DE1030341B

DE1030341B - Process for the nuclear oxidation of? -3-keto steroids

Info

Publication number: DE1030341B
Application number: DE1956P0017035
Authority: DE
Inventors: Gilbert Malcom Shull
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1956-09-20
Filing date: 1956-09-20
Publication date: 1958-05-22

Description

Verfahren zur Kernoxydation von 44-3-Ketosteroiden Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Oxydation von Steroidverbindungen, die in 3-Stellung eine Ketogruppe und in 4-Stellung eine Doppelbindung besitzen, mit Hilfe bestimmter Mikroorganismen oder den von diesen erzeugten oxydierend wirkenden Enzymen.Method for Nuclear Oxidation of 44-3-Keto Steroids The invention relates to a process for the oxidation of steroid compounds which have a keto group in the 3-position and have a double bond in the 4-position, with the help of certain microorganisms or the oxidizing enzymes produced by them.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß 3-Ketod 1.4-Steroidverbindungen aus den entsprechenden 3-Keto-44-Steroidverbindungen hergestellt werden können, wenn man diese der von Mikroorganismen der Gattung Nocardia entwickelten oxydierenden Wirkung aussetzt. Diese Reaktion ist von außerordentlichem Wert, da das 11ß;17a,21-Trioxy-3,20-diketo-d1,4-pregnadien (Prednisolon) und das 17a,21-Dioxy-3,11,20-triketo-41.4-pregnadien (Prednison) große Bedeutung bei der Behandlung bestimmter Erkrankungen des menschlichen Körpers, insbesondere der rheumatischen Arthritis haben. Es gibt viele leicht zugängliche Ausgangsstoffe für die Synthese dieser Verbindungen, jedoch besitzen diese nur eine Doppelbindung im Ring A, d. h. es sind 3-Ketod4-Steroide. Ein Verfahren, mit dem eine zweite Doppelbindung in den Ring A eingeführt werden kann, ist daher für die pharmazeutische Industrie und die Öffentlichkeit sehr wertvoll.It has surprisingly been found that 3-ketod 1,4-steroid compounds can be made from the corresponding 3-keto-44 steroid compounds, if one considers these of the oxidizing agents developed by microorganisms of the genus Nocardia Suspends effect. This reaction is of extraordinary value since the 11ß; 17a, 21-trioxy-3,20-diketo-d1,4-pregnadiene (Prednisolone) and the 17a, 21-dioxy-3,11,20-triketo-41.4-pregnadiene (prednisone) major Importance in the treatment of certain diseases of the human body, in particular have rheumatoid arthritis. There are many readily available raw materials for the synthesis of these compounds, but they only have one double bond in ring A, d. H. they are 3-Ketod4 steroids. A process that creates a second double bond can be introduced into the ring A is therefore for the pharmaceutical industry and the public very valuable.

Es ist bereits bekannt, daß in bestimmte 3-Keto-44-Verbindungen mit Hilfe von Organismen der Gattungen Fusarium, Calonectria, Ophiobolus, Alternaria, Didymella und Corynebakterium in 1(2)-Stellung eine Doppelbindung eingeführt werden kann. Während bei diesen Verfahren nichts über die erzielten Ausbeuten an 1(2)-Dehydroverbindung angegeben ist, wurde nun gefunden, daß die Dehydrierung der 1(2)-Stellung von 3-Keto-44-Steroiden mit Organismen der Gattung Nocardia in hoher Ausbeute erreicht werden kann. Die erhaltenen Ausbeuten liegen zwischen 50 und 800/" was für ein biochemisches Verfahren außerordentlich gut ist. Weitere Vorteile der Organismen der Gattung Nocardia beruhen auf der Tatsache, daß das erhaltene Produkt verhältnismäßig frei von Nebenprodukten ist und folglich leicht gereinigt werden kann. Da die Reinigung des Produktes kostspielig ist, ist die Abwesenheit von Nebenprodukten ein bedeutender Vorteil des Verfahrens. Außerdem wächst der genannte Organismus verhältnismäßig schnell und kann leicht in billigen Nährmedien gezüchtet werden.It is already known that a double bond in the 1 (2) position can be introduced into certain 3-keto-44 compounds with the aid of organisms of the genera Fusarium, Calonectria, Ophiobolus, Alternaria, Didymella and Corynebacterium. While nothing is stated about the yields of 1 (2) -dehydrocompound achieved in these processes, it has now been found that the dehydrogenation of the 1 (2) -position of 3-keto-44 steroids with organisms of the genus Nocardia achieves high yields can be. The yields obtained are between 50 and 800 / ", which is extremely good for a biochemical process. Further advantages of the organisms of the genus Nocardia are based on the fact that the product obtained is relatively free of by-products and can therefore be easily cleaned of the product is expensive, the absence of by-products is a significant advantage of the process, and the said organism grows relatively quickly and can easily be grown in cheap nutrient media.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bebrütet man die entsprechende Steroidverbindung in wäßriger Lösung` oder Suspension entweder mit einer wachsenden Kultur von Nocardia oder mit Zellen von Nocardia, die der wachsenden Kultur entnommen und in einem geeigneten Medium suspendiert worden sind, oder aber mit Extrakten der oxydieren wirkenden Enzyme, die aus der Kultur einer Art der Gattung Nocardia erhalten worden sind.To carry out the process according to the invention, the appropriate steroid compound in aqueous solution or suspension either with of a growing culture of Nocardia or with cells of Nocardia corresponding to the growing Culture removed and suspended in a suitable medium, or else with extracts of the oxidizing enzymes from the culture of a species of the genus Nocardia have been obtained.

Eine Anzahl von Steroidverbindungen, die in 3-Stellung eine Ketogruppe und in 4-Stellung eine Doppelbindung besitzen, kann als Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäße Reaktion verwendet werden. Sie umfassen Stoffe wie Verbindung F (Hydrocortison) Verbindung E (Cortison) Corticosteron Verbindung S 14a-Oxy-Verbindung S Desoxycorticosteron Androstendion Nortestosteron 17 a-Oxyprogesteron 11-Ketoprogesteron 9a-Fluor-Verbindung F 14a-Oxy-Verbindung F 11-Epi-Hydrocortison 4 4. 8-Androstadiendion 11 ß,17 a-Dioxyprogesteron 414-Dehydro-Verbindung S Testosteron Progesteron 16-Dehydroprogesteron A'(")_Dehydro-Verbindung S Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf 3-Keto-d4-Steroide anwendbar, die 18 bis 21 Kohlenstoffatome besitzen. Die Reaktionsprodukte können durch sorgfältiges Vergleichen von Papierchromatogramme der erfindungsgemäß hergestellten Produkte mit bekannten Steroiden nachgewiesen werden.A number of steroid compounds that have a keto group in the 3-position and have a double bond in the 4-position, can be used as a starting material for the reaction according to the invention can be used. They include substances like compound F (Hydrocortisone) Compound E (Cortisone) Corticosterone Compound S 14a-Oxy-Compound S deoxycorticosterone androstenedione nortestosterone 17 a-oxyprogesterone 11-ketoprogesterone 9a-fluoro compound F 14a-oxy compound F 11-epi-hydrocortisone 4 4. 8-androstadiene dione 11 ß, 17 a-Dioxyprogesterone 414-Dehydro-Compound S Testosterone Progesterone 16-Dehydroprogesterone A '(") _ Dehydro Compound S The inventive method is based on 3-keto-d4 steroids applicable, which have 18 to 21 carbon atoms. The reaction products can by carefully comparing paper chromatograms of the according to the invention manufactured products with known steroids can be detected.

Die Arten der Gattung Nocardia für die Dehydrierung sind aus öffentlichen Kulturen, Sammlungen, z. B. der American Type Culture Collection of Washington, D. C., leicht zugänglich. Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Arten sind Nocardia coeliaca, Nocardia convoluta, Nocardia corallina, Nocardia crythropolis, Nocardia garneri, Nocardia minima and. Nocardia polychro:noöens.3; von b°sonderem Wert sind die Organismen der Arten N. opaca und N. globerula. Eine lebende Kultur von N. opaca ist bei der American Type Culture Collection of Washington, D. C. mit der Nr. ATCC 4276 hinterlegt worden. Eine lebende Kultur der Art N. globerula wurde ebenfalls dort hinterlegt und ihr die Nr. ATCC 9356 gegeben. Die verschiedenen Arten von Nocardia unterscheiden sich erheblich bezüglich ihrer Reaktionsfreudigkeit und -geschwindigkeit. Es bestehen auch Abweichungen zwischen den Stämmen derselben Art. In ähnlicher Weise unterscheiden sich die verschiedenen Steroidsubstrate bezüglich ihrer Reaktionsfreudigkeit und -geschwindigkeit. Es ist jedoch leicht möglich, die optimalen Bedingungen für die Dehydrierung jedes einzelnen Steroids mit jeder speziellen Art des Organismus experimentell zu bestimmen.The species in the genus Nocardia for dehydration are from public Cultures, collections, e.g. B. the American Type Culture Collection of Washington, D. C., easily available. Types suitable for the method according to the invention are Nocardia coeliaca, Nocardia convoluta, Nocardia corallina, Nocardia crythropolis, Nocardia garneri, Nocardia minima and. Nocardia polychro: noöens.3; of b ° special The organisms of the species N. opaca and N. globerula are of value. A living culture by N. opaca is with the American Type Culture Collection of Washington, D. C. with the No. ATCC 4276 has been deposited. A living culture of the species N. globerula became also deposited there and given it the number ATCC 9356. The different types from Nocardia differ considerably in terms of their responsiveness and -speed. There are also discrepancies between the tribes of the same species. Similarly, the various steroid substrates differ with regard to one another their responsiveness and speed. However, it is easily possible that optimal conditions for the dehydration of each and every steroid with each particular one To determine the type of organism experimentally.

Es gibt mehrere Verfahren, die zur erfindungsgemäßen Dehydrierung von Steroidverbindungen angewendet werden können. In einem von ihnen werden Nährmedien mit Schrägkulturen des ausgewählten Nocardia Organismus beimpft. Solch ein Medium kann z. B. aus einem Gemisch einer bakteriologischen Standard Nährlösung und zugesetztem Kohlenhydrat bestehen. Die Züchtung von Nocardia ist in vielen Veröffentlichungen genau beschrieben. Die beimpften, sterilen Nährlösungen kann man in Schüttelkolben 2 oder 3 Tage wachsen lassen, um Impfmaterial für Ansätze in größeren Gefäßen zu erzeugen, und die Produkte der größeren, mit Rührwerke und Möglichkeiten für Luftzutritt versehenen Gefäße können ihrerseits zur Impfung von Ansätzen im großen Stil für die submerse Fermentation verwendet werden. Dasselbe Medium, wie oben beschrieben, kann zur erfindungsgemäßen Oxydation der Steroide im großen verwendet werden. Für die Kulturflüssigkeit, die verändert werden kann, sind im allgemeinen ein Kohlenhydrat, eine Quelle für organischen Stickstoff, Mineralsalze und verschiedene Spurenmetalle erforderlich.There are several methods that can be used for dehydration according to the invention of steroid compounds can be applied. In one of them there will be culture media inoculated with slant cultures of the selected Nocardia organism. Such a medium can e.g. B. from a mixture of a bacteriological standard nutrient solution and added Carbohydrate. The breeding of Nocardia is in many publications exactly described. The inoculated, sterile nutrient solutions can be placed in shake flasks Let it grow for 2 or 3 days in order to use inoculum for approaches in larger vessels produce, and the products of the larger ones, with agitators and possibilities for air access provided vessels can be used for inoculation of approaches on a large scale for their part submerged fermentation can be used. The same medium as described above, can be used to a large extent for the oxidation of the steroids according to the invention. For the culture fluid that can be altered is generally a carbohydrate, a source of organic nitrogen, mineral salts and various trace metals necessary.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man auch Zellen aus den wachsenden Kulturen entnehmen und sie dann in einem Medium suspendieren, welches zur Erzeugung des Enzym-Reaktionsgemisches bestim°nt war. Solch ein Reaktionsgemisch kann z. B. aus einer Lösung bestehen, die in bezug auf fumarsaures Natrium oder einen anderen Wasserstoffakzeptor und in bezug auf Magnesiumsulfat 0,01 molar und in bezug auf Natriumcitrat 0,03 molar ist. Die Gegenwart einer bestimmten Menge Adenosyltriphosphat, z. B. von 0,125°/0, hat sich als nützlich erwiesen. Zentrifugierte, gewaschene Zellen des ausgewählten Nocardiastammes können in dieser Art Reaktionsgemisch, das z. B. mit Citronensäure auf einen pH-Wert von etwa 6 eingestellt wird, suspendiert werden. Nach Zusatz der zu oxydierenden Steroidverbindung kann das Gemisch bei etwa 37° C bebrütet und von Zeit zu Zeit können Proben entnommen werden, um zu ermitteln, wann eine maximale Umwandlung des Steroids stattgefunden hat. Im allgemeinen erfolgt diese Entnahme nach einem bis mehreren Tagen. Es wurde gefunden, daß zur Erzielung geeigneter Ergebnisse die Zellen von etwa 100 cm3 unter Luftzutritt gerührter Nocardiakulturen in etwa 20 cm3 eines Enzym-Reaktionsgemisches suspendiert werden können. Diese Mengen können jedoch wesentlich geändert und etwa 25 bis etwa 200 mg der Steroidverbindung pro 100 cm" des Enzym-Reaktionsgemisches verwendet werden. Die Verbindung wird dem Medium in fester Form nach Einstellung des p1,1-Wertes zugegeben. Die Kolben werden mit Baumwolle verschlossen, so daß sie während der Bebrütung der Luft ausgesetzt sind. Man zieht es vor, kleine Volumina im Vergleich zum Volumen des Kolbens, z. B. 20 cm3 in einem 125-cm3-Erlenmeyerkolben, zu verwenden. Das Gemisch kann auch unter Luftzutritt gerührt werden. Im allgemeinen sind mindestens ein Wasserstoffakzeptor, ein zweiwertiges Metall, insbesondere Magnesium, und eine Puffersubstanz für die Zusammensetzung des Mediums erforderlich.Cells can also be used to carry out the method according to the invention take from the growing cultures and then suspend them in a medium, which was intended to generate the enzyme reaction mixture. Such a reaction mixture can e.g. B. consist of a solution with respect to sodium fumarate or another hydrogen acceptor and with respect to magnesium sulfate 0.01 molar and is 0.03 molar with respect to sodium citrate. The presence of a certain amount Adenosyl triphosphate, e.g. 0.125 ° / 0 has been found to be useful. Centrifuged, Washed cells of the selected Nocardia strain can be used in this type of reaction mixture, the Z. B. is adjusted to a pH of about 6 with citric acid, suspended will. After adding the steroid compound to be oxidized, the mixture can be at about 37 ° C and samples can be taken from time to time to determine when maximum conversion of the steroid has occurred. Generally done this removal after one to several days. It has been found that to achieve suitable results the cells of about 100 cm3 with the admission of air of stirred Nocardia cultures can be suspended in about 20 cm3 of an enzyme reaction mixture. These amounts however, can be substantially changed and about 25 to about 200 mg of the steroid compound per 100 cm "of the enzyme reaction mixture. The compound is dem Medium in solid form was added after setting the p1,1 value. The pistons will sealed with cotton so that they can be exposed to air during incubation are. It is preferred to use small volumes compared to the volume of the piston, e.g. B. 20 cm3 in a 125 cm3 Erlenmeyer flask. The mixture can also be stirred with admission of air. In general, at least one hydrogen acceptor a divalent metal, especially magnesium, and a buffer substance for the Composition of the medium required.

Man kann ferner die Steroidverbindung direkt zu einem sterilisierten Anteil des Nährmediums, wie oben beschrieben ist, zugeben und das Medium dann mit einem ausgewählten Nocardiastamm beimpfen. In diesem Fall kann ebenfalls annähernd dieselbe Menge der ausgewählten Steroidverbindung verwendet werden. Proben des unter Luftzutritt gerührten Gemisches können von Zeit zu Zeit zur Bestimmung des Umwandlungsgrades der Steroidverbindung in die oxydierten Produkte entnommen werden. Das Gemisch wird während des Wachstums der Zellen und der Umwandlung des Steroids bei Temperaturen zwischen 20 und 37° C oder darüber gehalten. Im allgemeinen sind etwa i/2 bis 7 Tage für eine maximale Produktion oxydierter Verbindungen erforderlich. Das Wachstum der Zellen kann aber auch vor dem Zusatz des Steroids vor sich gehen.One can also send the steroid compound directly to a sterilized one Add portion of the nutrient medium as described above and then add the medium with it inoculate a selected strain of nocardia. In this case, too, can be approximate the same amount of the selected steroid compound can be used. Samples of the under Mixture with stirring can be used from time to time to determine the degree of conversion the steroid compound can be taken into the oxidized products. The mixture will during the growth of the cells and the conversion of the steroid at temperatures held between 20 and 37 ° C or above. Generally about 1/2 to 7 Days required for maximum production of oxidized compounds. The growth however, the cells can also take place prior to the addition of the steroid.

Eine dritte Methode, die zur Oxydation von ausgewählten Steroidverbindungen ebenfalls gut anwendbar ist, besteht in der Verwendung von aus Nocardia erzeugten oxydierend wirkenden Enzymen. Diese können nach bekannten Verfahren aus den Zellen der ausgewählten Organismen gewonnen werden.A third method used to oxidize selected steroid compounds also well applicable is the use of those made from Nocardia oxidizing enzymes. These can be removed from the cells by known methods of the selected organisms can be obtained.

Die zellfreien Enzyme können in den obengenannten Medien oberhalb Temperaturen von etwa 20 bis etwa 40'C verwendet werden. Im allgemeinen wird die Oxydation der gewünschten Steroidverbindungen etwa in wenigen Stunden bis mehreren Tagen durchgeführt. Die optimale Zeitdauer und Temperatur sowie andere Bedingungen können leicht durch Versuche bestimmt werden. Eingehende Beschreibungen geeigneter Medien sowohl für die Verwendung von isolierten und wieder suspendierten Zellen als auch für die Verwendung von zellfreien Elaboraten sind in den Handbüchern »Manometric Technique in Tissue Metabolism« von W. W. Umbreit und Mitarbeitern, Brugess Publishing, Company, Minneapolis (1949), und »Respiratory Enzymes« von H. Lardy, Burgess Publishing Company, Minneapolis (1949), angeführt.The cell-free enzymes can be found in the above media Temperatures of about 20 to about 40 ° C can be used. In general, the Oxidation of the desired steroid compounds in about a few hours to several Days. The optimal length of time and temperature and other conditions can easily be determined by experiment. Incoming descriptions more appropriate Media for both the use of isolated and resuspended cells as well as for the use of cell-free elaborates are in the manuals »Manometric Technique in Tissue Metabolism «by W. W. Umbreit and colleagues, Brugess Publishing, Company, Minneapolis (1949) and "Respiratory Enzymes" by H. Lardy, Burgess Publishing Company, Minneapolis (1949).

Der Reaktionsverlauf wird gewöhnlich papierchromatographisch verfolgt. Die Produkte des neuen Verfahrens können aus der wäßrigen Lösung durch Extraktion mit verschiedenen, mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln in bekannter Weise isoliert werden: Niedere halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, sind besonders brauchbar. Nach der Extraktion können: die Lösungsmittel abdestilliert werden; dann wird das feste Produkt isoliert. Dieses Material kann durch Umkristallisation oder chromatographisch, z. B. mittels Tonerdesäulen oder anderen geeigneten festen Adsorptionsmitteln, von den organischen Lösungsmitteln befreit werden. Die Verwendung einer Kieselsäuregel-Äthanol-Säule und Gemischen aus Methylenchlorid mit 2 bis 5 Volumprozent Äthanol (95 °/oig) als Entwickler hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen. Für manche Verwendungsaxten kann das Rohgemisch als solche weiterverarbeitet werden. Es wurde in manchen Fällen als vorteilhaft empfunden, die Rohprodukte zu acylieren und mit den entstehenden Estern zu arbeiten, die etwas stabiler sind.The course of the reaction is usually followed by paper chromatography. The products of the new process can be extracted from the aqueous solution with various, water-immiscible organic solvents in known Way to isolate: lower halogenated hydrocarbons, such as chloroform, are particularly useful. After the extraction: the solvents can be distilled off will; then the solid product is isolated. This material can be obtained by recrystallization or chromatographically, e.g. B. by means of alumina columns or other suitable solid Adsorbents to be freed from the organic solvents. The usage a silica gel-ethanol column and mixtures of methylene chloride with 2 to 5 Percentage by volume of ethanol (95%) as a developer has proven to be particularly advantageous proven. For some usage axes, the raw mixture can be further processed as such will. It was referred to in some cases as a perceived beneficial that Acylate crude products and work with the resulting esters, which is something are more stable.

Als Ausgangssteroide können wohlbekannte Verbindungen, wie Testosteron, Progesteron und Reichsteins Verbindung S verwendet werden. Diese Produkte sind als Zwischenprodukte für die Synthese anderer nützlicher Verbindungen wertvoll. So sind z. B. die dehydrierten d1,4-3-Ketone besonders geeignet für die Inhoffen-Aromatisierung. Dabei entsteht eine Gruppe von Derivaten des Oestrons. Falls sich das Dehydrierungsprodukt von Reichsteins Verbindung S ableitet, kann die Seitenkette unter Bildung einer 17ständigen Ketogruppe leicht durch übliche Methoden, z. B. durch Oxydation mit Chromsäure, abgespalten und sodann nach Inhoffen aromatisiert werden.Well-known compounds such as testosterone, Progesterone and Reichstein's compound S can be used. These products are available as Intermediates valuable in the synthesis of other useful compounds. So are z. B. the dehydrated d1,4-3-ketones are particularly suitable for inhoffen aromatization. This creates a group of derivatives of oestron. If the dehydration product Derived from Reichstein's compound S, the side chain can form a 17 keto group easily by conventional methods, e.g. B. by oxidation with Chromic acid, split off and then flavored according to Inhoffen.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. Beispiel 1 In ein 4-1-Gefäß aus Pyrexglas, das für die Durchführung einer submersen Fermentation unter Luftzutritt eingerichtet war, wurden 21 folgender Lösung gegeben: Caseinhydrolysat, bekannt unter dem Handelsnamen N-Z Amin B ....... log Dextrosehydrat ......................... 10 g Hefeextrakt ............................ 5 g Calciumcarbonat ........................ 1 g Mit Wasser auf 1 Liter auffüllen. Das wäBrige Medium wurde sterilisiert und mit 0,25 g Hydrocortison versetzt. Das Gemisch wurde dann mit 100 cm3 einer Kultur von N. opaca (ATCC Nr. 4276), die in einem Schüttelkolben auf einer Nährlösung gezüchtet wurde, beimpft. Darauf wurde geschüttelt und sterile Luft zugeführt. Das gesamte Gemisch wurde dann mehrere Male mit 21 Chloroform ausgeschüttelt. Der Extrakt wurde auf eine mit Kieselsäuregel beschickte chromatographische Säule gebracht, die mit Gemischen aus Methylenchlorid und Äthanol eluiert wurde. Auf diese Art wurde Prednisolon gewonnen. Beispiel 2 Ein Versuch wurde, wie oben beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daB diesmal der verwendete Microorganismus N. globerula (ATCC Nr.9356) war. Prednisolon wurde auf dieselbe Art gewonnen. Beispiel 3 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei Cortison als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Es wurde das Produkt Prednison gewonnen.The following examples explain the process according to the invention. Example 1 21 of the following solutions were placed in a 4-1 vessel made of Pyrex glass, which was set up for carrying out a submerged fermentation with access to air: Casein hydrolyzate, known under the Trade name NZ Amin B ....... log Dextrose hydrate ......................... 10 g Yeast extract ............................ 5 g Calcium carbonate ........................ 1 g Make up to 1 liter with water. The aqueous medium was sterilized and 0.25 g hydrocortisone was added. The mixture was then inoculated with 100 cc of a culture of N. opaca (ATCC No. 4276) grown in a shake flask on a nutrient solution. This was followed by shaking and sterile air supplied. The entire mixture was then extracted several times with 21% chloroform. The extract was applied to a chromatographic column loaded with silica gel, which was eluted with mixtures of methylene chloride and ethanol. This is how prednisolone was obtained. Example 2 An experiment was carried out as described above, with the exception that this time the microorganism used was N. globerula (ATCC No. 9356). Prednisolone was obtained the same way. Example 3 The procedure of Example 1 was repeated using cortisone as the starting material. The product prednisone was obtained.

Beispiel 4 Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, wobei Cortison als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Prednison wurde auf dieselbe Art gewonnen. Beispiel 5 Eine Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, wobei man das in den obigen Beispielen beschriebene Verfahren anwandte und die folgenden Steroide benutzte: Verbindung S 9a-Fluor-Verbindung F d 4#8-Androstadiendion 11 ß,17a-Oxyprogesteron d 1#4-Dehydro-Verbindung S Androstendion 19-Nortestosteron 17 a-Oxyprogesteron 16-Dehydroprogesteron 11-Ketoprogesteron A'(")-Dehydro-Verbindung S 14a,15a-Epoxy-Verbindung S 14a,15a-Epoxy-Verbindung F 14a-Oxy-hydrocortison 14a-Oxy-cortison Die Produkte wurden aus dem Reaktionsgemisch durch Extraktion gewonnen und papierchromatographisch bestimmt. In j edem Falle wurde festgestellt, daB in 1-Stellung eine Doppelbindung eingeführt worden war.Example 4 The procedure of Example 2 was repeated using cortisone was used as the starting material. Prednisone was obtained in the same way. Example 5 A series of experiments were carried out using that described in the above Applied procedures described in the examples and used the following steroids: Compound S 9a-fluorine compound F d 4 # 8-androstadiendione 11β, 17a-oxyprogesterone d 1 # 4-dehydro-compound S androstenedione 19-nortestosterone 17 a-oxyprogesterone 16-dehydroprogesterone 11-ketoprogesterone A '(") - dehydro compound S 14a, 15a-epoxy compound S 14a, 15a-epoxy compound F 14a-Oxy-hydrocortisone 14a-Oxy-cortisone The products were from the reaction mixture obtained by extraction and determined by paper chromatography. In any case it was found that a double bond had been introduced in the 1-position.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for the nuclear oxidation of d 4-3-keto steroids containing 18 to 21 carbon atoms by incubation with cultures of oxidizing microorganisms or the oxidizing enzymes produced from these under submerged and aerobic conditions, characterized in that one is oxidizing Organism uses one from the genus Nocardia.

2. The method according to claim 1, characterized in that one is an organism of the Type Nocardia opaca or Nocardia globerula used.