und oder Infektionen, ihren Schweregrad und/oder den Erfolg einer therapeutischen Behandlung ableiten kann.The inventive method is characterized in that one in a sample of an individual's biological fluid the activity one or more marker genes are determined and determined from the Presence and / or amount of the specific gene product sepsis or sepsis-like systemic inflammation and or infection, their severity and / or deduce the success of a therapeutic treatment.

Eine Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur in vitro Erkennung von Sepsis und/oder sepsisähnlichen Zuständen, dadurch gekennzeichnet ist, daß es folgende Schritte umfaßt:

a) Isolieren von Proben-RNA aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;
b) Markieren der Proben-RNA und/oder wenigstens einer DNA, die ein für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifisches Gen oder Genfragment ist, mit einem detektierbaren Marker;
c) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der DNA unter Hybridisierungsbedingungen;
d) In-Kontakt-Bringen von Kontroqll-RNA, welche eine Kontrolle für nichtpathologische Zustände darstellt, mit wenigstens einer DNA, unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die DNA ein für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifisches Gen oder Genfragment ist;
e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-RNA und der Kontroll-RNA;
f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.

An embodiment of the invention is characterized in that the method for the in vitro detection of sepsis and / or sepsis-like conditions is characterized in that it comprises the following steps:

a) isolating sample RNA from a sample derived from a mammal;
b) labeling the sample RNA and / or at least one DNA, which is a gene or gene fragment specific for sepsis and / or sepsis-like conditions, with a detectable marker;
c) contacting the sample RNA with the DNA under hybridization conditions;
d) contacting Kontroqll RNA, which is a control for non-pathological conditions, with at least one DNA, under hybridization conditions, the DNA being a gene or gene fragment specific for sepsis and / or sepsis-like conditions;
e) quantitative detection of the marker signals of the hybridized sample RNA and the control RNA;
f) comparing the quantitative data of the marker signals in order to make a statement as to whether specific genes or gene fragments for sepsis and / or sepsis-like conditions are expressed more or less in the sample than in the control.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Kontroll-RNA vor dem Messen der Proben-RNA mit der DNA hybridisiert und die Markierungssignale des Kontroll-RNA/DNA-Komplexes erfaßt und gegebenenfalls in Form einer Kalibrierkurve oder -tabelle ablegt.A further embodiment The invention is characterized in that the control RNA before measuring the sample RNA hybridized with the DNA and the marker signals of the control RNA / DNA complex detected and optionally in the form a calibration curve or table.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als Proben-RNA mRNA verwendet wird.A further embodiment The invention is characterized in that mRNA is used as the sample RNA becomes.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die DNA an vorbestimmten Bereichen auf einem Träger in Form eines Microarrays angeordnet, insbesondere immobilisiert, wird.A further embodiment The invention is characterized in that the DNA at predetermined Areas on a support arranged in the form of a microarray, in particular immobilized, becomes.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des therapeutischen Verlaufs, zur Risikoabschätzung für Patienten sowie zur post mortem Diagnose von Sepsis und/oder septischen Zuständen und/oder systemischen Entzündungen und/oder Infektionen eingesetzt wird. A further embodiment The invention is characterized in that the method for differential diagnostic Early detection, to control the therapeutic process, to assess the risk for patients as well as for the post mortem diagnosis of sepsis and / or septic conditions and / or systemic inflammation and / or infections is used.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.A further embodiment The invention is characterized in that the sample is selected from: body fluids, especially blood, cerebrospinal fluid, urine, ascites fluid, seminal fluid, Saliva, punctate; Cell content or a mixture thereof.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.A further embodiment The invention is characterized in that cell samples are optionally one undergo lytic treatment to release their cell contents.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Säuger um einen Menschen handelt.A further embodiment The invention is characterized in that it is the mammal a human being.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifische Gen oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 6242, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5–2000, bevorzugt 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotiden.A further embodiment The invention is characterized in that for sepsis and / or sepsis-like conditions specific gene or gene fragment is selected from the group consisting of from SEQ-ID No. 1 to SEQ-ID No. 6242, and gene fragments thereof with at least 5-2000, preferably 20-200, more preferably 20-80 Nucleotides.

Diese Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 6242 sind durch den Umfang der vorliegenden Erfindung mit umfaßt und sind dem angefügten 759-seitigen, 6242 Sequenzen umfassenden, Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen offenbart. Dieses Sequenzprotokoll beinhaltet zudem eine Zuordnung der einzelnen Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 6242 zu deren GeneBank Accession Nr. (Internet-Zugang über http//www.ncbi.nlm.nih.gov/.This Sequences with sequence ID: 1 to sequence ID: 6242 are through encompasses the scope of the present invention and are attached to the 759-page, 6242 sequences comprehensive sequence protocol, which is therefore part of the invention, disclosed in detail. This sequence listing also includes an assignment of the individual sequences with the sequence ID: 1 to Sequence ID: 6242 to their GeneBank Accession No. (Internet access via http // www.ncbi.nlm.nih.gov /.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Sonden markiert werden. Für diese Ausführungsform finden selbstkomplementäre Oligonukleotide, so genannte Molecular beacons, als Sonden Verwendung. Sie tragen an ihren Enden ein Fluorophor/Quencher-Paar, so daß sie in Abwesenheit einer komplementären Sequenz in einer gefalteten Haarnadelstruktur vorliegen und erst mit einer entsprechenden Probensequenz ein Fluoreszenzsignal liefern. Die Haarnadelstruktur der Molecular Beacons ist so lange stabil, bis die Probe an der spezifischen Fängersequenzsequenz hybridisiert, was zu einer Konformationsänderung und damit auch Freisetzung der Reporterfluoreszenz führt. A further embodiment The invention is characterized in that the immobilized probes be marked. For this embodiment find self-complementary Oligonucleotides, so-called molecular beacons, are used as probes. They have a fluorophore / quencher pair at their ends so that they are in Absence of a complementary Sequence in a folded hairpin structure and only deliver a fluorescence signal with an appropriate sample sequence. The hairpin structure of the molecular beacons is stable as long as until the sample hybridizes to the specific capture sequence sequence, resulting in a conformational change and thus also leads to the release of reporter fluorescence.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.Another embodiment of the invention is characterized in that at least 2 to 100 different cDNAs can be used.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.A further embodiment The invention is characterized in that at least 200 different ones cDNAs can be used.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.A further embodiment The invention is characterized in that at least 200 to 500 different ones cDNAs can be used.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.A further embodiment the invention is characterized in that at least 500 to 1000 different cDNAs can be used.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.A further embodiment The invention is characterized in that at least 1000 to 2000 different cDNAs can be used.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die als cDNA von den in Anspruch 10 aufgelisteten Genen ersetzt wird durch synthetische Analoga, sowie Peptidonukleinsäuren.A further embodiment The invention is characterized in that the cDNA of those in claim 10 genes listed will be replaced by synthetic analogs, as well as peptide nucleic acids.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die synthetische Analoga der Gene 5–100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.A further embodiment The invention is characterized in that the synthetic analogs genes 5-100, in particular comprise approximately 70 base pairs.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Macker ein radioaktiver Marker, insbesondere ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ¹⁵⁵Ep, ³³P oder ³H verwendet wird.A further embodiment of the invention is characterized in that a radioactive marker, in particular ³² P, ¹⁴ C, ¹²⁵ I, ¹⁵⁵ Ep, ³³ P or ³ H, is used as the detectable marker.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, oder ein elektrischer Marker, insbesondere Potential- und/oder Kapazitätsänderung, verwendet wird.A further embodiment The invention is characterized in that as a detectable marker a non-radioactive marker, especially a color or fluorescent marker, an enzyme marker or immune marker, or an electrical marker, in particular potential and / or capacity change is used.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA dieselbe Markierung tragen.A further embodiment The invention is characterized in that the sample RNA and control RNA wear the same mark.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA unterschiedliche Markierungen tragen.A further embodiment The invention is characterized in that the sample RNA and control RNA wear different markings.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Sonden auf Glas oder Kuststoff, immobilisiert werden. A further embodiment The invention is characterized in that the cDNA probes are on glass or plastic, can be immobilized.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.A further embodiment The invention is characterized in that the individual cDNA molecules have a covalent bond to the carrier material be immobilized.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle mittels Adsorption an das Trägermaterial immobilisiert werden.A further embodiment The invention is characterized in that the individual cDNA molecules by means of Adsorption on the carrier material be immobilized.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:

a) Isolieren von Proben-Peptiden aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;
b) Markieren der Proben-Peptide mit einem detektierbaren Marker;
c) In-Kontakt-Bringen der markierten Proben-Peptide mit wenigstens einem Antikörper oder dessen bindendem Fragment, wobei der Antikörper ein für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet;
d) In-Kontakt-Bringen von markierten Kontroll-Peptiden, welche aus gesunden Probanden stammen, mit wenigstens einem, in Form eines Microarray auf einem Träger immobilisierten Antikörper oder dessen bindendes Fragment, wobei der Antikörper ein für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet;
e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der Proben-Peptide und der Kontroll-Peptide;
f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifisches Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.

Another embodiment of the invention is characterized in that it comprises the following steps:

a) isolating sample peptides from a sample derived from a mammal;
b) labeling the sample peptides with a detectable marker;
c) bringing the labeled sample peptides into contact with at least one antibody or its binding fragment, the antibody binding a peptide or peptide fragment specific for sepsis and / or sepsis-like conditions;
d) contacting labeled control peptides, which originate from healthy volunteers, with at least one antibody immobilized in the form of a microarray on a support or its binding fragment, the antibody being a peptide specific for sepsis and / or sepsis-like conditions - or peptide fragment binds;
e) quantitative detection of the marker signals of the sample peptides and the control peptides;
f) Comparing the quantitative data of the marker signals in order to make a statement as to whether genes or gene fragments specific for sepsis and / or sepsis-like conditions are expressed more or less in the sample than in the control.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper auf einem Träger in Form eines Microarrays immobilisiert ist.Another embodiment of the invention is characterized in that the antibody on egg a carrier is immobilized in the form of a microarray.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es als Immunoassay ausgebildet ist.A further embodiment The invention is characterized in that it is designed as an immunoassay is.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des therapeutischen Verlaufs, zur Risikoabschätzung für Patienten sowie zur post mortem Diagnose von Sepsis und/oder septischen Zuständen und/oder systemischen Entzündungen und/oder Infektionen eingesetzt wird.A further embodiment The invention is characterized in that the method for differential diagnostic Early detection, to control the therapeutic process, to assess the risk for patients as well as for the post mortem diagnosis of sepsis and / or septic conditions and / or systemic inflammation and / or infections is used.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß Gewebe- oder Zellproben gegebenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.A further embodiment The invention is characterized in that tissue or cell samples if necessary undergo a lytic treatment for their cell contents release.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifische Peptid ein Exdpressionsprodukt eines Gen oder Genfragmentes ist, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 6242, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5–2000, bevorzugt 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotiden.A further embodiment The invention is characterized in that for sepsis and / or sepsis-like conditions specific peptide is an expression product of a gene or gene fragment which is selected is part of the group consisting of SEQ-ID No. 1 to SEQ-ID No. 6242, as well as gene fragments thereof with at least 5-2000, preferably 20-200, more preferably 20-80 Nucleotides.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche Peptide verwendet werden.A further embodiment The invention is characterized in that at least 2 to 100 different ones Peptides can be used.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche Peptide verwendet werden.A further embodiment The invention is characterized in that at least 200 different ones Peptides can be used.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche Peptide verwendet werden.A further embodiment The invention is characterized in that at least 200 to 500 different ones Peptides can be used.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche Peptide verwendet werden.A further embodiment the invention is characterized in that at least 500 to 1000 different Peptides can be used.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche Peptide verwendet werden.A further embodiment The invention is characterized in that at least 1000 to 2000 different peptides can be used.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere ³²P, ¹ ⁴C, ¹²⁵I, ¹⁵⁵Ep, ³³P oder ³H verwendet wird.Another embodiment of the invention is characterized in that is used as a detectable marker, a radioactive marker, in particular ³² P, ¹ ⁴ C, ¹²⁵ I, ¹⁵⁵ Ep, ³³ P or ³ H.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker verwendet wird.A further embodiment The invention is characterized in that as a detectable marker a non-radioactive marker, especially a color or fluorescent marker, an enzyme marker or immune marker is used.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide dieselbe Markierung tragen.A further embodiment The invention is characterized in that the sample peptides and control peptides wear the same mark.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide unterschiedliche Markierungen tragen.A further embodiment The invention is characterized in that the sample peptides and control peptides wear different markings.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.A further embodiment The invention is characterized in that the peptide probes on glass or plastic, can be immobilized.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.A further embodiment The invention is characterized in that the individual peptide molecules have a covalent bond to the carrier material be immobilized.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels Adsorption an das Trägermaterial immobilisiert werden.Another embodiment of the invention is characterized in that the individual peptide molecules are immobilized by adsorption on the carrier material.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels monoklonaler Antikörper oder deren bindenden Fragmenten erkannt werden.A further embodiment The invention is characterized in that the individual peptide molecules by means of monoclonal antibody or their binding fragments are recognized.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Bestimmen einzelner Peptide mittels Immunoassay, oder Präzipitationsassay unter Verwendung monoklonaler Antikörper durchgeführt wird.A further embodiment The invention is characterized in that the determination of individual peptides by means of immunoassay or precipitation assay using monoclonal antibodies.

Eine weiter Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, für Sepsis und/oder sepsisähnlichen Zustände spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen oder davon abgeleiteten Protein-/ Peptidsequenzen einzeln oder in Teilmengen als Kalibrator in Sepsis-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von Sepsis, sepsisähnlichen systemischen entzündlichen Zuständen und sepsisähnlichen systemischen Infektionen.A further embodiment the invention consists in the use of recombinant or synthetic manufactured, for Sepsis and / or sepsis-like conditions specific nucleic acid sequences, Partial sequences or protein / peptide sequences derived therefrom individually or in subsets as a calibrator in sepsis assays and / or to evaluate the effect and toxicity in drug screening and / or for the production of therapeutic agents and substances and mixtures of substances, which are intended as a therapeutic, for prevention and treatment from sepsis, sepsis-like systemic inflammatory states and sepsis-like systemic infections.

Es ist dem Fachmann klar, daß die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.It it is clear to the person skilled in the art that the in the claims individual features of the invention set forth without restriction can be combined with each other.

Als Markergene im Sinne der Erfindung werden alle abgeleiteten DNA-Sequenzen, Partialsequenzen und synthetischen Analoga (beispielsweise Peptido-Nukleinsäuren, PNA) verstanden. Weiterhin werden im Sinne der Erfindung alle von den Markergenen kodierten Proteine, Peptide bzw. Partialsequenzen oder synthetische Peptidomimetica verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.As Marker genes in the sense of the invention are all derived DNA sequences, Partial sequences and synthetic analogs (e.g. peptido nucleic acids, PNA) Roger that. Furthermore, all of the Marker genes encoded proteins, peptides or partial sequences or understood synthetic peptidomimetics. The on determination of Gene expression at the RNA level related description of the invention is not a limitation but is only an example application.

Die auf Blut bezogene Beschreibung der Erfindung stellt nur eine beispielhafte Anwendung der Erfindung dar. Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle Körperflüssigkeiten des Menschen verstanden.The blood-related description of the invention is only exemplary Application of the invention. As biological liquids in the sense of the invention become all body fluids understood the human being.

Eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Messung der differentiellen Genexpression eines Patienten zur Diagnose einer Sepsis oder SIRS. Hierzu wird die RNA aus dem Vollblut eines Patienten und eine Kontrollprobe eines gesunden Probanden isoliert. Die RNA wird anschließend markiert, beispielsweise radioaktiv mit ³²P oder mit Farbstoffmolekülen (Fluoreszenz). Als Markierungsmoleküle können alle im Stand der Technik zu diesem Zwecke bekannten Moleküle eingesetzt werden. Entsprechende Markierungsverfahren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt.One application of the method according to the invention is to measure the differential gene expression of a patient for the diagnosis of sepsis or SIRS. For this purpose, the RNA is isolated from a patient's whole blood and a control sample from a healthy subject. The RNA is then labeled, for example radioactively with ³² P or with dye molecules (fluorescence). All molecules known in the prior art for this purpose can be used as labeling molecules. Corresponding marking methods are also known to the person skilled in the art.

Die so markierte RNA wird anschließend mit auf einem Microarray immobilisierten cDNA-Molekülen hybridisiert. Die auf dem Microarray immobilisierten cDNA-Moleküle stellen eine spezifische Auswahl der Gene gemäß Anspruch 10 dieser Erfindung für die Diagnose einer Sepsis oder SIRS dar.The RNA so labeled is then hybridized with cDNA molecules immobilized on a microarray. Place the cDNA molecules immobilized on the microarray a specific selection of the genes according to claim 10 of this invention for the Diagnosis of sepsis or SIRS.

Die Intensitätssignale der hybridisierten Moleküle werden im Anschluss durch geeignete Messgeräte (Phosporimager, Microarray-Scanner) gemessen und durch weitere softwaregestützte Auswertungen analysiert. Aus den gemessenen Signalintensitäten werden die Expressionsverhältnisse zwischen der Patientenprobe und der Kontrolle bestimmt. Aus den Expressionsverhältnissen der unter- und/oder überregulierten Gene lassen sich wie in den nachstehend dargestellten Experimenten Rückschlüsse auf eine Sepsis oder SIRS ziehen.The intensity signals of the hybridized molecules are then measured using suitable measuring devices (phosphor imager, microarray scanner) measured and analyzed by further software-supported evaluations. The expression ratios become the measured signal intensities determined between the patient sample and the control. From the expression ratios the under- and / or over-regulated Genes can be engineered as in the experiments shown below Conclusions on pull a sepsis or SIRS.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung der differentiellen Genexpression für die therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung einer Sepsis. Hierzu wird aus den in zeitlichen Abständen gesammelten Blutproben des Patienten die RNA (Proben-RNA) isoliert. Die verschiedenen RNA-Proben werden zusammen mit der Kontrollprobe markiert und mit ausgewählten Genen gemäß dem Anspruch 10, welche auf einem Microarray immobilisiert sind, hybridisiert. Aus den jeweiligen Expressionsverhältnissen läßt sich somit der Therapieverlauf beurteilen.A further use of the method according to the invention consists in Measurement of differential gene expression for the accompanying therapy Course assessment of a sepsis. For this purpose, the intervals collected blood samples from the patient's RNA (sample RNA) isolated. The different RNA samples are taken along with the control sample marked and with selected Genes according to the claim 10, which are immobilized on a microarray, hybridized. The course of therapy can thus be determined from the respective expression ratios judge.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung des Bindungsgrades von Proteinen, beispielsweise monoklonaler Antikörper, mittels der Verwendung von Immunoassays, Protein- oder Peptidarrays oder Präpitationsassays. Durch die Bestimmung der Konzentration der von den Sequenzen der in Anwendungsbeispiel 1 aufgeführten Nukleinsäuren entsprechenden Proteine oder Peptide kann auf ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung einer Sepsis oder sepsisähnlicher Zustände geschlossen werden. Weiterhin ermöglicht diese Verfahrenweise die differentialdiagnostische Erkennung bei Sepsispatienten.Another application of the method according to the invention is to measure the degree of binding of proteins, for example monoclonal antibodies, by using immunoassays, protein or peptide arrays or preparation assays. By determining the concentration of the proteins or peptides corresponding to the sequences of the nucleic acids listed in Example 1, an increased risk of developing sepsis or sepsis-like conditions can be concluded the. Furthermore, this procedure enables differential diagnosis in sepsis patients.

Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung der Ausführungsbeispiele sowie anhand der Zeichnung.Further Advantages and features of the present invention result from the description of the exemplary embodiments as well as from the drawing.

Es zeigt:It shows:

1 ein 2-dimensionales Gel, das darauf aufgetragenes präzipitiertes Serum-Protein eines Patienten mit Sepsis enthält, und 1 a 2-dimensional gel containing precipitated serum protein of a patient with sepsis, and

2 ein 2-dimensionales Gel, das darauf aufgetragenes präzipitiertes Serum-Protein eines Kontroll-Patienten enthält. 2 a 2-dimensional gel containing precipitated serum protein from a control patient applied thereon.

In 1 und in 2 ist mit K4 das Akutphase Protein Transthyretin (TTR; P02766, Seq.-Id. 6241, Seq.-Id. 6242) und mit K5 und K6 das Vitamin D-bindende Protein (DBP; P02774, Seq.-Id. 1554, Seq.-Id. 1555) bezeichnet.In 1 and in 2 with K4 is the acute phase protein transthyretin (TTR; P02766, Seq.-Id. 6241, Seq.-Id. 6242) and with K5 and K6 the vitamin D-binding protein (DBP; P02774, Seq.-Id. 1554, Seq .-Id. 1555).

Die Gele (Cibacron FT, W1-W3, 400mM NaCl, IEF pH 3–10, Coomassie) können wie folgt erstellt werden:
250 Mikrogramm präzipitiertes Serum-Protein werden in einer Lösung bestehend aus 8M Harnstoff; 2,0 M Thioharnstoff; 4% CHAPS; 65 mM DTT und 0,4% (w/v) Bio-Lytes 3/10 (Bio-Rad) aufgenommen und einer isoelektrischen Fokussierung, sowie einer nachfolgenden SDS-PAGE unterzogen.The gels (Cibacron FT, W1-W3, 400mM NaCl, IEF pH 3–10, Coomassie) can be prepared as follows:
250 micrograms of precipitated serum protein are dissolved in a solution consisting of 8M urea; 2.0 M thiourea; 4% CHAPS; 65 mM DTT and 0.4% (w / v) Bio-Lytes 3/10 (Bio-Rad) were added and subjected to isoelectric focusing and a subsequent SDS-PAGE.

Die fertigen 2-dimensionalen Gele werden mit Coomassie Brilliant Blau G-250 angefärbt.The finished 2-dimensional gels are made with Coomassie Brilliant Blue Stained G-250.

Ausführungsbeispiel 1:Example 1:

Untersuchung zur Genexpression zwischen einem Patienten mit einer frühen Sepsis und einer KontrollprobeExamination of gene expression between a patient with early sepsis and a control sample

Es wurde die Genexpression bei Auftreten einer frühen Sepsis und einer Kontrollprobe gemessen. Die Patientendaten sind in Tabelle 1 zusammengefasst.It was the gene expression when early sepsis and a control sample occurred measured. The patient data are summarized in Table 1.

Nach Abnahme des Vollblutes wurde die totale RNA unter Anwendungen von RNAeasy gemäß den Vorgaben des Herstellers (Quiagen) isoliert. Im Anschluss wurde aus der totalen RNA die cDNA mittels reverser Transkrition mittels Superscript II RT (Invitrogen) nach dem Protokoll des Herstellers synthetisiert, mit ³³P radioaktiv markiert und hydrolisiert.After the whole blood had been drawn, the total RNA was isolated using RNAeasy in accordance with the manufacturer's instructions (Quiagen). Subsequently, the total RNA was synthesized by reverse transcription using Superscript II RT (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol, radioactively labeled with ³³ P and hydrolyzed from the total RNA.

Für die Hybridisierung wurden Filtermembranen der Deutschen Ressourcenzentrum für Genomforschung gGmbH (RZPD) verwendet. Diese Filtermembran war mit ca. 70.000 humanen cDNA-Molekülen bestückt.For hybridization became filter membranes of the German Resource Center for Genome Research gGmbH (RZPD) used. This filter membrane was around 70,000 human cDNA molecules stocked.

Die vorbereiteten und markierten Proben wurden mit der Filtermembran entsprechend den Anweisungen des RZPD hybridisiert und im Anschluss gewaschen. Nach einer 24-stündigen Exposition im Phosphorimager wurde die radioaktiven Signale ausgewertet.The Prepared and labeled samples were made using the filter membrane hybridized according to the instructions of the RZPD and subsequently washed. After a 24 hour The exposure to the phosphor imager was used to evaluate the radioactive signals.

Aus den Signalintensitäten wurden mittels der Software AIDA Array Evaluation die Expressionsverhältnisse zwischen Patienten- und Kontrollprobe berechnet. Out the signal intensities the expression ratios were determined using the AIDA Array Evaluation software calculated between patient and control sample.

Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass 230 Gene der Patientenprobe gefunden wurden, die gegenüber der Kontrollprobe signifikant überexprimiert waren (Expressionsverhältnisse zwischen 13,67 und 98,33). Weiterhin wird aus Tabelle 3 deutlich, dass 206 Gene der Patientenprobe signifikant unterexprimiert gegenüber der Kontrollprobe waren (Expressionsverhältnisse zwischen 0,01 und 0,09). Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass die in Tabelle 2 und Tabelle 3 aufgeführten Gene mit dem Auftreten einer frühen Sepsis korrelieren. Somit stellen die aufgeführten Gene Markergene für die Diagnose einer frühen Sepsis dar.Out Table 2 shows that 230 genes were found in the patient sample that were opposite of the control sample was significantly overexpressed were (expression ratios between 13.67 and 98.33). Table 3 also shows that that 206 genes of the patient sample were significantly underexpressed compared to the Control sample were (expression ratios between 0.01 and 0.09). From the results it is clear that the in Table 2 and Table 3 listed Genes with the appearance of an early Correlate sepsis. The genes listed thus represent marker genes for diagnosis an early Sepsis.

Tabelle 2: Expressionverhältnis überexprimierter Gene zwischen Patienten- und Kontrollprobe

Table 2: Expression ratio of overexpressed genes between patient and control sample

Tabelle 3: Expressionverhältnis unterrexprimierter Gene zwischen Patienten- und Kontrollprobe

Table 3: Expression ratio of under-expressed genes between patient and control sample

Diese charakteristischen Veränderungen sind für das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 26 ausnutzbar.This characteristic changes are for the inventive method according to claim 1 or 26 exploitable.

Die in den Tabellen 2 und 3 aufgeführten GeneBank Accession Nummern (Internet-Zugang über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) der einzelnen Sequenzen sind in dem dieser Anmeldung angefügten 759-seitigen Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen jeweils einer Sequenz ID (Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 6242) zugeordnet. Dieses Sequenzprotokoll ist Teil der vorliegenden Erfindung.The listed in Tables 2 and 3 GeneBank Accession Numbers (Internet access via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) of the individual sequences are in the 759-page attached to this application Sequence listing, which is thus part of the invention, in detail one sequence ID each (sequence ID: 1 to sequence ID: 6242) assigned. This sequence listing is part of the present invention.

Durchführung:Execution:

RNA-Vorbereitung. Die konditionierten Medien wurden aus den Kulturflaschen entfernt und die adherenten Zellen wurden gemäß den Herstelleranweisungen direkt in den Kulturflaschen unter Verwendung von TRIzol-Reagens (GIBCO/BRL) lysiert. Nach einem Deproteinierungszyklus wurde die RNA durch Zusatz von Isopropanol präzipitiert, danach mit Äthanol gespült und erneut in 200 μl RNA-sicherer Resuspensions-Lösung (Ambion, Austin, TX) gelöst. Die RNA-Präparate wurden mit 0,1 Mengeneinheiten/μl DNase I abgebaut, in DNase 1 Puffer von CLONTECH. Die RNA-Einheiten wurden zusätzlich in einer Alkoholmischung aus Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol von Proteinen befreit, durch Zusatz von Äthanol präzipitiert und in 50–100μl RNA-sicherer Resupensions-Lösung gelöst. Die RNA-Konzentration wurde spektrophotometrisch unter der Prämisse, daß 1A₂₆₀ einer Konzentration von 40 μg/ml entspricht, bestimmt. Die Proben wurden auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml angepasst und bei 80°C gelagert, ohne daß irgendwelche Anzeichen der Qualitätsverschlechterung festzustellen waren. Alle RNA-Präparate wurden durch eine Agarosegelelektrophorese auf ihre Ganzheit (im Sinne von Nichtzerfall in seine Bestandteile) hin beurteilt, wobei RNA-Standards (GIBCO/BRL) zu Hilfe genommen wurden. Alle hier beschriebenen Präparate enthielten intakte RNA mit eindeutig erkennbaren 28S-, 18S- and 5S-Banden (Daten sind nicht angegeben). Es wurden keine erkennbaren Unterschiede hinsichtlich der elektrophoretisch bestimmten RNA-Muster zwischen gesunden und infektiösen Zellen festgestellt.RNA preparation. The conditioned media was removed from the culture bottles and the adherent cells were lysed directly in the culture bottles using TRIzol reagent (GIBCO / BRL) according to the manufacturer's instructions. After a deproteinization cycle, the RNA was precipitated by adding isopropanol, then rinsed with ethanol and redissolved in 200 μl RNA-safe resuspension solution (Ambion, Austin, TX). The RNA preparations were degraded with 0.1 units / μl DNase I, in DNase 1 buffer from CLONTECH. The RNA units were additionally freed of proteins in an alcohol mixture of phenol, chloroform and isoamyl alcohol, precipitated by the addition of ethanol and dissolved in 50-100 μl RNA-safe resolution solution. The RNA concentration was determined spectrophotometrically on the premise that 1A ₂₆₀ corresponds to a concentration of 40 μg / ml. The samples were adjusted to a final concentration of 1 mg / ml and stored at 80 ° C without any signs of deterioration. All RNA preparations were assessed for their entirety (in the sense of non-disintegration into its components) by agarose gel electrophoresis, with RNA standards (GIBCO / BRL) being used. All preparations described here contained intact RNA with clearly recognizable 28S, 18S and 5S bands (data are not specified). There were no discernible differences in the electrophoretically determined RNA patterns between healthy and infectious cells.

Vorbereitung von radioaktiv-markierten cDNA-Proben und Hybridisierung mittels DNA-Arrays. Gemäß dem Herstellerprotokoll wurde die cDNA-Synthese unter Verwendung von genspezifischen Primern (CLONTECH) und [³²P]-dATP mit der Moloney Murine Leukemea Virus Reverse Transkriptase (Superscript II, GIBCO/BRL) durchgeführt. Für die cDNA-Synthese wurden gleiche Mengen (5 μg) an RNA von jeder Probe verwendet.Preparation of radio-labeled cDNA samples and hybridization using DNA arrays. According to the manufacturer's protocol, the cDNA synthesis was carried out using gene-specific primers (CLONTECH) and [ ³² P] -dATP using the Moloney Murine Leukemea Virus Reverse Transcriptase (Superscript II, GIBCO / BRL). Equal amounts (5 µg) of RNA from each sample were used for cDNA synthesis.

Alternative Möglichkeit Alternative way

RNA wurde aus den Gewebeproben mit Hilfe von Guanidinium Thiocyanate extrahiert und danach wie beschrieben [19] in CsCl zentrifugiert. Gemäß den Herstellerempfehlungen wurde die RNA aus den Zell-Linien mit RNAzol (Biotex Laboratories, Houston) extrahiert. Die Poly(A)-RNA wurde von 500 μg RNA mittels DynaBeads (Dynal, Oslo) isoliert, ganz entsprechend den Empfehlungen des Herstellers.RNA was made from the tissue samples with the help of guanidinium thiocyanate extracted and then centrifuged in CsCl as described [19]. According to the manufacturer's recommendations the RNA from the cell lines with RNAzol (Biotex Laboratories, Houston) extracted. The poly (A) RNA was derived from 500 μg RNA DynaBeads (Dynal, Oslo) isolated, according to the recommendations of the manufacturer.

Die Unterschiede in der Genexpression wurden unter Verwendung von Atlas Array Membranen (CLONTECH) untersucht. In einem ersten kurzen Arbeitsschritt wurden jeweils 1 μg RNA von jeder Zell-Linie in [-³²P]dATP-markierte cDNA umgeschrieben.The differences in gene expression were examined using Atlas Array Membranes (CLONTECH). In a first short step, 1 μg RNA from each cell line was transcribed into [- ³² P] dATP-labeled cDNA.

Auswertungevaluation

Die Auswertung der Genexpressionsdaten aus den radioaktiv markierten Filtern beruht auf der Messung der Färbungsintensitäten im digitalisierten Bild. Dazu werden über allen 57600 Spotpositionen kreisförmige Flächen definiert, innerhalb derer die Pixelintensitäten integriert werden. Die möglichst exakte Positionierung der Flächen über die Spots erfolgt automatisch durch die Analysesoftware (AIDA Array Evaluation, raytest Isotopenmessgeräte GmbH).The Evaluation of the gene expression data from the radioactively labeled Filtering is based on the measurement of the coloring intensities in the digitized Image. This will be done via all 57600 spot positions defined circular areas within which the pixel intensities to get integrated. The most possible exact positioning of the surfaces over the Spots are created automatically by the analysis software (AIDA array Evaluation, raytest Isotopenmessgeräte GmbH).

Die ermittelten Signale beinhalten neben der gewünschten Information, nämlich der Menge gebundener Nukleinsäuren aber auch Hintergrundsignale, welche durch unspezifische Bindungen an der Membranoberfläche verursacht werden. Um diese Einflüsse zu eliminieren, werden die Hintergrundsignale in 4608 leeren Flächen des Filters bestimmt und als Grundrauschen von den Hybridisierungssignalen subtrahiert. Punktuelle Signale, die nicht durch Bindung von Nukleinsäuren sondern durch Staubpartikel oder sonstige Störungen auf dem Filter verursacht werden, können von realen Spots durch ihre Unregelmäßigkeit der Form unterschieden werden und werden von der weiteren Analyse ausgeschlossen.The The signals determined contain the desired information, namely the Amount of bound nucleic acids but also background signals, which are caused by non-specific bindings on the membrane surface caused. To eliminate these influences, be the background signals in 4608 empty areas of the filter are determined and subtracted as background noise from the hybridization signals. Selective signals, not by binding nucleic acids but by dust particles or other disturbances can be caused by real spots on the filter their irregularity the form can be distinguished and are further analysis locked out.

Um die Werte verschiedener Filter miteinander vergleichbar zu machen, ist anschließend eine Normalisierung der Daten notwendig. Wegen der hohen Anzahl der Spots auf dem Filter wird als Normalisierungsreferenz der Mittelwert aller Expressionswerte festgelegt. Weiterhin ist der Ausschluss niedriger Spotsignale (unterhalb 10% des durchschnittlichen Expressionssignals) notwendig, da diese einem prozentual großen Fehler unterliegen und bei den späteren Berechnungen zu starken Schwankungen der Ergebisse führen würden.Around to make the values of different filters comparable, is afterwards normalization of the data necessary. Because of the high number the spots on the filter become the normalization reference the mean of all expression values. Furthermore, the exclusion low spot signals (below 10% of the average expression signal) necessary because these are subject to a large percentage error and in the later Calculations would lead to large fluctuations in the results.

Die Selektion der SIRS/Sepsis-relevanten Gene basiert auf dem Vergleich der Genexpressionswerte bei einer Kontrollperson ohne SIRS/Sepsis gegenüber jeweils einem Patienten mit der Diagnose Sepsis / SIRS. Die Höhe des Expressionsverhältnisses jedes Gens stellt das Kriterium für eine Sortierung der untersuchten Gene dar. Von Interesse sind die Gene, die in den Patienten gegenüber der Kontrolle am meisten überexprimiert bzw, unterexprimiert wurden.The Selection of the SIRS / sepsis-relevant genes is based on the comparison the gene expression values in a control person without SIRS / sepsis across from one patient each with a diagnosis of sepsis / SIRS. The level of the expression ratio each gene is the criterion for sorting the examined Genes are of interest are the genes that are present in the patient compared to the Control most overexpressed or were underexpressed.

Ausführungsbeispiel 2:Example 2:

Untersuchung zur Proteinexpression zwischen einem Patienten mit einer Sepsis und einer Kontrollprobe Es wurde die Proteinexpression bei Auftreten einer Sepsis und einer Kontrollprobe gemessen. Die Patientendaten sind in Tabelle 4 zusammengefasst.investigation for protein expression between a patient with sepsis and a control sample. Protein expression was observed a sepsis and a control sample. The patient data are summarized in Table 4.

Nach Abnahme des Vollblutes in ein Serum-Röhrchen erfolgte eine Zentrifugation (5500 rcf; 10 min; 4° C). Der Serum-Überstand wurde unmittelbar nach der Zentrifugation in Kryoröhrchen überführt und dann bei –35 ° C gelagert.To The whole blood was drawn into a serum tube and centrifuged (5500 rcf; 10 min; 4 ° C). The serum supernatant was transferred to cryotubes immediately after centrifugation and then stored at -35 ° C.

Das Serum wurde zur Abreicherung des Albumins mit Affi-Gel Blue Affinity Chromatographie Gel for Enzyme and Blood Protein Purifications (Bio-Rad) gemäß den Angaben des Herstellers behandelt. Zur Vermeidung unerwünschter Protein-Matrix-Wechselwirkungen wurden Equilibrierungs- und Bindungspuffer zusätzlich mit 400 mM NaCl versetzt.The Serum was used to deplete the albumin with Affi-Gel Blue Affinity Chromatography Gel for Enzyme and Blood Protein Purifications (Bio-Rad) according to the information of the manufacturer treated. To avoid unwanted protein-matrix interactions Equilibration and binding buffers were additionally mixed with 400 mM NaCl.

Nicht bindende Proteine wurden gesammelt und mit Methanol und Chloroform entsprechend dem Protokoll von Wessel und Flügge (Anal Biochem. 1984 Apr;138(1):141–3. ) präzipitiert.Not binding proteins were collected and mixed with methanol and chloroform precipitated according to the protocol of Wessel and Flügge (Anal Biochem. 1984 Apr; 138 (1): 141-3.).

250 Mikrogramm des präzipitierten Serum-Proteins wurden in einer Lösung bestehend aus 8M Harnstoff; 2,0 M Thioharnstoff; 4% CHAPS; 65 mM DTT und 0,4% (w/v) Bio-Lytes 3/10 (Bio-Rad) aufgenommen und einer isoelektrischen Fokussierung, sowie einer nachfolgenden SDS-PAGE unterzogen.250 Microgram of the precipitated Serum protein were in a solution consisting of 8M urea; 2.0 M thiourea; 4% CHAPS; 65 mM DTT and 0.4% (w / v) Bio-Lytes 3/10 (Bio-Rad) added and one isoelectric focusing, and a subsequent SDS-PAGE subjected.

Die fertigen 2-dimensionalen Gele wurden mit Coomassie Brilliant Blau G-250 angefärbt und differentiell exprimierte Proteine wurden massenspektrometrisch identifiziert.The finished 2-dimensional gels were made with Coomassie Brilliant Blue Stained G-250 and differentially expressed proteins were measured by mass spectrometry identified.

Die vergleichende Analyse (1, 2) zeigt, dass das Akutphase Protein Transthyretin (TTR; P02766, Seq.-Id. 6241, Seq.-Id. 6242 ), sowie das Vitamin D-bindende Protein (DBP; P02774, Seq.-Id. 1554, Seq.-Id. 1555) beim Sepsis-Patienten gegenüber dem Kontroll-Patienten schwächer exprimiert wird.The comparative analysis ( 1 . 2 ) shows that the acute phase protein transthyretin (TTR; P02766, Seq.-Id. 6241, Seq.-Id. 6242), as well as the vitamin D-binding protein (DBP; P02774, Seq.-Id. 1554, Seq.- Id. 1555) is less expressed in the sepsis patient compared to the control patient.

Aus diesen Ergebnissen lässt sich eindeutig ableiten, dass die Proteinexpression bzw. die Proteinzusammensetzung von Serum und Plasma krankheitsbegleitend verändert werden.Out these results clearly derive that the protein expression or the protein composition of serum and plasma can be changed to accompany the disease.

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Claims

Method for the in vitro detection of sepsis and / or sepsis-like conditions, characterized in that it comprises the following steps: a) isolating sample RNA from a sample derived from a mammal; b) labeling the sample RNA and / or at least one DNA, which is a gene or gene fragment specific for sepsis and / or sepsis-like conditions, with a detectable marker; c) contacting the sample RNA with the DNA under hybridization conditions; d) contacting control RNA, which is a control for non-pathological conditions, with at least one DNA, under hybridization conditions, the DNA being a gene or gene fragment specific for sepsis and / or sepsis-like conditions; e) quantitative detection of the marker signals of the hybridized sample RNA and the control RNA; f) comparing the quantitative data of the marker signals in order to make a statement as to whether specific genes or gene fragments for sepsis and / or sepsis-like conditions are expressed more or less in the sample than in the control.

A method according to claim 1, characterized in that the control RNA is measured with the DNA hybridizes and the marker signals of the control RNA / DNA complex are detected and, if appropriate in the form of a calibration curve or table.

A method according to claim 2, characterized in that not changed Genes from the sample and / or control RNA as reference genes for quantification be used.

A method according to claim 1 to 3, characterized in that as Sample RNA mRNA is used.

A method according to claim 1 to 4, characterized in that that the DNA at predetermined areas on a support in the form of a microarray arranged, in particular immobilized.

A method according to claim 1 to 5, characterized in that this Procedure for differential diagnostic early detection, to control the clinical course, for individual risk assessment for patients, for appraisal the likely response to a specific treatment as well as for the post mortem diagnosis of sepsis and / or septic conditions and / or systemic inflammation and / or infections is used.

Method according to claims 1 to 6, characterized in that that the Sample is selected from: body fluids, especially blood, cerebrospinal fluid, urine, ascites fluid, seminal fluid, Saliva, punctate; Cell content or a mixture thereof.

Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that that cell samples if necessary, be subjected to a lytic treatment in order to To release cell contents.

Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that that it itself in the mammal is a human being.

Method according to one of claims 1 to 9, characterized in that that this for sepsis and / or sepsis-like conditions specific gene or gene fragment is selected from the group consisting of from SEQ-ID No. 1 up to SEQ-ID No. 6242, as well as gene fragments thereof with at least 5-2000, are preferred 20-200, more preferably 20-80 Nucleotides.

Method according to one of claims 1 to 10, characterized in that at least 2 to 100 different cDNAs can be used.

Method according to one of claims 1 to 11, characterized in that that at least 200 different cDNAs can be used.

Method according to one of claims 1 to 12, characterized in that at least 200 to 500 different cDNAs can be used.

Method according to one of claims 1 to 13, characterized in that that at least 500 to 1000 different cDNAs can be used.

Method according to one of claims 1 to 14, characterized in that that at least 1000 to 2000 different cDNAs can be used.

Method according to one of claims 1 to 15, characterized in that the is replaced as a cDNA by the genes listed in claim 6 through synthetic analogs, as well as peptide nucleic acids.

A method according to claim 16, characterized that the synthetic analogs of genes 5-100, in particular include approximately 70 base pairs.

Method according to one of claims 1 to 17, characterized in that as detectable marks a radioactive marker, in particular ³² P, ¹⁴ C, ¹²⁵ I, ¹⁵⁵ Ep, ³³ P or ³ H is used.

Method according to one of claims 1 to 17, characterized in that that as detectable marker is a non-radioactive marker, in particular a color or fluorescent marker, an enzyme marker or immune marker, or an electrical marker, in particular a change in potential and / or capacity, is used.

Method according to one of claims 1 to 19, characterized in that that the Sample mRNA and control mRNA have the same label.

Method according to one of claims 1 to 19, characterized in that that the Sample mRNA and control mRNA have different labels.

Method according to one of claims 1-19, characterized in that the immobilized probes have a label.

Method according to one of claims 1 to 22, characterized in that that the cDNA probes can be immobilized on glass or plastic.

Method according to one of claims 1 to 23, characterized in that that the single cDNA molecules over a covalent bond to the carrier material be immobilized.

Method according to one of claims 1 to 24, characterized in that that the single cDNA molecules by means of adsorption on the carrier material be immobilized.

Method for the in vitro detection of sepsis and / or sepsis-like states characterized in that it includes the following steps: a) Isolate sample peptides from a mammalian one Sample; b) Labeling the sample peptides with a detectable Marker; c) contacting the labeled sample peptides with at least one antibody or its binding fragment, the antibody being one for sepsis and / or sepsis-like conditions specific peptide or peptide fragment binds; d) bringing into contact of labeled control peptides, which are from healthy volunteers originate, with at least one, in the form of a microarray on one carrier immobilized antibody or its binding fragment, the antibody being one for sepsis and / or sepsis-like conditions specific peptide or peptide fragment binds; e) quantitative Detecting the marker signals of the sample peptides and the control peptides; f) Compare the quantitative data of the marker signals to a To make a statement whether for Sepsis and / or sepsis-like conditions specific genes or gene fragments in the sample stronger or expressed less are as in control.

A method according to claim 26, characterized in that the antibody on a support is immobilized in the form of a microarray.

A method according to claim 26 or 27, characterized in that that it is designed as an immunoassay.

Method according to claims 26 to 28, characterized in that that this Procedure for differential diagnostic early detection, to control the therapeutic course, risk assessment for patients and post mortem diagnosis of sepsis and / or septic conditions and / or systemic inflammation and / or infections is used.

Method according to claims 26 to 29, characterized in that that the Sample selected becomes: body fluids, especially blood, cerebrospinal fluid, urine, ascites fluid, seminal fluid, Saliva, punctate; Cell content or a mixture thereof.

Method according to one of claims 26 to 30, characterized in that that cell samples if necessary, be subjected to a lytic treatment in order to To release cell contents.

Method according to one of claims 26 to 31, characterized in that that it around the mammal a human being.

Method according to one of claims 26 to 32, characterized in that that this for sepsis and / or sepsis-like conditions specific peptide is an expression product of a gene or gene fragment which is selected is made up of the group consisting of SEQ-ID No. 1 to SEQ-ID No. 6242, as well Gene fragments thereof with at least 5-2000, preferably 20-200, more preferably 20-80 Nucleotides.

Method according to one of claims 26 to 33, characterized in that that at least 2 to 100 different peptides can be used.

Method according to one of claims 26 to 33, characterized in that that at least 200 different peptides can be used.

Method according to one of claims 26 to 33, characterized in that that at least 200 to 500 different peptides can be used.

Method according to one of claims 26 to 33, characterized in that that at least 500 to 1000 different peptides can be used.

Method according to one of claims 26 to 37, characterized in that that at least 1000 to 2000 different peptides can be used.

Method according to one of claims 26 to 38, characterized in that a radioactive marker, in particular ³² P, ¹⁴ C, ¹²⁵ I, ¹⁵⁵ Ep, ³³ P or ³ H, is used as the detectable marker.

Method according to one of claims 26 to 38, characterized in that that as detectable marker is a non-radioactive marker, in particular a color or fluorescent label, an enzyme label or an immune label is used.

Method according to one of claims 26 to 40, characterized in that that the Sample peptides and control peptides have the same label.

Method according to one of claims 26 to 40, characterized in that that the Sample peptides and control peptides have different labels wear.

Method according to one of claims 26 to 38, characterized in that that the peptides used as probes, which are labeled with antibodies are and a signal change when binding occurs.

Method according to one of claims 26 to 43, characterized in that that the Peptide probes can be immobilized on glass or plastic.

Method according to one of claims 26 to 44, characterized in that that the individual peptide molecules via a covalent bond to the carrier material be immobilized.

Method according to one of claims 26 to 44, characterized in that that the individual peptide molecules by means of adsorption on the carrier material be immobilized.

Method according to one of claims 26 to 46, characterized in that that the individual peptide molecules using monoclonal antibodies or their binding fragments are recognized.

Method according to one of claims 26 to 47, characterized in that that this Determination of individual peptides using an immunoassay or precipitation assay using monoclonal antibodies.

Use of recombinantly or synthetically produced for sepsis and / or sepsis-like conditions specific nucleic acid sequences, Partial sequences or protein / peptide sequences derived therefrom individually or in subsets as a calibrator in sepsis assays and / or to evaluate the effect and toxicity in drug screening and / or for the production of therapeutic agents and substances and mixtures of substances, which are intended as a therapeutic, for prevention and treatment of sepsis, sepsis-like systemic inflammatory states and sepsis-like systemic infections.