DE10315031B4 - Method for detecting sepsis and / or sepsis-like conditions - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur in vitro Erkennung von Sepsis, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst: a) Isolieren einer Mehrzahl von Proben-RNAs aus einer aus einem Menschen stammenden Blutprobe; a1) Zugeben von cDNA, die ein für Sepsis spezifisches Gen oder Genfragment ist b) Markieren der Proben-RNA und/oder der cDNA mit einem detektierbaren Marker; c) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der cDNA unter Hybridisierungsbedingungen; d) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, welche eine Kontrolle ohne SIRS/Sepsis darstellt, mit wenigstens einer cDNA unter Hybridisierungsbedingungen; e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-RNA und der Kontroll-RNA; f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für Sepsis spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle; g) wobei Sepsis vorliegt, wenn die Gesamtheit der folgenden Gruppe von Genen oder Genfragmenten mit den SEQ ID NO: 325, 268, 294, 235, 262, 240, 248, 331, 486, 251, 903, 196, 324, 672, 134, 363, 259, 168, 326, 671, 114, 253, 116, 489,485, 273, 154, 187, 358, 495, 330, 327, 1511, 314, 339, 219, 328, 348, 272, 232, 349, 310, 65, 265, 361, 269, 652, 1755, 151, 275, 66, 317, 329 überexprimiert ist; und/oder die Gesamtheit der folgenden Gruppe von Genen oder Genfragmenten mit den SEQ ID NO: 2050, 375, 211, 250, 1477, 130, 23, 46, 26, 764, 383, 298, 28, 146, 1352, 42, 257, 1502, 203, 19, 12, 95, 188, 47, 45, 237, 706, 129, 1353, 137, 51, 43, 169, 1462, 59, 378, 246, 201, 67, 1597, 216, 490, 5, 93, 142, 189, 1442, 152, 53, 238, 180, 491, 190, 148, 386, 245 unterexprimiert ist.Method for in vitro detection of sepsis, characterized in that it comprises the following steps: a) isolating a plurality of sample RNAs from a blood sample derived from a human; a1) adding cDNA which is a gene or gene fragment specific for sepsis b) marking the sample RNA and / or the cDNA with a detectable marker; c) bringing the sample RNA into contact with the cDNA under hybridization conditions; d) bringing control RNA, which represents a control without SIRS / sepsis, into contact with at least one cDNA under hybridization conditions; e) quantitative detection of the marker signals of the hybridized sample RNA and the control RNA; f) comparing the quantitative data of the marker signals in order to make a statement as to whether genes or gene fragments specific for sepsis are more or less expressed in the sample than in the control; g) where sepsis is present if the entirety of the following group of genes or gene fragments with the SEQ ID NO: 325, 268, 294, 235, 262, 240, 248, 331, 486, 251, 903, 196, 324, 672, 134, 363, 259, 168, 326, 671, 114, 253, 116, 489,485, 273, 154, 187, 358, 495, 330, 327, 1511, 314, 339, 219, 328, 348, 272, 232, 349, 310, 65, 265, 361, 269, 652, 1755, 151, 275, 66, 317, 329 is overexpressed; and / or the entirety of the following group of genes or gene fragments with the SEQ ID NO: 2050, 375, 211, 250, 1477, 130, 23, 46, 26, 764, 383, 298, 28, 146, 1352, 42, 257, 1502, 203, 19, 12, 95, 188, 47, 45, 237, 706, 129, 1353, 137, 51, 43, 169, 1462, 59, 378, 246, 201, 67, 1597, 216, 490, 5, 93, 142, 189, 1442, 152, 53, 238, 180, 491, 190, 148, 386, 245 is under-expressed.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Erkennung von Sepsis gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 15.The present invention relates to a method for in vitro detection of sepsis according to claim 1 or claim 15.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Genaktivitätsmarker für die Diagnose und Therapieoptimierung von Sepsis.In particular, the present invention relates to gene activity markers for the diagnosis and therapy optimization of sepsis.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung neue Diagnosemöglichkeiten, die sich aus experimentell abgesicherten Erkenntnissen im Zusammenhang mit dem Auftreten von Änderungen der Genaktivitäten (Transkription und nachfolgende Proteinexpression) bei gefährdeten Patienten mit Sepsis, sepsis-ähnlichen systemischen Infektionen und klinischen Zuständen mit deutlich erhöhtem Sepsisrisiko (z. B. nach schweren Traumata, Organtransplantationen, offenenen operativen Eingriffen, Hyperthermibehandlungen etc.) ableiten lassen.Furthermore, the present invention relates to new diagnostic options, which are based on experimentally verified findings in connection with the occurrence of changes in gene activities (transcription and subsequent protein expression) in vulnerable patients with sepsis, sepsis-like systemic infections and clinical conditions with significantly increased risk of sepsis (z. After severe trauma, organ transplants, open surgery, Hyperthermbehandlungen etc.) can be derived.
Trotz großer Fortschritte im pathophysiologischen Verständnis und der supportiven Behandlung von Infektionserkrankungen bilden Sepsis und konsekutives Multiorganversagen heute die Haupttodesursache auf nichtkardiologischen Intensivstationen [1–3]. Man nimmt an, daß in den U.S.A. jährlich ca. 400.000 Patienten an einer Sepsis erkranken [4]. Die Letalität beträgt ca. 40% und steigt bei Entwicklung eines Schocks auf 70–80% an [5, 6]. Die von der Grunderkrankung der Patienten und der zugrundeliegenden Infektion unabhängige Exzessletalität beträgt bis zu 35% [8].Despite major advances in the pathophysiological understanding and supportive treatment of infectious diseases, sepsis and consecutive multi-organ failure are now the leading cause of death in non-cardiac intensive care units [1-3]. It is estimated that approximately 400,000 patients in the U.S.A. annually develop sepsis [4]. The lethality is about 40% and increases when shock develops to 70-80% [5, 6]. The excess lethality independent of the underlying disease of the patients and the underlying infection is up to 35% [8].
Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag der Sepsis ist von fachübergreifender Bedeutung. In den letzten Jahrzehnten veränderte sich die Letalität der Sepsis nur unwesentlich. Im Vergleich dazu stieg die Inzidenz kontinuierlich an (z. B. zwischen 1979 und 1987 um 139% von 73,6 auf 176 pro 100.000 Krankenhauspatienten) [7]. Dadurch werden in zunehmenden Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten oder experimentellen Therapieverfahren zahlreicher Fachgebiete (Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/Onkologie) gefährdet, da diesen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Sepsisrisikos immanent ist. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Prophylaxe, Behandlung und insbesondere der Diagnose der Sepsis gebunden.The morbidity and mortality contribution of sepsis is of interdisciplinary importance. In recent decades, the fatality of sepsis changed only insignificantly. In comparison, the incidence increased continuously (for example, between 1979 and 1987, by 139% from 73.6 to 176 per 100,000 hospital patients) [7]. As a result, the treatment success of the most advanced or experimental therapy methods in numerous fields (visceral surgery, transplantation medicine, hematology / oncology) are increasingly endangered, as these are inherently an increase in the risk of sepsis. The reduction in morbidity and mortality of a large number of critically ill patients is therefore linked to a simultaneous advance in the prophylaxis, treatment and, in particular, the diagnosis of sepsis.
Sepsis ist ein Ergebnis von stark heterogenen molekularen Vorgängen, die gekennzeichnet sind durch eine Einbeziehung von vielen Komponenten und deren Wechselwirkungen auf jeder organisatorischen Ebene des menschlichen Körpers: Gene, Zellen, Gewebe, Organe. Die Komplexität der zugrundeliegenden biologischen und immunologischen Prozesse haben viele Arten von Forschungsstudien hervorgerufen, die einen weiten Bereich klinischer Aspekte umfassen. Eines der hieraus zu erkennenden Ergebnisse war, daß die Bewertung neuer Sepsis-Therapien durch relativ unspezifische, klinisch-basierte Einschlusskriterien, welche die molekularen Mechanismen in nicht ausreichender Weise wiedergeben, erschwert wird [9].Sepsis is a result of highly heterogeneous molecular processes characterized by the inclusion of many components and their interactions at every organizational level of the human body: genes, cells, tissues, organs. The complexity of the underlying biological and immunological processes has led to many types of research studies covering a wide range of clinical aspects. One of the results to be seen was that the evaluation of new sepsis therapies is complicated by relatively nonspecific, clinically-based inclusion criteria that do not adequately reflect the molecular mechanisms [9].
Daher ist ein dringender Bedarf für innovative diagnostische Mittel entstanden, welche die Fähigkeit des Fachmanns verbessern sollten, Patienten mit Sepsis frühzeitig zu diagnostizieren, die Schwere einer Sepsis auf molekularer Ebene messbar zu machen und im klinischem Verlauf vergleichbar zu gestalten, und bezüglich der individuellen Prognose und dem Ansprechen auf spezifische Behandlungen Aussagen abzuleiten.Therefore, an urgent need has arisen for innovative diagnostic agents which should improve the ability of the skilled artisan to diagnose patients with sepsis at an early stage, to measure the severity of sepsis at the molecular level and to make them comparable in clinical course, and to individual prognosis to derive statements in response to specific treatments.
Technologische Fortschritte, insbesondere die Entwicklung der Mikroarray-Technologie, versetzen den Fachmann nun in die Lage, 10000 oder mehr Gene und deren Genprodukte gleichzeitig zu vergleichen. Die Anwendung solcher Mikroarray-Technologien kann nun Hinweise auf den Status von Gesundheit, Regulationsmechanismen, biochemischer Wechselwirkungen und Signalisierungsnetzwerken geben. Das Verbessern des Verständnisses darüber, wie ein Organismus auf Infektionen reagiert, sollte die Entwicklung von verstärkten Erkennungs-, Diagnose- und Behandlungsmodalitäten für Sepsis-Erkrankungen erleichtern.Technological advances, particularly the development of microarray technology, now enable the skilled artisan to simultaneously compare 10,000 or more genes and their gene products. The application of such microarray technologies can now provide information on the status of health, regulatory mechanisms, biochemical interactions, and signaling networks. Improving understanding of how an organism responds to infections should facilitate the development of enhanced detection, diagnosis and treatment modalities for sepsis disorders.
Mikroarrays stammen vom „Southern blotting” [10] ab, was die erste Herangehensweise darstellt, DNA-Moleküle in einer räumlich ansprechbaren Art und Weise auf einer festen Matrix zu immobilisieren. Die ersten Mikroarrays bestanden aus DNA-Fragmenten, oft mit unbekannter Sequenz, und wurden auf eine poröse Membran (normalerweise Nylon) punktweise aufgebracht. Routinegemäß wurden cDNA, genomische DNA oder Plasmid-Bilbliotheken verwendet, und das hybridisierte Material wurde mit einer radioaktiven Gruppe markiert [11–13].Microarrays are derived from Southern blotting [10], which is the first approach to immobilize DNA molecules in a spatially responsive manner on a solid matrix. The first microarrays consisted of DNA fragments, often of unknown sequence, and were spotted onto a porous membrane (usually nylon). Routine use was made of cDNA, genomic DNA or plasmid libraries, and the hybridized material was labeled with a radioactive group [11-13].
Kürzlich hat es die Verwendung von Glas als Substrat und Fluoreszenz zur Detektion zusammen mit der Entwicklung neuer Technologien für die Synthese und für das Aufbringen der Nukleinsäuren in sehr hohen Dichten erlaubt, die Nukleinsäurearrays zu miniaturisieren bei gleichzeitiger Erhöhung des experimentellen Durchsatzes und des Informationsgehaltes [14–16].Recently, it has the use of glass as a substrate and fluorescence for detection along with the development of new technologies for the synthesis and for applying the nucleic acids in very high levels Densities allow to miniaturize the nucleic acid arrays while increasing the experimental throughput and information content [14-16].
Weiterhin ist aus
Eine Begründung für die Anwendbarkeit der Mikroarray-Technologie wurde zunächst durch klinische Untersuchungen auf dem Gebiet der Krebsforschung geliefert. Hier haben Expressionsprofile ihre Nützlichkeit bei der Identifizierung von Aktivitäten einzelner Gene oder Gengruppen gezeigt, die mit bestimmten klinischen Phänotypen korrelieren [17]. Durch die Analyse vieler Proben, die von Individuen mit oder ohne akute Leukämie oder diffuse Lymphome großer B-Zellen stammten, wurden Genexpressionsmarker (RNA) gefunden und auf die Klassifizierung dieser Krebsarten angewandt [17, 18]. Golub et al. haben herausgefunden, daß verläßliche Vorhersagen nicht aufgrund von irgendeinem einzelnen Gen gemacht werden können, aber daß Vorhersagen, die auf den Expressionsspiegeln von 53 Genen (ausgewählt aus über 6000 Genen, die auf den Arrays vertreten waren) basieren, sehr genau sind [17].A rationale for the applicability of microarray technology was first provided by clinical research in the field of cancer research. Here, expression profiles have shown their usefulness in the identification of activities of individual genes or gene groups that correlate with certain clinical phenotypes [17]. By analyzing many samples from individuals with or without acute leukemia or diffuse lymphomas of large B cells, gene expression markers (RNA) were found and applied to the classification of these cancers [17, 18]. Golub et al. found that reliable predictions can not be made on the basis of any single gene, but that predictions based on the expression levels of 53 genes (selected from over 6000 genes represented on the arrays) are very accurate [17].
Alisadeh et al. [18] untersuchten große B-Zell Lymphome (DLBCL). Die Autoren erarbeiteten Expressionsprofile mit einem „Lymphochip”, einem Mikroarray, der 18000 Klone komplementärer DNA trug und entwickelt worden war, um Gene zu überwachen, die in normale und abnormale Lymphozytenentwicklung involviert sind. Unter Verwendung von Cluster-Analyse waren sie in der Lage, DILBCL in zwei Kategorien einzuteilen, welche starke Unterschiede bezüglich der Überlebenschancen der Patienten aufzeigten. Die Genexpressionsprofile dieser Untergruppen entsprachen zwei bedeutsamer Stadien der B-Zelldifferenzierung.Alisadeh et al. [18] investigated large B-cell lymphomas (DLBCL). The authors developed expression profiles with a "lymphochip," a microarray carrying 18,000 complementary DNA clones designed to monitor genes involved in normal and abnormal lymphocyte development. Using cluster analysis, they were able to classify DILBCL into two categories that showed significant differences in patient survival rates. The gene expression profiles of these subgroups corresponded to two significant stages of B cell differentiation.
Besonders wertvoll hat sich die Bestimmung von Genexpressionsprofilen zur differentialdiagnostischen Unterscheidung von Krankheitserscheinungen, die auf systemische mikrobielle Infektionen zurückzuführen sind, von anderen Krankheitserscheinungen nichtinfektiöser Ätiologie erwiesen, die aufgrund ihres klinischen Erscheinungsbildes auf eine Sepsis hindeuten könnten, jedoch in Wirklichkeit nicht auf eine systemische mikrobielle Infektion zurückzuführen sind, z. B. von Krankheitserscheinungen, die auf nicht-infektiöse Entzündungen einzelner Organe zurückzuführen sind (20, 21, 22). Die Messung von Genexpressionprofilen zur Diagnose einer Sepsis oder sepsisähnlicher Zustände aus Körperflüssigkeiten wurde noch nicht beschrieben.Particularly valuable has been the determination of gene expression profiles for differential diagnosis of disease symptoms attributable to systemic microbial infections from other disease manifestations of non-infectious aetiology, which may be due to their clinical appearance suggest a sepsis, but in fact not due to a systemic microbial infection are, for. For example, symptoms of disease due to non-infectious inflammation of individual organs (20, 21, 22). The measurement of gene expression profiles for the diagnosis of sepsis or sepsis-like conditions from body fluids has not been described.
Cobb et al. [23] beschreibt eine prospektive Tierstudie anhand eines Mäusemodells, wobei sepsisbedingte Genexpressionsprofile aus der Mäusemilz verglichen werden mit Leberantworten, die unter Verwendung von cDNA-Microarrarrays untersucht wurden.Cobb et al. [23] describes a prospective animal study using a mouse model that compares sepsis-related gene expression profiles from mouse spleen with liver responses that were investigated using cDNA microarrays.
Pathan et al. [24] beschreiben die Komplexität der inflammatorischen Antwort auf eine Meningokokken-Sepsis.Pathan et al. [24] describe the complexity of the inflammatory response to meningococcal sepsis.
Wiegand et al. [25] offenbart eine spezielle Untersuchung der Genexpressionsmuster in humanen Monozyten als surrogater Marker für Sepsis.Wiegand et al. [25] discloses a special study of gene expression patterns in human monocytes as a surrogate marker for sepsis.
Heller et al. [26] untersucht mittels Genexpression und microarrays eine Reihe von nicht Sepsis-bezogenen Erkrankungen, z. B. rheumatoide Arthritis im Vergleich zu entzündlichen Darmerkrankungen.Heller et al. [26] uses gene expression and microarrays to investigate a number of non-sepsis-related diseases, eg, As rheumatoid arthritis compared to inflammatory bowel disease.
Rowe et al. [27] betrifft den technologischen Hintergrund von Arrays in Form von Immunsensoren zur Erfassung klinischer Analyte, wobei das D-Dimer als Marker für Sepsis und thrombotische Störungen unersucht wird. Es werden jedoch keine Genexpressionen untersucht.Rowe et al. [27] addresses the technological background of immune-array arrays for the detection of clinical analytes, using D-dimer as a marker for sepsis and thrombotic disorders. However, no gene expression is investigated.
Ausgangspunkt für die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarten Erfindung ist die Erkenntnis, daß vor der Diagnose von Sepsis, bei Sepsis und sepsisähnlichen systemischen Infektionen in biologischen Proben eines Individuums sich von normalen Werten unterscheidende RNA-Spiegel, bzw. sich davon ableitbare Peptid- und Teilpeptid-Spiegel in einem Serum oder Plasma eines Patienten, bei dem ein Sepsisrisiko besteht bzw. bei dem sepsistypische Krankheitserscheinungen festgestellt werden, feststellbar sind.The starting point for the invention disclosed in the present patent application is the recognition that, prior to the diagnosis of sepsis, sepsis and sepsis-like systemic infections in biological samples of an individual, RNA levels differing from normal values, or thereof deducible peptide and partial peptide levels in a serum or plasma of a patient who is at risk of sepsis or sepsistypische disease symptoms are detected detectable.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Erkennung von Sepsis schon in einem frühen Stadium ermöglicht.The present invention is therefore based on the object to provide a method that allows the detection of sepsis at an early stage.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 oder 15 gelöst.This object is achieved by a method having the characterizing features of claim 1 or 15.
Eine erste Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren gemäß Anspruch 1.A first embodiment of the invention is a method according to claim 1.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Kontroll-RNA vor dem Messen der Proben-RNA mit der cDNA hybridisiert und die Markierungssignale des Kontroll-RNA/DNA-Komplexes erfaßt und gegebenenfalls in Form einer Kalibrierkurve oder -tabelle ablegt.A further embodiment of the invention is characterized in that the control RNA is hybridized with the cDNA before the measurement of the sample RNA and the marker signals of the control RNA / DNA complex are detected and optionally deposited in the form of a calibration curve or table.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als Proben-RNA mRNA verwendet wird.Another embodiment of the invention is characterized in that mRNA is used as the sample RNA.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die DNA an vorbestimmten Bereichen auf einem Träger in Form eines Microarrays angeordnet, insbesondere immobilisiert, wird.A further embodiment of the invention is characterized in that the DNA is arranged at predetermined regions on a carrier in the form of a microarray, in particular immobilized.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass für Sepsis spezifische Genfragmente 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotide aufweisen.A further embodiment of the invention is characterized in that sepsis-specific gene fragments have 20-200, more preferably 20-80 nucleotides.
Die Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 6242 sind dem angefügten 759-seitigen, 6242 Sequenzen umfassenden, Sequenzprotokoll, das somit Teil der Beschreibung ist, im Einzelnen offenbart. Dieses Sequenzprotokoll beinhaltet zudem eine Zuordnung der einzelnen Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 6242 zu deren GeneBank Accession Nr. (Internet-Zugang über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).The sequences having the sequence ID: 1 to the sequence ID: 6242 are disclosed in detail in the attached 759-page, 6242 sequences, sequence listing, which is thus part of the description. This sequence protocol also includes an assignment of the individual sequences with the sequence ID: 1 to the sequence ID: 6242 to their GeneBank Accession No. (Internet access via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Sonden markiert werden. Für diese Ausführungsform finden selbstkomplementäre Oligonukleotide, so genannte Molecular beacons, als Sonden Verwendung. Sie tragen an ihren Enden ein Fluorophor/Quencher-Paar, so daß sie in Abwesenheit einer komplementären Sequenz in einer gefalteten Haarnadelstruktur vorliegen und erst mit einer entsprechenden Probensequenz ein Fluoreszenzsignal liefern. Die Haarnadelstruktur der Molecular Beacons ist so lange stabil, bis die Probe an der spezifischen Fängersequenzsequenz hybridisiert, was zu einer Konformationsänderung und damit auch Freisetzung der Reporterfluoreszenz führt.Another embodiment of the invention is characterized in that the immobilized probes are labeled. For this embodiment, self-complementary oligonucleotides, so-called molecular beacons, are used as probes. They carry at their ends a fluorophore / quencher pair, so that they are in the absence of a complementary sequence in a folded hairpin structure and only deliver a fluorescence signal with a corresponding sample sequence. The hairpin structure of the Molecular Beacons is stable until the probe hybridizes to the specific capture sequence sequence, resulting in a conformational change and concomitant release of reporter fluorescence.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere 32P, 14C, 125I, 155Eu, 33P oder 3H verwendet wird.A further embodiment of the invention is characterized in that a radioactive marker, in particular 32 P, 14 C, 125 I, 155 Eu, 33 P or 3 H is used as the detectable marker.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, oder ein elektrischer Marker, insbesondere Potential- und/oder Kapazitätsänderung, verwendet wird.A further embodiment of the invention is characterized in that a non-radioactive marker, in particular a color or fluorescence marker, an enzyme marker or immune marker, or an electrical marker, in particular potential and / or capacitance change, is used as the detectable marker.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA dieselbe Markierung tragen.Another embodiment of the invention is characterized in that the sample RNA and control RNA carry the same label.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA unterschiedliche Markierungen tragen.Another embodiment of the invention is characterized in that the sample RNA and control RNA carry different labels.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Sonden auf Glas oder Kuststoff, immobilisiert werden.Another embodiment of the invention is characterized in that the cDNA probes are immobilized on glass or plastic.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.Another embodiment of the invention is characterized in that the individual cDNA molecules are immobilized via a covalent bond to the carrier material.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle mittels Adsorption an das Trägermaterial immobilisiert werden.Another embodiment of the invention is characterized in that the individual cDNA molecules are immobilized by adsorption to the carrier material.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren gemäß Anspruch 15. Another embodiment of the invention is a method according to claim 15.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper auf einem Träger in Form eines Microarrays immobilisiert ist.A further embodiment of the invention is characterized in that the antibody is immobilized on a carrier in the form of a microarray.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es als Immunassay ausgebildet ist.Another embodiment of the invention is characterized in that it is designed as an immunoassay.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des therapeutischen Verlaufs, zur Risikoabschätzung für Patienten sowie zur post mortem Diagnose von Sepsis und/oder septischen Zuständen und/oder systemischen Entzündungen und/oder Infektionen eingesetzt werden.The method according to the invention can be used for the differential diagnostic early detection, for the control of the therapeutic course, for the risk assessment for patients as well as for the post-mortem diagnosis of sepsis and / or septic conditions and / or systemic inflammations and / or infections.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere 32P, 14C, 125I, 155Eu, 33P oder 3H verwendet wird.A further embodiment of the invention is characterized in that a radioactive marker, in particular 32 P, 14 C, 125 I, 155 Eu, 33 P or 3 H is used as the detectable marker.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker verwendet wird.A further embodiment of the invention is characterized in that a non-radioactive marker, in particular a color or fluorescence marker, an enzyme marker or immune marker is used as the detectable marker.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide dieselbe Markierung tragen.Another embodiment of the invention is characterized in that the sample peptides and control peptides carry the same label.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide unterschiedliche Markierungen tragen.Another embodiment of the invention is characterized in that the sample peptides and control peptides carry different labels.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.Another embodiment of the invention is characterized in that the peptide probes are immobilized on glass or plastic.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.Another embodiment of the invention is characterized in that the individual peptide molecules are immobilized via a covalent bond to the carrier material.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels Adsorption an das Trägermaterial immobilisiert werden.Another embodiment of the invention is characterized in that the individual peptide molecules are immobilized by adsorption on the carrier material.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels monoklonaler Antikörper oder deren bindenden Fragmenten erkannt werden.Another embodiment of the invention is characterized in that the individual peptide molecules are recognized by means of monoclonal antibodies or their binding fragments.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Bestimmen einzelner Peptide mittels Immunassay, oder Präzipitationsassay unter Verwendung monoklonaler Antikörper durchgeführt wird.Another embodiment of the invention is characterized in that the determination of individual peptides is performed by immunoassay or precipitation assay using monoclonal antibodies.
Es ist dem Fachmann klar, daß die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.It is clear to the person skilled in the art that the individual features of the invention set out in the claims can be combined with one another without restriction.
Als Markergene im Sinne der Erfindung werden alle abgeleiteten DNA-Sequenzen, Partialsequenzen und synthetischen Analoga (beispielsweise Peptido-Nukleinsäuren, PNA) verstanden. Weiterhin werden im Sinne der Erfindung alle von den Markergenen kodierten Proteine, Peptide bzw. Partialsequenzen oder synthetische Peptidomimetica verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.For the purposes of the invention, marker genes are understood to mean all derived DNA sequences, partial sequences and synthetic analogs (for example peptido-nucleic acids, PNA). Furthermore, for the purposes of the invention, all proteins encoded by the marker genes, peptides or partial sequences or synthetic peptidomimetics are understood. The description of the invention related to gene expression determination at the RNA level is not a limitation but only an exemplary application.
Eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Messung der differentiellen Genexpression eines Patienten zur Diagnose einer Sepsis. Hierzu wird die RNA aus dem Vollblut eines Patienten und eine Kontrollprobe eines gesunden Probanden isoliert. Die RNA wird anschließend markiert, beispielsweise radioaktiv mit 32P oder mit Farbstoffmolekülen (Fluoreszenz). Als Markierungsmoleküle können alle im Stand der Technik zu diesem Zwecke bekannten Moleküle eingesetzt werden. Entsprechende Markierungsverfahren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt.One application of the method according to the invention is the measurement of the differential gene expression of a patient for the diagnosis of sepsis. For this purpose, the RNA is isolated from the whole blood of a patient and a control sample of a healthy subject. The RNA is then labeled, for example radioactively with 32 P or with dye molecules (fluorescence). As labeling molecules, it is possible to use all molecules known for this purpose in the state of the art. Corresponding labeling methods are also known to the person skilled in the art.
Die so markierte RNA wird anschließend mit auf einem Microarray immobilisierten cDNA-Molekülen hybridisiert. Die auf dem Microarray immobilisierten cDNA-Moleküle stellen eine spezifische Auswahl der Gene gemäß Anspruch 1 dieser Erfindung für die Diagnose einer Sepsis.The RNA thus labeled is then hybridized with cDNA molecules immobilized on a microarray. The cDNA molecules immobilized on the microarray provide a specific selection of the genes according to claim 1 of this invention for the diagnosis of sepsis.
Die Intensitätssignale der hybridisierten Moleküle werden im Anschluss durch geeignete Messgeräte (Phosporimager, Microarray-Scanner) gemessen und durch weitere softwaregestützte Auswertungen analysiert. Aus den gemessenen Signalintensitäten werden die Expressionsverhältnisse zwischen der Patientenprobe und der Kontrolle bestimmt. Aus den Expressionsverhältnissen der unter- und/oder überregulierten Gene lassen sich wie in den nachstehend dargestellten Experimenten Rückschlüsse auf eine Sepsis. The intensity signals of the hybridized molecules are subsequently measured by suitable measuring devices (phosporimager, microarray scanner) and analyzed by further software-supported evaluations. From the measured signal intensities, the expression ratios between the patient sample and the control are determined. The expression ratios of the under- and / or over-regulated genes can be used to draw conclusions about sepsis as in the experiments presented below.
Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung der differentiellen Genexpression für die therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung einer Sepsis. Hierzu wird aus den in zeitlichen Abständen gesammelten Blutproben des Patienten die RNA (Proben-RNA) isoliert. Die verschiedenen RNA-Proben werden zusammen mit der Kontrollprobe markiert und mit ausgewählten Genen gemäß dem Anspruch 1, welche auf einem Microarray immobilisiert sind, hybridisiert. Aus den jeweiligen Expressionsverhältnissen läßt sich somit der Therapieverlauf beurteilen.Another application of the method according to the invention consists in the measurement of the differential gene expression for the therapy-accompanying course assessment of a sepsis. For this purpose, the RNA (sample RNA) is isolated from the patient's blood samples collected at intervals. The various RNA samples are labeled together with the control and hybridized with selected genes according to claim 1 immobilized on a microarray. From the respective expression ratios can thus assess the course of therapy.
Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung des Bindungsgrades von Proteinen, beispielsweise monoklonaler Antikörper, mittels der Verwendung von Immunassays, Protein- oder Peptidarrays oder Präpitationsassays. Durch die Bestimmung der Konzentration der von den Sequenzen der in Anwendungsbeispiel 1 aufgeführten Nukleinsäuren entsprechenden Proteine oder Peptide kann auf ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung einer Sepsis oder sepsisähnlicher Zustände geschlossen werden. Weiterhin ermöglicht diese Verfahrenweise die differentialdiagnostische Erkennung bei Sepsispatienten.A further application of the method according to the invention consists in the measurement of the degree of binding of proteins, for example monoclonal antibodies, by means of the use of immunoassays, protein or peptide arrays or prepitiation assays. By determining the concentration of proteins or peptides corresponding to the sequences of the nucleic acids listed in application example 1, an increased risk for the development of sepsis or sepsis-like states can be concluded. Furthermore, this procedure allows differential diagnosis in sepsis patients.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung der Ausführungsbeispiele sowie anhand der Zeichnung.Further advantages and features of the present invention will become apparent from the description of the embodiments and from the drawing.
Es zeigt:It shows:
In
Die Gele (Cibacron FT, W1–W3, 400 mM NaCl, IEF pH 3–10, Coomassie) können wie folgt erstellt werden:
250 Mikrogramm präzipitiertes Serum-Protein werden in einer Lösung bestehend aus 8 M Harnstoff; 2,0 M Thioharnstoff; 4% CHAPS; 65 mM DTT und 0,4% (w/v) Bio-Lytes 3/10 (Bio-Rad) aufgenommen und einer isoelektrischen Fokussierung, sowie einer nachfolgenden SDS-PAGE unterzogen.The gels (Cibacron FT, W1-W3, 400 mM NaCl, IEF pH 3-10, Coomassie) can be prepared as follows:
250 micrograms of precipitated serum protein are dissolved in a solution consisting of 8 M urea; 2.0 M thiourea; 4% CHAPS; 65 mM DTT and 0.4% (w / v) Bio-Lytes 3/10 (Bio-Rad) and subjected to isoelectric focusing and subsequent SDS-PAGE.
Die fertigen 2-dimensionalen Gele werden mit Coomassie Brilliant Blau G-250 angefärbt.The finished 2-dimensional gels are stained with Coomassie Brilliant Blue G-250.
Ausführungsbeispiel 1:Embodiment 1
Untersuchung zur Genexpression zwischen einem Patienten mit einer frühen Sepsis und einer KontrollprobeExamination of gene expression between a patient with early sepsis and a control sample
Es wurde die Genexpression bei Auftreten einer frühen Sepsis und einer Kontrollprobe gemessen. Die Patientendaten sind in Tabelle 1 zusammengefasst.Gene expression was measured on the occurrence of early sepsis and a control sample. The patient data are summarized in Table 1.
Nach Abnahme des Vollblutes wurde die totale RNA unter Anwendungen von RNAeasy gemäß den Vorgaben des Herstellers (Quiagen) isoliert. Im Anschluss wurde aus der totalen RNA die cDNA mittels reverser Transkrition mittels Superscript II RT (Invitrogen) nach dem Protokoll des Herstellers synthetisiert, mit 33P radioaktiv markiert und hydrolisiert. After collection of the whole blood, the total RNA was isolated using RNAeasy according to the manufacturer's instructions (Quiagen). The cDNA was then synthesized from the total RNA by means of reverse transcription using Superscript II RT (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol, radiolabeled with 33 P and hydrolyzed.
Für die Hybridisierung wurden Filtermembranen der Deutschen Ressourcenzentrum für Genomforschung gGmbH (RZPD) verwendet. Diese Filtermembran war mit ca. 70.000 humanen cDNA-Molekülen bestückt.For the hybridization filter membranes of the German Resource Center for Genome Research gGmbH (RZPD) were used. This filter membrane was populated with approximately 70,000 human cDNA molecules.
Die vorbereiteten und markierten Proben wurden mit der Filtermembran entsprechend den Anweisungen des RZPD hybridisiert und im Anschluss gewaschen. Nach einer 24-stündigen Exposition im Phosphorimager wurde die radioaktiven Signale ausgewertet.The prepared and labeled samples were hybridized with the filter membrane according to the instructions of the RZPD and subsequently washed. After a 24-hour exposure in the phosphorimager, the radioactive signals were evaluated.
Aus den Signalintensitäten wurden mittels der Software AIDA Array Evaluation die Expressionsverhältnisse zwischen Patienten- und Kontrollprobe berechnet.From the signal intensities the expression ratios between patient and control sample were calculated by means of the software AIDA Array Evaluation.
Tabelle 2 zeigt diejenigen Gene, die in der Patientenprobe gefunden wurden, die gegenüber der Kontrollprobe signifikant überexprimiert waren (Expressionsverhältnisse zwischen 13,67 und 98,33). Weiterhin sind in Tabelle 3 diejenigen Gene gezeigt, die in der Patientenprobe signifikant unterexprimiert gegenüber der Kontrollprobe waren (Expressionsverhältnisse zwischen 0,01 und 0,09). Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass die in Tabelle 2 und Tabelle 3 aufgeführten Gene mit dem Auftreten einer frühen Sepsis korrelieren. Somit stellen die aufgeführten Gene Markergene für die Diagnose einer frühen Sepsis dar. Tabelle 2: Expressionverhältnis überexprimierter Gene zwischen Patienten- und Kontrollprobe
Diese charakteristischen Veränderungen sind für das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 15 ausnutzbar.These characteristic changes are exploitable for the method according to claim 1 or 15 according to the invention.
Die in den Tabellen 2 und 3 aufgeführten GeneBank Accession Nummern (Internet-Zugang über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) der einzelnen Sequenzen sind in dem dieser Anmeldung angefügten 759-seitigen Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen jeweils einer Sequenz ID (Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 6242) zugeordnet. Dieses Sequenzprotokoll ist Teil der vorliegenden Erfindung.The GeneBank accession numbers listed in Tables 2 and 3 (Internet access via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) of the individual sequences are in the 759-page sequence listing attached to this application, which thus forms part of the invention is in each case assigned to a sequence ID (sequence ID: 1 to the sequence ID: 6242). This sequence listing is part of the present invention.
Durchführung:Execution:
RNA-Vorbereitung. Die konditionierten Medien wurden aus den Kulturflaschen entfernt und die adherenten Zellen wurden gemäß den Herstelleranweisungen direkt in den Kulturflaschen unter Verwendung von TRIzol-Reagens (GIBCO/BRL) lysiert.RNA preparation. The conditioned media were removed from the culture flasks and the adherent cells were lysed directly in the culture flasks using TRIzol reagent (GIBCO / BRL) according to the manufacturer's instructions.
Nach einem Deproteinierungszyklus wurde die RNA durch Zusatz von Isopropanol präzipitiert, danach mit Äthanol gespült und erneut in 200 μl RNA-sicherer Resuspensions-Lösung (Ambion, Austin, TX) gelöst. Die RNA-Präparate wurden mit 0,1 Mengeneinheiten/μl DNase I abgebaut, in DNase 1 Puffer von CLONTECH. Die RNA-Einheiten wurden zusätzlich in einer Alkoholmischung aus Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol von Proteinen befreit, durch Zusatz von Äthanol präzipitiert und in 50–100 μl RNA-sicherer Resupensions-Lösung gelöst. Die RNA-Konzentration wurde spektrophotometrisch unter der Prämisse, daß 1A260 einer Konzentration von 40 μg/ml entspricht, bestimmt. Die Proben wurden auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml angepasst und bei –80°C gelagert, ohne daß irgendwelche Anzeichen der Qualitätsverschlechterung festzustellen waren. Alle RNA-Präparate wurden durch eine Agarosegelelektrophorese auf ihre Ganzheit (im Sinne von Nichtzerfall in seine Bestandteile) hin beurteilt, wobei RNA-Standards (GIBCO/BRL) zu Hilfe genommen wurden. Alle hier beschriebenen Präparate enthielten intakte RNA mit eindeutig erkennbaren 28S-, 18S- and 5S-Banden (Daten sind nicht angegeben). Es wurden keine erkennbaren Unterschiede hinsichtlich der elektrophoretisch bestimmten RNA-Muster zwischen gesunden und infektiösen Zellen festgestellt.After a deproteination cycle, the RNA was precipitated by addition of isopropanol, then rinsed with ethanol and redissolved in 200 μl of RNA-safe resuspension solution (Ambion, Austin, TX). The RNA preparations were digested with 0.1 units / μl DNase I, in DNase 1 buffer from CLONTECH. The RNA units were additionally freed of proteins in an alcohol mixture of phenol, chloroform and isoamyl alcohol, precipitated by the addition of ethanol and dissolved in 50-100 μl of RNA-safe resupensions solution. The RNA concentration was determined spectrophotometrically on the premise that 1A 260 corresponds to a concentration of 40 μg / ml. The samples were adjusted to a final concentration of 1 mg / ml and stored at -80 ° C without any evidence of quality deterioration. All RNA preparations were evaluated for wholeness (in terms of non-disintegration into its components) by agarose gel electrophoresis using RNA standards (GIBCO / BRL). All of the preparations described here contained intact RNA with clearly recognizable 28S, 18S and 5S bands (data not shown). There were no discernible differences in electrophoretically determined RNA patterns between healthy and infectious cells.
Vorbereitung von radioaktiv-markierten cDNA-Proben und Hybridisierung mittels DNA-Arrays. Gemäß dem Herstellerprotokoll wurde die cDNA-Synthese unter Verwendung von genspezifischen Primern (CLONTECH) und [32P]-dATP mit der Moloney Murine Leukemea Virus Reverse Transkriptase (SuperScript II, GIBCO/BRL) durchgeführt. Für die cDNA-Synthese wurden gleiche Mengen (5 μg) an RNA von jeder Probe verwendet.Preparation of radioactively labeled cDNA samples and hybridization using DNA arrays. According to the manufacturer's protocol, cDNA synthesis was performed using gene-specific primers (CLONTECH) and [ 32 P] -dATP with the Moloney Murine Leukemea virus reverse transcriptase (SuperScript II, GIBCO / BRL). For cDNA synthesis, equal amounts (5 μg) of RNA from each sample were used.
Alternative MöglichkeitAlternative possibility
RNA wurde aus den Gewebeproben mit Hilfe von Guanidinium Thiocyanate extrahiert und danach wie beschrieben [19] in CsCl zentrifugiert. Gemäß den Herstellerempfehlungen wurde die RNA aus den Zell-Linien mit RNAzol (Biotex Laboratories, Houston) extrahiert. Die Poly(A)-RNA wurde von 500 μg RNA mittels DynaBeads (Dynal, Oslo) isoliert, ganz entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Die Unterschiede in der Genexpression wurden unter Verwendung von Atlas Array Membranen (CLONTECH) untersucht. In einem ersten kurzen Arbeitsschritt wurden jeweils 1 μg RNA von jeder Zell-Linie in [-32P]dATP-markierte cDNA umgeschrieben.RNA was extracted from the tissue samples using guanidinium thiocyanate and then centrifuged in CsCl as described [19]. According to the manufacturer's recommendations, the RNA was extracted from the cell lines with RNAzol (Biotex Laboratories, Houston). The poly (A) RNA was isolated from 500 μg RNA by DynaBeads (Dynal, Oslo) according to the manufacturer's recommendations. Differences in gene expression were examined using Atlas Array membranes (CLONTECH). In In a first short step, 1 μg of RNA from each cell line was transcribed into [- 32 P] dATP-labeled cDNA.
Auswertungevaluation
Die Auswertung der Genexpressionsdaten aus den radioaktiv markierten Filtern beruht auf der Messung der Färbungsintensitäten im digitalisierten Bild. Dazu werden über allen 57600 Spotpositionen kreisförmige Flächen definiert, innerhalb derer die Pixelintensitäten integriert werden. Die möglichst exakte Positionierung der Flächen über die Spots erfolgt automatisch durch die Analysesoftware (AIDA Array Evaluation, ragtest Isotopenmessgeräte GmbH).The evaluation of the gene expression data from the radiolabeled filters is based on the measurement of the staining intensities in the digitized image. For this purpose, circular surfaces are defined over all 57600 spot positions, within which the pixel intensities are integrated. The most exact possible positioning of the surfaces via the spots is carried out automatically by the analysis software (AIDA Array Evaluation, ragtest Isotopenmessgeräte GmbH).
Die ermittelten Signale beinhalten neben der gewünschten Information, nämlich der Menge gebundener Nukleinsäuren aber auch Hintergrundsignale, welche durch unspezifische Bindungen an der Membranoberfläche verursacht werden. Um diese Einflüsse zu eliminieren, werden die Hintergrundsignale in 4608 leeren Flächen des Filters bestimmt und als Grundrauschen von den Hybridisierungssignalen subtrahiert. Punktuelle Signale, die nicht durch Bindung von Nukleinsäuren sondern durch Staubpartikel oder sonstige Störungen auf dem Filter verursacht werden, können von realen Spots durch ihre Unregelmäßigkeit der Form unterschieden werden und werden von der weiteren Analyse ausgeschlossen.The signals obtained include not only the desired information, namely the amount of bound nucleic acids, but also background signals, which are caused by non-specific binding to the membrane surface. To eliminate these effects, the background signals in 4608 empty areas of the filter are determined and subtracted as background noise from the hybridization signals. Selective signals, which are not caused by binding of nucleic acids but by dust particles or other disturbances on the filter, can be distinguished from real spots by their irregularity of the form and are excluded from the further analysis.
Um die Werte verschiedener Filter miteinander vergleichbar zu machen, ist anschließend eine Normalisierung der Daten notwendig. Wegen der hohen Anzahl der Spots auf dem Filter wird als Normalisierungsreferenz der Mittelwert aller Expressionswerte festgelegt. Weiterhin ist der Ausschluss niedriger Spotsignale (unterhalb 10% des durchschnittlichen Expressionssignals) notwendig, da diese einem prozentual großen Fehler unterliegen und bei den späteren Berechnungen zu starken Schwankungen der Ergebisse führen würden.In order to make the values of different filters comparable, a normalization of the data is necessary afterwards. Because of the high number of spots on the filter, the mean value of all expression values is defined as normalization reference. Furthermore, the exclusion of low spot signals (below 10% of the average expression signal) is necessary because they are subject to a large percentage error and would lead to strong fluctuations in the results in the later calculations.
Die Selektion der SIRS/Sepsis-relevanten Gene basiert auf dem Vergleich der Genexpressionswerte bei einer Kontrollperson ohne SIRS/Sepsis gegenüber jeweils einem Patienten mit der Diagnose Sepsis/SIRS. Die Höhe des Expressionsverhältnisses jedes Gens stellt das Kriterium für eine Sortierung der untersuchten Gene dar. Von Interesse sind die Gene, die in den Patienten gegenüber der Kontrolle am meisten überexprimiert bzw. unterexprimiert wurden.The selection of the SIRS / sepsis-relevant genes is based on the comparison of gene expression values in a control subject without SIRS / sepsis to one patient each with the diagnosis of sepsis / SIRS. The level of expression of each gene is the criterion for sorting the genes being studied. Of interest are the genes that are most overexpressed or under-expressed in the patient over control.
Ausführungsbeispiel 2:Embodiment 2:
Untersuchung zur Proteinexpression zwischen einem Patienten mit einer Sepsis und einer Kontrollprobe Investigation of protein expression between a patient with sepsis and a control
Es wurde die Proteinexpression bei Auftreten einer Sepsis und einer Kontrollprobe gemessen. Die Patientendaten sind in Tabelle 4 zusammengefasst.Protein expression was measured on the occurrence of sepsis and a control sample. The patient data are summarized in Table 4.
Nach Abnahme des Vollblutes in ein Serum-Röhrchen erfolgte eine Zentrifugation (5500 rcf; 10 min; 4°C). Der Serum-Überstand wurde unmittelbar nach der Zentrifugation in Kryoröhrchen überführt und dann bei –35°C gelagert. After taking the whole blood into a serum tube, centrifugation was performed (5500 rcf, 10 min, 4 ° C). The serum supernatant was transferred to cryotubes immediately after centrifugation and then stored at -35 ° C.
Das Serum wurde zur Abreicherung des Albumins mit Affi-Gel Blue Affinity Chromatographie Gel for Enzyme and Blood Protein Purifications (Bio-Rad) gemäß den Angaben des Herstellers behandelt. Zur Vermeidung unerwünschter Protein-Matrix-Wechselwirkungen wurden Equilibrierungs- und Bindungspuffer zusätzlich mit 400 mM NaCl versetzt.The serum was treated to deplete the albumin with Affi-Gel Blue Affinity Chromatography Gel for Enzyme and Blood Protein Purifications (Bio-Rad) according to the manufacturer's instructions. To avoid unwanted protein-matrix interactions, equilibration and binding buffers were additionally treated with 400 mM NaCl.
Nicht bindende Proteine wurden gesammelt und mit Methanol und Chloroform entsprechend dem Protokoll von Wessel und Flügge (Anal Biochem. 1984 Apr; 138(1): 141–3.) präzipitiert.Non-binding proteins were collected and precipitated with methanol and chloroform according to the protocol of Wessel and Flügge (Anal Biochem., 1984 Apr; 138 (1): 141-3.).
250 Mikrogramm des präzipitierten Serum-Proteins wurden in einer Lösung bestehend aus 8 mol/l Harnstoff; 2,0 mol/l Thioharnstoff; 4% CHAPS; 65 mmol/l DTT und 0,4% (w/v) Bio-Lytes 3/10 (Bio-Rad) aufgenommen und einer isoelektrischen Fokussierung, sowie einer nachfolgenden SDS-PAGE unterzogen.250 micrograms of the precipitated serum protein was dissolved in a solution consisting of 8 mol / l urea; 2.0 mol / l thiourea; 4% CHAPS; 65 mmol / l DTT and 0.4% (w / v) Bio-Lytes 3/10 (Bio-Rad) and subjected to an isoelectric focusing, as well as a subsequent SDS-PAGE.
Die fertigen 2-dimensionalen Gele wurden mit Coomassie Brilliant Blau G-250 angefärbt und differentiell exprimierte Proteine wurden massenspektrometrisch identifiziert.The final 2-D gels were stained with Coomassie Brilliant Blue G-250 and differentially expressed proteins were identified by mass spectrometry.
Die vergleichende Analyse (
Aus diesen Ergebnissen lässt sich eindeutig ableiten, dass die Proteinexpression bzw. die Proteinzusammensetzung von Serum und Plasma krankheitsbegleitend verändert werden.From these results it can be clearly deduced that the protein expression or the protein composition of serum and plasma are altered along with the disease.
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