DE19529099A1 - Vorrichtung zur Serien-Kultivierung von Mikroorganismen bzw. Zellen in begasten Flüssigkeitssäulen - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Serien-Kultivierung von Mikroorganismen bzw. Zellen in begasten Flüssigkeitssäulen und sie umfaßt dafür geeignete Kulturflaschen.

Zur Durchführung von Reihenuntersuchungen auf festen Nährböden ist die Verwendung von Agarplatten gebräuchlich. Hierbei werden die Mikroorganismen als Einzelkeime auf den festen Nährboden gebracht und bei der jeweiligen Reaktionstemperatur inkubiert. Der Stofftransport (Substrat aus dem festen Nährboden und Sauerstoff aus der Gasphase) erfolgt rein diffusiv.

Das klassische Instrument zur Kultivierung von Mikroorganismen für Serienuntersuchungen stellt die Schüttelkolbentechnik dar. Hierbei lassen sich bei Reaktionsvolumina von wenigen ml bis zu 1000 ml mit Hilfe von Schüttelinkubatoren viele Experimente parallel durchführen. Der Energieeintrag zur Dispergierung der Flüssigphase (Medium und Mikroorgansimen) erfolgt dabei über eine kreisförmige Bewegung aller Reaktionsgefäße, die auf einem Tablett angeordnet sind. Der Sauerstoffeintrag ist hierbei nur über eine Oberflächenbegasung möglich. Der Stofftransport erfolgt in der Flüssigphase konvektiv.

Zur Miniaturisierung dieser Technik (um noch mehr Versuche parallel durchführen zu können) wurde versucht, Mikrotiterplatten als Reaktionsgefäße zu nutzen. Insbesondere Probleme bei der Verdunstung aufgrund des ungünstigeren Oberfläche/Volumenverhältnisses verhinderten eine Anwendung dieser Technik.

Eine apparatetechnisch sehr aufwendige Technik zur Durchführung von Serienuntersuchungen mit Mikroorganismen ist der parallele Einsatz von Laborfermentern. Hier werden Geräte angeboten, die eine Paralleldurchführung von bis zu 6 Fermentationen mit einem Gerät ermöglichen. Der Energieeintrag erfolgt hierbei über Standardrührorgane; über eine Begasungseinrichtung ist eine Volumenbegasung möglich.

Ziel der Erfindung ist daher eine relativ einfache apparative Anordnung zur Serienkultivierung, bei der eine ausreichende Begasung gewährleistet werden kann.

Dieses Ziel wird mit einer Vorrichtung gemäß der Erfindung erreicht, die im wesentlichen gekennzeichnet ist durch eine Serie von Kulturflaschen mit einem offenen oder perforierbaren Boden, die oberhalb des Bodens bzw. der Bodenöffnung mit einer gasdurchlässigen porösen Filterplatte ausgestattet sind, deren Porenfeinheit und Hydrophobizität ausreichen, den Flüssigkeitsablauf aus einer darüber befindlichen Kulturflüssigkeitssäule zu unterbinden und die über ihren Boden mit einer Sterilgaszuleitung gasdicht verbunden bzw. zu verbinden sind.

Eine solche Anordnung einer Serie von Kulturflaschen, die über ihren Boden mit einem Gasverteiler in Verbindung stehen, kann mit unterschiedlichen Gasverteilern in Form von Schlauchzuleitungen oder Zuleitungen über Bohrungen versehen und mit einem Serien-Stativ ausgerüstet sein.

Besonders zweckmäßig ist jedoch ein als Gasverteiler wirkender; mit Sterileinlaß für Gas versehener, gasdichter Doppelboden für die Sterilgaszuleitung, dessen obere Platte mit einer Serie von Gasauslaßöffnungen aufweisenden Aufnahmeplätzen für den abgedichteten Einsatz bzw. Aufsatz der Kulturflaschen versehen ist. D.h. zwischen dem oberen Boden des Gasverteilers und dem unteren Ende der Kulturflasche wird für eine dichte Verbindung koaxial zur Gasverbindungsbohrung des Gasverteilers gesorgt.

Weitere Besonderheiten der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen.

Gemäß der Erfindung werden insbesondere folgende Verbesserungen erzielt:

• 1. Wesentliches Problem bei der Kultivierung von aeroben Mikroorgansimen ist die Sauerstoffversorgung. Durch die Verwendung von begasten Säulen zur Kultivierung von Mikroorganismen für Reihenuntersuchungen ist aufgrund der Volumenbegasung eine weitaus bessere Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen als im herkömmlichen Schüttelkolben möglich. Der Unterschied im Sauerstoffeintragsvermögen zwischen Oberflächenbegasung und Volumenbegasung kann je nach Oberfläche/Volumenverhältnis mehr als 1 Zehnerpotenz betragen.
• 2. Das wesentliche Problem bei der Nutzung von Daten, die in kleinen Reaktionsgefäßen gewonnen werden, ist die Übertragung dieser Ergebnisse in den Reaktor. Durch die Verbesserung der Sauerstoffversorgung in der begasten Säule auf Werte, wie sie in technischen Reaktoren erhalten werden, ist eine Maßstabsübertragung besser möglich, insbesondere, da das verwendete Verfahren zur Sauerstoffversorgung (Volumenbegasung) identisch ist. Damit kann die Entwicklungszeit von Verfahren zur Herstellung von Produkten mit Mikroorganismen verkürzt werden.
• 3. Gegenüber der Verwendung von parallelen Laborreaktoren zur Kultivierung von Mikroorganismen für Reihenuntersuchungen ist der apparative und damit finanzielle Aufwand bei der Verwendung von begasten Säulen bedeutend geringer.

Nachfolgend sind zur Veranschaulichung der Erfindung in ihren Besonderheiten Zeichnungen beigefügt. Es zeigen schematisch

Fig. 1 einen Vertikalschnitt durch eine erfindungsgemäße Serienkultur-Anordnung;

Fig. 2 eine einzelne Kulturflasche im Detail in Schnittdarstellung;

Fig. 3 eine Variante zur Aufnahmeplatz- und Flaschenbodenausgestaltung;

Fig. 4 eine Unterteilung der Anordnung in unterschiedliche Begasungsreihen in Aufsicht;

Fig. 5 einen Vergleich der parallelen Kultivierung von Corynebacterium glutamicum Bakterien zur L-Isoleucin-Herstellung in erfindungsgemäßen Kulturflaschen (begasten Säulen) und in Schüttelkolben;

Fig. 6 einen Vergleich der volumetrischen Stoffübergangskoeffizienten (k_La) für erfindungsgemäße Kulturflaschen (begaste Säulen), Schüttelkolben und 2 l Rührreaktor, die nach der Sulfitmethode bei 30 °C bestimmt worden sind.

Fig. 1 zeigt eine Anordnung mit einer Mehrzahl von Kulturflaschen 1, die in Fig. 2 näher ausgeführt sind. Ein allgemein zylindrisches Glasgefäß 2, welches am Boden 3 offen oder mit einer Öffnung zur Einleitung von Gas versehen ist, enthält im unteren Teil eine poröse Filterplatte 4 (z. B. aus Borsilikatglas) insb. über die gesamte Querschnittsfläche, durch die das Gas in die darüberstehende Flüssigphase 5 (Medium mit Mikroorganismen) eingetragen wird. Am Kopf der Flasche 1 befindet sich eine Öffnung 6 zur Aufnahme von Standardvorrichtungen wie z. B. Sterilstopfen oder Aluminiumkappen 7, die ein Entweichen des Gases ohne Kontamination des Glasgefäßinhalts ermöglichen.

Mehrere Kulturflaschen 1, bevorzugt mit einem umschlossenen Volumen von 10 bis 1000 ml und einem Durchmesser von 10 bis 100 mm sind (insbesondere) gleichverteilt in napfartigen Aufnahmeplätzen 8 eines Gasverteilers 9 befestigt, der mit entsprechenden Anschlußstutzen zur Gasversorgung 10 der einzelnen Kulturflaschen 1 versehen ist. Dieser Gasverteiler 9 besitzt neben den Aufnahmeplätzen zur Gasversorgung und Befestigungsmitteln für die einzelnen Kulturflaschen eine oder mehrere zentrale Gaszufuhreinrichtungen, die jeweils mit einem Sterilfilter 11 versehen sind. Der Gasverteiler 9 ist zusammen mit den daran befestigten Kulturflaschen 1 autoklavierbar.

Die Fixierung der Kulturflaschen 1 in bzw. an den Aufnahmeplätzen 8 erfolgt zweckmäßigerweise über Verschraubungen oder Bajonettverschlüsse (bei 12) mit Dichtungsringen 13. Gegebenenfalls sind in den Aufnahmeplätzen des Gasverteilers 9 zur Aufnahme der Kulturflaschen 1 Anstechvorrichtungen 14 angebracht, wie in Fig. 3 angedeutet, die eine Boden-Membran der Flasche durchstechen. Damit ist eine getrennte Sterilisation und nachträgliche Sterilverbindung von Gasverteiler und Kulturflaschen möglich.

Zur Temperierung ist der Gasverteiler mit den einzelnen Kulturflaschen in einem temperierten Gehäuse 15 installierbar, bzw. mit einer Abdeckhaube versehen, so daß die Reaktionstemperatur geregelt werden kann.

Die Medien und die Animpfbiomasse können nach dem Autoklavieren mit Standardtechniken steril zugegeben werden, um den Prozeß zu starten. Hierbei ist ein Flüssigvolumen 5 bis maximal 50% des umschlossenen Volumens der Kulturflaschen besonders günstig, um ein Ausschäumen bei eventueller Schaumbildung zu verhindern.

Um auch im unbegasten Zustand ein Eindringen von Medium in den Gasverteiler zu unterbinden, sind die Kulturflaschen mit porösen Filterplatten ausgestattet, deren Porendurchmesser so fein ist, daß der hydrostatische Druck der darüberstehenden Flüssigkeitssäule nicht ausreicht, die Kapillaren der porösen Filterplatte zu füllen. So können im allgemeinen Filterplatten mit einem Porendurchmesser von maximal 20 µm Flüssigkeitssäulen von ca. 10 cm Höhe im unbegasten Zustand oberhalb der porösen Filterplatten halten. Zusätzlich kann die innere Oberfläche der porösen Filterplatten mit bekannten Mitteln hydrophobisiert werden. Besonders geeignete Techniken zur Herstellung von hydrophoben Glasoberflächen sind aus der Silan­ bzw. Siliconchemie bekannt.

Das zur Begasung eingesetzte Gas wird vor dem Einleiten in den Sterilfilter 11 des Gasverteilers 9 mit Wasserdampf in einem Gasbefeuchter 16 (z. B. mittels entsprechender Waschflaschen) bei der eingestellten Reaktionstemperatur gesättigt, um eine Volumenabnahme in den begasten Säulen durch Verdunstung zu unterbinden.

Der Gasvolumenstrom (z. B. Luft oder mit Sauerstoff angereichertes Gasgemisch) kann auf Volumenströme z. B. bis zu 2,5 l Gas/(l Reaktionsvolumen _* Minute) vorgegeben werden. Bei Einsatz mehrerer parallel angeordneter Gaszufuhreinrichtungen für jeweils 1 Reihe von begasten Säulen kann für jede der unterschiedlichen Gaszufuhreinrichtungen ein anderer Gasvolumenstrom vorgegeben werden, wie in Fig. 4 angedeutet ist.

Zur Probenahme während der Reaktion sind die Kulturflaschen gegebenenfalls mit seitlichen Probenahmestutzen 17 und Septum versehen, über welches mit Hilfe einer Kanüle jederzeit eine definierte Probemenge steril entnommen werden kann.

Zur Aufnahme von Meßsonden (z. B. zum Messen von pH-Wert oder pO₂-Wert) ist gegebenenfalls am Kopf der begasten Säulen ein weiterer Stutzen 18 angebracht.

Bei Verwendung von Aluminiumkappen ("Alucaps") 7 zur kontaminationsfreien Entfernung des Gases aus den begasten Säulen ist gegebenenfalls durch Anbringen eines Septums und Anbindung von miniaturisierten Substratleitungen die kontinuierliche Zudosierung von Substraten oder Korrekturmittel während der Reaktion möglich.

Als Anwendungsgebiete sind

• - die biotechnologische Forschung (als Alternative zur bisher üblichen Verwendung von Schüttelkolben) und
• - die industrielle Prozeßentwicklung zur Herstellung von Produkten mit Mikroorganismen (mehr als 90% der Experimente, die im Rahmen einer industriellen Prozeßentwicklung durchgeführt werden, erfolgen im Schüttelkolben) zu nennen.

Es folgen Beispiele, welche die Tauglichkeit der erfindungsgemäßen Anordnung veranschaulichen:

Beispiel 1 Vergleich der volumetrischen Sauerstoffeintragskoeffizienten (k_La) der erfindungsgemäßen Kulturflaschen (begaste Säulen), herkömmlichen Schüttelkolben und Labor-Rührreaktor

Der volumetrische Sauerstoffeintragskoeffizient k_La wurde nach der Sulfit-Methode in Kulturflaschen (Durchmesser 60 mm) mit porösen Filterplatten aus Borosilikatglas (Porengröße 10-16 µm) bei einem Arbeitsvolumen von 150 ml und verschiedenen Gasdurchsätzen bestimmt (T = 30°C). Die erhaltenen Meßergebnisse (siehe Fig. 6) zeigen k_La-Werte zwischen 0.05 und 0.15 s^-1. Zum Vergleich sind Daten aufgetragen, die unter vergleichbaren Bedingungen im Schüttelkolben und im Labor- Rührreaktor ermittelt wurden (Sulfit-Methode, T = 30°C).

Es ist deutlich zu erkennen, daß die volumetrischen Sauerstoffeintragskoeffizienten der Kulturflaschen (begaste Säulen) deutlich über den im Schüttelkolben erreichten Werten liegen und die Größenordnung des Labor-Rührreaktors erreichen.

Beispiel 2 Vergleich der Kultivierung von Corynebacterium glutamicum in erfindungsgemäßen Kulturflaschen (begaste Säulen) und in herkömmlichen Schüttelkolben

Zum Vergleich des Fermentationsverlaufes in Kulturflaschen (begaste Säulen) und den herkömmlich im Labor verwendeten Schüttelkolben wurden Parallelansätze durchgeführt. Als Beispielsystem wurde die L-Isoleucin-Herstellung mit einem Corynebacterium glutamicum Stamm (KK47×15) des Instituts für Biotechnologie des Forschungszentrums Jülich gewählt.

Die porösen Filterplatten der im Beispiel 1 verwendeten Kulturflaschen (begaste Säulen) wurden vor dem Einsatz zur Fermentation wie folgt hydrophobisiert:

• - Zur Vorbehandlung der Glasoberfläche wurden die begasten Säulen mit 5% Salpetersäure 4 h unter Rückfluß gekocht. Nach einer 12 h Reinigung mit destilliertem Wasser wurden bei 150 °C getrocknet.
• - Zur kovalenten Bindung von Methylgruppen an die Glasoberfläche der porösen Filterplatten werden die begasten Säulen mit 5% Trimethylchlorsilan in Chloroform 4 h unter Rückfluß gekocht. Anschließend wird 3fach mit Chloroform gewaschen und 48 h bei 50°C im Wasserstrahlvakuum getrocknet. Danach erfolgt eine 12 h Reinigung mit destilliertem Wasser mit anschließender Trocknung.

Herstellung der Vorkultur: 80 ml sterilisiertes Komplexmedium werden mit 20 ml steriler Glucoselösung (100 g/l) steril im 1000 ml Schüttelkolben vermischt und mit 2% Inocculum aus der Stammhaltung 12 h bei 30°C und 155 U/min inkubiert.

Nach der Hitzesterilisation der 1000 ml Schüttelkolben und der Kulturflaschen (begaste Säulen, Porendurchmesser der porösen Filterplatten: 10-16 µm) wurden jeweils 90 ml sterilisiertes Medium und 10 ml Inocculum aus der Vorkultur steril zugegeben (Glucose 20 g/l). Die Schüttelkolben wurden im Schüttelinkubator bei 30 °C und 155 U/min kultiviert, die Kulturflaschen (begaste Säulen) im Inkubator bei 30 °C und 0.6 l/min befeuchteter Luft.

Die Meßergebnisse zeigen: Mit den Kulturflaschen (begaste Säulen) lassen sich aufgrund des weitaus besseren Sauerstoffeintrags 4fach höhere L- Isoleucinkonzentrationen erreichen (siehe Fig. 5). Dabei konnte über eine Lactatanalytik nachgewiesen werden, daß in den begasten Säulen keine Sauerstofflimitierung auftritt (kein Gärprodukt Lactat nachweisbar), während die Schüttelkolben sauerstofflimitiert waren (Lactat nachweisbar, siehe Fig. 5).

Claims (14)

1. Vorrichtung zur Serien-Kultivierung von Mikroorganismen bzw. Zellen in begasten Flüssigkeitssäulen, gekennzeichnet durch eine Serie von Kulturflaschen mit einem offenen oder perforierbaren Boden, die oberhalb des Bodens bzw. der Bodenöffnung mit einer gasdurchlässigen porösen Filterplatte ausgestattet sind, deren Porenfeinheit und Hydrophobizität ausreichen, den Flüssigkeitsablauf aus einer darüber befindlichen Kulturflüssigkeitssäule zu unterbinden und die über ihren Boden mit einer Sterilgaszuleitung gasdicht verbunden bzw. zu verbinden.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen als Gasverteiler wirkenden, mit Sterileinlaß für Gas versehenen gasdichten Doppelboden für die Sterilgaszuleitung, dessen obere Platte mit einer Serie von Gasauslaßöffnungen aufweisenden Aufnahmeplätzen für den abgedichteten Einsatz der Kulturflaschen versehen ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch im wesentlichen säulenförmige Kulturflaschen mit einer ggf. perforierbar abgedeckten Bodenöffnung bzw. ohne Boden mit einer oberen Verschlußkappe mit Septum-Einsatz.

4. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Kulturflaschen mit einem oberen, zum Einbringen von Meßsonden geeigneten Septum-Anschluß.

5. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen seitlichen Stutzen mit Septum-Verschluß für Probenahmen.

6. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Aufnahmeplätze, die napfartig mit Durchlaß zum Doppelboden Raum ausgebildet und mit am unteren Kulturflaschenumfang vorgesehenen zusammenwirkenden Verbindungselementen versehen sind, die zur Herbeiführung eines ausreichenden Anpreßdrucks an einer Ringdichtung zwischen unterem Flaschenende und Gasverteiler geeignet sind.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch Schraub- oder Bajonettverbindungen als Verbindungselemente.

8. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ggf. auswechselbare und/oder als Schließventil ausgebildete Anstechnadeln im Aufnahmeplatzboden und Kulturflaschen mit perforierbarem Membran-Boden.

9. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine die Flaschen-Serie übergreifende Abdeckhaube mit Thermostatisierung.

10. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen oder mehrere den Doppelboden in unterschiedliche Abteile mit jeweils eigener Gasversorgung unterteilende Trennwände.

11. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch jeweils mit Sterilfilter und Gasbefeuchter versehene Gasversorgungen.

12. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Druck- und Durchflußmesser in der Sterilgaszuleitung.

13. Vorrichtung nach einem der Vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet, durch Einrichtungen, die die Gasbefeuchter auf gleicher Temperatur halten wie den Kulturraum.

14. Kulturflaschen für Vorrichtungen nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen offenen oder perforierbaren Boden und eine gasdurchlässige poröse Filterplatte oberhalb des Bodens, deren Porenfeinheit und Hydrophobizität ausreichen, den Flüssigkeitsablauf aus einer darüber befindlichen Flüssigkeitssäule zu unterbinden.