Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es daher, eine Abdeckung für
eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen in Flüssigkeitssäulen im
Millilitermaßstab
zu schaffen, mit der zum einen ein hoher Gas- und Leistungseintrag
erzielt wird und zum andern einzelne oder auch eine große Zahl
von derartigen Vorrichtungen parallelisiert effektiv betrieben werden
können.
Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine derartig
verschlossene Vorrichtung, sowie eine Anordnung derartiger paralleler Vorrichtungen
zur Verfügung
zu stellen. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es zusätzlich,
entsprechende Kulturverfahren von Zellen in Flüssigkeitssäulen im Millilitermaßstab zur
Verfügung
zu stellen.
Diese Aufgabe wird durch die Abdeckung nach
Anspruch 1, die Vorrichtung nach Anspruch 14, die Anordnung nach
Anspruch 39 sowie das Verfahren nach Anspruch 44 gelöst. Vorteilhafte
Weiterbildungen der jeweiligen Abdeckung, Vorrichtung, Anordnung
bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens werden
in den jeweiligen abhängigen
Ansprüchen gegeben.
Mit der erfindungsgemäßen Lösung, ist
es möglich,
einzelne oder auch eine Vielzahl von automatisierten Rührkesselreaktoren,
beispielsweise 24,48 oder 96 oder mehr Rührkesselreaktoren sowohl für die Stamm- als auch für die Bioprozeßentwicklung
zeiteffektiv unter technischen Reaktionsbedingungen zu betreiben.
Damit ist die parallele automatisierte Kultivierung von Zellen im
Millilitermaßstab unter
individuell kontrollierten sterilen Reaktionsbedingungen, wie Temperatur,
Wasserstoffionenaktivität,
Sauerstoffeintrag, Leistungseintrag sowie Medienzufuhr möglich, so
daß Reaktionsverläufe, wie
sie im klassischen Rührkesselbioreaktor
erzielt werden, im Parallelansatz durchführbar sind. Unter Millimetermaßstab wird
dabei vorteilhafterweise ein Bereich für das gerührte Flüssigkeitsvolumen von 0,5 bis
50 ml, vorzugsweise von 1 bis 30 ml, vorzugsweise von 5 bis 20 ml
verstanden. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verschlusses der erfindungsgemäßen Vorrichtung
und des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist eine direkte Übertragung
der so gewonnenen (fed batch) Prozeßverläufe aus dem erfindungsgemäßen Milliliter-Maßstab in
den Liter-Maßstab
(und umgekehrt) möglich.
Die erfindungsgemäßen Milliliter-Rührreaktoren erlauben eine ebenso
effiziente Sauerstoffversorgung von Organismen in Flüssigkultur
wie Rührkesselreaktoren
größeren Maßstabs mit
Volumenbegasung.
Erfindungsgemäß wird ein Verschluß bzw. Abdeckung
vorgesehen, die ein Gefäß bzw. eine
Anordnung von Gefäßen steril
abdeckt. In diese Verschlüsse
können
zum einen Gasverteilerstrukturen zur Zufuhr von Sterilgas eingebracht
sein. Der Verschluß kann
hierzu beispielsweise aus einer Doppelbodenplatte bestehen, wobei
die Gasverteilerstruktur im Zwischenraum zwischen den beiden Platten
der Doppelbodenplatte angeordnet sind. Der Verschluß kann auch
aus einer oder mehreren Platten bestehen, wobei die Gasverteilerstrukturen
an der Unterseite der untersten Platte angeordnet sind.
Vorteilhafterweise werden die Gasverteilerstrukturen
derart angelegt, daß ausgehend
von einer zentralen Gaszufuhr einzelne Kanäle als Abzweigungen zu den
jeweiligen Behältern
führen.
Vorteilhafterweise werden die Kanäle dabei so geführt, daß sie sowohl
gleiche Querschnitte, gleiche Länge
als auch die gleiche Anzahl von Biegungen oder Knicken aufweisen.
Dadurch wird ein gleichmäßiger Gasdruck auf
sämtlichen
Behältern
bewirkt. Dabei können
entweder lediglich die Ab zweigungen in gleicher Weise angelegt sein
oder auch das gesamte System.
Weiterhin weist der Verschluß erfindungsgemäß für jeden
einzelnen Behälter
eine Öffnung
auf, die nach außen
von dem Behälter
zugeführtem
Sterilgas durchströmt
wird. Diese Öffnung
kann beispielsweise ein Röhrchen
sein, durch das eine Kanüle
oder jede andere längliche
Probenentnahme- oder Sensoreinheit eingeführt werden kann. Da dies dann im
Gegenstrom erfolgt, ist es lediglich erforderlich, die jeweils eingebrachte
Einheit zuvor zu sterilisieren und dann durch das Röhrchen in
die Suspension einzuführen,
um eine Kontamination des Reaktionsgefäßes zu vermeiden.
Bei Einsatz der erfindungsgemäßen Rührkesselreaktoren
ist eine Parallelisierung von einer großen Zahl von Bioreaktoren in
einem Bioreaktorblock möglich,
wobei deren Betrieb erstmalig durch Einsatz von Laborrobottern,
beispielsweise Pipettier-Robotern und dergleichen automatisierbar
ist und so ein effizienter, individuell kontrollierter Parallelbetrieb
ermöglicht
wird. Erst die erfindungsgemäße Vorrichtung
und auch die erfindungsgemäße Abdeckung
ermöglichen
die Verwendung eines Laborroboters und damit einen Quantensprung
in der Gewinnung relevanter Prozeßdaten.
Werden die Laborroboter mit geeigneten Screening
und Optimierroutinen betrieben, so kann eine Prozeßoptimierung,
beispielsweise bezüglich der
Medienzusammensetzung, der Induktionsverfahren und der Dosierprofile,
systematisch und mit hoher Zeiteffizienz erzielt werden. Die vollständige Digitalisierung
der parallelen Prozeßentwicklung
ermöglicht weiterhin
eine neuartige Datentransparenz und Datenverfügbarkeit.
Da die Volumina der Rührkesselreaktoren, mit
denen dennoch eine aussagekräftige
Information über
den jeweiligen Prozeßverlauf
gewonnen werden kann, nunmehr stark minimiert werden können, beispielsweise
statt 500 ml lediglich noch 5 ml, kann bei gleichem Gesamtvolumen
durch Einsatz von 100x mehr Reaktionsgefäßen ein Vielfaches an Information
gewonnen bzw. bei gleicher Informationsmenge der Zeitaufwand durch
die realiesierte Automatisierung minimiert werden. Bei Einsatz geeigneter
Versuchsplanungs-Algorithmen kann damit ein Quantensprung in der
Effektivität
der Bioprozeßentwicklung
ermöglicht
werden.
Die vorliegende Erfindung beruht
entscheidend darauf, daß erkannt
wurde, daß der
Gaseintrag von der Oberfläche
der Flüssigkeitssäule in die
Flüssigkeitssäule in einem
Rührkesselreaktor
dadurch verbessert wird, daß entweder
der Behälter
und/oder das Rührorgan
derart ausgebildet werden, daß die Strömungsgeschwindigkeit
sich längs
einer Stromlinie oder Bahnlinie, die beim Rührkesselreaktor im Kreis verläuft, sich
längs der
Stromlinie bzw. Bahnlinie örtlich
und/oder zeitlich ändert.
Dies führt
zu einem räumlich
und/oder zeitlich pulsierenden Bernoulli-Effekt. Dies kann beispielsweise
in einer zum Boden des Rührkesselreaktors
(Behälters)
gerichtete Förderung
der Kultursuspension führen,
welche zu intensiven Eintrag von Glasblasen führt. Als Stromlinien werden
dabei Linien in der Strömung
bezeichnet, deren Richtung in jedem Rammpunkt mit der Richtung des
Geschwindigkeitssektors übereinstimmt.
Als Bahnlinie werden Linien bezeichnet, die von den Flüssigkeitsteilchen
durchlaufen werden.
Geeignete Ausgestaltung des Behälters (Rührkesselreaktor)
und/oder des Rührorgans
verstärken
den oben genannten Gaseintrag von der Oberfläche in die Flüssigkeitssäule.
Zum einen ist es möglich, den
Behälter selbst
so auszugestalten, daß sein
Innenvolumen keine rotationssymmetrische Form aufweist. Dort wo der
Flüssigkeitsstrom
sich dann verbreitert, befindet sich ein Bereich geringer Strömungsgeschwindigkeit und
damit hohen Druckes während
dort wo die Flüssigkeit
zwischen dem Rührorgan
und der Behälterwand
durchströmt
ein Bereich hoher Strömungsgeschwindigkeit
und damit niedrigen Druckes vorliegt. Damit ist eine räumlich längs des
Umfangs des Behälters
variierende Strömungsgeschwindigkeit
bzw. variierender Flüssigkeitsdruck
gegeben.
Derselbe Effekt wird erzielt, wenn
das Rührorgan
innerhalb des beliebig oder auch rotationssymmetrisch geformten
Behälters
außermittig
bzw. exzentrisch angeordnet wird. In diesem Falle ergeben sich wieder
Abstände
zwischen Rührorgan
und Wand des Behälters,
die längs
des Umfangs des Behälters
variieren und dadurch unterschiedliche Strömungsgeschwindigkeiten und
Druckverhältnisse
induzieren.
Eine weitere Möglichkeit um diesen pulsierenden
Bernoulli-Effekt zu erzielen, ist es, längs des Umfangs des Behälters Strömungsbrecher
anzuordnen. Unter Strömungsbecher
werden dabei Elemente verstanden, die sich in der Strömung der
gerührten Flüssigkeit
befinden und so für
diese einen Strömungswiderstand
darstellen. Strömungsbrecher
führen
zu einer Verengung des Strömungsquerschnitts. Da
der Abstand zwischen Rührer
und Wand des Gefäßes größer ist
als zwischen Rührer
und Strömungsbrecher,
bilden sich zwischen Rührer
und Strömungsbrecher
wieder Bereiche hoher Strömungsgeschwindigkeit
und zwischen Rührer
und freien Wandbereichen Bereiche geringer Strömungsgeschwindigkeit aus. Der
Strömungsbrecher
muß dabei
nicht in der Drehebene des Rührorgans
angeordnet sein, sondern kann unterhalb, in der Drehebene oder auch bzw.
zusätzlich
auch oberhalb der Drehebene des Rührorgans angeordnet sein. In
all diesen Fällen
ergibt sich ein pulsierender Bernoulli-Effekt. Die Strömungsbrecher
können
vorteilhafterweise einstückig mit
der Lagerung des Rührorgans
oder einstückig
mit dem Behälter
ausgebildet sein, beispielsweise im Spritzgußverfahren.
Die Spaltabstände sollen dabei so gewählt werden,
daß sich
ein ausreichender pulsierender Bernoulli-Effekt ergibt, jedoch die
Scherkräfte
nicht so groß werden,
daß die
in der Suspension enthaltenen Zellen zerstört werden. Spaltabstände > 0,05 mm, vorzugsweise > 0,1 mm und/oder < 20 mm, vorzugsweise < 3 mm sind hierfür besonders
geeignet. Als Behälter
sind klassische Rührkolben,
Reagenzgläser
oder auch die Kavitäten
einer Mikrotiterplatte oder einer speziell gefertigten Platte gleicher
Kavitätenanordnung
mit adäquaten
Durchmessern geeignet.
Eine weitere Möglichkeit einen pulsierenden Bernoulli-Effekt
zu erzeugen besteht darin, das Rührorgan
geeignet auszubilden. Hierzu wird in das Rührorgan eine Bohrung eingebracht,
die von der Unterseite des Rührorgans
sich zu einer Seitenwand bzw. zur Oberseite des Rührorgans
erstreckt. Vorteilhafterweise verläuft die Bohrung unter einem
Winkel α mit
0° ≤ α < 90° zur Dreh-
bzw. Mittelachse des Rührorgans,
wobei sich dieser Winkel nach oben öffnet.
Vorteilhaft können auch weitere Durchgangskanäle mit einer
entsprechenden Öffnung
nach unten von der Oberseite des Rührorgans sich zu dessen Seitenwand
bzw. Unterseite erstrecken.
Diese Kanäle können auch nur teilweise durch
das Rührorgan
unter dem Winkel α verlaufen und
dann auf einen bezüglich
der auf der Drehachse senkrecht stehenden Ebene in dieser Ebene
oder unter einem Winkel < 90° nach oben
oder unten zu dieser Ebene verknüpft
verlaufenden weiteren Kanal stoßen
und in diesen einmünden,
der seinerseits an der seitlichen Außenwand des Rührorgans
mit einer Öffnung
endet.
Durch derartige Bohrungen wird ebenfalls eine
Strömung
vom Boden des Behälters
zur Seitenwand des Rührorgans
induziert, die zu einem veränderten
Druck an den von der Drehachse abgewandten Öffnung der Bohrungen bzw. Kanäle führt und
so einen pulsierenden Bernoulli-Effekt induziert.
Weiterhin kann der Verschluß Stege
aufweisen, die bei einer Anordnung von Behältern die einzelnen Behälter voneinander
steril isoliert. Ein weiterer Steg, Probebehälter, der ebenfalls dem jeweiligen Behälter zugeordnet
ist, kann so ausgebildet sein, daß er in die Suspension eintaucht
und dabei den Einlaß für das Sterilgas
von dem oben genannten Auslaß abtrennt.
Dies führt
dazu, daß das
Sterilgas zu einem Weg durch die Kultursuspension gezwungen wird
und dadurch die Begasung der Kultursuspension weiter verbessert
wird.
Im folgenden werden Beispiele erfindungsgemäßer Vorrichtung,
Anordnung von Vorrichtung, Rührorgane
und zugehöriger
Verfahren beschrieben.
Es zeigen
1 einen
Längsschnitt
durch eine Anordnung (Bioreaktorblock) von Bioreaktoren;
2 verschiedene
Varianten der Anordnung von Strömungsbrechern
und Rührorganen
in einem Biorektor;
3 die
Anordnung eines erfindungsgemäßen Rührorgans
und Strömungsbrecher
in einem Bioreaktor;
4 bis 6 weitere erfindungsgemäße Vorrichtungen;
7 ein
erfindungsgemäßes Rührorgan;
8 bis 13 weitere erfindungsgemäße Rührorgane;
14 eine
weitere Anordnung von Bioreaktoren und die Struktur des dazugehörigen Verschlusses;
15 die
Struktur eines weiteren Verschlusses;
16 eine
Gesamtanordnung mit Pipettier-Roboter;
17 den
prinzipiellen Ablauf einer parallelen Steuerung einer Bioreaktorenanordnung;
18 maximale
Sauerstoffübergangs-Koeffizienten
für erfindungsgemäße Magnetrührorgane verschiedenen
Typs;
19 Sauerstoffübergangskoeffizienten
für Magnetrührorgane
verschiedener erfindungsgemäßer Typen;
20 bis 22 die Ergebnisse der Kultivierung
von Escherichia coli in erfindungsgemäßen Rührsystemen verschiedenen Typs;
23 eine
Tabelle der für
die Messungen gemäß der 18 bis 22 verwendeten Rührsysteme.
Im folgenden werden in sämtlichen
Figuren für
gleiche oder ähnliche
Elemente gleiche oder ähnliche
Bezugszeichen verwendet.
1 zeigt
eine erfindungsgemäße Anordnung
von Reaktionsgefäßen 9a, 9b als
Behälter
in einem Modulsystem 2, das im folgenden insgesamt als Bioreaktorblock 1 bezeichnet
wird.
Dieser Bioreaktorblock
1 enthält bis zu
96 Kavitäten bzw.
Bohrungen
8a,
8b, wobei diese in verschiedenen
Formaten angeordnet sein können,
beispielsweise 4 × 3,
4 × 5,
8 × 3,
8 × 6
bzw. 8 × 12
Bohrungen. Die Durchmesser der Bohrungen
8a,
8b liegen
vorteilhafterweise zwischen 10 und 35 mm. Sie werden so im Bioreaktorblock
1 angeordnet,
daß entsprechend
dimensionierte Kleinstreaktionsgefäße
9a,
9b in
diese formschlüssig
eingebracht werden können.
Der Bioreaktorblock
1 ist dabei aus einer Vielzahl von
horizontalen Schichten
3,
4,
5 aufgebaut,
wobei die unterste Schicht
3 eine Basisplatte, die darüberliegende
Schicht
4 einen Mittelteil und die darüberliegende Schicht
5 einen
Oberteil bildet. Zwischen der Basis platte
3 und dem Mittelteil
4 sind
Bohrungen
6a,
6b,
6c angeordnet, die
als Wärmetauscher
von einem Fluid mit geeigneter Temperatur durchströmt werden
und so den gesamten Bioreaktorblock
1 temperieren. Im Mittelteil
4 sind
weiterhin die Bohrungen
8a,
8b umgebend magnetisch
induktive Magnetantriebe
7a,
7b angeordnet wie
sie beispielsweise aus der
US
4 568 195 bekannt sind. Das Oberteil
5 enthält einen
seitlich überstehenden
Rand
12 längs
der Außenseite
des gesamten Biorektorblockes
1, in den eine Sterilgaszufuhr
13 zur
Zufuhr von sterilem Gas von außen
in den Bioreaktorblock
1 eingebracht ist.
Im Innenbereich des Bioreaktorblocks 1 kann
auf das Oberteil 5 eine Distanzscheibe 11 aufgelegt
werden. Da das einzelne Rührgefäß 9a, 9b an seiner
Oberseite bzw. Oberkante einen ringförmigen Flansch 10a, 10b aufweist,
stützt
sich dieser Flansch 10a, lOb auf die Distanzscheibe 11.
Durch Wahl einer geeignet dicken Distanzscheibe 11 kann
die Höhe des
Reaktorgefäßes 9a, 9b eingestellt
werden. Damit ist dann die Rührhöhe eines
in dem Gefäß 9a, 9b angeordneten
Magnetrührers 21a, 21b über dem
Boden des Reaktionsgefäßes 9a, 9b definiert.
In das jeweilige Reaktionsgefäß 9a, 9b ist
an dessen Boden aufliegend ein einstückiger Strömungsbrecher 20a, 20b angeordnet,
der an zwei Stellen auf der Umfangslinie des Reaktorgefäßes 9a, 9b den
Querschnitt des Reaktorgefäßes verengt.
Der Strömungsbrecher 20a, 20b endet
mit seiner Oberkante im vorliegenden Beispiel unterhalb der Rührebene
des Rührorgans 21a, 21b.
In anderen Beispielen kann sich jedoch der Strömungsbrecher auch seitlich
neben das Rührorgan
erstrecken oder dieses sogar nach oben überragen. Es ist auch möglich, daß die Strömungsbrecher
nur oberhalb und/oder in der Rührebene
des Rührorgans
angeordnet sind.
Der auf den Bioreaktorblock 1 aufgebrachte Deckel
bzw. Abdeckung 15 weist Mittelstege 14a, 14b auf,
die sich bis zu der Distanzscheibe 11 erstrecken und so
die einzelnen Reaktionsgefäße 9a, 9b als
Trennwände
steril voneinander isolieren. Weiterhin sind Stege 18a, 18b vorgesehen,
die sich bis in den Reaktionsraum 9a, 9b erstrecken
und diesen ebenfalls als Trennwände
in zwei Kompartimente teilen. Zuletzt weist der Deckel 15 auch
noch je eine Bohrung 16a, 16b auf, durch die sich
jeweils ein Röhrchen 17a, 17b erstreckt.
Dieses Röhrchen 17a, 17b stellt
eine beständig
offene Verbindung zwischen der Außenseite des Bioreaktorblocks 1 und
jeweils einem der Reaktorgefäße 9a, 9b dar.
Wird nun eine Kultursuspension 30a, 30b in die
jeweiligen Gefäße 9a, 9b eingebracht,
so trennt der Steg 18a, 18b die Oberfläche 19a, 19b der
Flüssigkeit 30a, 30b in
zwei voneinander getrennte Bereiche 19a, 19a' bzw. 19b, 19b'. Wird nun der
Rührer 21a bzw. 21b in
Drehung zersetzt, so bildet sich eine konvexe Flüssigkeitsoberfläche 19a bzw. 19b aufgrund
der Mitdrehung der Flüssigkeit
aus. Für
die Flüssigkeit 30a bzw. 30b an
der Oberfläche 19a' bzw. 19b' ist dieser
Effekt nicht so ausgeprägt
und hier nicht weiter dargestellt.
Wird nun über die Sterilgaszufuhr 13 ein
Gas auf die Oberfläche 19a' unter Überdruck
geleitet, so muß dieses
um den Behälter 9a wieder
zu verlassen durch den linken Schenkel 31a der Flüssigkeitssäule unter
dem Steg 18a hindurch in den rechten Schenkel 32a der
Flüssigkeitssäule strömen und
von dort das Gefäß über das
Röhrchen 17a wieder
verlassen. Da das Röhrchen 17a auf
diese Art und Weise ständig
von innen nach außen
durchströmt
wird, ist das Reaktionsgefäß 9a steril,
obwohl das Röhrchen 17a offen
ist und einen beständig
offenen Zugang zu dem Gefäß 9a bildet.
Dasselbe gilt für
das Reaktionsgefäß 9b entsprechend.
Vorteilhafterweise können nun über das Röhrchen 17a bzw. 17b ohne
weiteres Eingriffe in den Reaktionsablauf durchgeführt werden.
Dies bedeutet beispielsweise, daß über das Röhrchen 17a, 17b Substrat
oder Titrationsmittel oder Induktoren hinzugegeben werden können, daß Proben
entnommen werden können
oder Meßsonden,
beispielsweise pH-Elektroden in die Flüssigkeit 30a bzw. 30b eingeführt werden
können.
Das Einführen
entsprechender Sonden erfolgt dabei im Gegenstrom des ausströmenden sterilen
Gases, so daß eine
Kontamination des Gefäßes 9a bzw. 9b vermieden
wird.
Die Abdeckung 15 realisiert
daher eine Sterilabdekkung für
den Bioreaktorblock 1 mit einer zentralen Gaseinspeisung 13 über ein
Sterilfilter. Eine individuelle Verteilung des sterilen Gases über zu den einzelnen
Milliliter-Rührreaktoren
führende
Gasverteilerstrukturen kann ebenfalls erfolgen.
Der konvektive Luftstrom durch das
Röhrchen 17a, 17b,
verhindert also im Betrieb den Eintrag von Fremdkeimen über die
Umgebungsluft. Das offene Führungsrohr 17a, 17b ist
hier beispielsweise aus Aluminium gefertigt und ist dadurch auch
als Zugang mit sterilen Pipettenspitzen oder Anstechkanülen geeignet.
Werden Gasverteilerstrukturen in
der Sterilabdeckung eingesetzt, so sind diese so zu gestalten, daß eine Kreuzkontamination
durch Aerosolverschleppung oder Schaumbildung ausgeschlossen wird.
Der Bioreaktorblock 1 und
die Abdeckung 15 sind so paßgenau gestaltet, daß sie unter
einer sterilen Arbeitsbank, gegebenenfalls nach steriler Befüllung der
Einzelreaktoren 9a, 9b mit Reaktionsmedium 30a, 30b zu
einer Funktionseinheit zusammengefügt werden können.
Die Sterilisation des Bioreaktorblocks 1 und der
Abdeckung 15 kann entweder gemeinsam in einem Autoklaven
oder auch als Einzelkomponenten erfolgen. Zur Sterilisation des
Bioreaktorblocks 1 im Autoklaven ist eine kostenaufwendige
Kapselung der induktiven Antriebe 7a, 7b erforderlich,
um ein direktes Autoklavieren zu ermöglichen.
Alternativ können auch wie hier vorgestellt, Bioreaktoreinsätze 9a, 9b verwendet
werden (entsprechend zu Mikrotiterplatten) die getrennt vom Bioreaktorblock 1 sterilisierbar
sind. Diese Bioreaktoreinsätze 9a, 9b können auch
als sterile Einmal- bzw. Wegwerfartikel ausgestaltet sein, sofern
deren Material und Produktionskosten gering sind.
2 zeigt
in den Teilbildern a bis d die Verwendung von Strömungsbrechern 20 und
Rührorganen 21 zur
Erzeugung eines pulsierenden Bernoulli-Effektes. Dabei ist jeweils
nur die linke Hälfte
eines Reaktionsgefäßes 9 dargestellt.
In den 20a und 20b ist die Oberkante des
Strömungsbrechers 20 unterhalb
der Rührebene des
Rührorgans 21.
In 2a ist
das Rührorgan
mittig in dem Gefäß 9 gelagert,
wobei die Lagerung magnetisch induktiv er folgt.
In 2b ist
das Magnetrührorgan 21 über eine
Welle 23 gelagert, über
die es auch angetrieben werden kann.
In den 2c und 2d erstreckt sich der Strömungsbrecher 20 seitlich über die
Drehebene des Magnetrührorgans 21 hinaus.
In 2c ist
das Rührorgan 21 so
wie in 2b über eine
Welle 23 gelagert und wird gegebenenfalls auch über diese
oder magnetisch angetrieben. In 2d ist
die Welle 23 innerhalb des Rührgefäßes 9 exzentrisch
außerhalb
der Mittelachse 24 des Gefäßes 9 gelagert, so
daß der
durch den Strömungsbrecher
erzeugte pulsierende Bernoulli-Effekt hier noch weiter verstärkt wird.
In den einzelnen Fällen der 2a und 2d bildet sich damit eine unterschiedlich
geformte Flüssigkeitsoberfläche 19 der
Flüssigkeit 30 aus.
Bei sämtlichen Beispielen 2b bis 2d ist
es möglich,
sofern die Welle 23 nicht dem Antrieb des Magnetrührorgans 21 dient,
die Welle 23 und den Strömungsbrecher 20 einstückig zu
fertigen und als Einheit in das Reaktionsgefäß 9 paßgenau einzuschieben.
Im folgenden werden nun Beispiele
für erfindungsgemäße Rührorgane
und erfindungsgemäße Reaktionsgefäße dargestellt.
Denn bei Verwendung eines geeigneten Rührorgans besteht prinzipiell
die Möglichkeit,
auf eine Primärdispergierung
der Gasphase durch einen Gasverteiler wie im Stand der Technik zu
verzichten, da kleine Reaktionsgefäße im Vergleich zu Labor-Rühr kesselreaktoren
ein weitaus höheres
Oberfläche/Volumen-Verhältnis aufweisen.
In der vorliegenden Erfindung wurden
geeignete, vorteilhafterweise dampfsterilisierbare Magnetrührorgane
entwickelt, die eine axiale Förderung von
der Flüssigkeitsoberfläche zum
Boden des Reaktionsgefäßes (Einsaugen
der Gasphase) und eine effektive Dispergierung der Gasphase in möglichst kleine
Gasblasen mit hoher Sauerstoffaustauschfläche (hohe lokale Energiedissipation)
im Reaktionsmedium sowie eine Freisetzung der verbrauchten Gasblasen
an der Flüssigkeitsoberfläche bewirken. Diese
Magnetrührorgane
besitzen einen Grundkörper,
der vorteilhafterweise aus Teflon gefertigt sein kann und einen
bis vier Magnetkerne (Ferrit oder seltene Erdmagnete wie z. B. SmCo
(SamariumCobalt) oder NdFeB (NeodymEisenBor)) als Antriebsmittel enthält. Die
im folgenden vorgestellten Magnetrührorgane haben vorteilhafterweise
die folgenden Dimensionen und Formen:
- – Kreiszylindrische
Magnetrührorgane
3 bis 20 mm Durchmesser, Höhe
von 2 bis 25 mm.
- – Eiförmige Magnetrührorgane
runder Zentralquerschnitt (Durchmesser 15 mm), Länge von 3 bis 20 mm.
- – Quaderförmige Magnetrührorgane
3 × 8
mm bis 9 × 20
mm Grundfläche
und Höhen
von 4 bis 25 mm.
Diese Grundkörper sind vorteilhafterweise mit
Bohrungen bzw. Kanälen
versehen. Diese sind zwischen 3 und 20 mm lang und besitzen Durchmesser
von 0,5 bis 3 mm. Hierbei sind unterschiedliche Anordnungen der
Bohrungen realisierbar:
- – Unter einem nach oben offenen
Winkel α zur Vertikalen
verlaufende Kanäle
induzieren eine Ringströmung
im Reaktionsgefäß.
- – Unter
einem nach oben offenen Winkel a zur Vertikalen verlaufende Kanäle treffen
vor deren Austritt in die Flüssigkeit
auf unter einem Winkel β zur
Horizontalen verlaufende Luftkanäle.
- – Vertikal
verlaufende Kanäle
mit einem Abstand von 0–3
mm begünstigen
das Entgasen der Flüssigphase.
Diese Magnetrührorgane werden dabei auf Geschwindigkeiten
bis zu 4000 U/min beschleunigt, beispielsweise durch ein geeignetes
magnetisches Drehfeld oder durch eine Welle.
Das Einsaugen der Gasphase in die
Reaktionsgefäße mit diesen
Rührorganen
setzt bei einer Mindestdrehzahl des Magnetrührorgans ein und wird durch
Steigerung der Drehzahl stärker.
Diese Mindestdrehzahl ist abhängig
vom eingesetzten Magnetrührorgan,
von der Position des Magnetrührorgans
unterhalb der ruhenden Flüssigkeitsoberfläche und
von den Stoffeigenschaften der Flüssigkeit.
Ein besonders effektives Einsaugen
der Gasphase und Dispergierung in Gasblasen im Reaktionsmedium kann
in Reaktionsgefäßen mit
Strömungsbrechern
erfolgen, die längs
der Gefäßwand in der
umlaufenden Flüssigkeitsströmung angeordnet sind.
Diese vorteilhafterweise ein bis vier Strömungsbrecher können entweder
unterhalb und/oder oberhalb oder über die gesamte Gefäßhöhe an der
Gefäßwand angeordnet
sein.
Das Magnetrührorgan wird bevorzugt selbstzentrierend in
einem geeigneten, rotierenden Magnetfeld betrieben. Es kann jedoch
wie in 2 gezeigt auch
eine Befestigung des Magnetrührorgans auf
einer im Reaktionsgefäß fixierten
Welle erfolgen.
Die 3 bis 13 zeigen verschiedene Ausführungsformen
erfindungsgemäßer Rührgefäße bzw.
Rührorgane.
3 zeigt
in 3b ein Rührgefäß 9,
bei dem an jeweils gegenüberliegenden
Seiten insgesamt vier Strömungsbrecher 20a bis 20d angeordnet sind.
Diese sind in 90° Abstand
auf den Umfang des Rührgefäßes 9 verteilt
und erstrecken sich bis in die Drehebene des in dem Gefäß 9 angeordneten
Rührorgans 21.
Das Rührorgan 21 dreht
sich um seine Mittelachse 22 und ist zentrisch in dem Gefäß 9 angeordnet.
Es weist ausgehend von seiner Unterseite 29 eine Bohrung 33 mit
einer unteren Öffnung 43 auf, die
sich in senkrechter Richtung, d. h. unter einem Winkel von 0° zur Drehachse 22 nach
oben erstreckt. Von der Oberseite 28 des Drehorgans 21 erstrecken sich
zwei Bohrungen 34a und 34b mit Öffnungen 44a und 44b an
der Oberseite 28 des Drehorgans 21 nach unten.
Sämtliche
Bohrungen 33, 34a und 34b münden in
horizontale Bohrungen 35a und 35b, die sich um
180° zueinander
versetzt bis zur seitlichen Außenseite
des Rührorgans 21 erstrekken
und dort Öffnungen 45a und 45b bilden.
Wenn das Rührorgan 21 um seine
Mittelachse 22 in einer Flüssigkeit 30 dreht,
induziert der Kanal 33 eine Ringströmung im Reaktionsgefäß gemeinsam
mit dem horizontal verlaufenden Kanal 35a. Die Kanäle 34a und 34b saugen
ihrerseits Gas von oben ein und führen ebenfalls zu einer verbesserten
Begasung der im Gefäß 9 befindlichen
Flüssigkeit 30.
3a zeigt
einen Querschnitt längs
der Linie A-A in 3b durch
die gesamte Anordnung. Unter der Annahme, daß sich das Rührorgan 21 um
die Achse 22 in Uhrzeigerrichtung dreht (diese Annahme wird
auch bei den folgenden Figuren eingehalten) bilden sich nun zwischen
den Brechern 20a bis 20d und dem Rührorgan 21 jeweils
schmale Spalte 37a bis 37d mit Bereichen 40 mit
hoher Strömungsgeschwindigkeit
und damit niedrigem Flüssigkeitsdruck
aus. Zwischen den Strömungsbrechern 20a bis 20d längs des
Gefäßumfangs
liegt ein großer
Spalt 36 zwischen dem Rührorgan 21 und
der Wand des Gefäßes 9 vor
in dem dementsprechend Bereiche 41 mit geringer Strömungsgeschwindigkeit
und damit großen hydrostatischem
Druck auftreten. Insgesamt führt
der Betrieb eines solchen Reaktionsgefäßes 9 zu einer örtlichen
Schwankung der Strömungsgeschwindigkeit,
d. h. zu einem örtlich
pulsierenden Bernoulli-Effekt.
Durch die Bohrungen 33, 34a, 34b, 35a und 35b werden
weiterhin zeitlich längs
der Öffnungen 45a und 45b im
Gefäß umlaufende,
pulsierende Schwankungen der Strömungsgeschwindigkeit
induziert, die ebenfalls zu einer Begasung des Reaktionsvolumens
führen.
Der Antrieb des Rührorgans 21 erfolgt
magnetisch induktiv über
in das Rührorgan 21 eingelagerte
Magnete 25a bis 25d.
4 zeigt
eine Anordnung mit einem zu 3 identischen
Rührorgan 21,
wobei hier jedoch das Reaktionsgefäß wie in 4a, dem Schnitt längs der Linie A-A in 4b, zu erkennen ist, einen
rechteckigen Querschnitt aufweist. Strömungsbrecher sind nicht vorhanden.
In diesem Falle ändert
sich die Spaltbrei te zwischen Rührorgan,
das rotationssymmetrisch aufgebaut ist und der Wand des Rührgefäßes 9 räumlich periodisch,
da die Spalten in den Ecken des Rührgefäßes 9 breiter sind
als zwischen der Mitte der jeweiligen Wand des Rührgefäßes 9 und dem Rührorgan 21.
Dies führt
wiederum zu Bereichen 40 mit hoher Strömungsgeschwindigkeit in der
Mitte der Wände
und Bereichen 41 mit geringer Strömungsgeschwindigkeit in den
Ecken des Gefäßes 9.
Die Wirkung dieses so räumlich
pulsierenden Bernoulli-Effektes wird verstärkt durch die Verwendung eines
Rührorgans 21 mit
den vorbeschriebenen Bohrungen, die einen zeitlich pulsierenden
Bernoulli-Effekt induzieren.
5 zeigt
wiederum dasselbe Rührorgan 21,
das nunmehr jedoch in einem rotationssymmetrischen Rührgefäß 9 angeordnet
ist. Allerdings erfolgt die Anordnung des Rührorgans 21 exzentrisch
zur Mittelachse 24 des Gefäßes 9 auf einer Welle 23. Nunmehr
ist durch die exzentrische Anordnung dafür gesorgt, daß der Spaltabstand 36 zwischen
der Wand des Rührgefäßes 9 und
dem Rührorgan 21 auf einer
Seite des Gefäßes größer ist
als auf der anderen Seite des Gefäßes. Dementsprechend bilden sich
wieder Zonen 41 geringer Strömungsgeschwindigkeit 41 im
Bereich des großen
Spaltes und Zonen 40 hoher Strömungsgeschwindigkeit im Bereich
des schmalen Spaltes aus. Auch hier wird der so mit einer Periode
von 360° pulsierende
Bernoulli-Effekt verstärkt
durch die Bohrungen 33, 34a, 34b, 35a, 35b in dem
Rührorgan 21.
Auch in 6 wird ein ähnliches Rührorgan 21 verwendet
wie in der vorigen Figur. In diesem Falle liegt wiederum ein zylinderförmiges Reaktionsgefäß 9 und
ein zylinderförmiges
Rührorgan 21 vor.
Der Abstand 36 zwischen der Wand des Rührgefäßes 9 und dem Rührorgan 21 ist
nun auf dem vollen Umfang nahezu identisch mit zwei Ausnahmen. Denn die
horizontalen Bohrungen 35a und 35b sind beim vorliegenden
Rührorgan 21 im
Bereich ihrer seitlichen Öffnungen 45a und 45b konisch
auf geweitet. In diesen Bereichen liegt jeweils eine Erweiterung 36a' bzw. 36b' des Spaltes 36 vor,
so daß dort
Zonen 41 niedriger Strömungsgeschwindigkeit
sich ausbilden. Daher laufen diese Zonen 41 niedriger Strömungsgeschwindigkeit
nunmehr mit dem Rührorgan 21 innerhalb
des Gefäßes 9 um.
Dies führt
zu einem örtlich und
zeitlich pulsierenden Strömungsfeld
und damit wiederum zu dem gewünschten
pulsierenden Bernoulli-Effekt.
7 zeigt
die einfachste Form eines Rührorganes 21 mit
schräg
nach außen
verlaufenden Bohrungen 33a und 33b. Die Bohrungen 33a, 33b beginnen
an der Unterseite 29 des Rührorgans 21 mit einer Öffnung 43a, 43b und
enden an der Oberseite 28 des Rührers 21 in einer Öffnung 44a bzw. 44b. 7b zeigt dabei einen Schnitt
längs der
Linie A-A aus 7a.
Die Bohrungen weisen dabei einen
länglichen
Querschnitt auf, wie in 7a in
der Aufsicht zu erkennen ist. Sie führen zu einer Förderung
von Flüssigkeit
von dem Boden 29 des Rührgefäßes 9 nach oben
und tragen so zur Ausbildung der Flüssigkeitsoberfläche als
Trombe bei.
8 zeigt
ebenfalls ein Rührorgan,
wie es ähnlich
bereits in 3 dargestellt
wurde. 8b zeigt dabei
einen Querschnitt, 8a einen
Querschnitt längs
der Schnittlinie A-A in 8b und 8c einen Querschnitt längs der
Schnittlinie B-B in 8b.
Im Unterschied zu 3 liegen
nunmehr jedoch nicht zwei vertikal von der Oberfläche des
Rührorgans sich
in dessen Innere erstreckende Bohrung 34a und 34b sondern
insgesamt vier um einen Winkel von 90° zueinander versetzte Bohrungen 34a bis 34d vor.
In 9 ist
ein weiteres erfindungsgemäßes Rührorgan
dargestellt, wobei die 9a und 9c eine Aufsicht bzw. eine
Untersicht des in 9b im
Querschnitt dargestellten Rührorganes
darstellen. Auch hier sind in dem Rührer 21 wiederum vier
von der Oberseite 28 des Rührorgans 21 ausgehende
Bohrungen 34a bis 34d um die Mittelachse 22 des
Rührorganes 21 um
90° versetzt
angeordnet, wobei sich diese Bohrung 34a bis 34d nunmehr
unter einem Winkel β zur
Mittelachse bzw. Drehachse 22 des Rührorgans 21 nach unten
außen
erstrecken. In gleicher, nahezu symmetrischer Weise erstrecken sich Bohrungen 33a bis 33d von
der Unterseite 29 des Rührorganes 21 unter
einem Winkel α gegen
die Mittelachse bzw. Drehachse 22 des Rührorgans 21 nach oben
außen
in den Körper
des Rührorgans 21 hinein. Beide
treffen auf insgesamt vier ebenfalls um 90° gegeneinander versetzt angeordnete
horizontale Kanäle 35a bis 35d,
die mit Öffnung 45a bis 45d in
der Seitenfläche 26 des
Rührorganes
enden.
Die Seitenfläche 26 dieses Rührorganes
erstreckt sich von seiner Oberfläche 28 senkrecht
nach unten bis zu der Ebene der horizontalen Bohrungen 35a bis 35d und
läuft dann
konisch parallel zu den Bohrungen 33a bis 33d nach
unten zusammen.
Die Bohrungen 33a bis 33d fördern wiederum
Flüssigkeit
vom Boden eines Gefäßes nach
oben während
die Bohrungen 34a bis 34d Gas- und Flüssigkeit
bzw. eine Mischung hiervon von der Oberfläche 28 des Rührorganes 21 einziehen
und an der Grenzfläche
von Gas- und Flüssigkeit
Turbulenzen erzeugen. Auch hierdurch wird ein pulsierender Bernoulli-Effekt
erzeugt bzw. gegebenenfalls verstärkt.
Eine weitere Möglichkeit einen pulsierenden Bernoulli-Effekt
zu erzeugen besteht darin, ein nicht rotationssymmetrisches Rührorgan
einzusetzen.
Bei dem in 10 dargestellten Rührorgan 21 liegen
eine geradlinige Vorderseite 26 und eine zur Vorderseite 26 parallele,
geradlinige Rückseite 27 vor,
während
die sich längs
der Wand des Rührgefäßes 9 bewegenden
die Vorderseite 26 und die Rückseiten 27 verbindenden
Seitenflächen 27 konvex
gekrümmt
sind.
Ein derartiges Rührorgan 21 kann beispielsweise
in einem nicht rotationssymmetrischen Rührgefäß oder in einem Rührgefäß mit Strömungsbrechern
eingesetzt werden.
In 11 ist
ein Rührorgan
wie in 10 dargestellt,
das zusätzlich
unter einem Winkel α gegen
die Drehachse 22 verlaufende Bohrungen 33a bzw. 33b aufweist.
Diese fördern
Flüssigkeit
von den Öffnungen 43a, 43b an
der Unterseite 29 des Rührorganes 21 zu
den Öffnungen 43a' und 43b' an der Oberseite 28 des
Rührorgans 21.
12 zeigt
ein Rührorgan
wie in 11, wobei nunmehr
die Bohrungen 33a und 33b eine wie in 12a in der Aufsicht erkenntliche
im Querschnitt längliche
Form aufweisen.
In 13 sind
zusätzlich
zu den Bohrungen 33a und 33b wie in 11 weitere Bohrungen 34a, 34b eingebracht,
die sich versetzt zur Mittelachse 22 des Rührorgans 21 parallel
zur Mittelachse 22 von der Un terseite 29 zur Oberseite 28 erstrecken
und jeweils in Öffnungen 44a, 44b an
der Unterseite 29 bzw. in Öffnungen 44a', 44b' an der Oberseite 28 enden.
Diese Kanäle 34a, 34b dienen
der Entgasung der Flüssigkeit,
d. h. dem Entfernen der verbrauchten in die Flüssigkeit eindispergierten Gasblasen.
14 zeigt
in Teilbild a eine erfindungsgemäße Reaktorvorrichtung,
bei der in Öffnungen 8a bis 8e in
einem Reaktorblock 2 Behälter 9a bis 9e eingelassen
sind. Diese Behälter 9a bis 9e weisen wiederum
an ihrem oberen Umfangsrand ihrer Öffnung einen Flansch auf, mit
dem sie auf einer Distanzscheibe 11a bis 11f aufliegen.
Die gesamte Anordnung der Behälter
wird überdeckt
von einem deckelartigen Verschluß 15, in den wie bereits
oben beschrieben, Röhrchen 17a bis 17e eingelassen
sind, um ein Ausströmen
von Gas zu ermöglichen.
Der Deckel 15 weist weiterhin Trennwände 14a bis 14e auf, um
die einzelnen Behälter
voneinander gasdicht zu isolieren.
14b zeigt
nun einen Querschnitt längs der
Linie A-A in 14a durch
den Verschluß 15, während 14a ein Querschnitt durch
die Gesamtanordnung längs
der Linie B-B in 14b darstellt.
Ausgehend von einer Gaszufuhrbohrung 50 verästelt sich
diese Bohrung über
einzelne weitere Bohrungen 51, 52, 53, 54 bis 55 immer
weiter und mündet
letztlich in jeweils einen Gasauslaß über den einzelnen Behältern 9a bis 9e.
In 14b ist auch zu erkennen,
daß die
Behälter 9 in
einem zweidimensionalen Array angeordnet sind. Die Länge der
Bohrungen 50 bis 55 von dem Gaseinlaß 50 bis
zum Auslaß in
den Luftraum über
den Gefäßen 9 ist
dabei jeweils konstant. Auch die Zahl der Knicke, die die einzelnen
Gasfüh rungen
vom Einlaß bis
zum Auslaß über den
Behältern
durchlaufen, ist konstant. Die Höhe
der Kanäle
kann dabei jedoch variabel sein. Entscheidend ist nun, daß entweder
in diesen Bohrungen 50 bis 55 kein nennenswerter
Druckabfall auftritt oder der Druckabfall durch die gleiche Länge und die
gleiche Anzahl an Knicke für
jedes einzelne Behältnis 9 identisch
ist.
15 zeigt
einen weiteren Verschluß 15 mit einer
entsprechenden Gasverteilerstruktur bestehend aus Kanälen 50 bis 55, 51' bis 55'. Auch hier sind
die Wege und die Anzahl der Knicke vom Einlaß 50 bis zu dem jeweiligen
Behälter 9 für jeden
Behälter
identisch.
Im folgenden werden nun einzelne
Messungen mit erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßen bzw. mit
einem erfindungsgemäßen Bioreaktorblock
dargestellt.
Wenn der Bioreaktorblock 1 entsprechend geometrisch
gestaltet wird (Abstand und Anordnung der einzelnen Milliliter-Rührreaktoren,
z. B. jeweils 8 Milliliter-Rührreaktoren
parallel – da
Pipettier-Roboter meist mit 8 parallelen Dosierstrecken ausgerüstet sind
-, etc.) kann eine einfache Automatisierung erfolgen. Mit Hilfe
eines Pipettier-Roboters als Aktor können
- – Proben
individuell gezogen und prinzipiell alle manuellen off-line Analysenverfahren
automatisiert werden (Bestimmung von Zell-, Substrat-, Produkt-
und Nebenprodukt-Konzentrationen),
- – Korrekturmittel,
Substrate und/oder Induktoren individuell dosiert werden,
- – die
einzelnen Milliliter-Rührreaktoren
mit Sensoren (bspw. entsprechend dimensionierte pH- Elektroden) intermittierend
beprobt werden.
Mit Hilfe geeigneter Prozeßkontrollsysteme ist
damit eine automatisierte Prozeßführung im
Parallelansatz möglich:
pH-Regelung, individuelle Substratdosierung, automatisierte off-line
Probenahme und Analyse, und dergleichen.
Prinzipiell sind zur automatisierten
Durchführung
von parallelen Zellkultivierungen folgende Arbeitsschritte notwendig.
Die Zeitplanung sind dabei so ausgelegt, daß die Arbeitsschritte im Verlauf
des gesamten Prozesses im gleichen Zeittakt ausgeführt werden
können,
d.h. es wird die Einhaltung einer konstanten Zeitspanne Δt zwischen
den Arbeitsschritten ermöglicht.
Ein solcher Zeitplan ist in 17 dargestellt.
- – Dispensing
D: Die parallel betriebenen Milliliter-Rührreaktoren werden von einem
Pipettier-Roboter
mit sterilem, destillierten Wasser zur Verdunstungskontrolle und/oder
frischem Medium zur Realisierung von Zulauf- oder kontinuierlichen Verfahren
und/oder Titrationsmittel zur pH-Kontrolle
und/oder Induktionsmittel versorgt. Die jeweilig notwendigen Volumina
einer jeden Lösung werden
durch im Voraus mit allen notwendigen Parametern initialisierte
Algorithmen berechnet.
- – Sampling:
Um at-line Analytik automatisiert durchführen zu können, werden den Milliliter-Rührreaktoren regelmäßig vorgegebene
Probenvolumina entnommen und in Mikrotiterplatten abgegeben.
- – Mikrotiterplattenbewegungen
MTP Trans: Nach Entnahme einer vorgegebenen Anzahl Proben in eine
Mikrotiterplatte, beispielsweise einer Probe pro Milliliter-Rührreaktor,
wird die Mikrotiterplatte vom Labor-Roboter zu einem Mikrotiterplatten-Meßgerät transportiert.
- – At-line
Analytik: Die in eine Mikrotiterplatte abgegebenen Bioreaktorproben
werden in einem Meßgerät (z.B.
Mikrotiterplatten-Photometer/Fluorimeter) vermessen. Beispielsweise
können
so die Biotrockenmassekonzentration (cx)
und der pH-Wert bestimmt werden. Auch andere bioverfahrenstechnisch
relevante Parameter (z.B. Substratkonzentration, Produktkonzentration)
könnten
auf diese Weise bestimmt werden. Die erhaltenen Meßwerte werden
Regelalgorithmen zur Verfügung
gestellt und nehmen so Einfluß auf
die folgenden vom Laborroboter auszuführenden Dispensing-Schritte.
Durch Etablierung eines Kreislaufs mindestens zweier Mikrotiterplatten
kann die Analytik parallel zu den vom Pipettier-Roboter durchgeführten Dispensing- und Sampling-Schritten erfolgen.
Eine Mikrotiterplatte wird demnach mit Proben gefüllt während die
Proben in der zweiten Mikrotiterplatte im Meßgerät analysiert werden. Nach abgeschlossener
Analyse der Mikrotiterplatte wird diese in einem Mikrotiterplatten-Waschgerät gesäubert und
dem Kreislauf erneut zugeführt.
- – Reinigung
der Mikrotiterplatte („Plate
wash"): Nach Beendigung
des Versuchs wird die jeweilige Mikrotiterplatte gereinigt und kann
so erneut verwendet werden.
16 zeigt
eine Anordnung mit Mikrotiterplatten 60a, 60b, 60c in
einem Pipettier-Roboter, wobei in dieser Skizze der Kreislauf einer
Proben-Mikrotiterplatte 60a bis 60c verfolgt werden
kann. Die in 16 dargestellte
automatische Anlage 56 weist eine Grundplatte 57 auf,
auf der eine Anordnung 64 von Behältern (Reaktorblock) oder Probenahmegefäßen, ein
Tisch 58 zur Aufnahme von Mikrotiterplatten 60a,
ein Fotometer 62 und eine Waschstation 63 aufweist.
Weiterhin ist oberhalb der Grundplatte 57 ein Tragebalken 66 angeordnet,
auf dem mittels Querbalken 59a und 59b die Pipettenspitzen 65 und
ein Tragarm 61 für
Mikrotiterplatten verschieblich aufgehängt sind.
In einem ersten Schritt wird nun
eine Mikrotiterplatte 60a mit Proben aus dem Reaktorblock 64 über die
Pipettenspitzen 65 befüllt.
Die Mikrotiterplatte 60a wird dann mit dem Tragarm 61 zu
dem Fotometer 62 transportiert, wo die einzelnen Näpfchen der
Mikrotiterplatten 60b fotometrisch vermessen werden. Die
so vermessene Mikrotiterplatte 60b wird mit dem Tragarm
zu der Waschvorrichtung 63 transportiert, wo die Mikrotiterplatte
(hier nun Mikrotiterplatte 60c) gewaschen und gereinigt
wird. Damit steht die Mikrotiterplatte 60c wiederum den
Proben und Meßzyklus
zur Verfügung
und wird von dem Tragarm 61 zurück auf den Tisch 58 befördert.
Je nach Prozeßanforderung können dem Prozeßkreislauf
zu bestimmten Zeitpunkten mit Proben gefüllte Mikrotiterplatten entzogen
und gekühlt zwischengelagert
werden. Eine neue Mikrotiterplatte kann dem Prozeß automatisch
zugeführt
werden, um den Analytikkreislauf aufrecht erhalten zu können.
Die Bestimmung von im wäßrigen Reaktionsmedium
gelösten
Stoffen wie die Wasserstoffionenaktivität (pH) muß in jedem Reaktionsgefäß individuell
erfolgen. Eine Verwendung von 48 oder 96 einzelnen
pH-Sensoren, beispielsweise sterilisierbare pH-Einstabmeßketten
(Glaselektroden), ist nicht ökonomisch.
Auch die Verwendung von kostengünstigen
pH-Feldeffekttransistoren („Wegwerfsensoren") ist aufgrund der
zusätzlich
erforderlichen klassischen Referenzelektroden und der fehlenden
thermischen Stabilität
(Sterilisierbarkeit) praktisch nicht möglich.
Die Anzahl der erforderlichen pH-Sensoren für Parallelreaktoren
kann prinzipiell reduziert werden, wenn ein Sensor für mehrere
Reaktionsgefäße benutzt
werden kann. Eine Möglichkeit
der technischen Realisierung ist die Integration kommerziell erhältlicher
Miniatur-pH-Elektroden in Anstechkanülen, die mit Hilfe eines Pipettierroboters
intermittierend in die einzelnen Milliliter-Rührreaktoren eingetaucht werden.
Hierzu geeignet sind pH-Einstabmeßketten mit einem Außendurchmesser
von 1 mm und einer Ansprechzeit von ~ 6 s.
Eine weitere Möglichkeit ist die sterile Entnahme
von Proben aus den einzelnen Milliliter-Rührreaktoren mit Kanülen und
die parallele Messung des pH-Wertes in den Proben mit pH-sensitiven
Mikrotiterplatten. Am Boden der Kavitäten dieser kommerziell erhältlichen
Mikrotiterplatten ist ein Sensorspot integriert, in welchem zwei
Fluorophore immobilisiert sind. Diese Fluorophore können in
einem entsprechend ausgestatteten Photometer-Fluorimeter ausgelesen
werden.
Die Fluoreszenzeigenschaften des
Indikator-Fluorophors variieren mit dem pH-Wert der Lösung während der
Referenz-Fluorophor ein vom pH-Wert unabhängiges Fluoreszenzsignal produziert.
Das Verhältnis
aus Indikator- zu Referenzsignal kann zum pH-Wert der Lösung über eine
Sigmoid-Funktion korreliert werden. Die Verwendung eines Referenzfarbstoffs
erhöht
die Meßgenauigkeit
und die Lebensdauer der Sensoren, da eine Abnahme der Signalintensität durch "Ausbluten" des Sensors (Diffusion
der Fluorophore in die Meßlösungen)
einen geringeren Einfluß auf
das Meßsignal
zur Folge hat.
Die erzeugten pH-Meßdaten werden
vom Prozeßkontrollsystem
gelesen und Regelalgorithmen zur Verfügung gestellt. Diese berechnen
das notwendige Volumen Titrationsmittel pro Reaktorgefäß um einen
gewünschten
pH-Sollwert in dem
Reaktorgefäß aufrecht
zu erhalten. Das Prozeßkontrollsystem berechnet
die Dispensing-Schritte
unter Berücksichtigung
der notwendigen Zudosierung zur pH-Kontrolle.
Wesentlich an der vorliegenden Erfindung
ist der damit mögliche
hohe Sauerstoff- und Energieeintrag in eine Kultursuspension. Im
folgenden werden daher Messungen der Sauerstoffübergangskoeffizienten kLa verschiedener erfindungsgemäßen Magnetrührsysteme
beschrieben.
Es wurden Rührorgane der Typen I bis V
entsprechend 7 (Typ
I), 10 (Typ II), 12 (Typ III), 11 (Typ IV) und 9 (Typ V) mit der dynamischen
Sulfitmethode (Havelka et al. 1998) unter vergleichbaren Bedingungen
bzgl. Volumen der Flüssigphase,
Lagerung des Rührorgans
und Anordnung der Strömungsbrecher
verglichen (siehe 18). Diese
Versuche wurden in einem Milliliter-Rührreaktor mit 15,5 mm Durchmesser
durchgeführt.
Mit den Rührern
der Ty pen I bis V wurden bei einer Drehzahl von 2600 rpm kLa-Werte in 0,5 M Na2SO4-Lösung
im Bereich von 0,156-0,244
s–1 erreicht.
Zur Bestimmung der kLa-Werte
wird als Flüssigphase
0,5 M Na2SO9-Lösung verwendet,
weiche nicht-koaleszierende Bedingungen garantiert. Zusätzlich wird
eine Konzentration von 10–3 M CoSO4 als Katalysator
für die
chemische Oxidation von Sulfit zu Sulfat vorgelegt. Die Durchführung der
dynamischen Sulfitmethode beginnt mit dem Belüften der Flüssigphase mit Luft, bis diese
Sättigung
erreicht. Nach Zugabe einer ausreichend großen Stoffmenge Sulfit um den
gesamten; in der Flüssigphase
gelösten
Sauerstoff zu verbrauchen, sinkt die Gelöstsauerstoffkonzentration der
Flüssigphase
schlagartig auf Null. Nach stöchiometrischem
Sulfitumsatz steigt die Gelöstsauerstoffkonzentration
in der Flüssigphase wieder
an. Aus dieser sogenannten Aufsättigungskurve
wird der kLa-Wert unter Annahme ideal durchmischter
Bedingungen in Flüssig-
und Gasphase bestimmt. Dabei wird die Ansprechzeit der verwendeten Sauerstoffsonde
im Modell berücksichtigt.
Herkömmliche technische Rührkesselreaktoren
werden bei Sauerstoffübergangskoeffizienten von
kLa < 0,25
s–1 betrieben.
Damit sind in erfindungsgemäßen Milliliter-Rührreaktoren
bzw. mit den erfindungsgemäßen Rührorganen
dieselben oder ähnliche
Sauerstoffeintragsraten erreichbar (zum Vergleich: in Schüttelkolben
oder Mikrotiterplatten können
unter optimalen Bedingungen Sauerstoffübergangskoeffizienten von maximal
kLa = 0.07 s–1 erreicht
werden).
Sauerstoffübergangskoeffizienten der Rührsysteme
des Typs III und V wurden darüber
hinaus mit 8 ml 0,5 M Na2SO4-Lösung ebenfalls
in einem Milliliter-Rühr reaktor
mit 20 mm Durchmesser durchgeführt
(19). Dabei wurden Rührsysteme
nach 2b und 2c verwendet. Maximal erreichte kLa-Werte für eine Drehzahl von 2800 rpm
liegen hier sogar bei bis zu 0,355 s–1.
Zur Verifizierung der Sauerstoffeintragseigenschaften
der Rührsysteme
wurden parallele Kultivierungen mit Escherichia coli (wt) als Beispielsystem
durchgeführt.
100 ml eines sterilen, definierten
Mediums wurden in einem mit Alucap verschlossenen 500 ml Schüttelkolben
mit 0,25% Inokkulum aus dem Feedstock angeimpft und 14 h bei 37°C und 200
rpm in einem Schüttelinkubator
mit einer Exzentrizität
von 5 cm inkubiert. Am folgenden Tag wurden 4–6 ml dieser Vorkultur in Milliliter-Rührreaktoren überführt. In
den Milliliter-Rührreaktoren
wurden die Zellen für
3,5 h bei 2000 rpm eines erfindungsgemäßen Rührorgans und weitere 2,5 h
bei 2200 rpm bei 37°C
inkubiert. Der pH-Wert wurde auf 6,8 geregelt.
Der Schüttelkolben (SK) wurde mit den
ca. 40 ml Restvolumen der Vorkultur weiter im Schüttelinkubator
bei gleichen Bedingungen inkubiert.
Die Meßergebnisse in 20 bis 22 belegen,
daß in
den Milliliter-Rührreaktoren
ein weiteres Wachstum der Bakterien möglich ist, wenn genügend Sauerstoff
eingetragen wird. Dabei zeigen die jeweiligen Kurven einen herkömmlichen
Schüttelkolben (SK),
einen erfindungsgemäßen Rührer eines
bestimmten Typs ohne Strömungsbrecher
(z. B. „Typ
II ohne SB") bzw.
mit Strömungsbrecher
(z. B. Typ II"). Aus
den 20 bis 22 ist zu erkennen, daß bereits eine
Drehzahl von 2200 rpm in den Ansätzen
mit den Rührsystemen
des Typs II, III und V eine bis zu 2,5-fach höhere Biotrockenmassekonzentration,
als im Schüttelkolbenansatz
(SK) ermöglicht.
23 gibt
in Tabellenform nun jeweils an, in welcher Konfiguration die einzelnen
Rührsysteme eingesetzt
wurden. Dabei wird jeweils für
die Messungen, die in einer bestimmten Figur dargestellt sind, der
Gefäßdurchmesser
und die Anzahl der Strömungsbrecher
angegeben. Weiterhin wird die Konfiguration aus Strömungsbrecher
und Rührorgan
unter Bezug auf die Darstellung in den 2a bis 2d angegeben.
Zusammenfassend läßt sich damit feststellen,
daß durch
die vorliegende Erfindung parallele Milliliter-Rührreaktoren
ermöglicht
wurden, in denen ein vergleichbarer Wachstumsverlauf von kontrollierten
Prozeßverläufen unter
sterilen Bedingungen ermöglicht
wird wie in Bioreaktoren des Labormaßstabs.
Oberflächenbegaste, gegebenenfalls
mit speziellen Magnetrührorganen
ausgestattete Milliliter-Rührreaktoren
mit einer erfindungsgemäßen Abdeckung
erlauben eine ebenso effiziente Sauerstoffversorgung von Organismen
in Flüssigkultur
wie Rührkesselreaktoren
größeren Maßstabs mit
Volumenbegasung.
Der Einsatz von bis zu 96 und mehr
sterilen Milliliter-Rührreaktoren
in einem Bioreaktorblock, der mit Hilfe von Pipettier-Robotern unter
sterilen Bedingungen automatisierbar ist, ermöglicht erstmalig einen effizienten,
individuell kontrollierten Parallelbetrieb. Die Verwendung eines
Labor-Roboters zur Automatisierung der Parallelreaktionen ermöglicht damit
einen Quantensprung in der Gewinnung relevanter Pro zeßdaten.
Durch Implementierung geeigneter
Screening- und Optimierroutinen können Screening-Verfahren und
Prozeßoptimierungen
(Medienzusammensetzung, Induktionsverfahren, Dosierprofile) systematisch
und mit hoher Zeiteffizienz im Parallelansatz automatisiert werden.
Dies wird durch die erfindungsgemäße Ausgestaltung des Verschlusses
bzw. Abdeckung ermöglicht.
Eine vollständige
Digitalisierung der parallelen Prozeßentwicklung ermöglicht weiter
eine neuartige Datentransparenz und -verfügbarkeit.
Mit Hilfe dieses neuen Werkzeuges
zur Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung
können
neue Bioprozesse zeiteffektiv unter technischen Reaktionsbedingungen
entwikkelt werden, da beispielsweise statt einem Experiment im kontrollierten
0,5 l Rührkesselreaktor
mit demselben Reaktionsvolumen zeitgleich 100 Experimente in 100
parallelen 5 ml-Rührkesselreaktoren
automatisiert durchführbar sind – also der
100-fache Informationsgewinn pro Zeiteinheit möglich wird. Bei Einsatz geeigneter
Versuchsplanungsalgorithmen wird die Effektivität der Bioprozeßentwicklung
weiter gesteigert.