DE10100122A1 - Method for determining skin aging in vitro - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen in vitro, Test-Kits und Biochips zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung sowie die Verwendung von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA- Molekülen als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut; ferner ein Testverfah ren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung sowie ein Screening- Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstof fen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.The present invention relates to a method for determining skin stress and / or skin aging in humans in vitro, test kits and biochips for Determination of skin stress and / or skin aging and use of proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA Molecules as skin stress and / or aging markers; also a test procedure to prove the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical Active substances against skin stress and / or skin aging as well as a screening Process for the identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against skin stress and / or skin aging and a process for its manufacture a cosmetic or pharmaceutical preparation for skin stress and / or skin aging.
Die menschliche Haut ist ein sehr komplex aufgebautes Organ, welches aus einer Vielzahl verschiedener Zelltypen besteht. Der Metabolismus der lebenden Zellen ist nicht statisch sondern sehr dynamisch. In der Haut bemerken Zellen Veränderungen ihrer Umgebung (z. B. die Einstrahlung von Sonnenlicht) und reagieren darauf mit der Umstellung ihrer RNA- und/oder Proteinsyntheselei stungen.The human skin is a very complex organ, which consists of a variety of different cell types. The metabolism of the living Cells are not static but very dynamic. Cells notice in the skin Changes in their environment (e.g. exposure to sunlight) and react to this by changing their RNA and / or protein synthesis stungen.
Einige Moleküle werden nach einem Stresstimulus (z. B. Sonnenlicht) vermehrt synthetisiert (z. B. MMP-1), andere wiederum werden in einem geringerem Um fang produziert (z. B. Kollagen α1 (I)). Weiterhin wird bei einer Vielzahl der Syn theseprozesse keine signifikante Veränderung erfolgen (z. B. TIMP-1).Some molecules are increasingly synthesized after a stress stimulus (e.g. sunlight) (e.g. MMP-1), others are produced to a lesser extent (e.g. collagen α 1 (I)). Furthermore, no significant change will occur in a large number of the synthesis processes (e.g. TIMP-1).
Die Reaktionen der Haut auf Stress dürfen nicht als Reaktionen einzelner, iso lierter Hautzellen betrachtet werden. Vielmehr ist jede Zelle in ein komplexes Kommunikationsnetzwerk eingebunden. Dieses Netzwerk beinhaltet z. B. die Kommunikation zwischen Zellen der Epidermis und Zellen der Dermis. An der Kommunikation zwischen den Zellen der Haut sind Signalmoleküle wie z. B. Interleukine, Wachstumsfaktoren (z. B. KGF, EGF oder FGF) usw. beteiligt.The reactions of the skin to stress must not be individual, iso skin cells. Rather, each cell is complex Communication network integrated. This network includes e.g. B. the Communication between cells of the epidermis and cells of the dermis. At the Communication between the cells of the skin are signaling molecules such as B. Interleukins, growth factors (e.g. KGF, EGF or FGF) etc. involved.
Die makroskopischen Phänomene alternder Haut beruhen zum einen auf der intrinsischen oder chronologischen Alterung (Hautalterung), zum anderen auf der extrinsischen Alterung durch Umweltstress (Hautstreß). Die Fähigkeit le bender Hautzellen, auf Ihre Umwelt zu reagieren, verändert sich mit der Zeit - es finden Alterungsprozesse statt, die zur Seneszenz und letztendlich zum Zelltod führen. Die sichtbaren Zeichen gealterter Haut sind als Integral der intrinsischen und der extrinsischen Alterung (z. B. durch Sonnenlicht) zu verste hen, wobei die Ereignisse der extrinsischen Alterung über einen längeren Zeit raum in der Haut akkumulieren.The macroscopic phenomena of aging skin are based on the one hand intrinsic or chronological aging (skin aging), on the other extrinsic aging due to environmental stress (skin stress). The ability le skin cells reacting to your environment changes over time - aging processes take place that lead to senescence and ultimately to Cause cell death. The visible signs of aged skin are integral to the to understand intrinsic and extrinsic aging (e.g. from sunlight) hen, the events of extrinsic aging over a long period of time accumulate space in the skin.
Diese Einzelereignisse können direkte Reaktionen von Hautzellen auf den Streßstimulus oder indirekte Reaktionen aufgrund eines Signals (z. B. Interleu kine oder Wachstumsfaktoren) benachbarter, gestresster Zellen sein.These individual events can cause skin cells to react directly to the skin Stress stimulus or indirect reactions based on a signal (e.g. Interleu kine or growth factors) of neighboring, stressed cells.
Effektive Anti-Ageprodukte zeigen ihre Wirkung auf ein möglichst breites Spek trum molekularer Einzelereignisse der extrinsischen Hautalterung. Bisher sind jedoch nur wenige solcher Ereignisse in lebenden Hautzellen bekannt, die als Marker gestresster Haut und somit zur Wirksamkeitsüberprüfung von Antiage- Produkten dienen können.Effective anti-aging products show their effect on the broadest possible spectrum trum of individual molecular events in extrinsic skin aging. So far however, few such events in living skin cells are known to occur as Markers of stressed skin and thus to check the effectiveness of anti-aging Products.
Die Identifikation neuer stressinduzierter Hautreaktionen ermöglicht es, den komplexen Prozess der Hautalterung und seine kausalen Zusammenhänge zu begreifen.The identification of new stress-induced skin reactions enables the complex process of skin aging and its causal relationships understand.
Mit diesem Wissen können neue Konzepte für kosmetische oder pharmazeuti sche Antiage-Produkte entwickelt werden, die ihre Wirkung auf das breite Spek trum der Alterungsprozesse in der Haut ausüben. With this knowledge, new concepts for cosmetic or pharmaceutical Antiage products are developed that have an effect on the broad spectrum exercise the aging processes in the skin.
Jeder Zelltyp der Haut synthetisiert ca. 15.000 verschiedene Proteine. Welche Proteine davon für die intrinsische und/oder extrinsische Hautalterung eine Rolle spielen ist bisher weitgehend unklar.Each cell type of the skin synthesizes approximately 15,000 different proteins. Which Proteins thereof for intrinsic and / or extrinsic skin aging Playing a role has so far been largely unclear.
Erschwerend kommt hinzu, dass die Haut aus mehreren verschiedenen Zellty pen (Fibroblasten, Keratinozyten in verschiedenen Differenzierungszuständen, Melanozyten, Langerhanszellen Haarfollikelzellen, Schweißdrüsenzellen etc.) besteht und somit die Komplexität in der Haut produzierter Proteingemische sehr groß ist.To make matters worse, the skin consists of several different cell types pen (fibroblasts, keratinocytes in various differentiation states, Melanocytes, Langerhans cells, hair follicle cells, sweat gland cells etc.) exists and thus the complexity of protein mixtures produced in the skin is very large.
Es ist bisher nicht möglich gewesen, aus dieser immensen Komplexität die Proteine zu identifizieren, die mit der Hautalterung in kausalem Zusammenhang stehen.It has not been possible to date from this immense complexity Identify proteins that are causally related to skin aging stand.
Ein Verständnis der komplexen Alterungsprozesse in der Haut durch die Identi fikation stressregulierter Markerproteine gestattet die gezielte Suche nach Sub stanzen oder Kombinationen von Substanzen mit einem breiten Antiage- Wirkspektrum.An understanding of the complex aging processes in the skin through identi fication of stress-regulated marker proteins allows the targeted search for sub punch or combinations of substances with a broad anti-aging Spectrum.
Produktkonzepte dieser Art konnten jedoch bis zu dem jetzigen Zeitpunkt nicht entwickelt werden, da eine Vielzahl der Markerproteine für die Hautalterung noch nicht bekannt waren.Up to the present time, however, product concepts of this type have not been able to be developed as a variety of marker proteins for skin aging were not yet known.
Ein erhebliches Problem bei der Identifikation von Markern der Hautalterung ist die komplexe Zusammensetzung der Haut aus verschiedenen Zelltypen. Dieses Problem kann minimiert werden indem man sich für die Identifikation hautrele vanter Altersmarker auf einzelne Zelltypen der Haut beschränkt. Dabei wird jedoch außer Acht gelassen, dass auch Zellen die nicht direkt einem Streßsti mulus ausgesetzt waren, durch die Kommunikation mit benachbarten, gestress ten Zellen extrinsisch altern.A major problem in identifying markers of aging is the complex composition of the skin from different cell types. This Problem can be minimized by looking for identification vanter age marker limited to individual cell types of the skin. Doing so however, disregarded the fact that even cells that are not directly stressed mulus were exposed through communication with neighboring, stressed aging cells extrinsically.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, für die Hautalterung und/oder den Hautstreß charakteristische Marker und die für diese kodierenden Gene auch aus solchen Hautschichten bzw. Hautzellen zu identifizieren, die nicht direkt, sondern indirekt (durch Kommunikation mit benachbarten, gestressten Zellen) extrinsisch altern. Außerdem sollen mittels der identifizierten Marker bzw. Gene Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalte rung bereitgestellt werden.The object of the present invention is therefore for skin aging and / or markers characteristic of skin stress and the genes coding for them also identify from those skin layers or skin cells that are not directly, but indirectly (through communication with neighboring, stressed Cells) age extrinsically. In addition, using the identified markers or gene method for determining skin stress and / or skin age tion.
Diese erste Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur
Identifizierung von für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsamen
Markern bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man
This first object is achieved according to the invention by a method for identifying markers which are important for skin aging and / or skin stress in humans, characterized in that
- a) Menschliche Haut, ein Vollhautmodell oder gentechnisch humanisierte Haut eines Tieres einem Streßstimulus aussetzt,a) Human skin, a full skin model or genetically humanized Exposes an animal's skin to a stress stimulus,
- b) Ein erstes Gemisch von translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen oder Fragmenten von Proteinen aus der in a) gestressten Haut gewinnt,b) A first mixture of translated genetically encoded factors, ie of proteins or fragments of proteins from the stressed in a) Skin wins,
- c) ein zweites Gemisch von translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen oder Fragmenten von Proteinen aus nicht gestresster menschlicher Haut, einem nicht gestressten Vollhautmodell oder nicht ge stresster gentechnisch humanisierter Haut eines Tieres gewinnt,c) a second mixture of translated genetically encoded factors, ie of proteins or fragments of proteins from non-stressed human skin, a non-stressed full skin model or not ge stressed animal's genetically humanized skin wins,
- d) die in b) und c) gewonnenen Gemische einer Analyse der translatierten genetisch codierten Faktoren unterwirft, und durch den Vergleich der Ergeb nisse dieser Analyse die Faktoren identifiziert, die in gestreßter bzw. alter und ungestreßter bzw. junger Haut unterschiedlich stark produziert werden.d) the mixtures obtained in b) and c) an analysis of the translated Subjects genetically encoded factors, and by comparing the results This analysis identified the factors that were stressed or aged and undressed or young skin are produced to different degrees.
Ein in Schritt a) vorteilhaft einsetzbares Vollhautmodell ist beispielsweise von der Firma CellSystems® Biotechnologie Vertrieb GmbH aus D-53562 St. Katha rinen unter der Bezeichnung Haut-Testsystem AST-2000 erhältlich.A full skin model which can advantageously be used in step a) is, for example, from from CellSystems® Biotechnologie Vertrieb GmbH from D-53562 St. Katha available under the name skin test system AST-2000.
Ein geeignetes Vollhautmodell besteht aus dermalen und epidermalen Kompo nenten und ist daher mit der natürlichen Haut physiologisch vergleichbar. Das Hautäquivalent besteht aus dermalen Fibroblasten (Unterhaut) und einer mehr schichtigen Epidermis mit Verhornungsschicht (stratum corneum). Dieses Hautmodell kommt in seiner Struktur und Funktion der lebenden, natürlichen Haut sehr nahe.A suitable full skin model consists of dermal and epidermal compo and is therefore physiologically comparable to natural skin. The Skin equivalent consists of dermal fibroblasts (subcutaneous tissue) and one more layered epidermis with a cornification layer (stratum corneum). This Skin model comes in its structure and function of the living, natural Skin very close.
Geeignete Streßstimuli können beispielsweise sein:
Suitable stress stimuli can be, for example:
- - UV-Licht, insbesondere UV-A (320-400 nm), beispielsweise in einer Do sis von etwa 10 J/cm2 oder UV-B (280-320 nm), beispielsweise in einer Dosis von etwa 360 mJ/cm2 UV light, in particular UV-A (320-400 nm), for example in a dose of about 10 J / cm 2 or UV-B (280-320 nm), for example in a dose of about 360 mJ / cm 2
- - Sonnenlicht, grundsätzlich das gesamte solare Strahlungsspektrum. Man kann aber auch ein Teilspektrum zur Quantifizierung heranziehen, z. B. durch- Sunlight, basically the entire solar radiation spectrum. you can also use a sub-spectrum for quantification, e.g. B. by
- - Bestrahlung mit Sonnenlicht entsprechend einer Dosis UV-A von etwa 10 J/cm2 oder- Irradiation with sunlight corresponding to a dose of UV-A of approximately 10 J / cm 2 or
- - Bestrahlung mit etwa ¼ bis < 1,0 MED (Minimale Erythemale Do sis)- Irradiation with about ¼ to <1.0 MED (minimal erythemale Thurs sis)
- - Hitze, im Temperaturbereich von etwa < 37°C bis 44°C für etwa 1-60 min- Heat, in the temperature range from about <37 ° C to 44 ° C for about 1-60 min
- - Chemische Reizung durch Oxidantien, Reizende Chemikalien (z. B.: SDS = sodium dodecyl sulfate), Ozon, Schwefeldioxid, Stickoxide, Reaktive Sauerstoffspezies (Sauerstoffradikal; Superoxidanion, Wasserstoffpero xid etc.)- Chemical irritation due to oxidants, irritant chemicals (e.g. SDS = sodium dodecyl sulfate), ozone, sulfur dioxide, nitrogen oxides, reactive Oxygen species (oxygen radical; superoxide anion, hydrogen pero xid etc.)
Vorzugsweise führt man die Analyse in d) mittels Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese und nachfolgender Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) durch.The analysis in d) is preferably carried out by means of one or two dimensions Gel electrophoresis and subsequent mass spectrometry, in particular Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) by.
Überraschenderweise wurde mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gefunden, daß die Proteine Stratifin (14-3-3, σ-Isoform), HSP27 (Heat shock protein 27 kDa) und GRP78/BiP von menschlicher Haut streßinduzierbar pro duziert werden, d. h. gestreßte Haut produziert diese Proteine in erheblich grö ßerer Menge, als nicht gestreßte Haut. Außerdem wurde überraschenderweise gefunden, daß gestreßte Haut phosphorylierte, insbesondere hyperphosphory lierte Isoformen des HSP27 (Heat shock protein 27 kDa) in erheblich größerer Menge produziert, als nicht gestreßte Haut. Die für gestreßte bzw. nicht ge streßte Haut jeweils charakteristische Menge der genannten Proteine, das Verhältnis der produzierten Mengen zueinander sowie das Vorhandensein bzw. Fehlen der phosphorylierten Isoformen des HSP27 ergeben zusammenge nommen ein für gestreßte bzw. ungestreßte Haut charakteristisches Translati onsprofil.Surprisingly, with the help of the method according to the invention found that the proteins stratifin (14-3-3, σ-isoform), HSP27 (Heat shock protein 27 kDa) and GRP78 / BiP of human skin stress inducible pro be reduced, d. H. Stressed skin produces these proteins in a considerable size more than skin that is not stressed. Also, surprisingly found that stressed skin phosphorylated, especially hyperphosphory gated isoforms of the HSP27 (Heat shock protein 27 kDa) in considerably larger sizes Quantity produced as skin not stressed. The stressed or not ge stressed skin each characteristic amount of the proteins mentioned, the Ratio of the quantities produced to one another and the presence or Absence of the phosphorylated isoforms of the HSP27 result together take a translati characteristic of stressed or undressed skin transient profiles.
Die zweite der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird daher
erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß
und/oder der Hautalterung bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß
man
The second object on which the present invention is based is therefore achieved according to the invention by a method for determining skin stress and / or skin aging in humans in vitro, characterized in that
- a) ein Gemisch von Proteinen oder Fragmenten von Proteinen aus menschli cher Haut gewinnt,a) a mixture of proteins or fragments of proteins from human skin wins,
- b) das Gemisch auf das Vorhandensein und die Menge von Stratifin (14-3-3, σ- Isoform), GRP78/BiP, HSP27 (Heat shock protein 27 kDa), phosphorylier ten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27 oder von Fragmenten dieser Proteine untersucht undb) the mixture for the presence and amount of stratifin (14-3-3, σ- Isoform), GRP78 / BiP, HSP27 (Heat shock protein 27 kDa), phosphorylier ten, in particular hyperphosphorylated isoforms of HSP27 or of Fragments of these proteins are examined and
- c) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es hinsichtlich der in b) aufgeführten Proteine ein für alte bzw. gestreßte Haut charakteristisches Translationsprofil aufweist; oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es hinsichtlich der in b) aufgeführten Proteine ein für junge bzw. ungestreßte Haut charakteri stisches Translationsprofil aufweist.c) assigns the mixture examined in b) to old or stressed skin, if it with regard to the proteins listed in b) for old or stressed skin has a characteristic translation profile; or that examined in b) Mixture of young or undressed skin assigns if it regards the Proteins listed in b) are characteristic of young or undressed skin has static translation profile.
Ein für alte Haut charakteristisches Translationsprofil liegt vor, wenn das Ge misch entweder mehr unterschiedliche typischerweise in alter Haut translatierte Verbindungen enthält, als solche, die typischerweise in junger Haut exprimiert werden (qualitative Differenzierung), oder mehr Kopien von typischerweise in alter Haut exprimierten Verbindungen enthält, als typischerweise in junger Haut vorhanden sind (quantitative Differenzierung). Für die Zuordnung zu junger bzw. ungestreßter Haut wird in komplementärer Weise verfahren. A translational profile characteristic of old skin is present when the Ge mix either more different typically translated in old skin Contains compounds as such, which are typically expressed in young skin be (qualitative differentiation), or more copies of typically in contains compounds expressed in old skin than is typically found in young skin are present (quantitative differentiation). For assignment to young or undressed skin is processed in a complementary manner.
Ein charakteristisches Translationsprofil liegt auch dann vor, wenn mehrere Marker (Translatioprodukte der für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsamen Gene) quantifiziert werden, die dann untereinander in einem charakteristischen Verhältnis vorhanden sein müssen, um junge Haut zu reprä sentieren, bzw. in einem hiervon verschiedenen charakteristischen Verhältnis vorhanden sein müssen, um alte Haut zu repräsentieren.A characteristic translation profile is also present when there are several Marker (translatooproducts for skin aging and / or skin stress significant genes) that can then be quantified among themselves characteristic ratio must be present to represent young skin present, or in a different characteristic ratio must be present to represent old skin.
Vorzugsweise gewinnt man in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung das Gemisch aus einer Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe oder aus einer Epidermis probe. Hierbei eröffnet die Vollhautprobe umfassendere Vergleichsmöglichkei ten mit den gleichfalls auf Vollhaut oder auf entsprechende in vitro- oder Tier modelle bezogenen Translationsprofilen. Die Epidermisprobe ist hingegen leich ter zu gewinnen, beispielsweise durch Aufbringen eines Klebebandes auf die Haut und Abreißen desselben, wie in der WO 00/10579 beschrieben, auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.Preferably, in step a) of the process according to the invention Determination of skin stress and / or skin aging the mixture of one Skin sample, especially from a whole skin sample or from an epidermis sample. Here, the full-skin sample opens up more comprehensive comparison options with the same on whole skin or on corresponding in vitro or animal model-related translation profiles. The epidermis sample, however, is easy ter to win, for example by applying an adhesive tape on the Skin and tearing of the same, as described in WO 00/10579, on the reference is hereby made in full.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung gewinnt man in Schritt a) das Gemisch mittels Mikrodialyse. Die Technik der Mikrodialyse wird beispiels weise in "Microdialysis: A method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161: 12 1735- 8; sowie in "Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption stu dies", Anderson, C. et al.; Drugs Pharm. Sci., 1998, 91, 231-244; und auch im Internet unter http:/ /www.microdialysis.se/techniqu.htm beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.In a further embodiment of the method according to the invention for Determination of skin stress and / or skin aging is obtained in step a) the mixture using microdialysis. The microdialysis technique is used, for example as in "Microdialysis: A method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161: 12 1735- 8th; and in "Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption stu dies ", Anderson, C. et al .; Drugs Pharm. Sci., 1998, 91, 231-244; and also in Internet at http: / /www.microdialysis.se/techniqu.htm described what reference is hereby made in full.
Bei der Anwendung der Mikrodialyse führt man typischerweise eine Sonde in die Haut ein und beginnt mit einer geeigneten Trägerlösung die Sonde langsam zu spülen. Nach dem Abklingen der akuten Reaktionen nach dem Einstich liefert die Mikrodialyse Proteine oder Fragmente von Proteinen, die im extrazel lulären Raum vorkommen und die, beispielsweise durch Fraktionierung der Trägerflüssigkeit, dann in vitro isoliert und analysiert werden können. Die Mi krodialyse ist weniger invasiv, als die Entnahme einer Vollhautprobe; sie ist aber nachteiligerweise auf die Gewinnung im extrazelulären Raum vorkom mender Verbindungen beschränkt.When using microdialysis, a probe is typically inserted the skin and slowly start the probe with a suitable carrier solution to wash. After the acute reactions after the puncture subsided delivers microdialysis proteins or fragments of proteins that are in the extracel lular space and which occur, for example by fractionating the Carrier liquid, then can be isolated and analyzed in vitro. The Wed crodialysis is less invasive than taking a full skin sample; she is but disadvantageously occurs in the extracellular space limiting connections.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung so durchgeführt, daß man die Untersu chung auf das Vorhandensein und die Menge von Stratifin (14-3-3, σ-Isoform), GRP78/BiP, HSP27 (Heat shock protein 27 kDa), phosphorylierten, insbeson dere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27 oder von Fragmenten dieser Proteine durch Separation der Proteine mittels Gelelektrophorese und nachfol gende Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorpti ons Ionisation (MALDI) vornimmt.The method according to the invention for determining the Skin stress and / or skin aging carried out so that the Untersu checking for the presence and amount of stratifin (14-3-3, σ-isoform), GRP78 / BiP, HSP27 (Heat shock protein 27 kDa), phosphorylated, in particular their hyperphosphorylated isoforms of HSP27 or fragments thereof Proteins by separating the proteins using gel electrophoresis and subsequent mass spectrometry, especially matrix assisted laser desorpti ons ionization (MALDI).
Besonders bevorzugt erfolgt die Separation der Proteine durch 2D- Gelelektrophorese, wie beispielsweise in L. D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System oder in L. D. Adams & S. R. Gallagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; beide in Cur rent Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F. M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1 -10.4.13; oder in 2-D Electrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60), beschrieben.The separation of the proteins is particularly preferably carried out by 2D Gel electrophoresis, such as in L. D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System or in L. D. Adams & S. R. Gallagher, Two-dimensional gel electrophoresis using the O'Farrell system; both in cur rent Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F. M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1 -10.4.13; or in 2-D electrophoresis manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Order No. 80-6429-60).
Die Gewinnung der Proteine erfolgt vorzugsweise durch Proteinpräzipitation, beispielsweise mit Methanol/Chloroformgemisch im Verhältnis von etwa 4 : 1 : 4 zur Probe und/oder durch Aufkonzentrierung der Proteine, beispielsweise durch Ultrafiltration mit einem Cut off von etwa 5.000 Da, z. B. mittels der Vivaspin- Produkte der Fa. Sartorius.The proteins are preferably obtained by protein precipitation, for example with a methanol / chloroform mixture in a ratio of about 4: 1: 4 for sample and / or by concentrating the proteins, for example by Ultrafiltration with a cut off of about 5,000 Da, e.g. B. by means of the Vivaspin Products from Sartorius.
Das so erhaltene Konzentrat bzw. Präzipitat kann dann in dem Fachmann be kannter Weise in Rehydratisierungspuffer aufgenommen werden, beispielswei se, wie in "2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients. Principles and methods", Berkelman, T. and Stenstedt, T (eds); Amersham Pharmacia Biotech Inc (1998) 80-6429-60; beschrieben.The concentrate or precipitate thus obtained can then be in the expert known to be included in rehydration buffer, for example se, as in "2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients. Principles and methods ", Berkelman, T. and Stenstedt, T (eds); Amersham Pharmacia Biotech Inc (1998) 80-6429-60; described.
Die erfindungsgemäß bevorzugte Separation der Proteine durch 2- Dimensionale Gelelektrophorese kann beispielsweise so erfolgen, daß man in der ersten Dimension eine isoelektrische Fokussierung vornimmt, beispielswei se unter Verwendung von Immobilin DryStrips mit einem immobilisierten pH- Gradienten (IPG) von 4 bis 7 der Fa. Amersham-Pharmacia oder unter Ver wendung von Carrierampholyt tragenden Polyacrylamid-Gelstreifen, die im elektrischen Feld einen pH-Gradienten aufbauen (O'Farrell, P. H.; 1975; J Biol. Chem. 250, 4007-4021) und in der zweiten Dimension eine SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese, z. B. mit 12.5%tigem Polyacrylamid bei 30 mA für 3 bis 4 h vornimmt.The separation of the proteins preferred by 2- Dimensional gel electrophoresis can be carried out, for example, in that the first dimension is isoelectric focusing, for example se using Immobilin DryStrips with an immobilized pH Gradients (IPG) from 4 to 7 from Amersham-Pharmacia or under Ver Use of carrier ampholyte-bearing polyacrylamide gel strips, which in the electrical field build up a pH gradient (O'Farrell, P. H .; 1975; J Biol. Chem. 250, 4007-4021) and in the second dimension an SDS-polyacrylamide Gel electrophoresis, e.g. B. with 12.5% polyacrylamide at 30 mA for 3 to 4 h performs.
Die Gelfärbung kann nach üblichen Methoden, beispielsweise durch Silberfär bung nach Heukeshoven oder durch Colloidal Coomassieblaufärbung erfolgen.The gel staining can be carried out by customary methods, for example by silver staining Heukeshoven or colloidal Coomassie staining.
Die massenspektrometrische Charakterisierung der Proteine erfolgt in der
Fachwelt bekannter Weise, beispielsweise wie in den folgenden Literaturstellen
beschrieben:
Methods in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols;
Editor: A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere:
Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487-512.The mass spectrometric characterization of the proteins is carried out in a manner known to those skilled in the art, for example as described in the following references:
Methods in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor: AJ Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. In particular: Courchesne, PL and Patterson, SD; Pp. 487-512.
Carr, S. A. und Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology; Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1-10.21.27.Carr, S.A. and Annan, R. S .; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology; Editor: Ausubel, F. M. et al .; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1-10.21.27.
Es können jedoch erfindungsgemäß auch andere dem Fachmann bekannte Methoden zur Analyse bzw. zum Nachweis der oben genannten Proteine oder Proteinfragmente eingesetzt werden, insbesondere Methoden, die auf der spezifischen Bindung von Antikörpern an Proteine beruhen, beispielsweise Radio immunoassays und auf Immunofluoreszenz basierende Nachweisverfahren.According to the invention, however, others known to the person skilled in the art can also be used Methods for analysis or detection of the above proteins or Protein fragments are used, especially methods based on the specific Binding of antibodies to proteins is based, for example radio immunoassays and immunofluorescence based detection methods.
Ein weiteres besonders bevorzugtes Verfahren zum Nachweis der oben ge nannten Proteine oder Proteinfragmente ist der Einsatz eines Proteinchip.Another particularly preferred method for detecting the above ge called proteins or protein fragments is the use of a protein chip.
Stratifin gehört zu der großen Familie der 14-3-3-Proteine. Einige Mitglieder dieser Proteinfamilie werden ubiquitär exprimiert (z. B. die ξ-Isoform), während z. B. die τ-Isoform spezifisch in T-Zellen vorkommt. Eine spezifisch in stratifizier ten Epithelien (z. B. in der Epidermis) produzierte Form des 14-3-3-Proteines ist das Stratifin (die σ-Isoform). Eine herausragende Eigenschaft aller 14-3-3- Proteine ist deren Fähigkeit an verschiedene, funktionell unterschiedliche Si gnalproteine, wie z. B. Kinasen, Phosphatasen oder Transmembranrezeptoren, zu binden. Eine wichtige biologische Funktion von Stratifin wurde entdeckt, als das Wachstum colonrectaler Karzinomazellen mit γ-Strahlen inhibiert wurde (Hermeking, H. et al., 1997, Mol. Cell. 1, 3-11) Einige der Zellen stoppten ihr Wachstum in der G1-Phase des Zellzyklus, während andere in der G2-Phase arretiert wurden. Beide Varianten des Wachstumarrests sind an die vermehrte Produktion des Transkriptionsfaktors p53 gekoppelt. Exogener Stress, wie z. B. γ-Strahlung oder UV-Strahlung führt zu einer Induktion des Gens für p53. Der Transkriptionsfaktor p53 bindet dann an die Promotoren der Gene für Stratifin und p21 und aktiviert deren Transkription. Während p21 am Wachstumsstopp in der G1-Phase beteiligt ist, führt Stratifin zum Wachstumsarrest in der G2- Phase. Der Wachstumsarrest sich teilender Zellen ist eine notwendige Voraus setzung für deren Differenzierung. Wachstum und Differenzierung sind also zwei gegenläufige Prozesse die sich gegenseitig ausschließen.Stratifin belongs to the large family of 14-3-3 proteins. Some members of this protein family are ubiquitously expressed (e.g. the ξ-isoform), while z. B. the τ isoform occurs specifically in T cells. One specifically in stratified form of the 14-3-3 protein produced (e.g. in the epidermis) the stratifin (the σ isoform). An outstanding property of all 14-3-3- Proteins are their ability to different, functionally different Si gnal proteins, such as B. kinases, phosphatases or transmembrane receptors, to tie. An important biological function of stratifin was discovered when the growth of colonrectal carcinoma cells was inhibited with γ-rays (Hermeking, H. et al., 1997, Mol. Cell. 1, 3-11) Some of the cells stopped her Growth in the G1 phase of the cell cycle, while others in the G2 phase were arrested. Both variants of the growth arrest are more common Production of the transcription factor p53 coupled. Exogenous stress, such as B. γ-radiation or UV radiation leads to induction of the gene for p53. The Transcription factor p53 then binds to the promoters of the genes for stratifin and p21 and activates their transcription. During p21 at the growth stop in involved in the G1 phase, Stratifin leads to growth arrest in the G2 Phase. The growth arrest of dividing cells is a necessary advance setting for their differentiation. So growth and differentiation are two opposing processes that are mutually exclusive.
Die exakte Regulation dieser Prozesse ist insbesondere in der Haut von ent scheidender Bedeutung. Die Epidermis ist ein Teil der Haut, welcher sich konti nuierlich erneuert. Im Stratum basale, der tiefsten Schicht der Epidermis, befin den sich teilungsfähige Keratinozyten. Diese Zellen wandern langsam in höhere Schichten der Epidermis und differenzieren dabei zu den Corneozyten des Stratum corneum. The exact regulation of these processes is particularly in the skin of ent outgoing meaning. The epidermis is a part of the skin that is continuous renewed every minute. Located in the basal stratum, the deepest layer of the epidermis the divisible keratinocytes. These cells slowly migrate to higher ones Layers of the epidermis and differentiate to the corneocytes of the Stratum corneum.
An diesem Differenzierungsprozess kann Stratifin maßgeblich beteiligt sein.Stratifin can play a key role in this differentiation process.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter "Stratifin" ein Protein mit der Aminosäurensequenz (A)In the context of the present invention, a protein with the "Stratifin" is Amino acid sequence (A)
verstanden, sowie Proteine, die mehr als 40%, insbesondere mehr als 60%, besonders bevorzugt mehr als 80% Sequenzhomologie mit dieser Sequenz aufweisen. Die Aminosäuresequenz (A) ist in der Proteindatenbank des Natio nal Center for Biotechnology Information (NCBI) unter der Nummer 5454052 offenbart. Über einen direkten Link ist dort auch die Sequenz der entsprechen den mRNA offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/.understood, as well as proteins that more than 40%, in particular more than 60%, particularly preferably more than 80% sequence homology with this sequence exhibit. The amino acid sequence (A) is in the protein database of the Natio National Center for Biotechnology Information (NCBI) under number 5454052 disclosed. The sequence of the corresponding is also there via a direct link disclosed the mRNA. This database is on the Internet at the following address accessible: http: / /www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt "Stratifin" auch solche Proteine, deren Aminosäuresequenzen durch konservative Mutationen, also durch den Austausch strukturell oder funktionell ähnlicher Aminosäuren, aus der oben aufgeführten Sequenz (A) erhalten werden können.In the context of the present invention, "stratifin" also includes those proteins whose amino acid sequences through conservative mutations, i.e. through the Exchange of structurally or functionally similar amino acids, from the above listed sequence (A) can be obtained.
Jede lebende Zelle ist kontinuierlich einem gewissen Maß an Stress ausge setzt. Im Laufe der Evolution wurden jedoch Mechanismen entwickelt, die es Zellen erlauben dem Stress entgegenzuwirken. Ein großes stressbedingtes Problem einer jeden Zelle sind Proteine, die eine falsche Tertiärstruktur haben, also nicht korrekt gefaltet sind. Dies ist insbesondere unter erhöhter Energie einwirkung wie z. B. durch Strahlung oder Temperatur der Fall. Die Qualitäts kontrolle neu produzierter Proteine ist daher für das Überleben von Organismen von entscheidender Bedeutung. An dieser Qualitätskontrolle sind Glukose regulierte Proteine (GRP's) wie z. B. GRP78/BiP und Heat shock Proteine wie z. B. HSP27 entscheident beteiligt. Diese Proteine vermitteln lebenden Zellen in gewissem Maße eine Resistenz gegen sublethale Stressbedingungen.Every living cell is continuously out of a certain amount of stress puts. Mechanisms have been developed in the course of evolution that Cells allow to counteract the stress. A great stress related The problem of every cell is proteins that have the wrong tertiary structure, are not folded correctly. This is especially true under increased energy action such as B. by radiation or temperature. The quality Control of newly produced proteins is therefore essential for the survival of organisms vital. At this quality control are glucose regulated proteins (GRP's) such as B. GRP78 / BiP and heat shock proteins such as z. B. HSP27 decisively involved. These proteins mediate living cells in to some extent resistance to sublethal stress conditions.
Die Ansammlung nicht korrekt gefalteter Proteine im Endoplasmatischen Reti culum (ER) führt zur Aktivierung eines Signaltransduktionswegs vom ER in den Nukleus der Zelle (unfolded protein response; UPR). Im Kern der Zelle werden Gene aktiviert, deren Produkte im Endoplasmatischen Reticulum (ER) korrekte Proteinfaltungen unterstützen (Chaperone). Zu diesen Chaperonen gehört GRP78/BiP. Die Bindung von GRP78/BiP z. B. an naszierende Proteine im ER verhindert die Akkumulation denaturierter, also entfalteter Proteine. Mit dem Ende der Stressbedingungen kann GRP78/BiP von den gebundenen Proteinen in einer-ATP-abhängigen Reaktion dissoziieren, sodass diese dann korrekt gefaltet werden können. Ein weitere Mechanismus beinhaltet die gezielten Degradation GRP78/BiP-gebundener Proteine über den Ubiquitin/Proteasom- Weg. Weiterhin ist HSP27 an der Regulation des Zytoskeletts, insbesondere der Actin-Polymerisation, beteiligt.The accumulation of incorrectly folded proteins in the endoplasmic reti culum (ER) leads to the activation of a signal transduction path from the ER to the Cell nucleus (unfolded protein response; UPR). Be at the core of the cell Genes activated whose products in the endoplasmic reticulum (ER) correct Support protein folding (chaperones). One of these chaperones GRP78 / BiP. The binding of GRP78 / BiP e.g. B. to nascent proteins in the ER prevents the accumulation of denatured, i.e. unfolded, proteins. With the GRP78 / BiP of the bound proteins can end the stress conditions dissociate in an ATP-dependent reaction so that it is correct can be folded. Another mechanism involves the targeted Degradation of GRP78 / BiP-bound proteins via the ubiquitin / proteasome Path. Furthermore, HSP27 is involved in the regulation of the cytoskeleton, in particular actin polymerization.
Die Bestrahlung humaner Ganzhautmodelle mit simuliertem Sonnenlicht führte in Experimenten der Anmelderin ebenfalls zu Induktion der HSP27-Synthese. Dabei konnten mehrere HSP-27-Isoformen detektiert werden, die unterschied liche isoelektrische Punkte aufwiesen. Diese Unterschiede entstehen durch Phosphorylierungen des Proteins an Serinresten, die zwei Aminosäuren nach einem Arginin im Molekül vorkommen. Neben den in der Literatur beschriebe nen mono- und bi-phosphorylierten Isoformen von HSP27 konnten weiterhin hyperphosphorylierte Moleküle detektiert werden. Die Phosphorylierung von HSP27 kann ebenso wie seine Synthese durch die Zugabe des Zytokins Inter leukin-1 induziert werden. Dieses Zytokin ist bekannt dafür (Wlaschek et al. 1997, FEBS Letters 413; 239-242), daß es durch UV-Licht induziert wird und an der verstärkten Produktion der Matrix-Metalloprotease-1 (ein Markerprotein photogealterter Haut), beteiligt ist. The irradiation of human whole skin models with simulated sunlight resulted in experiments by the applicant also for induction of HSP27 synthesis. Several HSP-27 isoforms could be detected, which differed showed isoelectric points. These differences arise from Phosphorylation of the protein on serine residues that follow two amino acids an arginine in the molecule. In addition to those described in the literature mono- and bi-phosphorylated isoforms of HSP27 were able to continue hyperphosphorylated molecules are detected. The phosphorylation of HSP27, like its synthesis, can be added by adding the cytokine Inter leukin-1 can be induced. This cytokine is known for it (Wlaschek et al. 1997, FEBS Letters 413; 239-242) that it is induced by UV light and on the increased production of matrix metalloprotease-1 (a marker protein photo-aged skin).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter "GRP78/BiP" ein Protein mit der Aminosäurensequenz (B)In the context of the present invention, a protein is included under "GRP78 / BiP" the amino acid sequence (B)
verstanden, sowie Proteine, die mehr als 40%, insbesondere mehr als 60%, besonders bevorzugt mehr als 80% Sequenzhomologie mit dieser Sequenz aufweisen. Die Aminosäuresequenz (B) ist in der Proteindatenbank des Natio nal Center for Biotechnology Information (NCBI) unter der Nummer 6900104 offenbart. Über einen direkten Link ist dort auch die Sequenz der entsprechen den mRNA offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/.understood, as well as proteins that more than 40%, in particular more than 60%, particularly preferably more than 80% sequence homology with this sequence exhibit. The amino acid sequence (B) is in the protein database of the Natio nal Center for Biotechnology Information (NCBI) under number 6900104 disclosed. The sequence of the corresponding is also there via a direct link disclosed the mRNA. This database is on the Internet at the following address accessible: http: / /www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt "GRP78/BiP" auch solche Pro teine, deren Aminosäuresequenzen durch konservative Mutationen, also durch den Austausch strukturell oder funktionell ähnlicher Aminosäuren, aus der oben aufgeführten Sequenz (B) erhalten werden können.In the context of the present invention, "GRP78 / BiP" also includes such pro teins whose amino acid sequences are caused by conservative mutations the exchange of structurally or functionally similar amino acids, from the above listed sequence (B) can be obtained.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter "HSP27" ein Protein mit der Aminosäurensequenz (C) In the context of the present invention under "HSP27" a protein with the Amino acid sequence (C)
verstanden, sowie Proteine, die mehr als 40%, insbesondere mehr als 60%, besonders bevorzugt mehr als 80% Sequenzhomologie mit dieser Sequenz aufweisen. Die Aminosäuresequenz (C) ist in der Proteindatenbank des Natio nal Center for Biotechnology Information (NCBI) unter der Nummer 4504517 offenbart. Über einen direkten Link ist dort auch die Sequenz der entsprechen den mRNA offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/.understood, as well as proteins that more than 40%, in particular more than 60%, particularly preferably more than 80% sequence homology with this sequence exhibit. The amino acid sequence (C) is in the protein database of the Natio nal Center for Biotechnology Information (NCBI) under number 4504517 disclosed. The sequence of the corresponding is also there via a direct link disclosed the mRNA. This database is on the Internet at the following address accessible: http: / /www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt "HSP27" auch solche Proteine, deren Aminosäuresequenzen durch konservative Mutationen, also durch den Austausch strukturell oder funktionell ähnlicher Aminosäuren, aus der oben aufgeführten Sequenz (C) erhalten werden können.In the context of the present invention, "HSP27" also includes those proteins whose amino acid sequences through conservative mutations, i.e. through the Exchange of structurally or functionally similar amino acids, from the above listed sequence (C) can be obtained.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zur Be stimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung.Another object of the present invention is a test kit for loading mood of skin stress and / or skin aging in humans in vitro, comprising means for performing the method according to the invention for Determination of skin stress and / or skin aging.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Biochip zur Be
stimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen in vitro,
umfassend
Another object of the present invention is a biochip for determining skin stress and / or skin aging in humans in vitro, comprising
- a) einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger unda) a fixed, d. H. rigid or flexible supports and
-
b) auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an
mindestens eines der Moleküle befähigt sind, die ausgewählt sind un
ter:
- - Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
- - GRP78/BiP,
- - HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
- - phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isofor men des HSP27,
- - Fragmenten dieser Proteine,
- - für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
- - Fragmenten dieser mRNA-Moleküle.
- - stratifin (14-3-3, σ-isoform),
- - GRP78 / BiP,
- - HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
- phosphorylated, in particular hyperphosphorylated, isoforms of HSP27,
- Fragments of these proteins,
- - mRNA molecules coding for these proteins or protein fragments, or
- - Fragments of these mRNA molecules.
Bei einem BioChip handelt es sich um ein miniaturisiertes Funktionselement mit auf einer Oberfläche immobilisierten Molekülen, insbesondere Biomolekülen, die als spezifische Interaktionspartner dienen können.A BioChip is a miniaturized functional element with Molecules immobilized on a surface, in particular biomolecules, that can serve as specific interaction partners.
Häufig weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf; man spricht dann von Chip-"Arrays". Da tausende von biologischen bzw. bio chemischen Funktionselementen auf einem Chip angeordnet sein können, müssen diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt werden. Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere in Frage: DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten können z. B. Einzelstränge, Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide, Peptide, Proteine (z. B. Antikörper, Antigene, Rezepto ren) und Derivate der kombinatorischen Chemie (z. B. organische Moleküle). Im allgemeinen haben BioChips eine 2D-Basisfläche für das Beschichten mit biologisch oder biochemisch funktionellen Materialien. Die Basisflächen können beispielweise auch von Wänden einer oder mehrerer Kapillaren oder von Kanä len gebildet sein.The structure of these functional elements often has rows and columns; one then speaks of chip “arrays”. Because thousands of biological or bio chemical functional elements can be arranged on a chip, these usually have to be made using microtechnical methods. In particular, biological and biochemical functional elements come in Question: DNA, RNA, PNA, (for nucleic acids and their chemical derivatives can e.g. B. single strands, triplex structures or combinations thereof are present), saccharides, peptides, proteins (e.g. antibodies, antigens, recepto ren) and derivatives of combinatorial chemistry (e.g. organic molecules). In general, BioChips have a 2D base area for coating with biologically or biochemically functional materials. The base areas can for example, from walls of one or more capillaries or from Kanä len be formed.
Zum Stand der Technik kann z. B. auf folgende Publikationen hingewiesen werden: Nature Genetics, Vol. 21, supplement (Gesamt), Jan. 1999 (BioChips); Nature Biotechnology, Vol. 16, S. 981-983, Okt. 1998 (BioChips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, S. 301-306, Jul. 1998 (BioChips) sowie die Übersichts artikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: "Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837-846 (2000), und "Ge nomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827-836 (2000), und die dort angegebenen Referenzen, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird. The prior art can e.g. B. referred to the following publications are: Nature Genetics, Vol. 21, supplement (total), Jan. 1999 (BioChips); Nature Biotechnology, Vol. 16, pp. 981-983, Oct. 1998 (BioChips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, pp. 301-306, Jul. 1998 (BioChips) and the overview article by Akhilesh Pandey and Matthias Mann: "Proteomics to study genes and genomes ", Nature, Volume 405, Number 6788, 837-846 (2000), and" Ge nomics, gene expression and DNA arrays ", Nature, Volume 405, Number 6788, 827-836 (2000), and the references given there, which are hereby referred to in full reference is made.
Eine übersichtliche Darstellung der praktischen Anwendungsverfahren der DNA-Chiptechnologie liefern die Bücher "DNA Microarrays: A Practical Appro ach" (Editor: Mark Schena, 1999, Oxford University Press) und "Microarray Biochip Technology" (Editor: Mark Schena, 2000, Eaton Publishing), auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.A clear representation of the practical application procedures of The books "DNA Microarrays: A Practical Appro ach "(Editor: Mark Schena, 1999, Oxford University Press) and" Microarray Biochip Technology "(Editor: Mark Schena, 2000, Eaton Publishing), on the reference is hereby made in full.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte DNA- Chiptechnologie beruht auf der Fähigkeit von Nukleinsäuren komplementäre Basenpaarungen einzugehen. Dieses als Hybridisierung bezeichnete techni sche Prinzip wird bereits seit Jahren bei der Southern-Blot- und Northern-Blot- Analyse eingesetzt. Im Vergleich zu diesen herkömmlichen Methoden, bei de nen lediglich einige wenige Gene analysiert werden, gestattet es die DNA- Chiptechnologie einige hundert bis zu mehreren zehntausend Genen parallel zu untersuchen.The DNA preferred in the context of the present invention Chip technology is based on the ability of complementary nucleic acids Base pairings. This techni called hybridization principle has been used for years for Southern blot and Northern blot Analysis used. Compared to these conventional methods, de If only a few genes are analyzed, the DNA Chip technology in parallel from a few hundred to several tens of thousands of genes investigate.
Ein DNA-Chip besteht im wesentlichen aus einem Trägermaterial (z. B. Glas oder Kunststoff), auf dem einzelsträngige, genspezifische Sonden in hoher Dichte an einer definierten Stelle (Spot) immobilisiert werden. Als problematisch wird dabei die Technik der Sonden-Applikation und die Chemie der Sonden- Immobilisierung eingeschätzt.A DNA chip essentially consists of a carrier material (e.g. glass or plastic), on which single-stranded, gene-specific probes in high Density can be immobilized at a defined location (spot). As problematic the technique of probe application and the chemistry of the probe Immobilization assessed.
Nach dem derzeitigen Stand der Technik sind mehrere Wege der Sonden-
Immobilisierung realisiert:
E. M. Southern (E. M. Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-
1684 und E. M. Southern et al. (1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161)
beschreibt die Herstellung von Oligonukleotidanordnungen durch direkte Syn
these an einer Glasoberfläche, die mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und
anschließend mit einem Glycol derivatisiert wurde.According to the current state of the art, several ways of immobilizing probes are realized:
EM Southern (EM Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-1684 and EM Southern et al. (1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) describes the preparation of oligonucleotide arrays by direct synthesis on one Glass surface that was derivatized with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane and then with a glycol.
Ein ähnliches Verfahren realisiert die in situ Synthese von Oligonukleotiden mittels einer photosensitiven, kombinatorischen Chemie, die mit photolithogra phischen Techniken verglichen werden kann (Pease, A. C. et al. (1994), Proc. Natl Acad Sci USA 91, 5022-5026). A similar process realizes the in situ synthesis of oligonucleotides using a photosensitive, combinatorial chemistry using photolithogra phical techniques can be compared (Pease, A.C. et al. (1994), Proc. Natl Acad Sci USA 91, 5022-5026).
Neben diesen auf der in situ-Synthese von Oligonukleotiden beruhenden Tech niken können ebenso bereits vorhandene DNA-Moleküle an Oberflächen von Trägermaterial gebunden werden.In addition to this tech based on the in situ synthesis of oligonucleotides techniques can also be used to pre-existing DNA molecules on surfaces of Carrier material are bound.
P. O. Brown (DeRisi et al. (1997), Science 278, 680-686) beschreibt die Immobi lisierung von DNA an mit Polylysin beschichteten Glasoberflächen.P. O. Brown (DeRisi et al. (1997) Science 278, 680-686) describes the immobi Analysis of DNA on glass surfaces coated with polylysine.
Die Veröffentlichung von L. M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acid Re search 22, 5456-5465) legt ein ähnliches Verfahren offen: Oligonukleotide, die eine 5'terminale Aminogruppe tragen, können an eine Glasoberfläche gebun den werden, die mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1,4- Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde.The publication by L. M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acid Re search 22, 5456-5465) discloses a similar process: oligonucleotides, the carrying a 5'-terminal amino group can be bonded to a glass surface with 3-aminopropyltrimethoxysilane and then with 1,4- Phenyldiisothiocyanate was treated.
Die Applikation der DNA-Sonden auf einem Träger kann mit einem sogenann ten "Pin-Spotter" erfolgen. Dazu tauchen dünne Metallnadeln mit z. B. einem Durchmesser von 250 µm, in Sondenlösungen ein und überführen anschlie ßend das anhängende Probenmaterial mit definierten Volumina auf das Trä germaterial des DNA-Chips.The application of the DNA probes on a carrier can be done with a so-called "Pin-Spotter" take place. To do this, dip thin metal needles with z. B. one Diameter of 250 µm, in probe solutions and then transfer ßend the attached sample material with defined volumes on the Trä DNA chip material.
Bevorzugterweise erfolgt die Sondenapplikation jedoch mittels eines piezoge steuerten Nanodispensers, der ähnlich einem Tintenstrahldrucker, Sondenlö sungen mit einem Volumen von 100 Picolitern kontaktfrei auf die Oberfläche des Trägermaterials aufbringt.However, the probe is preferably applied by means of a piezoge controlled nanodispensers, which are similar to an inkjet printer, probe solution solutions with a volume of 100 picoliters on the surface without contact of the carrier material.
Die Immobilisierung der Sonden erfolgt z. B. wie in der EP-A-0 965 647 be schrieben: Die Generierung von DNA-Sonden erfolgt hierbei mittels PCR unter Verwendung eines sequenzspezifischen Primerpaares, wobei ein Primer am 5'- Ende modifiziert ist und einen Linker mit einer freien Aminogruppe trägt. Damit ist sichergestellt, dass ein definierter Strang der PCR-Produkte an einer Glas oberfläche gebunden werden kann, welche mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1,4-Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde. Die genspe zifischen PCR-Produkte sollen idealerweise eine definierte Nukleinsäuresequenz in einer Länge von 200-400 bp haben und nicht redundante Sequenzen beinhalten. Nach der Immobilisierung der PCR-Produkte über den derivatisier ten Primer wird der Gegenstrang des PCR-Produkts durch eine Inkubation bei 96°C für 10 Min entfernt.The probes are immobilized e.g. B. as in EP-A-0 965 647 be wrote: The generation of DNA probes takes place here by means of PCR Use of a sequence-specific primer pair, one primer at the 5'- End is modified and carries a linker with a free amino group. In order to ensures that a defined strand of the PCR products is on a glass Surface can be bound with 3-aminopropyltrimethoxysilane and then treated with 1,4-phenyldiisothiocyanate. The genspe Specific PCR products should ideally have a defined nucleic acid sequence have a length of 200-400 bp and non-redundant sequences include. After the immobilization of the PCR products via the derivatised The primer becomes the counter strand of the PCR product by incubation 96 ° C for 10 min away.
In einer für DNA-Chips typischen Anwendung wird mRNA aus zwei zu verglei chenden Zeilpopulationen isoliert. Die isolierten mRNAs werden mittels reverser Transkription unter Verwendung von z. B. fluoreszenzmarkierten Nukleotiden in cDNA umgewandelt. Dabei werden die zu vergleichenden Proben mit z. B. rot bzw. grün fluoreszierenden Nukleotiden markiert. Die cDNAs werden dann mit den auf dem DNA-Chip immobilisierten Gensonden hybridisiert und anschlie ßend die gebundenen Fluoreszenzen quantifiziert.In a typical application for DNA chips, mRNA is compared to two line populations isolated. The isolated mRNAs are reversed Transcription using e.g. B. fluorescence-labeled nucleotides in cDNA converted. The samples to be compared are z. Loaf or green fluorescent nucleotides marked. The cDNAs are then with hybridize the gene probes immobilized on the DNA chip and then connect them quantified the bound fluorescence.
Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt 1 bis etwa 5000, insbeson dere 1 bis etwa 1000, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 500, besonders bevor zugt etwa 10 bis etwa 250, in besonderem Maße bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschie dene Sonden. Die voneinander verschiedenen Sonden können jeweils in mehr facher Kopie auf dem Chip vorhanden sein.The biochip according to the invention preferably comprises 1 to about 5000, in particular 1 to about 1000, preferably about 10 to about 500, especially before adds about 10 to about 250, particularly preferably about 10 to about 100 and very particularly preferably about 10 to about 50 different from each other their probes. The different probes can each have more multiple copies are available on the chip.
Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt Nukleinsäuresonden, insbe sondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden. Die Nukleinsäuresonden weisen bevorzugt eine Länge von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden auf.The biochip according to the invention preferably comprises nucleic acid probes, in particular special RNA or PNA probes, particularly preferably DNA probes. The Nucleic acid probes preferably have a length of about 10 to about 1000, in particular about 10 to about 800, preferably about 100 to about 600, particularly preferably about 200 to about 400 nucleotides.
In einer weiteren bevorzugten Form umfasst der erfindungsgemäße Biochip Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.In a further preferred form, the biochip according to the invention comprises Peptide or protein probes, especially antibodies.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von
Molekülen, die ausgewählt sind unter:
Another object of the present invention is the use of molecules which are selected from:
- - Stratifin (14-3-3, σ-Isoform), - stratifin (14-3-3, σ-isoform),
- - GRP78/BiP,- GRP78 / BiP,
- - HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),- HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
- - phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isofor men des HSP27,- Phosphorylated, especially hyperphosphorylated Isofor men of the HSP27,
- - Fragmenten dieser Proteine,Fragments of these proteins,
- - für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oderMRNA coding for these proteins or protein fragments Molecules, or
- - Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,Fragments of these mRNA molecules,
als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut bei Menschen.as a stress and / or aging marker of the skin in humans.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testverfahren zum
Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstof
fen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, dadurch gekennzeichnet,
daß man
Another object of the present invention is a test method for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against skin stress and / or skin aging in vitro, characterized in that
- a) den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestim mung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines er findungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt,a) the skin status by an inventive method for determining tion of skin stress and / or skin aging, or by means of an er Test kits according to the invention for determining skin stress and / or skin aging, or by means of a biochip according to the invention certainly,
- b) einen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt,b) an active ingredient against skin stress and / or skin aging once or applied to the skin several times,
- c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, undc) the skin status again by an inventive method for Determination of skin stress and / or skin aging, or by means of of a test kit according to the invention for determining skin stress and / or skin aging, or by means of an inventive Biochips determined, and
- d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.d) the effectiveness of the active ingredient by comparing the results determined from a) and c).
Zur Beschleunigung des Testverfahrens ist es auch möglich, verschiedene
Wirkstoffe oder Placebos parallel auf verschiedene Hautareale aufzubringen;
beispielsweise einen Wirkstoff auf den linken Unterarm und ein Placebo auf den
rechten Unterarm, oder umgekehrt.To accelerate the test procedure, it is also possible to apply different active substances or placebos in parallel to different skin areas;
for example, an active ingredient on the left forearm and a placebo on the right forearm, or vice versa.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zum Nach weis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, umfassend Mittel zur Durchfüh rung des erfindungsgemäßen Testverfahrens.Another object of the present invention is a test kit for after knows the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical agents against skin stress and / or skin aging in vitro, comprising agents for implementation tion of the test method according to the invention.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von
Molekülen, die ausgewählt sind unter:
Another object of the present invention is the use of molecules which are selected from:
- - Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),- stratifin (14-3-3, σ-isoform),
- - GRP78/BiP,- GRP78 / BiP,
- - HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),- HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
- - phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isofor men des HSP27,- Phosphorylated, especially hyperphosphorylated Isofor men of the HSP27,
- - Fragmenten dieser Proteine,Fragments of these proteins,
- - für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oderMRNA coding for these proteins or protein fragments Molecules, or
- - Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,Fragments of these mRNA molecules,
zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.to demonstrate the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical Active substances against skin stress and / or skin aging.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Screening-
Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstof
fen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, dadurch gekennzeichnet,
daß man
Another object of the present invention is a screening method for the identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against skin stress and / or skin aging in vitro, characterized in that
- a) den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungs gemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalte rung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt,a) the skin status by an inventive method for determination of skin stress and / or skin aging, or by means of a fiction appropriate test kits for determining skin stress and / or skin age tion, or determined by means of a biochip according to the invention,
- b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung ein mal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, b) a potential active ingredient against skin stress and / or skin aging applied to the skin one or more times,
- c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Be stimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines er findungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, undc) the skin status again by an inventive method for loading mood of the skin stress and / or skin aging, or by means of an er Test kits according to the invention for determining skin stress and / or Skin aging, or determined using a biochip according to the invention, and
- d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.d) active ingredients by comparing the results from a) and c) certainly.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von
Molekülen, die ausgewählt sind unter:
Another object of the present invention is the use of molecules which are selected from:
- - Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),- stratifin (14-3-3, σ-isoform),
- - GRP78/BiP,- GRP78 / BiP,
- - HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),- HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
- - phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isofor men des HSP27,- Phosphorylated, especially hyperphosphorylated Isofor men of the HSP27,
- - Fragmenten dieser Proteine,Fragments of these proteins,
- - für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oderMRNA coding for these proteins or protein fragments Molecules, or
- - Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,Fragments of these mRNA molecules,
zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.for the identification of cosmetic or pharmaceutical agents against Skin stress and / or aging.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Her
stellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Haut
streß und/oder Hautalterung, dadurch gekennzeichnet, daß man
Another object of the present invention is a process for the manufacture of a cosmetic or pharmaceutical preparation against skin stress and / or skin aging, characterized in that
- a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening- Verfahrens, oder der Verwendung zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalte rung bestimmt unda) active ingredients with the help of the screening according to the invention Process, or use to identify cosmetic or pharmaceutical agents against skin stress and / or skin oldness determination and
- b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.b) active ingredients found to be cosmetic and pharmacological suitable and compatible carriers mixed.
Claims (23)
- a) Menschliche Haut, ein Vollhautmodell oder gentechnisch humanisierte Haut eines Tieres einem Streßstimulus aussetzt,
- b) Ein erstes Gemisch von Proteinen oder Fragmenten von Proteinen aus der in a) gestressten Haut gewinnt,
- c) ein zweites Gemisch von Proteinen oder Fragmenten von Proteinen aus nicht gestresster menschlicher Haut, einem nicht gestressten Vollhaut modell oder nicht gestresster gentechnisch humanisierter Haut eines Tie res gewinnt,
- d) die in b) und c) gewonnenen Gemische einer Analyse der Proteine oder Proteinfragmente unterwirft, und durch den Vergleich der Ergebnisse dieser Analyse die Faktoren identifiziert, die in gestreßter bzw. alter und ungestreßter bzw. junger Haut unterschiedlich stark produziert werden.
- a) exposes human skin, a full-skin model or genetically humanized skin of an animal to a stress stimulus,
- b) a first mixture of proteins or fragments of proteins is obtained from the skin stressed in a),
- c) a second mixture of proteins or fragments of proteins from non-stressed human skin, a non-stressed full skin model or non-stressed genetically humanized skin of a human being is obtained,
- d) subjecting the mixtures obtained in b) and c) to an analysis of the proteins or protein fragments, and by comparing the results of this analysis identifying the factors which are produced to different degrees in stressed or old and undressed or young skin.
- a) ein Gemisch von Proteinen oder Fragmenten von Proteinen aus mensch licher Haut gewinnt,
- b) das Gemisch auf das Vorhandensein und die Menge von Stratifin (14-3- 3, σ-Isoform), GRP78/BiP, HSP27 (Heat shock protein 27 kDa), phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27 oder von Fragmenten dieser Proteine untersucht und
- c) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es hinsichtlich der in b) aufgeführten Proteine ein für alte bzw. ge streßte Haut charakteristisches Translationsprofil aufweist; oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es hinsichtlich der in b) aufgeführten Proteine ein für junge bzw. ungestreß te Haut charakteristisches Translationsprofil aufweist.
- a) a mixture of proteins or fragments of proteins from human skin is obtained,
- b) the mixture was examined for the presence and the amount of stratifin (14-3-3, σ-isoform), GRP78 / BiP, HSP27 (Heat shock protein 27 kDa), phosphorylated, in particular hyperphosphorylated isoforms of HSP27 or fragments of these proteins and
- c) assigns the mixture examined in b) to old or stressed skin if it has a translation profile characteristic of old or stressed skin with regard to the proteins listed in b); or assigns the mixture of young or undressed skin examined in b) if it has a translation profile characteristic of young or undressed skin with regard to the proteins listed in b).
- a) einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und
- b) auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an min
destens eines der Moleküle befähigt sind, die ausgewählt sind unter:
Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
GRP78/BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27,
Fragmenten dieser Proteine,
für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
Fragmenten dieser mRNA-Moleküle.
- a) a solid, ie rigid or flexible support and
- b) on this immobilized probes which are capable of specific binding to at least one of the molecules selected from:
Stratifin (14-3-3, σ-isoform),
GRP78 / BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylated, in particular hyperphosphorylated, isoforms of HSP27,
Fragments of these proteins,
mRNA molecules coding for these proteins or protein fragments, or
Fragments of these mRNA molecules.
Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
GRP78/BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27,
Fragmenten dieser Proteine,
für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,
als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut bei Menschen.17. Use of molecules selected from:
Stratifin (14-3-3, σ-isoform),
GRP78 / BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylated, especially hyperphosphorylated isoforms of HSP27,
Fragments of these proteins,
mRNA molecules coding for these proteins or protein fragments, or
Fragments of these mRNA molecules,
as a stress and / or aging marker of the skin in humans.
- a) den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 11, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 12 bis 16 bestimmt,
- b) einen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt,
- c) erneut den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 11, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 12 bis 16 bestimmt, und
- d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
- a) the skin status is determined by a method according to one of claims 3 to 10, or by means of a test kit according to claim 11, or by means of a biochip according to one of claims 12 to 16,
- b) applying an active substance against skin stress and / or skin aging to the skin once or several times,
- c) the skin status is determined again by a method according to one of claims 3 to 10, or by means of a test kit according to claim 11, or by means of a biochip according to one of claims 12 to 16, and
- d) the effectiveness of the active ingredient is determined by comparing the results from a) and c).
Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
GRP78/BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27,
Fragmenten dieser Proteine,
für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,
zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.20. Use of molecules selected from:
Stratifin (14-3-3, σ-isoform),
GRP78 / BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylated, especially hyperphosphorylated isoforms of HSP27,
Fragments of these proteins,
mRNA molecules coding for these proteins or protein fragments, or
Fragments of these mRNA molecules,
to demonstrate the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against skin stress and / or skin aging.
- a) den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 11, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 12 bis 16 bestimmt,
- b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt,
- c) erneut den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 11, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 12 bis 16 bestimmt, und
- d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
- a) the skin status is determined by a method according to one of claims 3 to 10, or by means of a test kit according to claim 11, or by means of a biochip according to one of claims 12 to 16,
- b) applies a potential active substance against skin stress and / or skin aging to the skin one or more times,
- c) the skin status is determined again by a method according to one of claims 3 to 10, or by means of a test kit according to claim 11, or by means of a biochip according to one of claims 12 to 16, and
- d) active ingredients determined by comparing the results from a) and c).
Stratifin (14-3-3, σ-Isoform),
GRP78/BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylierten, insbesondere hyperphosphorylierten Isoformen des HSP27,
Fragmenten dieser Proteine,
für diese Proteine oder Proteinfragmente kodierenden mRNA- Molekülen, oder
Fragmenten dieser mRNA-Moleküle,
zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.22. Use of molecules selected from:
Stratifin (14-3-3, σ-isoform),
GRP78 / BiP,
HSP27 (Heat shock protein 27 kDa),
phosphorylated, especially hyperphosphorylated isoforms of HSP27,
Fragments of these proteins,
mRNA molecules coding for these proteins or protein fragments, or
Fragments of these mRNA molecules,
for the identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against skin stress and / or skin aging.
- a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des Verfahrens nach Anspruch 21, oder der Verwendung nach Anspruch 22 bestimmt und
- b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
- a) active ingredients determined using the method according to claim 21, or the use according to claim 22 and
- b) active ingredients found to be effective are mixed with cosmetically and pharmacologically suitable and compatible carriers.
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OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8131 | Rejection |