WO2004005542A2 - Method for identifying infection-specific regulated genes of the skin - Google Patents

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WO2004005542A2
WO2004005542A2 PCT/EP2003/006663 EP0306663W WO2004005542A2 WO 2004005542 A2 WO2004005542 A2 WO 2004005542A2 EP 0306663 W EP0306663 W EP 0306663W WO 2004005542 A2 WO2004005542 A2 WO 2004005542A2
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skin
approximately
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infection
proteins
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PCT/EP2003/006663
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Dirk Bockmühl
Dirk Petersohn
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Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for the identification of infection-specifically regulated genes of the skin, test kits and biochips for the identification of infection-specific regulated genes of the skin as well as a test method for the detection of the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical agents against microbial infections of the skin as well as a screening method for identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin and a method for producing a cosmetic or pharmaceutical preparation against microbial infections of the skin.
  • the human genome contains at least 30,000 - 50,000 genes.
  • each cell uses only a small, specific part for the synthesis of proteins, which is reflected in the gene expression pattern.
  • the skin is the largest organ in the human body. It is a very complex organ that consists of a large number of different cell types and forms the body's interface with the environment. This fact shows that the cells of the skin are particularly exposed to exogenous signals of the environment, physical, chemical and biological. To understand skin responses to exogenous stimuli, analyzing skin gene expression is critical.
  • the expression of the genes in differentiated cells of the skin is not constant, but very dynamic.
  • Extracellular stimuli act on the transcription of living cells via partially complex signal transduction cascades.
  • the regulation of transcription in response to extracellular signals is called stimulus-transcription coupling.
  • An environmental stimulus that the skin is constantly confronted with is contact with microorganisms. This includes both harmless or useful and potentially pathogenic germs that are responsible for skin infections. How the skin reacts to colonization with microorganisms and how it differentiates between "harmless" and pathogenic germs is largely unknown.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a method for identifying the genes which are subjected to specific regulation as a result of a microbial infection of the skin and which overcomes the disadvantages of the prior art mentioned.
  • This object is achieved according to the invention by a method for identifying infection-specifically regulated genes of the skin in vitro, which is characterized in that
  • “expressed genetically coded factors” mean proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules.
  • the term “skin” encompasses natural skin from humans or animals, the genetically humanized skin of an animal and also a so-called skin model based on human and / or animal skin cells.
  • skin includes all epithelial covering tissues in humans and animals, including the scalp and mucous membranes, e.g. B. the oral mucosa or the vaginal mucosa.
  • a skin model which is particularly suitable according to the invention is known under the name "SkinEthic® reconstituted human epithelial tissue" (SkinEthic, France). This is a three-dimensional reconstructed human epithelial model.
  • the model is made from transformed human keratinocytes (TR146) from squamous cell carcinoma. The keratinocytes are cultivated on an inert polycarbonate filter in a defined medium. An epithelium without stratum corneum forms, which has the properties of the epithelial part of the human cornea.
  • Skin-specific probes suitable according to the invention are, in particular, the probes mentioned in the patent applications PCT / EP01 / 15179 and DE-A-101 00 127.4-41, which were not yet published on the filing date of the present patent application, and which are used for specific binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments are capable of proteins or mRNA molecules that are expressed more or less (ie differentially) in skin than in other tissues.
  • the method according to the invention can be used in the case of infection with any pathogen which can affect the skin.
  • pathogens which are selected from fungi and bacteria, in particular from the fungi Candida albicans, Candida glabrata, Candida dubliniensis, Candida tropicalis, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Microsporum canis, Epidermophyton floccosum and Malassezia aurfusoccus staurfusoccus bacteria , Staphylococcus epidermis, Propionibacterium acnes, Streptococcus mutans and Corynebacterium xerosis.
  • the respective mixtures are preferably obtained from a skin sample, in particular from a whole skin sample or from an epidermis sample.
  • the whole skin sample provides copies of all cell types represented in the skin.
  • the epidermis sample on the other hand, is easier to obtain, for example by applying an adhesive tape to the skin and tearing it off, as described in WO 00/10579, to which reference is hereby made in full.
  • the respective mixtures are obtained in steps a) and b) by means of microdialysis.
  • microdialysis technique is described, for example, in "Microdialysis: A method for measuring local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161: 12 1735-8; as well as in “Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption studies", Anderson, C. et al. ; Drugs Pharm. Sci., 1998, 91, 231-244; and also described on the Internet at http://www.microdialysis.se/techniqu.htm, to which reference is hereby made in full.
  • microdialysis When using microdialysis, a probe is typically inserted into the skin and the probe is slowly rinsed with a suitable carrier solution. After the acute reactions have subsided after the puncture, the microdialysis provides proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which occur in the extracellular space and which can then be isolated and analyzed in vitro, for example by fractionation of the carrier liquid. Microdialysis is less invasive than taking a full skin sample; however, it is disadvantageously limited to the extraction of compounds occurring in the extracellular space.
  • a biochip that can be used in step c) of the method according to the invention comprises i. a firm, d. H. rigid or flexible beams and ii. on this immobilized skin-specific probes, as mentioned in the as yet unpublished patent applications PCT / EP01 / 15179 and DE-A-101 00 127.4-41, which are used for specific binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of Proteins or mRNA molecules are capable, which are expressed more or less (ie differentially) in skin than in other tissues.
  • a biochip for identifying genes of the human skin regulated by infection by infection with Candida is preferably used in vitro i. a carrier and ii. immobilized on this skin-specific probes that are used for specific
  • a biochip can be used with particular preference which, in addition to the above-mentioned probes, comprises further probes which are capable of specific binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are transcribed and / or translated into the person skilled in the art can be derived from the genes listed in List 1.
  • a BioChip is a miniaturized functional element with molecules immobilized on a surface, in particular biomolecules, which can serve as specific interaction partners.
  • BioChips have a 2D base area for coating with biologically or biochemically functional materials.
  • the base surfaces can also be formed, for example, by walls of one or more capillaries or by channels.
  • the prior art can e.g. For example, reference is made to the following publications: Nature Genetics, Vol. 21, Supplement (overall), Jan. 1999 (BioChips); Nature Biotechnology, Vol. 16, pp. 981-983, Oct. 1998 (BioChips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, pp. 301-306, Jul.
  • the DNA chip technology which is particularly preferred in the context of the present invention is based on the ability of nucleic acids to enter into complementary base pairings.
  • This technical principle known as hybridization, has been used in Southern blot and Northern blot analysis for years. Compared to these conventional methods, in which only a few genes are analyzed, DNA chip technology allows a few hundred to several tens of thousands of genes to be examined in parallel.
  • a DNA chip essentially consists of a carrier material (e.g. glass or plastic) on which single-stranded, gene-specific probes are immobilized in a high density at a defined location (spot). The technique of probe application and the chemistry of probe immobilization are considered problematic.
  • EM Southern (EM Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-1684 and EM Southern et al. (1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) describes the preparation of oligonucleotide arrangements by direct synthesis on a glass surface which has been derivatized with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane and then with a glycol.
  • P.O. Brown (DeRisi et al. (1997), Science 278, 680-686) describes the immobilization of DNA on glass surfaces coated with polylysine.
  • L.M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acid Research 22, 5456-5465) discloses a similar procedure: oligonucleotides bearing a 5'-terminal amino group can be bound to a glass surface which is coated with 3-aminopropyltrimethoxysilane and then treated with 1,4-phenyl diisothioeyanate.
  • the DNA probes can be applied to a carrier using a so-called "pin spotter”. Thin metal needles with e.g. with a diameter of 250 ⁇ m, in probe solutions and then transfer the attached sample material with defined volumes to the carrier material of the DNA chip.
  • the probe is preferably applied by means of a piezocontrolled nanodispenser, which, like an inkjet printer, applies probe solutions with a volume of 100 picoliters to the surface of the carrier material without contact.
  • the probes are immobilized, for example, as described in EP-A-0 965 647: DNA probes are generated here by means of PCR under Use of a sequence-specific pair of primers, a primer being modified at the 5 'end and carrying a linker with a free amino group. This ensures that a defined strand of the PCR products can be bound to a glass surface which has been treated with 3-aminopropyltrimethoxysilane and then with 1,4-phenyldiisothiocyanate.
  • the gene-specific PCR products should ideally have a defined nucleic acid sequence with a length of 200-400 bp and contain non-redundant sequences.
  • mRNA is isolated from two cell populations to be compared.
  • the isolated mRNAs are reverse transcribed using e.g. fluorescence-labeled nucleotides converted into cDNA.
  • the samples to be compared are e.g. marked with red or green fluorescent nucleotides.
  • the cDNAs are then hybridized with the gene probes immobilized on the DNA chip and the bound fluorescence is then quantified.
  • the biochip according to the invention preferably comprises 1 to approximately 5000, preferably 1 to approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 500, preferably approximately 10 to approximately 250, particularly preferably approximately 10 to approximately 100 and very particularly preferably approximately 10 to approximately 50 different probes.
  • the probes which differ from one another, can each be present in duplicate on the chip.
  • the biochip according to the invention preferably comprises nucleic acid probes, in particular RNA or PNA probes, particularly preferably DNA probes.
  • the nucleic acid probes preferably have a length of approximately 10 to approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 800, preferably approximately 100 to approximately 600, particularly preferably approximately 200 to approximately 400 nucleotides.
  • the biochip according to the invention comprises peptide or protein probes, in particular antibodies.
  • Another object of the present invention is a test method for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin in vitro, characterized in that
  • a) determines the skin status of microbially infected skin by means of a method according to the invention for identifying infection-specifically regulated genes of the skin, b) applies an active substance against microbial infections of the skin to the skin one or more times, c) again the skin status by means of a method according to the invention for identifying infection-specifically regulated skin Genes of the skin are determined, and d) the effectiveness of the active ingredient is determined by comparing the results from a) and c).
  • Another object of the present invention is a test kit for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin in vitro, comprising means for carrying out the test method according to the invention.
  • Another object of the present invention is a screening method for the identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin in vitro, characterized in that a) the skin status of microbially infected skin is determined by an inventive method for the identification of infection-specific regulated genes of the skin or determined in vitro using a test kit according to the invention for the detection of the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin, b) applying a potential active substance against microbial infections of the skin to the skin one or more times, c) the skin status is determined again in vitro by a method according to the invention for identifying infection-specifically regulated genes of the skin or by means of a test kit according to the invention for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin, and d) the effectiveness of the active substance by the Comparison of the results from a) and c) determined.
  • Another object of the present invention is a method for producing a cosmetic or pharmaceutical preparation against microbial infections of the skin, characterized in that a) active ingredients are determined using the screening method according to the invention and b) active ingredients found to be effective with cosmetic and pharmacological suitable and compatible carriers mixed.
  • Another object of the invention is the use of biochips according to one of claims 7 to 13 for carrying out in vitro measures for the identification, prophylaxis, therapy and therapy control of microbial skin diseases.
  • C. albicans (SC5314) cells were grown overnight at 30 ° C. in minimal medium (0.67% yeast nitrogen base, 2% glucose), centrifuged and resuspended in PBS, so that a cell density of 4x10 7 resulted.
  • Skin models (from Skinethics) were overlaid with 50 ⁇ l of this suspension and incubated for 6 or 24 hours (37 ° C., 100% RH, 5% CO 2 ).
  • PBS was overlaid Incorporated skin models.
  • the corresponding skin models were either placed in formalin for histological sections or stored at -20 ° C for the later preparation of the RNA.
  • the histological examinations and the RNA preparation were carried out according to standard methods.
  • CDNA synthesized from the RNA was used to hybridize DNA microarrays, so that a differential expression of skin genes due to the Candida infection could be determined.
  • the DNA array data show a differential expression of numerous genes after 6 hours of incubation. The exact values of repression or induction can be found in Table 9. The coefficient of variation indicates the scatter from the parallel measurements (all tests were carried out in duplicate).
  • Fig. 1 In vitro infection of skin models with C. albicans
  • Table 1 shows the expression profiles of infection-specifically regulated genes of the skin after infection with Candida albicans (after 6 or 24 hours after the infection), divided into 5 groups according to the degree of differential expression, group 1 expressing weakly differentially and group 5 particularly strongly contains differentially expressed genes, ie a lower value in group 1, a high one in group 5.
  • Group 1 of Table 1 lists all genes that are differentially expressed at least 1.5 times and less than 2.6 times after 6 hours or 24 hours of incubation.
  • Group 2 of Table 1 lists all genes that are at least 2.6-fold differentially expressed after 24 hours of incubation.
  • Group 3 of Table 1 lists all genes which are expressed differentially at least 2.6-fold and less than 7.0-fold after 6 hours of incubation.
  • Group 4 of Table 1 lists all genes that are differentially expressed at least 7.1 times and less than 10.0 times after 6 hours of incubation.
  • Tables 2 to 8 represent subsets of Table 1 and explain the meaning of some differentially expressed genes after a Candida infection. The effects described in Tables 2 to 8 are particularly important because they were in no way predictable. These are in detail:
  • Table 9 shows the differential expression of numerous genes from the above embodiment. The coefficient of variation indicates the scatter from the parallel measurements (all tests were carried out in duplicate).

Abstract

The invention relates to a method for identifying infection-specific regulated genes of the skin, test kits and biochips for the identification of infection-specific regulated genes of the skin in addition to a test method for detecting the efficacy of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin, in addition to a screening method for identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin and to a method for the production of a cosmetic or pharmaceutical preparation against microbial infections of the skin.

Description

Verfahren zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut Procedure for the identification of infection-specific regulated genes of the skin
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut, Test-Kits und Biochips zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut sowie ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen mikrobielle Infektionen der Haut sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen mikrobielle Infektionen der Haut und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen mikrobielle Infektionen der Haut.The present invention relates to a method for the identification of infection-specifically regulated genes of the skin, test kits and biochips for the identification of infection-specific regulated genes of the skin as well as a test method for the detection of the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical agents against microbial infections of the skin as well as a screening method for identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin and a method for producing a cosmetic or pharmaceutical preparation against microbial infections of the skin.
Das menschliche Genom umfasst nach jüngsten Schätzungen mindestens 30.000 - 50.000 Gene. Von diesem immensen Informationsangebot verwendet jede Zelle jedoch lediglich einen kleinen, für sie spezifischen Teil für die Synthese von Proteinen, der sich im Genexpressionsmuster wiederspiegelt.According to recent estimates, the human genome contains at least 30,000 - 50,000 genes. Of this immense amount of information, however, each cell uses only a small, specific part for the synthesis of proteins, which is reflected in the gene expression pattern.
Die Haut ist das größte Organ des menschlichen Körpers. Sie ist ein sehr komplex aufgebautes Organ, das aus einer Vielzahl verschiedener Zelltypen besteht und die Grenzfläche des Körpers zur Umwelt bildet. Diese Tatsache verdeutlicht, dass die Zellen der Haut in besonderem Maße exogenen Signalen der Umwelt, physikalischer, chemischer und biologischer Natur ausgesetzt werden. Für das Verständnis von Hautreaktionen auf exogene Stimuli ist die Analyse der Genexpression in der Haut von entscheidender Bedeutung.The skin is the largest organ in the human body. It is a very complex organ that consists of a large number of different cell types and forms the body's interface with the environment. This fact shows that the cells of the skin are particularly exposed to exogenous signals of the environment, physical, chemical and biological. To understand skin responses to exogenous stimuli, analyzing skin gene expression is critical.
Die Expression der Gene in differenzierten Zellen der Haut ist nicht konstant, sondern sehr dynamisch. Extrazelluläre Stimuli wirken über zum Teil komplexe Signaltransduktionskaskaden auf die Transkription lebender Zellen. Die Regulation der Transkription als Antwort auf extrazelluläre Signale wird als Stimulus-Transkriptions-Kopplung bezeichnet. Ein Umweltreiz, mit dem die Haut ständig konfrontiert wird, ist der Kontakt mit Mikroorganismen. Darunter fallen sowohl harmlose bzw. nützliche als auch potenziell pathogene Keime, die für Infektionen der Haut verantwortlich sind. Wie die Haut auf die Besiedlung mit Mikroorganismen reagiert und wie sie zwischen "harmlosen" und pathogenen Keimen differenziert, ist weitgehend unbekannt.The expression of the genes in differentiated cells of the skin is not constant, but very dynamic. Extracellular stimuli act on the transcription of living cells via partially complex signal transduction cascades. The regulation of transcription in response to extracellular signals is called stimulus-transcription coupling. An environmental stimulus that the skin is constantly confronted with is contact with microorganisms. This includes both harmless or useful and potentially pathogenic germs that are responsible for skin infections. How the skin reacts to colonization with microorganisms and how it differentiates between "harmless" and pathogenic germs is largely unknown.
Jeder Zelltyp der Haut exprimiert ca. 15 000 verschiedene Gene und synthetisiert daraus entsprechend viele Proteine. Welche Gene davon für die Interaktion mit hautrelevanten Mikroorganismen von Bedeutung sind, ist kaum erforscht.Each cell type in the skin expresses around 15,000 different genes and synthesizes a corresponding number of proteins from it. Little research has been carried out into which genes are important for the interaction with skin-relevant microorganisms.
Aus Kagnoff MF und Eckmann L, Curr Opin Microbiol 2001, 4:246-250, ist bekannt, Gen-Expressionsprofile zur Erforschung der Interaktion zwischen Wirtsorganismus und mikrobiellem Pathogen einzusetzen. Unter anderem wird der Einsatz von SAGE, TOGA und DNA-Microarrays vorgeschlagen.From Kagnoff MF and Eckmann L, Curr Opin Microbiol 2001, 4: 246-250, it is known to use gene expression profiles to research the interaction between host organism and microbial pathogen. Among other things, the use of SAGE, TOGA and DNA microarrays is proposed.
Weitgehend ähnliche Ansätze sind den Publikationen Kellam P, Genome Biology 2000, 1(2):reviews1009.1-1009.4; Manger ID und Relman DA, Curr Opin Immunol 2000, 12:215-218 und Yowe D et al., Microbes and Infection 2001 , 3:813-821 zu entnehmen.Extensively similar approaches are the publications Kellam P, Genome Biology 2000, 1 (2): reviews1009.1-1009.4; Manger ID and Relman DA, Curr Opin Immunol 2000, 12: 215-218 and Yowe D et al., Microbes and Infection 2001, 3: 813-821.
Der Stand der Technik erschöpft sich allerdings in der nur mit enormem Aufwand umsetzbaren Anregung, die Expressionsprofile mikrobiell infizierter Zellen mit denen nicht infizierter Zellen eines Gewebetyps zu vergleichen. Die bislang vorliegenden Studien werden als "proof-of-concept experiments" bezeichnet, beispielsweise in Manger ID und Relman DA, Curr Opin Immunol 2000, 12:216, rechte Spalte, letzter Absatz.The state of the art is exhausted, however, in the suggestion, which can only be implemented with enormous effort, of comparing the expression profiles of microbially infected cells with those of uninfected cells of a tissue type. The studies available so far are referred to as "proof-of-concept experiments", for example in Manger ID and Relman DA, Curr Opin Immunol 2000, 12: 216, right column, last paragraph.
Ein praktisch durchführbares Verfahren zur Identifikation der Gene, die in Folge einer mikrobiellen Infektion der Haut einer spezifischen Regulation unterworfen werden, ist bislang nicht beschrieben worden. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Identifikation der Gene bereitzustellen, die in Folge einer mikrobiellen Infektion der Haut einer spezifischen Regulation unterworfen werden, das die genannten Nachteile des Standes der Technik überwindet.A practically feasible method for identifying the genes which are subjected to specific regulation as a result of a microbial infection of the skin has not yet been described. The present invention is therefore based on the object of providing a method for identifying the genes which are subjected to specific regulation as a result of a microbial infection of the skin and which overcomes the disadvantages of the prior art mentioned.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß manThis object is achieved according to the invention by a method for identifying infection-specifically regulated genes of the skin in vitro, which is characterized in that
a) ein erstes Gemisch von in mikrobiell infizierter Haut exprimierten genetisch codierten Faktoren gewinnt, b) ein zweites Gemisch von in nicht infizierter Haut exprimierten genetisch codierten Faktoren gewinnt, c) die in a) und b) gewonnenen Gemische mit Hilfe eines hautspezifische Sonden enthaltenden Biochips analysiert und d) die Analyseergebnisse miteinander vergleicht und dadurch die in mikrobiell infizierter Haut bzw. in nicht infizierter Haut exprimierten Gene identifiziert und ihre Expression quantifiziert.a) a first mixture of genetically encoded factors expressed in microbially infected skin is obtained, b) a second mixture of genetically encoded factors expressed in non-infected skin is obtained, c) the mixtures obtained in a) and b) using a biochip containing skin-specific probes analyzed and d) comparing the analysis results with one another, thereby identifying the genes expressed in microbially infected skin or in non-infected skin and quantifying their expression.
Unter "exprimierten genetisch codierten Faktoren" werden erfindungsgemäß Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen verstanden.According to the invention, “expressed genetically coded factors” mean proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff "Haut" natürliche Haut von Menschen oder Tieren, die gentechnisch humanisierte Haut eines Tieres und auch ein sogenanntes Hautmodell auf der Basis menschlicher und/oder tierischer Hautzellen. Außerdem umfaßt der Begriff "Haut" alle epithelialen Deckgewebe bei Mensch und Tier, einschließlich der Kopfhaut und der Schleimhäute, z. B. der Mundschleimhaut oder der Vaginalschleimhaut.In the context of the present invention, the term “skin” encompasses natural skin from humans or animals, the genetically humanized skin of an animal and also a so-called skin model based on human and / or animal skin cells. In addition, the term "skin" includes all epithelial covering tissues in humans and animals, including the scalp and mucous membranes, e.g. B. the oral mucosa or the vaginal mucosa.
Ein erfindungsgemäß besonders geeignetes Hautmodell ist unter der Bezeichnung "SkinEthic® reconstituted human epithelial tissue" (Fa. SkinEthic, Frankreich) bekannt. Hierbei handelt es sich um ein dreidimensionales rekonstruiertes humanes Epithelialmodell. Das Modell wird aus transformierten humanen Keratinozyten (TR146) aus Plattenepithelkarzinom hergestellt. Die Keratinozyten werden auf einem inerten Polycarbonatfilter in einem definierten Medium kultiviert. Dabei bildet sich ein Epithel ohne Stratum Corneum aus, das die Eigenschaften des epithelialen Teils der humanen Cornea besitzt.A skin model which is particularly suitable according to the invention is known under the name "SkinEthic® reconstituted human epithelial tissue" (SkinEthic, France). This is a three-dimensional reconstructed human epithelial model. The model is made from transformed human keratinocytes (TR146) from squamous cell carcinoma. The keratinocytes are cultivated on an inert polycarbonate filter in a defined medium. An epithelium without stratum corneum forms, which has the properties of the epithelial part of the human cornea.
Erfindungsgemäß geeignete hautspezifische Sonden sind insbesondere die in den zum Anmeldetag der vorliegenden Patentanmeldung noch unveröffentlichten Patentanmeldungen PCT/EP01/15179 und DE-A-101 00 127.4-41 genannten Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in Haut stärker oder schwächer (d. h. differentiell) exprimiert werden als in anderen Geweben.Skin-specific probes suitable according to the invention are, in particular, the probes mentioned in the patent applications PCT / EP01 / 15179 and DE-A-101 00 127.4-41, which were not yet published on the filing date of the present patent application, and which are used for specific binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments are capable of proteins or mRNA molecules that are expressed more or less (ie differentially) in skin than in other tissues.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist bei Infektion mit jedem Erreger anwendbar, der Haut befallen kann. Bevorzugt sind jedoch mikrobielle Erreger, die ausgewählt sind unter Pilzen und Bakterien, insbesondere unter den Pilzen Candida albicans, Candida glabrata, Candida dubliniensis, Candida tropicalis, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Microsporum canis, Epidermophyton floccosum und Malassezia furfur sowie unter den Bakterien Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Propionibacterium acnes, Streptococcus mutans und Corynebacterium xerosis.The method according to the invention can be used in the case of infection with any pathogen which can affect the skin. However, preference is given to microbial pathogens which are selected from fungi and bacteria, in particular from the fungi Candida albicans, Candida glabrata, Candida dubliniensis, Candida tropicalis, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Microsporum canis, Epidermophyton floccosum and Malassezia aurfusoccus staurfusoccus bacteria , Staphylococcus epidermis, Propionibacterium acnes, Streptococcus mutans and Corynebacterium xerosis.
Vorzugsweise gewinnt man in den Schritten a) und b) des Verfahrens zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut die jeweiligen Gemische aus einer Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe oder aus einer Epidermisprobe. Hierbei liefert die Vollhautprobe Exemplare aller in der Haut repräsentierten Zelltypen. Die Epidermisprobe ist hingegen leichter zu gewinnen, beispielsweise durch Aufbringen eines Klebebandes auf die Haut und Abreißen desselben, wie in der WO 00/10579 beschrieben, auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut gewinnt man in den Schritten a) und b) die jeweiligen Gemische mittels Mikrodialyse. Die Technik der Mikrodialyse wird beispielsweise in "Microdialysis: A method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161:12 1735-8; sowie in "Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption studies", Anderson, C. et al. ; Drugs Pharm. Sei., 1998, 91, 231- 244; und auch im Internet unter http://www.microdialysis.se/techniqu.htm beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.In steps a) and b) of the method for identifying infection-specifically regulated genes of the skin, the respective mixtures are preferably obtained from a skin sample, in particular from a whole skin sample or from an epidermis sample. The whole skin sample provides copies of all cell types represented in the skin. The epidermis sample, on the other hand, is easier to obtain, for example by applying an adhesive tape to the skin and tearing it off, as described in WO 00/10579, to which reference is hereby made in full. In a further embodiment of the method according to the invention for identifying infection-specifically regulated genes of the skin, the respective mixtures are obtained in steps a) and b) by means of microdialysis. The microdialysis technique is described, for example, in "Microdialysis: A method for measuring local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161: 12 1735-8; as well as in "Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption studies", Anderson, C. et al. ; Drugs Pharm. Sci., 1998, 91, 231-244; and also described on the Internet at http://www.microdialysis.se/techniqu.htm, to which reference is hereby made in full.
Bei der Anwendung der Mikrodialyse führt man typischerweise eine Sonde in die Haut ein und beginnt mit einer geeigneten Trägerlösung die Sonde langsam zu spülen. Nach dem Abklingen der akuten Reaktionen nach dem Einstich liefert die Mikrodialyse Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die im extrazellulären Raum vorkommen und die, beispielsweise durch Fraktionierung der Trägerflüssigkeit, dann in vitro isoliert und analysiert werden können. Die Mikrodialyse ist weniger invasiv, als die Entnahme einer Vollhautprobe; sie ist aber nachteiligerweise auf die Gewinnung im extrazelulären Raum vorkommender Verbindungen beschränkt.When using microdialysis, a probe is typically inserted into the skin and the probe is slowly rinsed with a suitable carrier solution. After the acute reactions have subsided after the puncture, the microdialysis provides proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which occur in the extracellular space and which can then be isolated and analyzed in vitro, for example by fractionation of the carrier liquid. Microdialysis is less invasive than taking a full skin sample; however, it is disadvantageously limited to the extraction of compounds occurring in the extracellular space.
Ein in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens einsetzbarer Biochip umfasst i. einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und ii. auf diesem immobilisierte hautspezifische Sonden, wie in den zum Anmeldetag der vorliegenden Patentanmeldung noch unveröffentlichten Patentanmeldungen PCT/EP01/15179 und DE-A-101 00 127.4-41 genannt, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in Haut stärker oder schwächer (d. h. differentiell) exprimiert werden als in anderen Geweben.A biochip that can be used in step c) of the method according to the invention comprises i. a firm, d. H. rigid or flexible beams and ii. on this immobilized skin-specific probes, as mentioned in the as yet unpublished patent applications PCT / EP01 / 15179 and DE-A-101 00 127.4-41, which are used for specific binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of Proteins or mRNA molecules are capable, which are expressed more or less (ie differentially) in skin than in other tissues.
Erfindungsgemäß bevorzugt einsetzbar ist ein Biochip zur Identifikation von durch eine Infektion mit Candida, insbesondere Candida albicans, infektionsspezifisch regulierten Genen der menschlichen Haut in vitro, umfassend i. einen Träger und ii. auf diesem immobilisierte hautspezifische Sonden, die zur spezifischenAccording to the invention, a biochip for identifying genes of the human skin regulated by infection by infection with Candida, in particular Candida albicans, is preferably used in vitro i. a carrier and ii. immobilized on this skin-specific probes that are used for specific
Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in in Tabelle 1 , Gruppen 1 bis 5, insbesondere Gruppen 3 bis 5, vorzugsweise Gruppen 4 und 5, besonders bevorzugt in Gruppe 5 aufgeführt und durch ihre UniGene Accession Number definiert sind; ganz besonders bevorzugt, die in den Tabellen 2 bis 8 aufgeführt sind.Binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are listed in Table 1, groups 1 to 5, in particular groups 3 to 5, preferably groups 4 and 5, particularly preferably in group 5 and are defined by their UniGene Accession Number; very particularly preferred, which are listed in Tables 2 to 8.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt einsetzbar ist ein Biochip, der zusätzlich zu den obengenannten Sonden weitere Sonden umfaßt, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die durch Transkription und/oder Translation in dem Fachmann bekannter Weise aus den Genen abgeleitet werden können, die in Liste 1 aufgeführt sind.According to the invention, a biochip can be used with particular preference which, in addition to the above-mentioned probes, comprises further probes which are capable of specific binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are transcribed and / or translated into the person skilled in the art can be derived from the genes listed in List 1.
Bei einem BioChip handelt es sich um ein miniaturisiertes Funktionselement mit auf einer Oberfläche immobilisierten Molekülen, insbesondere Biomolekülen, die als spezifische Interaktionspartner dienen können.A BioChip is a miniaturized functional element with molecules immobilized on a surface, in particular biomolecules, which can serve as specific interaction partners.
Häufig weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf; man spricht dann von Chip-"Arrays". Da tausende von biologischen bzw. biochemischen Funktionselementen auf einem Chip angeordnet sein können, müssen diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt werden. Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere in Frage: DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten können z. B. Einzelstränge, Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide, Peptide, Proteine (z. B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren) und Derivate der kombinatorischen Chemie (z. B. organische Moleküle). Im allgemeinen haben BioChips eine 2D-Basisfläche für das Beschichten mit biologisch oder biochemisch funktioneilen Materialien. Die Basisflächen können beispielweise auch von Wänden einer oder mehrerer Kapillaren oder von Kanälen gebildet sein. Zum Stand der Technik kann z. B. auf folgende Publikationen hingewiesen werden: Nature Genetics, Vol. 21 , Supplement (Gesamt), Jan. 1999 (BioChips); Nature Biotechnology, Vol. 16, S. 981-983, Okt. 1998 (BioChips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, S. 301-306, Jul. 1998 (BioChips) sowie die bereits genannten Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: "Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und "Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827 - 836 (2000), und die dort angegebenen Referenzen, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.The structure of these functional elements often has rows and columns; one then speaks of chip "arrays". Since thousands of biological or biochemical functional elements can be arranged on a chip, they usually have to be manufactured using microtechnical methods. The following are particularly suitable as biological and biochemical functional elements: DNA, RNA, PNA (in the case of nucleic acids and their chemical derivatives, for example, single strands, triplex structures or combinations thereof), saccharides, peptides, proteins (for example antibodies) , Antigens, receptors) and derivatives of combinatorial chemistry (e.g. organic molecules). In general, BioChips have a 2D base area for coating with biologically or biochemically functional materials. The base surfaces can also be formed, for example, by walls of one or more capillaries or by channels. The prior art can e.g. For example, reference is made to the following publications: Nature Genetics, Vol. 21, Supplement (overall), Jan. 1999 (BioChips); Nature Biotechnology, Vol. 16, pp. 981-983, Oct. 1998 (BioChips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, pp. 301-306, Jul. 1998 (BioChips) as well as the previously mentioned reviews by Akhilesh Pandey and Matthias Mann: "Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), and "Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827-836 (2000), and the references given therein, to which reference is hereby made in full.
Eine übersichtliche Darstellung der praktischen Anwendungsverfahren der DNA- Chiptechnologie liefern die Bücher "DNA Microarrays: A Practical Approach" (Editor: Mark Schena, 1999, Oxford University Press) und "Microarray Biochip Technology" (Editor: Mark Schena, 2000, Eaton Publishing), auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.The books "DNA Microarrays: A Practical Approach" (editor: Mark Schena, 1999, Oxford University Press) and "Microarray Biochip Technology" (editor: Mark Schena, 2000, Eaton Publishing) provide a clear overview of the practical application methods of DNA chip technology. , to which reference is hereby made in full.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte DNA- Chiptechnologie beruht auf der Fähigkeit von Nukleinsäuren komplementäre Basenpaarungen einzugehen. Dieses als Hybridisierung bezeichnete technische Prinzip wird bereits seit Jahren bei der Southern-Blot- und Northern-Blot-Analyse eingesetzt. Im Vergleich zu diesen herkömmlichen Methoden, bei denen lediglich einige wenige Gene analysiert werden, gestattet es die DNA-Chiptechnologie einige hundert bis zu mehreren zehntausend Genen parallel zu untersuchen. Ein DNA-Chip besteht im wesentlichen aus einem Trägermaterial (z.B. Glas oder Kunststoff), auf dem einzelsträngige, genspezifische Sonden in hoher Dichte an einer definierten Stelle (Spot) immobilisiert werden. Als problematisch wird dabei die Technik der Sonden-Applikation und die Chemie der Sonden-Immobilisierung eingeschätzt.The DNA chip technology which is particularly preferred in the context of the present invention is based on the ability of nucleic acids to enter into complementary base pairings. This technical principle, known as hybridization, has been used in Southern blot and Northern blot analysis for years. Compared to these conventional methods, in which only a few genes are analyzed, DNA chip technology allows a few hundred to several tens of thousands of genes to be examined in parallel. A DNA chip essentially consists of a carrier material (e.g. glass or plastic) on which single-stranded, gene-specific probes are immobilized in a high density at a defined location (spot). The technique of probe application and the chemistry of probe immobilization are considered problematic.
Nach dem derzeitigen Stand der Technik sind mehrere Wege der Sonden- Immobilisierung realisiert:According to the current state of the art, several ways of immobilizing probes are realized:
E.M. Southern (E.M. Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-1684 und E.M. Southern et al. ( 1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) beschreibt die Herstellung von Oligonukleotidanordnungen durch direkte Synthese an einer Glasoberfläche, die mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und anschließend mit einem Glycol derivatisiert wurde.EM Southern (EM Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-1684 and EM Southern et al. (1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) describes the preparation of oligonucleotide arrangements by direct synthesis on a glass surface which has been derivatized with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane and then with a glycol.
Ein ähnliches Verfahren realisiert die in situ Synthese von Oligonukleotiden mittels einer photosensitiven, kombinatorischen Chemie, die mit photolithographischen Techniken verglichen werden kann (Pease, A.C. et al. (1994), Proc. NatI Acad Sei USA 91, 5022-5026).A similar process realizes the in situ synthesis of oligonucleotides using a photosensitive, combinatorial chemistry that can be compared with photolithographic techniques (Pease, A.C. et al. (1994), Proc. NatI Acad Sei USA 91, 5022-5026).
Neben diesen auf der in s/Yu-Synthese von Oligonukleotiden beruhenden Techniken können ebenso bereits vorhandene DNA-Moleküle an Oberflächen von Trägermaterial gebunden werden.In addition to these techniques, which are based on s / Yu synthesis of oligonucleotides, existing DNA molecules can also be bound to surfaces of support material.
P.O. Brown (DeRisi et al. (1997), Science 278, 680-686) beschreibt die Immobilisierung von DNA an mit Polylysin beschichteten Glasoberflächen. Die Veröffentlichung von L.M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acid Research 22, 5456-5465) legt ein ähnliches Verfahren offen: Oligonukleotide, die eine 5'terminale Aminogruppe tragen, können an eine Glasoberfläche gebunden werden, die mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1,4-Phenyl- diisothioeyanat behandelt wurde.P.O. Brown (DeRisi et al. (1997), Science 278, 680-686) describes the immobilization of DNA on glass surfaces coated with polylysine. The publication of L.M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acid Research 22, 5456-5465) discloses a similar procedure: oligonucleotides bearing a 5'-terminal amino group can be bound to a glass surface which is coated with 3-aminopropyltrimethoxysilane and then treated with 1,4-phenyl diisothioeyanate.
Die Applikation der DNA-Sonden auf einem Träger kann mit einem sogenannten "Pin-Spotter" erfolgen. Dazu tauchen dünne Metallnadeln mit z.B. einem Durchmesser von 250 μm, in Sondenlösungen ein und überführen anschließend das anhängende Probenmaterial mit definierten Volumina auf das Trägermaterial des DNA-Chips.The DNA probes can be applied to a carrier using a so-called "pin spotter". Thin metal needles with e.g. with a diameter of 250 μm, in probe solutions and then transfer the attached sample material with defined volumes to the carrier material of the DNA chip.
Bevorzugterweise erfolgt die Sondenapplikation jedoch mittels eines piezogesteuerten Nanodispensers, der ähnlich einem Tintenstrahldrucker, Sondenlösungen mit einem Volumen von 100 Picolitern kontaktfrei auf die Oberfläche des Trägermaterials aufbringt.However, the probe is preferably applied by means of a piezocontrolled nanodispenser, which, like an inkjet printer, applies probe solutions with a volume of 100 picoliters to the surface of the carrier material without contact.
Die Immobilisierung der Sonden erfolgt z.B. wie in der EP-A-0 965 647 beschrieben: Die Generierung von DNA-Sonden erfolgt hierbei mittels PCR unter Verwendung eines sequenzspezifischen Primerpaares, wobei ein Primer am 5'- Ende modifiziert ist und einen Linker mit einer freien Aminogruppe trägt. Damit ist sichergestellt, dass ein definierter Strang der PCR-Produkte an einer Glasoberfläche gebunden werden kann, welche mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1 ,4-Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde. Die genspezifischen PCR-Produkte sollen idealerweise eine definierte Nukleinsäuresequenz in einer Länge von 200-400 bp haben und nicht redundante Sequenzen beinhalten. Nach der Immobilisierung der PCR-Produkte über den derivatisierten Primer wird der Gegenstrang des PCR-Produkts durch eine Inkubation bei 96°C für 10 Min entfernt.The probes are immobilized, for example, as described in EP-A-0 965 647: DNA probes are generated here by means of PCR under Use of a sequence-specific pair of primers, a primer being modified at the 5 'end and carrying a linker with a free amino group. This ensures that a defined strand of the PCR products can be bound to a glass surface which has been treated with 3-aminopropyltrimethoxysilane and then with 1,4-phenyldiisothiocyanate. The gene-specific PCR products should ideally have a defined nucleic acid sequence with a length of 200-400 bp and contain non-redundant sequences. After the immobilization of the PCR products via the derivatized primer, the counter strand of the PCR product is removed by incubation at 96 ° C. for 10 minutes.
In einer für DNA-Chips typischen Anwendung wird mRNA aus zwei zu vergleichenden Zellpopulationen isoliert. Die isolierten mRNAs werden mittels reverser Transkription unter Verwendung von z.B. fluoreszenzmarkierten Nukleotiden in cDNA umgewandelt. Dabei werden die zu vergleichenden Proben mit z.B. rot bzw. grün fluoreszierenden Nukleotiden markiert. Die cDNAs werden dann mit den auf dem DNA-Chip immobilisierten Gensonden hybridisiert und anschließend die gebundenen Fluoreszenzen quantifiziert.In a typical application for DNA chips, mRNA is isolated from two cell populations to be compared. The isolated mRNAs are reverse transcribed using e.g. fluorescence-labeled nucleotides converted into cDNA. The samples to be compared are e.g. marked with red or green fluorescent nucleotides. The cDNAs are then hybridized with the gene probes immobilized on the DNA chip and the bound fluorescence is then quantified.
Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt 1 bis etwa 5000, bevorzugtermaßen 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Sonden. Die voneinander verschiedenen Sonden können jeweils in mehrfacher Kopie auf dem Chip vorhanden sein.The biochip according to the invention preferably comprises 1 to approximately 5000, preferably 1 to approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 500, preferably approximately 10 to approximately 250, particularly preferably approximately 10 to approximately 100 and very particularly preferably approximately 10 to approximately 50 different probes. The probes, which differ from one another, can each be present in duplicate on the chip.
Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt Nukleinsäuresonden, insbesondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden. Die Nukleinsäuresonden weisen bevorzugt eine Länge von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden auf. In einer weiteren bevorzugten Form umfasst der erfindungsgemäße Biochip Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.The biochip according to the invention preferably comprises nucleic acid probes, in particular RNA or PNA probes, particularly preferably DNA probes. The nucleic acid probes preferably have a length of approximately 10 to approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 800, preferably approximately 100 to approximately 600, particularly preferably approximately 200 to approximately 400 nucleotides. In a further preferred form, the biochip according to the invention comprises peptide or protein probes, in particular antibodies.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen mikrobielle Infektionen der Haut in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß manAnother object of the present invention is a test method for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin in vitro, characterized in that
a) den Hautstatus mikrobiell infizierter Haut durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut bestimmt, b) einen Wirkstoff gegen mikrobielle Infektionen der Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.a) determines the skin status of microbially infected skin by means of a method according to the invention for identifying infection-specifically regulated genes of the skin, b) applies an active substance against microbial infections of the skin to the skin one or more times, c) again the skin status by means of a method according to the invention for identifying infection-specifically regulated skin Genes of the skin are determined, and d) the effectiveness of the active ingredient is determined by comparing the results from a) and c).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen mikrobielle Infektionen der Haut in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Testverfahrens.Another object of the present invention is a test kit for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin in vitro, comprising means for carrying out the test method according to the invention.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen mikrobielle Infektionen der Haut in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus mikrobiell infizierter Haut durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen mikrobielle Infektionen der Haut in vitro bestimmt, b) einen potentiellen Wirkstoff gegen mikrobielle Infektionen der Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen mikrobielle Infektionen der Haut in vitro bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.Another object of the present invention is a screening method for the identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin in vitro, characterized in that a) the skin status of microbially infected skin is determined by an inventive method for the identification of infection-specific regulated genes of the skin or determined in vitro using a test kit according to the invention for the detection of the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin, b) applying a potential active substance against microbial infections of the skin to the skin one or more times, c) the skin status is determined again in vitro by a method according to the invention for identifying infection-specifically regulated genes of the skin or by means of a test kit according to the invention for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin, and d) the effectiveness of the active substance by the Comparison of the results from a) and c) determined.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen mikrobielle Infektionen der Haut, dadurch gekennzeichnet, daß man a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening- Verfahrens bestimmt und b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.Another object of the present invention is a method for producing a cosmetic or pharmaceutical preparation against microbial infections of the skin, characterized in that a) active ingredients are determined using the screening method according to the invention and b) active ingredients found to be effective with cosmetic and pharmacological suitable and compatible carriers mixed.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Biochips nach einem der Ansprüche 7 bis 13 zur Durchführung von in vitro Maßnahmen zur Identifikation, Prophylaxe, Therapie und Therapiekontrolle von mikrobiellen Hauterkrankungen.Another object of the invention is the use of biochips according to one of claims 7 to 13 for carrying out in vitro measures for the identification, prophylaxis, therapy and therapy control of microbial skin diseases.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:The following example explains the invention without, however, restricting it:
Ermittlung von differenziell exprimierten Hautgenen infolge einer Infektion mit C. albicansDetermination of differentially expressed skin genes due to infection with C. albicans
Zellen von C. albicans (SC5314) wurden über Nacht bei 30°C in Minimalmedium (0,67% Yeast Nitrogen Base, 2% Glukose) angezogen, abzentrifugiert und in PBS resuspendiert, so dass sich eine Zelldichte von 4x107 ergab. Mit 50μl dieser Suspension wurden Hautmodelle (Fa. Skinethics) überschichtet und 6h bzw. 24h inkubiert (37°C, 100% rLF, 5% CO2). Als Kontrolle wurden mit PBS überschichtete Hautmodelle mitinkubiert. Die entsprechenden Hautmodelle wurden entweder für histologische Schnitte in Formalin eingelegt, oder für die spätere Präparation der RNA bei -20°C gelagert. Die Durchführung der histologischen Untersuchungen und der RNA-Präparation erfolgte nach Standardmethoden. Aus der RNA synthetisierte cDNA wurde verwendet, um DNA-Microarrays zu hybridisieren, so dass eine differenzielle Expression von Hautgenen infolge der Candida-Infektion ermitttelt werden konnte.C. albicans (SC5314) cells were grown overnight at 30 ° C. in minimal medium (0.67% yeast nitrogen base, 2% glucose), centrifuged and resuspended in PBS, so that a cell density of 4x10 7 resulted. Skin models (from Skinethics) were overlaid with 50 μl of this suspension and incubated for 6 or 24 hours (37 ° C., 100% RH, 5% CO 2 ). As a control, PBS was overlaid Incorporated skin models. The corresponding skin models were either placed in formalin for histological sections or stored at -20 ° C for the later preparation of the RNA. The histological examinations and the RNA preparation were carried out according to standard methods. CDNA synthesized from the RNA was used to hybridize DNA microarrays, so that a differential expression of skin genes due to the Candida infection could be determined.
Wie die histologischen Schnitte zeigen, befinden sich nach 6h zahlreiche hyphale Candida-Zellen an der Oberfläche des Hautmodells, das histologisch weitgehend unversehrt erscheint. Nach 24h haben die Hyphen die Zellschicht jedoch vollständig durchdrungen. (Abb.1)As the histological sections show, after 6 hours there are numerous hyphal Candida cells on the surface of the skin model, which appears largely intact histologically. After 24 hours, however, the hyphae completely penetrated the cell layer. (Fig.1)
Die DNA-Array Daten zeigen eine differenzielle Expression zahlreicher Gene bereits nach 6h Inkubation. Die exakten Werte der Repression bzw. Induktion sind der Tabelle 9 zu entnehmen. Der Variationskoeffizient gibt die Streuung aus den Parallelmessungen an (Alle Versuche wurden in Doppelbestimmungen durchgeführt). The DNA array data show a differential expression of numerous genes after 6 hours of incubation. The exact values of repression or induction can be found in Table 9. The coefficient of variation indicates the scatter from the parallel measurements (all tests were carried out in duplicate).
Abb. 1.: in vitro Infektion von Hautmodellen mit C. albicansFig. 1 .: In vitro infection of skin models with C. albicans
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Tabellen und Listen:Tables and lists:
Tabelle 1 zeigt die Expressionsprofile infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut nach einer Infektion mit Candida albicans (nach 6 bzw. 24 Stunden nach der Infektion), eingeteilt nach dem Grad der differentiellen Expression in 5 Gruppen, wobei Gruppe 1 schwach differentiell exprimierte und Gruppe 5 besonders stark differentiell exprimierte Gene beinhaltet, d.h. ein nach dem Betrag niedriger Wert steht in Gruppe 1 , ein hoher in 5.Table 1 shows the expression profiles of infection-specifically regulated genes of the skin after infection with Candida albicans (after 6 or 24 hours after the infection), divided into 5 groups according to the degree of differential expression, group 1 expressing weakly differentially and group 5 particularly strongly contains differentially expressed genes, ie a lower value in group 1, a high one in group 5.
In Gruppe 1 der Tabelle 1 sind alle Gene aufgelistet, die nach 6-stündiger oder 24- stündiger Inkubationmindestens 1,5-fach und weniger als 2,6-fach differentiell exprimiert sind. In Gruppe 2 der Tabelle 1 sind alle Gene aufgelistet, die nach 24-stündiger Inkubation mindestens 2,6-fach differentiell exprimiert sind. In Gruppe 3 der Tabelle 1 sind alle Gene aufgelistet, die nach 6-stündiger Inkubation mindestens 2,6-fach und weniger als 7,0-fach differentiell exprimiert sind. In Gruppe 4 der Tabelle 1 sind alle Gene aufgelistet, die die nach 6-stündiger Inkubation mindestens 7,1 -fach und weniger als 10,0-fach differentiell exprimiert sind.Group 1 of Table 1 lists all genes that are differentially expressed at least 1.5 times and less than 2.6 times after 6 hours or 24 hours of incubation. Group 2 of Table 1 lists all genes that are at least 2.6-fold differentially expressed after 24 hours of incubation. Group 3 of Table 1 lists all genes which are expressed differentially at least 2.6-fold and less than 7.0-fold after 6 hours of incubation. Group 4 of Table 1 lists all genes that are differentially expressed at least 7.1 times and less than 10.0 times after 6 hours of incubation.
In Gruppe 5 der Tabelle 1 sind alle Gene aufgelistet, die die nach 6-stündigerIn group 5 of table 1 all genes are listed, those after 6 hours
Inkubation mindestens 10,1 -fach oder nach 24-stündiger Inkubation mindestensIncubation at least 10.1 times or at least after 24 hours of incubation
100-fach differentiell exprimiert sind.Are expressed 100-fold differentially.
Die Quotienten in Spalte 5 und 6 der Tabelle 1 geben die Stärke der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige Gen in infizierter Haut stärker exprimiert wird, als in nicht infizierter Haut, oder umgekehrt.The quotients in columns 5 and 6 of Table 1 indicate the level of differential expression, i. i.e. by which factor the respective gene is expressed more strongly in infected skin than in non-infected skin, or vice versa.
Unter ihrer UniGene-Accession-Number sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.The respective genes or gene products are disclosed in the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) under their UniGene Accession Number. This database is accessible on the Internet at the following address: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Die Gene bzw. Genprodukte sind außerdem unter den Internet-Adressen httD://www.ncbi.nlm.nih.qov/UniGene/Hs.Home.html oder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/qenome/auide direkt zugänglich. Die Tabellen 2 bis 8 stellen Untermengen der Tabelle 1 dar und erläutern die Bedeutung einiger differentiell exprimierter Gene nach einer Candida-Infektion. Die in den Tabellen 2 bis 8 beschriebenen Effekte sind als besonders wichtig einzuordnen, da sie in keiner Weise vorhersehbar waren. Diese sind im einzelnen:The genes or gene products are also available at the Internet addresses httD: //www.ncbi.nlm.nih.qov/UniGene/Hs.Home.html or http://www.ncbi.nlm.nih.gov/qenome/ auide directly accessible. Tables 2 to 8 represent subsets of Table 1 and explain the meaning of some differentially expressed genes after a Candida infection. The effects described in Tables 2 to 8 are particularly important because they were in no way predictable. These are in detail:
Tabelle 2: Candida induziert die Expression von Rezeptoren, die zur Anheftung an die Wirtszelloberfläche dienen könnenTable 2: Candida induces the expression of receptors that can serve for attachment to the host cell surface
Tabelle 3: Candida reguliert die Sekretion herabTable 3: Candida down-regulates secretion
Tabelle 4: Candida reguliert die Fettsäureoxidation herabTable 4: Candida down-regulates fatty acid oxidation
Tabelle 5: Candida induziert/reprimiert Stressantworten, die sonst durch andere Faktoren induziert werdenTable 5: Candida induces / represses stress responses that are otherwise induced by other factors
Tabelle 6: Candida-Infektionen führen zu gleichen Expressionsveränderungen wie TumorenTable 6: Candida infections lead to the same expression changes as tumors
Tabelle 7: Candida reguliert unbekannte Gene/ nicht charakterisierte ProteineTable 7: Candida regulates unknown genes / uncharacterized proteins
Tabelle 8: weitere überraschende EffekteTable 8: other surprising effects
Tabelle 9 zeigt die differenzielle Expression zahlreicher Gene aus dem obengenannten Ausführungsbeispiel. Der Variationskoeffizient gibt hierbei die Streuung aus den Parallelmessungen an (Alle Versuche wurden in Doppelbestimmungen durchgeführt).Table 9 shows the differential expression of numerous genes from the above embodiment. The coefficient of variation indicates the scatter from the parallel measurements (all tests were carried out in duplicate).
Liste 1 gibt die eindeutigen und in der Literatur verwendeten Bezeichnungen der bislang bekannten Virulenzgene von Candida albicans an, wie in Calderone und Fonzi, Vol 9, No. 7, 2001 , Trends in Microbiology, 327 ff, sowie den in diesem Übersichtsartikel zitierten Referenzen beschrieben, auf die hiermit vollumfänglich Bezug genommen wird. List 1 gives the unique and used names in the literature of the previously known virulence genes of Candida albicans, as in Calderone and Fonzi, Vol 9, No. 7, 2001, Trends in Microbiology, 327 ff, as well as in this References cited in overview articles, to which reference is hereby made in full.
Tabelle 1:Table 1:
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Tabelle 2:Table 2:
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Tabelle 3:Table 3:
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Tabelle 4:Table 4:
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Tabelle 5:Table 5:
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Tabelle 6:Table 6:
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Tabelle 7:
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Table 7:
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Tabelle 8:Table 8:
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Tabelle 9:Table 9:
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Liste 1:List 1:
ADE2, ALS1, ALS3, ALS5. ALS8, CEK1, CHS2, CHT2, CLA4, COS1, CPH1. CPH2, CPP1, CRK1, CST20, CZF1, DDR48, EBP1, ECE1, ECE99, EFG1. EFH1, FL011, HK1. HOG1, HSP12, HST7, HWP1, HYR1, INT1, MCM1, MIG1, MKC1, MNT1, NRG1, PDE1, PHR1, PHR2, PKC1, PLB1, PLC1, PMT1, PMT4, PMT6, PRR1, PRR2, RAD6, RAS1, RBT1, RBT4, RBT5, RIM101, SAP1. SAP2, SAP3, SAP4, SAP5, SAP6, SAP7, SAP8, SLN1, TEC1. TPK1. TPK2, TUP1. URA3, WAP1.WH11 ADE2, ALS1, ALS3, ALS5. ALS8, CEK1, CHS2, CHT2, CLA4, COS1, CPH1. CPH2, CPP1, CRK1, CST20, CZF1, DDR48, EBP1, ECE1, ECE99, EFG1. EFH1, FL011, HK1. HOG1, HSP12, HST7, HWP1, HYR1, INT1, MCM1, MIG1, MKC1, MNT1, NRG1, PDE1, PHR1, PHR2, PKC1, PLB1, PLC1, PMT1, PMT4, PMT6, PRR1, PRR2, RAD6, RAS1, RB RBT4, RBT5, RIM101, SAP1. SAP2, SAP3, SAP4, SAP5, SAP6, SAP7, SAP8, SLN1, TEC1. TPK1. TPK2, TUP1. URA3, WAP1.WH11

Claims

Patentansprüche: claims:
1. Verfahren zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man1. A method for identifying infection-specific regulated genes of the skin in vitro, which is characterized in that
a) ein erstes Gemisch von in mikrobiell infizierter Haut exprimierten genetisch codierten Faktoren gewinnt, b) ein zweites Gemisch von in nicht infizierter Haut exprimierten genetisch codierten Faktoren gewinnt, c) die in a) und b) gewonnenen Gemische mit Hilfe eines hautspezifische Sonden enthaltenden Biochips analysiert und d) die Analyseergebnisse miteinander vergleicht und dadurch die in mikrobiell infizierter Haut bzw. in nicht infizierter Haut exprimierten Gene identifiziert und ihre Expression quantifiziert.a) a first mixture of genetically encoded factors expressed in microbially infected skin is obtained, b) a second mixture of genetically encoded factors expressed in non-infected skin is obtained, c) the mixtures obtained in a) and b) using a biochip containing skin-specific probes analyzed and d) comparing the analysis results with one another, thereby identifying the genes expressed in microbially infected skin or in non-infected skin and quantifying their expression.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in den Schritten a) und b) die jeweiligen Gemische aus einer Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe oder aus einer Epidermisprobe gewinnt.2. The method according to claim 1, characterized in that in steps a) and b) the respective mixtures from a skin sample, in particular from a whole skin sample or from an epidermis sample.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in den Schritten a) und b) die jeweiligen Gemische mittels Mikrodialyse gewinnt.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that in steps a) and b) the respective mixtures are obtained by means of microdialysis.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die hautspezifischen Sonden auf dem Biochip in Schritt c) ausgewählt sind unter den in den Patentanmeldungen PCT/EP01/15179 und DE-A-101 00 127.4-41 genannten Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in Haut stärker oder schwächer (d. h. differentiell) exprimiert werden als in anderen Geweben. 4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the skin-specific probes on the biochip in step c) are selected from the probes mentioned in the patent applications PCT / EP01 / 15179 and DE-A-101 00 127.4-41 which are used for are specifically capable of binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed more or less (ie differentially) in skin than in other tissues.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrobiellen Erreger ausgewählt sind unter Pilzen und Bakterien, insbesondere unter den Pilzen Candida albicans, Candida glabrata, Candida dubliniensis, Candida tropicalis, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Microsporum canis, Epidermophyton floccosum und Malassezia furfur sowie unter den Bakterien Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Propionibacterium acnes, Streptococcus mutans und Corynebacterium xerosis.5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the microbial pathogens are selected from fungi and bacteria, in particular from the fungi Candida albicans, Candida glabrata, Candida dubliniensis, Candida tropicalis, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Microsporum canis, Epidermophyton floccosum and Malassezia furfur and among the bacteria Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Propionibacterium acnes, Streptococcus mutans and Corynebacterium xerosis.
6. Test-Kit zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5.6. Test kit for identifying infection-specifically regulated genes of the skin in vitro, comprising means for carrying out the method according to one of claims 1 to 5.
7. Biochip zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut in vitro, umfassend i. einen Träger und ii. auf diesem immobilisierte hautspezifische Sonden, wie in den Patentanmeldungen PCT/EP01/15179 und DE-A-101 00 127.4-41 genannt, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen befähigt sind, die in Haut stärker oder schwächer (d. h. differentiell) exprimiert werden als in anderen Geweben.7. Biochip for the identification of infection-specific regulated genes of the skin in vitro, comprising i. a carrier and ii. on this immobilized skin-specific probes, as mentioned in patent applications PCT / EP01 / 15179 and DE-A-101 00 127.4-41, which are capable of specific binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are expressed more or less (ie differentially) in skin than in other tissues.
8. Biochip zur Identifikation von durch eine Infektion mit Candida, insbesondere Candida albicans infektionsspezifisch regulierten Genen der menschlichen Haut in vitro, umfassend8. Biochip for the identification of genes of the human skin regulated by infection by a Candida infection, in particular Candida albicans, in vitro
i. einen Träger und ii. auf diesem immobilisierte hautspezifische Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in in Tabelle 1 , Gruppen 1 bis 5, insbesondere Gruppen 3 bis 5, vorzugsweise Gruppen 4 und 5, besonders bevorzugt in Gruppe 5 aufgeführt und durch ihre UniGene Accession Number definiert sind; ganz besonders bevorzugt, die in den Tabellen 2 bis 8 aufgeführt sind.i. a carrier and ii. immobilized on this skin-specific probes which are capable of specific binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are in Table 1, groups 1 to 5, in particular Groups 3 to 5, preferably groups 4 and 5, particularly preferably listed in group 5 and defined by their UniGene Accession Number; very particularly preferred, which are listed in Tables 2 to 8.
9. Biochip nach Anspruch 7 oder 8, umfassend zusätzlich Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die durch Transkription und/oder Translation in dem Fachmann bekannter Weise aus den Genen abgeleitet werden können, die in Liste 1 aufgeführt sind.9. Biochip according to claim 7 or 8, additionally comprising probes which are capable of specific binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are characterized by transcription and / or translation in a manner known to the person skilled in the art can be derived from the genes listed in List 1.
10. Biochip nach einem der Ansprüche 7 bis 9, umfassend 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Sonden.10. Biochip according to one of claims 7 to 9, comprising 1 to approximately 5000, preferably 1 to approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 500, preferably approximately 10 to approximately 250, particularly preferably approximately 10 to approximately 100 and very particularly preferably approximately 10 up to about 50 different probes.
11. Biochip nach einem der Ansprüche 7 bis 10, umfassend Nukleinsäuresonden, insbesondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden.11. Biochip according to one of claims 7 to 10, comprising nucleic acid probes, in particular RNA or PNA probes, particularly preferably DNA probes.
12. Biochip nach Anspruch 11 , umfassend Sonden mit einer Länge von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden.12. Biochip according to claim 11, comprising probes with a length of approximately 10 to approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 800, preferably approximately 100 to approximately 600, particularly preferably approximately 200 to approximately 400 nucleotides.
13. Biochip nach einem der Ansprüche 7 bis 10, umfassend Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.13. Biochip according to one of claims 7 to 10, comprising peptide or protein probes, in particular antibodies.
14. Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen mikrobielle Infektionen der Haut in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus mikrobiell infizierter Haut durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut bestimmt, b) einen Wirkstoff gegen mikrobielle Infektionen der Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.14. Test method for proving the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin in vitro, characterized in that a) determines the skin status of microbially infected skin by a method according to one of claims 1 to 5 for the identification of infection-specifically regulated genes of the skin, b) applies an active ingredient against microbial infections of the skin to the skin one or more times, c) again the skin status by means of a Method according to one of claims 1 to 5 for identifying infection-specific regulated genes of the skin, and d) determining the effectiveness of the active ingredient by comparing the results from a) and c).
15. Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen mikrobielle Infektionen der Haut in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung des Testverfahrens gemäß Anspruch 14.15. Test kit for proving the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin in vitro, comprising means for carrying out the test method according to claim 14.
16.Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen mikrobielle Infektionen der Haut in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man16. Screening method for the identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against microbial infections of the skin in vitro, characterized in that
a) den Hautstatus mikrobiell infizierter Haut durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 15 bestimmt, b) einen potentiellen Wirkstoff gegen mikrobielle Infektionen der Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 15 bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt. a) determines the skin status of microbially infected skin by a method according to one of claims 1 to 5 or by means of a test kit according to claim 15, b) applies a potential active substance against microbial infections of the skin to the skin one or more times, c) again Skin status determined by a method according to any one of claims 1 to 5 or by means of a test kit according to claim 15, and d) the effectiveness of the active ingredient by comparing the results from a) and c).
17. Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen mikrobielle Infektionen der Haut, dadurch gekennzeichnet, daß man17. A method for producing a cosmetic or pharmaceutical preparation against microbial infections of the skin, characterized in that
a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des Screening-Verfahrens nach Anspruch 16 bestimmt und b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.a) active ingredients determined with the aid of the screening method according to claim 16 and b) active ingredients found to be effective are mixed with cosmetically and pharmacologically suitable and compatible carriers.
18. Verwendung von Biochips nach einem der Ansprüche 7 bis 13 zur Durchführung von in vitro Maßnahmen zur Identifikation, Prophylaxe, Therapie und Therapiekontrolle von mikrobiellen Hauterkrankungen. 18. Use of biochips according to one of claims 7 to 13 for carrying out in vitro measures for the identification, prophylaxis, therapy and therapy control of microbial skin diseases.
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