DE19529099A1 - Vorrichtung zur Serien-Kultivierung von Mikroorganismen bzw. Zellen in begasten Flüssigkeitssäulen - Google Patents
Vorrichtung zur Serien-Kultivierung von Mikroorganismen bzw. Zellen in begasten FlüssigkeitssäulenInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Serien-Kultivierung von
Mikroorganismen bzw. Zellen in begasten Flüssigkeitssäulen und sie umfaßt dafür
geeignete Kulturflaschen.
Zur Durchführung von Reihenuntersuchungen auf festen Nährböden ist die
Verwendung von Agarplatten gebräuchlich. Hierbei werden die Mikroorganismen als
Einzelkeime auf den festen Nährboden gebracht und bei der jeweiligen
Reaktionstemperatur inkubiert. Der Stofftransport (Substrat aus dem festen
Nährboden und Sauerstoff aus der Gasphase) erfolgt rein diffusiv.
Das klassische Instrument zur Kultivierung von Mikroorganismen für
Serienuntersuchungen stellt die Schüttelkolbentechnik dar. Hierbei lassen sich bei
Reaktionsvolumina von wenigen ml bis zu 1000 ml mit Hilfe von Schüttelinkubatoren
viele Experimente parallel durchführen. Der Energieeintrag zur Dispergierung der
Flüssigphase (Medium und Mikroorgansimen) erfolgt dabei über eine kreisförmige
Bewegung aller Reaktionsgefäße, die auf einem Tablett angeordnet sind. Der
Sauerstoffeintrag ist hierbei nur über eine Oberflächenbegasung möglich. Der
Stofftransport erfolgt in der Flüssigphase konvektiv.
Zur Miniaturisierung dieser Technik (um noch mehr Versuche parallel durchführen
zu können) wurde versucht, Mikrotiterplatten als Reaktionsgefäße zu nutzen.
Insbesondere Probleme bei der Verdunstung aufgrund des ungünstigeren
Oberfläche/Volumenverhältnisses verhinderten eine Anwendung dieser Technik.
Eine apparatetechnisch sehr aufwendige Technik zur Durchführung von
Serienuntersuchungen mit Mikroorganismen ist der parallele Einsatz von
Laborfermentern. Hier werden Geräte angeboten, die eine Paralleldurchführung von
bis zu 6 Fermentationen mit einem Gerät ermöglichen. Der Energieeintrag erfolgt
hierbei über Standardrührorgane; über eine Begasungseinrichtung ist eine
Volumenbegasung möglich.
Ziel der Erfindung ist daher eine relativ einfache apparative Anordnung zur
Serienkultivierung, bei der eine ausreichende Begasung gewährleistet werden kann.
Dieses Ziel wird mit einer Vorrichtung gemäß der Erfindung erreicht, die im
wesentlichen gekennzeichnet ist durch eine Serie von Kulturflaschen mit einem
offenen oder perforierbaren Boden, die oberhalb des Bodens bzw. der Bodenöffnung
mit einer gasdurchlässigen porösen Filterplatte ausgestattet sind, deren
Porenfeinheit und Hydrophobizität ausreichen, den Flüssigkeitsablauf aus einer
darüber befindlichen Kulturflüssigkeitssäule zu unterbinden und die über ihren
Boden mit einer Sterilgaszuleitung gasdicht verbunden bzw. zu verbinden sind.
Eine solche Anordnung einer Serie von Kulturflaschen, die über ihren Boden mit
einem Gasverteiler in Verbindung stehen, kann mit unterschiedlichen Gasverteilern
in Form von Schlauchzuleitungen oder Zuleitungen über Bohrungen versehen und
mit einem Serien-Stativ ausgerüstet sein.
Besonders zweckmäßig ist jedoch ein als Gasverteiler wirkender; mit Sterileinlaß für
Gas versehener, gasdichter Doppelboden für die Sterilgaszuleitung, dessen obere
Platte mit einer Serie von Gasauslaßöffnungen aufweisenden Aufnahmeplätzen für
den abgedichteten Einsatz bzw. Aufsatz der Kulturflaschen versehen ist. D.h.
zwischen dem oberen Boden des Gasverteilers und dem unteren Ende der
Kulturflasche wird für eine dichte Verbindung koaxial zur Gasverbindungsbohrung
des Gasverteilers gesorgt.
Weitere Besonderheiten der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen.
Gemäß der Erfindung werden insbesondere folgende Verbesserungen erzielt:
- 1. Wesentliches Problem bei der Kultivierung von aeroben Mikroorgansimen ist die Sauerstoffversorgung. Durch die Verwendung von begasten Säulen zur Kultivierung von Mikroorganismen für Reihenuntersuchungen ist aufgrund der Volumenbegasung eine weitaus bessere Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen als im herkömmlichen Schüttelkolben möglich. Der Unterschied im Sauerstoffeintragsvermögen zwischen Oberflächenbegasung und Volumenbegasung kann je nach Oberfläche/Volumenverhältnis mehr als 1 Zehnerpotenz betragen.
- 2. Das wesentliche Problem bei der Nutzung von Daten, die in kleinen Reaktionsgefäßen gewonnen werden, ist die Übertragung dieser Ergebnisse in den Reaktor. Durch die Verbesserung der Sauerstoffversorgung in der begasten Säule auf Werte, wie sie in technischen Reaktoren erhalten werden, ist eine Maßstabsübertragung besser möglich, insbesondere, da das verwendete Verfahren zur Sauerstoffversorgung (Volumenbegasung) identisch ist. Damit kann die Entwicklungszeit von Verfahren zur Herstellung von Produkten mit Mikroorganismen verkürzt werden.
- 3. Gegenüber der Verwendung von parallelen Laborreaktoren zur Kultivierung von Mikroorganismen für Reihenuntersuchungen ist der apparative und damit finanzielle Aufwand bei der Verwendung von begasten Säulen bedeutend geringer.
Nachfolgend sind zur Veranschaulichung der Erfindung in ihren Besonderheiten
Zeichnungen beigefügt. Es zeigen schematisch
Fig. 1 einen Vertikalschnitt durch eine erfindungsgemäße Serienkultur-Anordnung;
Fig. 2 eine einzelne Kulturflasche im Detail in Schnittdarstellung;
Fig. 3 eine Variante zur Aufnahmeplatz- und Flaschenbodenausgestaltung;
Fig. 4 eine Unterteilung der Anordnung in unterschiedliche Begasungsreihen in
Aufsicht;
Fig. 5 einen Vergleich der parallelen Kultivierung von Corynebacterium glutamicum
Bakterien zur L-Isoleucin-Herstellung in erfindungsgemäßen Kulturflaschen
(begasten Säulen) und in Schüttelkolben;
Fig. 6 einen Vergleich der volumetrischen Stoffübergangskoeffizienten (kLa) für
erfindungsgemäße Kulturflaschen (begaste Säulen), Schüttelkolben und 2 l
Rührreaktor, die nach der Sulfitmethode bei 30 °C bestimmt worden sind.
Fig. 1 zeigt eine Anordnung mit einer Mehrzahl von Kulturflaschen 1, die in Fig. 2
näher ausgeführt sind. Ein allgemein zylindrisches Glasgefäß 2, welches am Boden
3 offen oder mit einer Öffnung zur Einleitung von Gas versehen ist, enthält im
unteren Teil eine poröse Filterplatte 4 (z. B. aus Borsilikatglas) insb. über die gesamte
Querschnittsfläche, durch die das Gas in die darüberstehende Flüssigphase 5
(Medium mit Mikroorganismen) eingetragen wird. Am Kopf der Flasche 1 befindet
sich eine Öffnung 6 zur Aufnahme von Standardvorrichtungen wie z. B. Sterilstopfen
oder Aluminiumkappen 7, die ein Entweichen des Gases ohne Kontamination des
Glasgefäßinhalts ermöglichen.
Mehrere Kulturflaschen 1, bevorzugt mit einem umschlossenen Volumen von 10 bis
1000 ml und einem Durchmesser von 10 bis 100 mm sind (insbesondere)
gleichverteilt in napfartigen Aufnahmeplätzen 8 eines Gasverteilers 9 befestigt, der
mit entsprechenden Anschlußstutzen zur Gasversorgung 10 der einzelnen
Kulturflaschen 1 versehen ist. Dieser Gasverteiler 9 besitzt neben den
Aufnahmeplätzen zur Gasversorgung und Befestigungsmitteln für die einzelnen
Kulturflaschen eine oder mehrere zentrale Gaszufuhreinrichtungen, die jeweils mit
einem Sterilfilter 11 versehen sind. Der Gasverteiler 9 ist zusammen mit den daran
befestigten Kulturflaschen 1 autoklavierbar.
Die Fixierung der Kulturflaschen 1 in bzw. an den Aufnahmeplätzen 8 erfolgt
zweckmäßigerweise über Verschraubungen oder Bajonettverschlüsse (bei 12) mit
Dichtungsringen 13. Gegebenenfalls sind in den Aufnahmeplätzen des Gasverteilers
9 zur Aufnahme der Kulturflaschen 1 Anstechvorrichtungen 14 angebracht, wie in
Fig. 3 angedeutet, die eine Boden-Membran der Flasche durchstechen. Damit ist
eine getrennte Sterilisation und nachträgliche Sterilverbindung von Gasverteiler und
Kulturflaschen möglich.
Zur Temperierung ist der Gasverteiler mit den einzelnen Kulturflaschen in einem
temperierten Gehäuse 15 installierbar, bzw. mit einer Abdeckhaube versehen, so
daß die Reaktionstemperatur geregelt werden kann.
Die Medien und die Animpfbiomasse können nach dem Autoklavieren mit
Standardtechniken steril zugegeben werden, um den Prozeß zu starten. Hierbei ist
ein Flüssigvolumen 5 bis maximal 50% des umschlossenen Volumens der
Kulturflaschen besonders günstig, um ein Ausschäumen bei eventueller
Schaumbildung zu verhindern.
Um auch im unbegasten Zustand ein Eindringen von Medium in den Gasverteiler zu
unterbinden, sind die Kulturflaschen mit porösen Filterplatten ausgestattet, deren
Porendurchmesser so fein ist, daß der hydrostatische Druck der darüberstehenden
Flüssigkeitssäule nicht ausreicht, die Kapillaren der porösen Filterplatte zu füllen. So
können im allgemeinen Filterplatten mit einem Porendurchmesser von maximal 20
µm Flüssigkeitssäulen von ca. 10 cm Höhe im unbegasten Zustand oberhalb der
porösen Filterplatten halten. Zusätzlich kann die innere Oberfläche der porösen
Filterplatten mit bekannten Mitteln hydrophobisiert werden. Besonders geeignete
Techniken zur Herstellung von hydrophoben Glasoberflächen sind aus der Silan
bzw. Siliconchemie bekannt.
Das zur Begasung eingesetzte Gas wird vor dem Einleiten in den Sterilfilter 11 des
Gasverteilers 9 mit Wasserdampf in einem Gasbefeuchter 16 (z. B. mittels
entsprechender Waschflaschen) bei der eingestellten Reaktionstemperatur
gesättigt, um eine Volumenabnahme in den begasten Säulen durch Verdunstung zu
unterbinden.
Der Gasvolumenstrom (z. B. Luft oder mit Sauerstoff angereichertes Gasgemisch)
kann auf Volumenströme z. B. bis zu 2,5 l Gas/(l Reaktionsvolumen * Minute)
vorgegeben werden. Bei Einsatz mehrerer parallel angeordneter
Gaszufuhreinrichtungen für jeweils 1 Reihe von begasten Säulen kann für jede der
unterschiedlichen Gaszufuhreinrichtungen ein anderer Gasvolumenstrom
vorgegeben werden, wie in Fig. 4 angedeutet ist.
Zur Probenahme während der Reaktion sind die Kulturflaschen gegebenenfalls mit
seitlichen Probenahmestutzen 17 und Septum versehen, über welches mit Hilfe
einer Kanüle jederzeit eine definierte Probemenge steril entnommen werden kann.
Zur Aufnahme von Meßsonden (z. B. zum Messen von pH-Wert oder pO₂-Wert) ist
gegebenenfalls am Kopf der begasten Säulen ein weiterer Stutzen 18 angebracht.
Bei Verwendung von Aluminiumkappen ("Alucaps") 7 zur kontaminationsfreien
Entfernung des Gases aus den begasten Säulen ist gegebenenfalls durch
Anbringen eines Septums und Anbindung von miniaturisierten Substratleitungen die
kontinuierliche Zudosierung von Substraten oder Korrekturmittel während der
Reaktion möglich.
Als Anwendungsgebiete sind
- - die biotechnologische Forschung (als Alternative zur bisher üblichen Verwendung von Schüttelkolben) und
- - die industrielle Prozeßentwicklung zur Herstellung von Produkten mit Mikroorganismen (mehr als 90% der Experimente, die im Rahmen einer industriellen Prozeßentwicklung durchgeführt werden, erfolgen im Schüttelkolben) zu nennen.
Es folgen Beispiele, welche die Tauglichkeit der erfindungsgemäßen Anordnung
veranschaulichen:
Der volumetrische Sauerstoffeintragskoeffizient kLa wurde nach der Sulfit-Methode
in Kulturflaschen (Durchmesser 60 mm) mit porösen Filterplatten aus Borosilikatglas
(Porengröße 10-16 µm) bei einem Arbeitsvolumen von 150 ml und verschiedenen
Gasdurchsätzen bestimmt (T = 30°C). Die erhaltenen Meßergebnisse (siehe Fig. 6)
zeigen kLa-Werte zwischen 0.05 und 0.15 s-1. Zum Vergleich sind Daten
aufgetragen, die unter vergleichbaren Bedingungen im Schüttelkolben und im Labor-
Rührreaktor ermittelt wurden (Sulfit-Methode, T = 30°C).
Es ist deutlich zu erkennen, daß die volumetrischen Sauerstoffeintragskoeffizienten
der Kulturflaschen (begaste Säulen) deutlich über den im Schüttelkolben erreichten
Werten liegen und die Größenordnung des Labor-Rührreaktors erreichen.
Zum Vergleich des Fermentationsverlaufes in Kulturflaschen (begaste Säulen) und
den herkömmlich im Labor verwendeten Schüttelkolben wurden Parallelansätze
durchgeführt. Als Beispielsystem wurde die L-Isoleucin-Herstellung mit einem
Corynebacterium glutamicum Stamm (KK47×15) des Instituts für Biotechnologie des
Forschungszentrums Jülich gewählt.
Die porösen Filterplatten der im Beispiel 1 verwendeten Kulturflaschen (begaste
Säulen) wurden vor dem Einsatz zur Fermentation wie folgt hydrophobisiert:
- - Zur Vorbehandlung der Glasoberfläche wurden die begasten Säulen mit 5% Salpetersäure 4 h unter Rückfluß gekocht. Nach einer 12 h Reinigung mit destilliertem Wasser wurden bei 150 °C getrocknet.
- - Zur kovalenten Bindung von Methylgruppen an die Glasoberfläche der porösen Filterplatten werden die begasten Säulen mit 5% Trimethylchlorsilan in Chloroform 4 h unter Rückfluß gekocht. Anschließend wird 3fach mit Chloroform gewaschen und 48 h bei 50°C im Wasserstrahlvakuum getrocknet. Danach erfolgt eine 12 h Reinigung mit destilliertem Wasser mit anschließender Trocknung.
Herstellung der Vorkultur: 80 ml sterilisiertes Komplexmedium werden mit 20 ml
steriler Glucoselösung (100 g/l) steril im 1000 ml Schüttelkolben vermischt und mit
2% Inocculum aus der Stammhaltung 12 h bei 30°C und 155 U/min inkubiert.
Nach der Hitzesterilisation der 1000 ml Schüttelkolben und der Kulturflaschen
(begaste Säulen, Porendurchmesser der porösen Filterplatten: 10-16 µm) wurden
jeweils 90 ml sterilisiertes Medium und 10 ml Inocculum aus der Vorkultur steril
zugegeben (Glucose 20 g/l). Die Schüttelkolben wurden im Schüttelinkubator bei 30
°C und 155 U/min kultiviert, die Kulturflaschen (begaste Säulen) im Inkubator bei 30
°C und 0.6 l/min befeuchteter Luft.
Die Meßergebnisse zeigen: Mit den Kulturflaschen (begaste Säulen) lassen sich
aufgrund des weitaus besseren Sauerstoffeintrags 4fach höhere L-
Isoleucinkonzentrationen erreichen (siehe Fig. 5). Dabei konnte über eine
Lactatanalytik nachgewiesen werden, daß in den begasten Säulen keine
Sauerstofflimitierung auftritt (kein Gärprodukt Lactat nachweisbar), während die
Schüttelkolben sauerstofflimitiert waren (Lactat nachweisbar, siehe Fig. 5).
Claims (14)
1. Vorrichtung zur Serien-Kultivierung von Mikroorganismen
bzw. Zellen in begasten Flüssigkeitssäulen,
gekennzeichnet durch
eine Serie von Kulturflaschen mit einem offenen oder
perforierbaren Boden, die oberhalb des Bodens bzw. der
Bodenöffnung mit einer gasdurchlässigen porösen Filterplatte
ausgestattet sind, deren Porenfeinheit und Hydrophobizität
ausreichen, den Flüssigkeitsablauf aus einer darüber
befindlichen Kulturflüssigkeitssäule zu unterbinden und die
über ihren Boden mit einer Sterilgaszuleitung gasdicht
verbunden bzw. zu verbinden.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1,
gekennzeichnet durch
einen als Gasverteiler wirkenden, mit Sterileinlaß für Gas
versehenen gasdichten Doppelboden für die Sterilgaszuleitung,
dessen obere Platte mit einer Serie von Gasauslaßöffnungen
aufweisenden Aufnahmeplätzen für den abgedichteten Einsatz der
Kulturflaschen versehen ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2,
gekennzeichnet durch
im wesentlichen säulenförmige Kulturflaschen mit einer ggf.
perforierbar abgedeckten Bodenöffnung bzw. ohne Boden mit einer
oberen Verschlußkappe mit Septum-Einsatz.
4. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
Kulturflaschen mit einem oberen, zum Einbringen von Meßsonden
geeigneten Septum-Anschluß.
5. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
einen seitlichen Stutzen mit Septum-Verschluß für Probenahmen.
6. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
Aufnahmeplätze, die napfartig mit Durchlaß zum Doppelboden
Raum ausgebildet und mit am unteren Kulturflaschenumfang
vorgesehenen zusammenwirkenden Verbindungselementen versehen
sind, die zur Herbeiführung eines ausreichenden Anpreßdrucks an
einer Ringdichtung zwischen unterem Flaschenende und
Gasverteiler geeignet sind.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6,
gekennzeichnet durch
Schraub- oder Bajonettverbindungen als Verbindungselemente.
8. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
ggf. auswechselbare und/oder als Schließventil ausgebildete
Anstechnadeln im Aufnahmeplatzboden und Kulturflaschen mit
perforierbarem Membran-Boden.
9. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
eine die Flaschen-Serie übergreifende Abdeckhaube mit
Thermostatisierung.
10. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
einen oder mehrere den Doppelboden in unterschiedliche Abteile
mit jeweils eigener Gasversorgung unterteilende Trennwände.
11. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
jeweils mit Sterilfilter und Gasbefeuchter versehene
Gasversorgungen.
12. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
Druck- und Durchflußmesser in der Sterilgaszuleitung.
13. Vorrichtung nach einem der Vorangehenden Ansprüche,
gekennzeichnet, durch
Einrichtungen, die die Gasbefeuchter auf gleicher Temperatur
halten wie den Kulturraum.
14. Kulturflaschen für Vorrichtungen nach einem der
vorangehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
einen offenen oder perforierbaren Boden und eine
gasdurchlässige poröse Filterplatte oberhalb des Bodens, deren
Porenfeinheit und Hydrophobizität ausreichen, den
Flüssigkeitsablauf aus einer
darüber befindlichen Flüssigkeitssäule zu unterbinden.
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