DE10247014A1

DE10247014A1 - New multimer of major histocompatibility complex molecules, useful e.g. for sorting specific T cells for therapeutic application, includes a chromoprotein as multimerizing agent

Info

Publication number: DE10247014A1
Application number: DE2002147014
Authority: DE
Inventors: Volker Dr. Erfle; Dirk Busch; Horst Wolff
Original assignee: Erfle Volker Prof Priv-Doz Dr
Current assignee: Erfle Volker Prof Priv-Doz Dr
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2002-10-09
Publication date: 2004-04-22
Also published as: WO2004033497A1; AU2003278063A1

Abstract

Multimer (A) containing two or more MHC (major histocompatibility complex) molecules (I) and a chromoprotein (II) other than DsRed1 as multimerizing agent, is new. Independent claims are also included for: (1) a MHC monomer fusion protein (FP) that includes (II), other than DsRed1, optionally attached through a linker; (2) a DNA that encodes the FP and derived RNA; (3) prokaryotic or eukaryotic cells that contain the nucleic acid of (2); (4) a method for preparing FP; (5) a method for preparing (A); (6) a method for studying an antigen-specific cellular immune response; and (7) a test system containing the new MHC monomers or multimers.

Description

Die Erfindung betrifft MHC-Multimer-Fusionsproteine, DNA, die für ein MHC-Fusionsprotein kodiert sowie RNA, die nach Transkription ein MHC-Monomer-Fusionsprotein ergibt. Die Erfindung offenbart weiterhin die Verwendung von Chromoproteinen als Mittel zur Multimerisierung von MHC-Molekülen, Verfahren zur Herstellung von MHC und Chromoprotein enthaltenden Fusionsproteinen und Verfahren zur Herstellung von MHC-Multimeren. Die Erfindung beschreibt weiterhin Verfahren zur Untersuchung einer Antigen-spezifischen zellulären Immunantwort, insbesondere zum Nachweis von T-Lymphozyten, die spezifische T-Zell-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche tragen, Verwendungen der erfindungsgemäß hergestellten MHC-Monomere und -Multimere sowie Testsysteme, die die MHC-Monomere oder MHC-Multimere der Erfindung enthalten.The invention relates to MHC multimer fusion proteins, DNA that is for encodes an MHC fusion protein, as well as RNA that occurs after transcription gives an MHC monomer fusion protein. The invention further discloses the Use of chromoproteins as a means of multimerizing MHC molecules, Process for the preparation of MHC and chromoprotein containing Fusion proteins and method for the production of MHC multimers. The invention further describes methods for examining a Antigen-specific cellular Immune response, especially for the detection of T-lymphocytes, the specific T cell receptors their cell surface wear, uses of the MHC monomers produced according to the invention and multimers as well as test systems, which the MHC monomers or MHC multimers of the invention contain.

Das zelluläre Immunsystem erkennt Antigenstrukturen über Vermittlung durch Oberflächenmoleküle des "Major Histocompatibility Complex" (MHC). Antigen-präsentierende Zellen (APC) bereiten Antigene zu kurzen Peptiden auf, die nach Bindung in einer speziellen Pepid-Bindungsgrube des MHC-Moleküls präsentiert werden und so von T-Zellen erkannt werden können. Die spezifische Erkennung des Epitops (Peptidfragmentes) durch den 7-Zell-Rezeptor (TCR) erfordert dabei die gleichzeitige Interaktion mit dem MHC Molekül ("MHC-Restriktion").The cellular immune system recognizes antigen structures through mediation by surface molecules of "Major Histocompatibility Complex "(MHC). Antigen-presenting Cells (APC) process antigens into short peptides that follow Binding presented in a special pepid binding pit of the MHC molecule and can be recognized by T cells. The specific detection of the epitope (peptide fragment) through the 7-cell receptor (TCR) the simultaneous interaction with the MHC molecule ("MHC restriction").

Die Bindung von MHC/Peptid Komplexen am TCR ist durch eine sehr niedrige Affinität charakterisiert, insbesondere durch eine sehr schnelle Dissoziation (K^off) des MHC vom TCR. Von daher ist es nicht möglich, T-Zellen direkt über die Verwendung einer löslichen Form des natürlichen Liganden (z.B. als Fluoreszenz-markierten MHC/Peptid Komplex) in Abhängigkeit ihrer Epitop-Spezifität zu markieren. Durch die Multimerisierung von MHC/Peptid Komplexen zu z.B. MHC-Tetrameren ließ sich zeigen, daß die relative Avidität der Epitop-spezifischen Bindung an der 7-Zell-Oberfläche soweit erhöht werden kann, daß eine spezifische T-Zell-Markierung ermöglicht wird. Hierzu werden lösliche MHC-Moleküle in vitro generiert, spezifisch biotinyliert und über Fluoreszenz- markiertes Streptavidin zusammen mit beta- Mikroglobulin multimerisiert. Mit Hilfe solcher Reagentien kann die antigen-spezifische zelluläre Immunantwort im Tiermodell und direkt am Menschen sehr genau untersucht werden.The binding of MHC / peptide complexes to the TCR is characterized by a very low affinity, in particular by a very fast dissociation (K ^off ) of the MHC from the TCR. It is therefore not possible to label T cells directly using a soluble form of the natural ligand (for example as a fluorescence-labeled MHC / peptide complex) depending on their epitope specificity. The multimerization of MHC / peptide complexes to give, for example, MHC tetramers showed that the relative avidity of the epitope-specific binding on the 7-cell surface can be increased to such an extent that specific T-cell labeling is possible. For this purpose, soluble MHC molecules are generated in vitro, specifically biotinylated and multimerized together with beta-microglobulin via fluorescent-labeled streptavidin. With the help of such reagents, the antigen-specific cellular immune response can be examined very precisely in animal models and directly on humans.

Die Herstellung von z.B. MHC-Tetramer-Reagenzien involviert eine Reihe komplexer biochemischer Reaktionen, wobei rekombinant exprimierte Proteine i.d.R. nach der Denaturierung korrekt in vitro gefaltet, biotinyliert und anschließend im richtigen molaren Verhältnis zur Multimerbildung gebracht werden müssen.The production of e.g. MHC tetramer reagents involves a number of complex biochemical reactions, whereby recombinantly expressed proteins usually correct after denaturation folded in vitro, biotinylated and then in the correct molar ratio to the Multimer formation must be brought.

Gegenwärtig werden die meisten MHC-Tetramer-Reagenzien über ein sehr komplexes und aufwendiges Verfahren hergestellt. Zunächst werden MHC-Komponenten als rekombinante Proteine in E.coli exprimiert und aus inclusion bodies aufgereinigt. Nach Harnstoffdenaturierung werden die MHC-Anteile in der Gegenwart von beta-Mikroglobulin und von hohen Peptid/Epitop-Konzentrationen durch Verdünnung in einem Arginin-reichen Puffer mit Glutathion-Redoxsystem gefaltet und isoliert. In einem weiteren Schritt wird das rekombinante MHC biotinyliert und nach erneuter Aufreinigung über Streptavidin multimerisiert. Das für die Multimerisierung verwendete Streptavidin ist für den späteren optischen Nachweis mit Phycoerythrin markiert. Diese Fluoreszenz-gekoppelten MHC-Multimer Reagenzien können mit komplexen T-Zellgemischen inkubiert und so selektiv die MHC/Peptid-spezifischen Zellen innerhalb der Gesamtpopulation (z.B. per FACS-Analyse) bestimmt werden.Currently, most MHC tetramer reagents are available through one very complex and complex process. First of all MHC components expressed as recombinant proteins in E. coli and purified from inclusion bodies. After urea denaturation the MHC levels in the presence of beta-microglobulin and high peptide / epitope concentrations by dilution in an arginine-rich Folded and isolated buffer with glutathione redox system. In one further step, the recombinant MHC is biotinylated and after renewed purification via Streptavidin multimerized. The one used for multimerization Streptavidin is for the later optical detection marked with phycoerythrin. This fluorescence-coupled MHC multimer reagents can incubated with complex T cell mixtures and so selectively the MHC / peptide-specific Cells within the total population can be determined (e.g. by FACS analysis).

Die bestehende Technik der Herstellung von MHC-Multimer Reagenzien ist sehr aufwendig, empfindlich (z.B. die Effizienz der Biotinylierungsreaktion) und kosten-intensiv. Eine Vereinfachung des Herstellungsverfahrens z.B. über Expression einer DNS, die die notwendigen Komponenten wie MHC-Molekül, beta-Mikroglobulin, den Farbstoff sowie das Multimerisierungsmolekül zusammen enthält, würde den breiteren Einsatz dieser Methodik in der Grundlagenforschung wie auch im klinisch-diagnostischen Bereich wesentlich beschleunigen.The existing technology of manufacture MHC multimer reagents are very complex, sensitive (e.g. the efficiency of the biotinylation reaction) and cost-intensive. A simplification of the manufacturing process e.g. about expression a DNA that contains the necessary components such as MHC molecule, beta-microglobulin, containing the dye and the multimerization molecule together, would wider use of this methodology in basic research such as Accelerate significantly in the clinical-diagnostic area.

Es ist damit eine Aufgabe der Erfindung ein neues Mittel bereitzustellen, welches die Multimerisierung von MHC-Molekülen verbessert und die oben dargestellten Nachteile vermeidet.It is therefore an object of the invention to provide a new means of multimerizing MHC molecules improved and avoids the disadvantages described above.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das in Anspruch 1 näher beschriebene MHC-Multimerisierungsmittel gelöst. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie den weiteren, unabhängigen Ansprüchen.This object is achieved according to the invention that in claim 1 closer MHC multimerization agents described solved. Preferred embodiments of the invention result from the subclaims and the further, independent Claims.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand einzelner Ausgestaltungen näher beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese speziellen Ausführungsformen beschränkt, sondern der Umfang der Erfindung wird durch die Patentansprüche in Verbindung mit der Beschreibung definiert.The invention is explained below individual configurations closer described. However, the invention is not specific to this embodiments limited, rather the scope of the invention is related by the claims defined with the description.

Erfindungsgemäß wird eine Multimerbildung, z.B. Tetramerbildung, von MHC-Molekülen unter Verwendung von Chromoproteinen durchgeführt, die zur Multimerisierung von MHC-Molekülen geeignet sind. Bei dem erfindungsgemäßen MHC Multimer handelt es sich um ein Multimer aus zwei oder mehreren, vorzugsweise vier MHC-Molekülen sowie einem Multimerisierungsmittel, wobei das Multimerisierungsmittel dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein Chromoprotein ist, wobei DsRed1 oder DsRed als Multimerisierungsmittel ausgenommen sind.According to the invention, multimer formation, eg tetramer formation, of MHC molecules using Ver Chromoproteins that are suitable for multimerization of MHC molecules. The MHC multimer according to the invention is a multimer composed of two or more, preferably four MHC molecules and a multimerizing agent, the multimerizing agent being characterized in that it is a chromoprotein, with DsRed1 or DsRed being excluded as multimerizing agents.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Chromoprotein um ein Protein mit β-Barrel oder β-Can-artiger Struktur, die besonders gut zur Multimerisierung geeignet ist.According to a particularly preferred embodiment the chromoprotein is a protein with a β-barrel or β-Can type Structure that is particularly well suited for multimerization.

Besonders bevorzugt sind Chromoproteine, die aus Korallen gewonnen werden, wobei solche Chromoproteine beispielsweise aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus AmCyanl, ZsGreen1, ZsYellow1, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRed1 besteht. Die Struktur der vorgenannten Proteine ist an sich bekannt, und sie können beispielsweise von CLONTECH^R in rekombinanter Form bezogen werden. Weitere Informationen sind in der veröffentlichten Broschüre „BC Living Colors RCFP Licensing Program von BD Biosciences – Clontech" zu finden.Chromoproteins obtained from corals are particularly preferred, such chromoproteins being selected, for example, from the group consisting of AmCyanl, ZsGreen1, ZsYellow1, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRed1. The structure of the aforementioned proteins is known per se and they can be obtained, for example, from CLONTECH ^R in recombinant form. Further information can be found in the published brochure "BC Living Colors RCFP Licensing Program by BD Biosciences - Clontech".

Die vorgenannten fluoreszierenden Proteine wurden aus Riff-Korallen der Klasse Anthozoa gewonnen und wurden bereits als Reporter eingesetzt und weisen viele Vorteile auf. Beispielsweise sind sie physikochemisch ausgesprochen stabil, tolerieren beträchtliche Änderungen des pHs und können die Einwirkungen üblicher denaturierender Mittel ohne Verlust der Fluoreszenzeigenschaft überstehen. Sie sind extrem vielseitig, emittieren eine starke, sichtbare Fluoreszenz in einer Vielzahl von Zelltypen und Medien. Sie zeigen eine ausgezeichnete Fotostabilität, was es ermöglichst, die Fluoreszenz über lange Zeitspannen hinweg zu überwachen. Abhängig vom Protein bewegt sich die Fluoreszenz von 489 nm bis 618 nm (siehe Tabelle 1). Die oben erwähnten fluoreszierenden Proteine werden von Säugetierzellen gut toleriert und sogar nach 14 Tagen einer konstitutiven Expression bleibt bei einem hohen Prozentsatz von Zellen eine Fluoreszenz erhalten. Die oben genannten Protelne haben sich als zur Erzeugung von stabil transfizierten Zelllinien und transgenen Organismen brauchbar erwiesen.The aforementioned fluorescent Proteins were obtained from reef corals of the Anthozoa class and have already been used as reporters and have many advantages on. For example, they are extremely stable physicochemically, tolerate significant changes of pH and can the actions more common survive denaturing agents without loss of fluorescent property. They are extremely versatile and emit strong, visible fluorescence in a variety of cell types and media. They show an excellent Photostability, what makes it possible the fluorescence over to monitor for long periods of time. Dependent the fluorescence of the protein ranges from 489 nm to 618 nm (see Table 1). The above fluorescent proteins are well tolerated by mammalian cells and even after 14 days of constitutive expression remains fluorescence in a high percentage of cells. The Above mentioned protelne have proven to be stable transfected cell lines and transgenic organisms have been shown to be useful.

Überraschend und unerwartet wurde von den Erfindern nunmehr festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Multimerisierungsmittel auch zur Multimerisierung von MHC-Molekülen und gleichzeitig für den späteren optischen Nachweis des Mittels herangezogen werden können. Weder die Bindung des Antigen-spezifischen Peptids an MHC-Moleküle noch die Bindung des MHC-Multimers an die T-Zell-Rezeptoren einer T-Zelle wird durch die erfindungsgemäße Multimerisierung gestört oder nachteilig beeinflußt. Insbesondere kann durch die Chromoprotein vermittelte Multimerisierung die Multimer-Herstellung wesentlich vereinfacht, beschleunigt und kostengünstig effizienter gestaltet werden, ohne die Funktionalität zu behindern. Der Nachweis der Chromoproteine, insbesondere der oben genannten fluoreszierenden Proteine, erfolgt durch fluoreszenzdetektierende Verfahren in an sich bekannter Weise, wie es im Stand der Technik beispielsweise in den von den CLONTECH^R Laboratories, Inc. veröffentlichten Protokollen dargestellt wird (CLONTECHniques XIV (4): 2 – 6). Dazu gehören neben FACS-analysen auch Fluoreszenzmikroskopie und fluoreszenzbasierende Scanningverfahren (z.B. Fluorimager von Molecular Dynamics).Surprisingly and unexpectedly, the inventors have now found that the multimerization agents according to the invention can also be used for the multimerization of MHC molecules and at the same time for the later optical detection of the agent. Neither the binding of the antigen-specific peptide to MHC molecules nor the binding of the MHC multimer to the T cell receptors of a T cell is disturbed or adversely affected by the multimerization according to the invention. In particular, the multimerization mediated by the chromoprotein can make the multimer production much simpler, faster and more cost-effective, without impeding the functionality. The chromoproteins, in particular the fluorescent proteins mentioned above, are detected by fluorescence-detecting methods in a manner known per se, as is shown in the prior art, for example, in the protocols published by CLONTECH ^R Laboratories, Inc. (CLONTECHniques XIV (4): 2 - 6). In addition to FACS analyzes, this also includes fluorescence microscopy and fluorescence-based scanning methods (e.g. Fluorimager from Molecular Dynamics).

Erfindungsgemäß können sowohl MHC-Klasse I als auch MHC-Klasse II -Moleküle multimerisiert werden. Der Begriff „Multimer", wie er hierin definiert ist, bedeutet vorzugsweise Di mere oder Tetramere, wobei die genaue Ausbildung des Multimers von der Auswahl des speziellen Multimerisierungsmittels abhängt.According to the invention, both MHC class I and also MHC class II molecules be multimerized. The term "multimer" as defined herein means preferably di mers or tetramers, the exact training of the multimer from the selection of the special multimerization agent depends.

Beispiele für einsetzbare Histokompatibilitätsantigene sind MHC-Klasse I-Antigene, beispielsweise HLA-A (zum Beispiel A1, A2, A3, A11, A24, A31, A33 und A38), HLA-B und HLA-C, MHC-Klasse II-Antigene, beispielsweise HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DX, HLA-DO, HLA-DZ und HLA-DP.Examples of histocompatibility antigens that can be used are MHC class I antigens, for example HLA-A (for example A1, A2, A3, A11, A24, A31, A33 and A38), HLA-B and HLA-C, MHC class II antigens, for example HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DX, HLA-DO, HLA-DZ and HLA-DP.

Z.B. sind MHC-Tetramere Komplexe aus vier MHC-Molekülen, die mit einem spezifischen Peptid assoziiert sein können und durch ihre Bindung an ein Fluorochrom nachweisbar sind. Diese Komplexe binden eine spezielle Gruppe von T-Zell-Rezeptoren auf CD8⁺-T-Zellen. Bei Vermischung der so erhaltenen Tetramere mit PBLs oder Gesamtblut und Nachweis zur Verwendung durchflusszytometrischer Verfahren kann die Menge aller T-Zellen, die für ein Peptid spezifisch sind und das damit verbundene Allel analysiert werden. Es ist also möglich, die zelluläre Immunantwort gegen ein spezifisches Peptid zu bestimmen.For example, MHC tetramers are complexes of four MHC molecules, which can be associated with a specific peptide and can be detected by their binding to a fluorochrome. These complexes bind a special group of T cell receptors to CD8 ⁺ T cells. If the tetramers obtained in this way are mixed with PBLs or whole blood and proven to use flow cytometric methods, the amount of all T cells which are specific for a peptide and the associated allele can be analyzed. It is therefore possible to determine the cellular immune response against a specific peptide.

MHC-Multimere gemäß der Erfindung können beispielsweise eingesetzt werden, um die zelluläre Immunantwort unter nachfolgenden Bedingungen zu studieren:MHC multimers according to the invention can for example used to the cellular Study immune response under the following conditions:

1. For all virus infections, for example HIV, HBV, CMV, HPV, HBV, HCV, influenza and measles and many others.
2. Bacterial infections
3. Parasite infections, for example malaria.
4. Tumors, including Breast prostate, melanoma, colon, lung and cervical tumors.
5. Autoimmunity disorders including Mutiplesclerosis, diabetes, rheumatoid arthritis, etc.
6. Allergic diseases such as bronchial asthma, neurodennitis etc.

Durch die Multimer-Technologie ist es möglich, individuelle T-Zellen auf Grundlage der Spezifität der Bindung an den MHC-Peptid-Komplex zu identifizieren. Aufgrund der Spezifität der Multimere bieten sich folgende Vorteile:Multimer technology makes it possible to identify individual T cells based on the specificity of the binding to the MHC-peptide complex. Due to the specificity of the multimers, fol advantages:

- The Procedure is quantitative;
- It no radioactive markings are to be used;
- The Procedure works quickly, so that even fresh blood samples or Tissue culture samples can be analyzed, and large amounts of samples processed can be;
- By the cells can not only use a flow cytometer with the multimer fluorochrome of the present invention, but also with other cell surface markers be marked at the same time;
- It can uniform subpopulations sorted by flow cytometry will be checked and their functionality checked by means of further test systems;
- Specific T cells can are analyzed from blood samples without prior in vitro culture;
- Specific T cells can isolated from blood samples and returned to the patient for therapy become;
- All specific T cells are detectable, regardless of their functional Status, such as cytotoxic T cells, T helper cells, etc.

Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der Möglichkeit der gentechnischen Erzeugung von Multimeren in einem einzigen Schritt. Dadurch werden die im Stand der Technik bestehenden Nachteile, d.h. eine Mulimerisierung mit Hilfe der Komponenten Avidin und Streptavidin vermieden. Ein beispielhaftes Genkonstrukt zur Expression des erfindungsgemäßen Fusionsproteins, das zur Herstellung der Multimeren dient umfaßt beispielsweise ein wie in 2 dargestelltes Konstrukt, bestehend aus einem Promotor, dem das jeweilige Chromoprotein kodierenden DNA-Abschnitt, einem Linker, einem MHC kodierenden Bereich und ggf. weiteren über einen Linker angebundenen kodierenden Bereichen wie vorzugsweise einen für β-Mikroglobulin kodierenden Bereich etc.A particular advantage of the present invention is the possibility of genetically engineering multimers in a single step. This avoids the disadvantages existing in the prior art, ie a multimerization using the components avidin and streptavidin. An exemplary gene construct for the expression of the fusion protein according to the invention, which is used to produce the multimers, comprises, for example, one as in 2 Construct shown, consisting of a promoter, the DNA segment coding the respective chromoprotein, a linker, an MHC coding region and possibly further coding regions connected via a linker, such as preferably a region coding for β-microglobulin etc.

Ausgangspunkt der Erfindung ist die Herstellung eines Fusionsproteins aus einem für ein MHC-Protein kodierenden Gen und aus einem für ein erfindungsgemäßes Chromoprotein kodierenden Gen. Hierzu werden bevorzugt beim MHC-Molekül die Transmembran-Anteile und die zytosolischen Anteile entfernt, um eine lösliche Form des MHC-Moleküls zu erhalten. Der MHC-Anteil und der Chromoprotein-Anteil werden bevorzugt durch ein Linkermolekül miteinander verknüpft. Das nach Entfernung der transmembranen und zytosolischen Anteile erhaltene trunkierte MHC-Molekül wird dann über das Linker-Molekül an den N-Terminus des Chromoproteins gekoppelt.The starting point of the invention is Production of a fusion protein from a coding for an MHC protein Gene and from one for a chromoprotein according to the invention coding gene. For this purpose, the transmembrane fractions are preferred for the MHC molecule and the cytosolic portions removed to a soluble form of the MHC molecule to obtain. The MHC portion and the chromoprotein portion will be preferably by a linker molecule linked together. That after removal of the transmembrane and cytosolic parts truncated MHC molecule obtained will then over the linker molecule coupled to the N-terminus of the chromoprotein.

Es ist insbesondere darauf zu achten, daß durch das Einfügen des Linker-Moleküls die Multimerbildung über den Chromoproteinanteil nicht behindert wird. Besonders bevorzugt wird ein Aminosäurelinker verwendet. Ein Beispiel für einen flexiblen Aminosäurenlinker ist ein Derivat des lacZ-Alpha-Peptids [angegeben im „single letter code": MASSG GTGGS GGTGG SGGGG ASPSL VPSSD PLVTA ASVLE FALAG AQE] oder der synthetische flexible Linker Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr[Gly Gly Ser Gly Gly Thr]₃, der zwischen den beiden Proteinanteilen des Fusionsproteins MHC und dem Chromoprotein eingefügt wird und die Multimerisierung sterisch nicht behindert.It is particularly important to ensure that the insertion of the linker molecule does not hinder multimer formation via the chromoprotein portion. An amino acid linker is particularly preferably used. An example of a flexible amino acid linker is a derivative of the lacZ alpha peptide [given in the "single letter code": MASSG GTGGS GGTGG SGGGG ASPSL VPSSD PLVTA ASVLE FALAG AQE] or the synthetic flexible linker Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr [Gly Gly Ser Gly Gly Thr] ₃ , which is inserted between the two protein portions of the fusion protein MHC and the chromoprotein and does not sterically hinder multimerization.

Selbstverständlich stehen dem Fachmann auch andere Aminosäurelinker zur Verfügung. Entsprechende Techniken sind bekannt. Es ist aber auch möglich, die Proteine selbst durch beispielsweise peptidchemische Bindungen über Crosslinker oder ähnliche Verfahren miteinander zu verbinden. Beispielsweise sei auf Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Gold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 1989 und Ansubel F.M. et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, NY) und nachfolgende Auflagen hingewiesen.Of course, the specialist also other amino acid linkers to disposal. Appropriate techniques are known. But it is also possible that Proteins themselves through, for example, peptide chemical bonds via crosslinkers or similar Process to connect with each other. For example, be on Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Gold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 1989 and Ansubel F.M. et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, NY) and subsequent editions pointed out.

In einer bevorzugten Ausgestaltungsform der Erfindung kann auch eine Variante des Aminosäurelinkers eingesetzt werden, die zumindest eine Erkennungssequenz für eine Protease enthält, beispielsweise den Faktor Xa. Hierdurch wird eine vereinfachte Abspaltung der MHC-Moleküle vom Chromoproteinmultimer ermöglicht.In a preferred embodiment a variant of the amino acid linker can also be used in the invention, which contains at least one recognition sequence for a protease, for example the factor Xa. This simplifies the cleavage of the MHC molecules from the chromoprotein multimer allows.

Folgende weitere Varianten des Linkers zwischen MHC und dem Chromoprotein können im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden:
lacZα-Linker:
E Q A G A L A F E L V S A A T V L P D S S P V L SThe following further variants of the linker between MHC and the chromoprotein can be used in the context of the present invention:
lacZα linker:
EQAGALA FELVSAATVLPDSSPVLS

Standard-Serin-Glycin-Linker:
S G G S S G G GStandard-serine-glycine linker:
S GGSSGGG

Extrem langer Standard-Linker:
S S S G G G S S G G S S G G GExtremely long standard linker:
S SSGGGSSGGSSGGG

Die erfindungsgemäß hergestellten rekombinanten MHC-Chromoprotein-DNA-Moleküle können in an sich bekannter Weise in rekombinanter Form in Expressionsplasmiden kloniert und in prokaryonten Zellen, bevorzugt E.coli-Zellen, oder in eukaryonten Zellen, beispielsweise Hefezellen oder etablierten menschlichen Zellen, exprimiert werden. Geeignete Techniken stehen auf diesem Fachgebiet zur Verfügung, und es wird hier wiederum auf die oben genannten Laborhandbücher verwiesen. Die erhaltenen rekombinanten monomeren Chromoprotein-MHC-Proteinmoleküle werden durch an sich bekannte Verfahren aufgereinigt und können dann in vitro oder in vivo multimerisiert werden.The recombinant MHC chromoprotein DNA molecules produced according to the invention can be cloned in a manner known per se in recombinant form in expression plasmids and expressed in prokaryotic cells, preferably E. coli cells, or in eukaryotic cells, for example yeast cells or established human cells. Appropriate techniques are available in the art, and it will be here again referred to the laboratory manuals mentioned above. The recombinant monomeric chromoprotein MHC protein molecules obtained are purified by methods known per se and can then be multimerized in vitro or in vivo.

Zur Multimerisierung werden die löslichen Versionen der MHC-Chromoprotein-Moleküle, wahlweise, insbesondere bei MHC-I, in Kombination mit beta₂-Mikroglobulin, zur Multimerisierung gebracht. Die Multimerisierung findet bevorzugt in Gegenwart des Antigenspezifischen Peptids statt. Die Ausbildung von Multimeren ist eine den erfindungsgemäßen Chromo-Proteinen inne wohnende Eigenschaft und es bedarf nicht mehr der aus dem Stand der Technik bekannten komplizierten, zeitraubenden Methoden wie Biotinylierungen, Streptavidin-Bindungen sowie Fluorochrom-Kopplungsreaktionen, um die Multimerbildung und die Fluoreszenzentwicklung zu gewährleisten. Bei der Erfindung wirkt das eingesetzte Chromo-Protein sowohl als Multimerisierungsagens als auch als fluoreszierendes Mittel.For multimerization, the soluble versions of the MHC chromoprotein molecules, optionally, in particular in the case of MHC-I, in combination with beta ₂ microglobulin, are brought to multimerization. The multimerization preferably takes place in the presence of the antigen-specific peptide. The formation of multimers is a property inherent in the chromoproteins according to the invention and the complicated, time-consuming methods known from the prior art, such as biotinylations, streptavidin bonds and fluorochrome coupling reactions, are no longer required to ensure multimer formation and fluorescence development. In the invention, the chromoprotein used acts both as a multimerization agent and as a fluorescent agent.

Die erfindungsgemäßen Chromo-Proteine können selbstverständlich durch an sich bekannte Methoden abgeändert werden, um beispielsweise die Multimerisierung, die Bindung an das MHC-Molekül und/oder die Fluoreszenz- bzw. Farbaktivität zu verbessern. Üblicherweise werden für derartige Mutagenisierungen zufallsgenerierte Mutanten auf ihre neuen Charakteristika ausgetestet, oder es wird in gezielter Weise nach Strukturuntersuchungen eine Mutagenisierung des Chromoproteins vorgenommen, um seine Aktivitäten zu verbessern.The chromo proteins according to the invention can of course by Modified methods known per se to, for example, multimerization, binding to the MHC molecule and / or to improve the fluorescence or color activity. Usually be for such mutagenizations randomly generated mutants on their tested new characteristics, or it is targeted after structural examinations, a mutagenization of the chromoprotein made to its activities to improve.

Zusammenfassend ist der Begriff „Chromoprotein" oder „rekombinantes Chromoprotein" nicht auf ein spezielles Protein beschränkt, sondern umfasst alle Varianten und Derivate dieser Proteinsequenzen, die dessen Funktion im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfüllen können, d.h. zur Multimerisierung von MHC-Molekülen sowie zum optischen Nachweis geeignet sind. Bevorzugte Beispiele sind oben angegeben, wobei diese selbstverständlich nicht isoliert betrachtet werden sollen, sondern jederzeit auch Kombinationen der einzelnen Veränderungen zur Erzielung eines vorteilhaften Chromoproteins vom Begriff „Chromoprotein" oder „rekombinantes Chromoprotein" mit umfasst sind.In summary, the term "chromoprotein" or "recombinant" Chromoprotein "not limited to a special protein, but includes all variants and derivatives of these protein sequences that function within the framework of the present invention can, i.e. for multimerization of MHC molecules and for optical detection are suitable. Preferred examples are given above, these being Of course should not be viewed in isolation, but at any time Combinations of the individual changes to achieve an advantageous chromoprotein from the term "chromoprotein" or "recombinant Chromoprotein "with are included.

Modifikationen der Sequenzen, wie beispielsweise Deletionen, Insertionen oder Substitutionen in der Sequenz, die im sich ergebenden Protein-Molekül sogenannte "stille" Veränderungen (silent changes) erzeugen, werden ebenfalls als innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet.Modifications of the sequences, such as for example deletions, insertions or substitutions in the sequence, the so-called "silent" changes in the resulting protein molecule (silent changes) are also considered to be within the range of the present invention.

Vorzugsweise sind derartige Aminosäure-Substitutionen das Ergebnis der Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, d.h. konservative Aminosäureersetzungen. Aminosäuresubstitutionen können auf Grundlage der Ähnlichkeit in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie, und/oder der amphipatischen (amphiphilen) Natur der involvierten Reste vorgenommen werden. Beispiele für unpolare (hydrophobe) Aminosäuren sind Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Polare neutrale Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Thyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Positiv geladene (basische) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Und negativ geladene (saure) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein.Such amino acid substitutions are preferred the result of replacing an amino acid with another amino acid with similar ones structural and / or chemical properties, i.e. conservative Amino acid replacements. amino acid substitutions can based on the similarity in polarity, Charge, solubility, Hydrophobicity, hydrophilicity, and / or the amphipathic (amphiphilic) Nature of the residues involved. Examples of non-polar (hydrophobic) amino acids are alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, Cysteine, thyrosine, asparagine and glutamine. Positively charged (basic) amino acids conclude Arginine, lysine and histidine. And negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid on.

"Insertionen" oder "Deletionen" bewegen sich typischerweise im Bereich von ein bis fünf Aminosäuren. Der erlaubte Variationsgrad kann experimentell durch systematisch vorgenommene Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in einem Polypeptidmolekül unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken und durch Untersuchen der sich ergebenden rekombinanten Varianten bezüglich ihrer biologischen Aktivität ermittelt werden."Insertions" or "deletions" typically move in the range of one to five Amino acids. The allowed degree of variation can be experimentally determined by systematic Insertions, deletions or substitutions of amino acids in a polypeptide molecule using recombinant DNA techniques and by investigation of the resulting recombinant variants with regard to their biological activity become.

Daraus ergibt sich, daß, wo der Begriff "Chromoprotein" entweder in der Beschreibung oder in den Ansprüchen verwendet wird, er alle derartigen Modifikationen und Varianten umfaßt, die ein biologisch äquivalentes Chromoprotein zur Folge haben. So kann eine erfindungsgemäßes Chromoprotein auch lediglich aus einer Multimerisierungsdomäne und einer Farbstoffdomäne bestehen.It follows that where the Term "chromoprotein" either in the Description or in the claims is used, he all such modifications and variants comprises which is a biologically equivalent Chromoprotein result. A chromoprotein according to the invention can thus also consist only of a multimerization domain and a dye domain.

Die erfindungsgemäß ausgebildeten Multimere, z.B. Tetramere, werden mit der zu analysierenden Zellpopulation gemischt. Unter Zellpopulation versteht man insbesondere PBMC-Populationen (periphere Blut mononukleäre Zellen) oder T-Lymphozyten (T-Zellen). Nur T-Zellen mit T-Zell-Rezeptoren, die zur Bindung an die spezielle MHC-Peptid-Kombination, die im Tetramer vorliegt, befähigt sind, können an das Tetramer bilden. Derartige Zellen werden durch das Chromoprotein markiert. Selbstverständlich können auch weitere Fluoreszenzmarkierungen zusätzlich zum Chromoprotein eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein für einen T-Zell-Marker spezifischer monoklonaler Antikörper in Kombination mit einem unterschiedlichen Fluorochrom, beispielsweise FITC, eingesetzt werden. Die Zellen können dann unter Verwendung eines Durchflusszytometrieverfahrens analysiert werden. Der Anteil der CD8⁺ T-Zell-Population, die mit Hilfe des Tetramers positiv gefärbt wurde, wird bestimmt. Mit Hilfe von Fluoreszenznachweisverfahren, beispielsweise der Durchflusszytometrie, können die MHC-Tetramer-T-Zell-Komplexe auch sortiert werden und Beispielsweise die so erkannten T-Zellen in einen Patienten appliziert werden.The multimers designed according to the invention, for example tetramers, are mixed with the cell population to be analyzed. Cell population is understood to mean, in particular, PBMC populations (peripheral blood mononuclear cells) or T lymphocytes (T cells). Only T cells with T cell receptors that are capable of binding to the special MHC-peptide combination present in the tetramer can form on the tetramer. Such cells are marked by the chromoprotein. Of course, other fluorescent labels can also be used in addition to the chromoprotein. For example, a monoclonal antibody specific for a T cell marker can be used in combination with a different fluorochrome, for example FITC. The cells can then be analyzed using a flow cytometry technique. The proportion of the CD8 ⁺ T cell population which was stained positive using the tetramer is determined. With the help of fluorescence detection methods, for example flow cytometry, the MHC tetramer T cell complexes can also be sorted and, for example, the T cells recognized in this way can be applied to a patient.

In einer weiteren Ausgestaltungsform der Erfindung liegen die MHC-Monomere oder -Multimere, z.B. Tetramere, in einem Testsystem vor, das in Form eines Kits angeboten werden kann.In a further embodiment of the invention are the MHC monomers or multimers, e.g. tetramers, in a test system that is offered in the form of a kit can.

Der Lösungsansatz der Erfindung reduziert die zur Herstellung von MHC-Multimer-Reagenzien benötigten Komponenten (2 MHC-Ketten [z.B. MHC-I: schwere Kette und beta-2-Mikroglobulin, MHC-II: alpha und beta Kette], d-Biotin, Peptid, Streptavidin-PE) auf 4 (MHC-linker-Chromoprotein-Fusionsprotein, 2: MHC-Kette und das jeweilige MHC-bindende Peptid/Epitop). Außerdem wird die hohe Anzahl der benötigten Reaktionsabläufe (Extraktion von rekombinanten MHC Anteilen, in vitro Faltung in Gegenwart des Peptides, Biotinylierung, chromatographische Aufreinigung, Multimerisierung unter Zugabe von Streptavidin-PE, weitere Reinigung über Molekularsiebchromatographie) auf z. B. 3 (Extraktion von rekombinantem HLA-linker-Chromoprotein, Refolding in Anwesenheit des Peptids und anschließende Aufreinigung) reduziert. Alleine die Reduktion der Anzahl der notwendigen Aufreinigungsschritte, welche immer mit starken Verlusten verbunden sind, steigert die Gesamtausbeute an Reagenz deutlich. Außerdem ist der generierte MHC-Multimer Komplex relativ klein und sehr viel stabiler, wodurch Vorteile gegenüber bisher verwendeten Reagenzien entstehen. Außerdem sind diese Fusionsproteine gegenüber den klassischen MHC-Tetrameren bei Lagerung in gefrorenem Zustand stabiler und können als ein Protein (eine Komponente) gelagert werden, im Gegensatz zu den klassischen MHC-Multimeren, die als zwei Komponenten getrennt gefroren gelagert werden müssen.The approach of the invention reduces the need for the production of MHC multimer reagents components (2 MHC chains [eg MHC-I: heavy chain and beta-2-microglobulin, MHC-II: alpha and beta chain], d-biotin, peptide, streptavidin-PE) on 4 (MHC-linker chromoprotein Fusion protein, 2: MHC chain and the respective MHC-binding peptide / epitope). In addition, the high number of required reaction processes (extraction of recombinant MHC portions, in vitro folding in the presence of the peptide, biotinylation, chromatographic purification, multimerization with the addition of streptavidin-PE, further purification via molecular sieve chromatography) on z. B. 3 (extraction of recombinant HLA linker chromoprotein, refolding in the presence of the peptide and subsequent purification) reduced. Simply reducing the number of necessary purification steps, which are always associated with high losses, significantly increases the overall yield of reagent. In addition, the generated MHC-Multimer complex is relatively small and much more stable, which results in advantages over previously used reagents. In addition, these fusion proteins are more stable to the classic MHC tetramers when stored in the frozen state and can be stored as one protein (one component), in contrast to the classic MHC multimers, which have to be stored frozen as two components.

Aus den vorgenannten Gründen ergeben sich folgende Möglichkeiten für in vivo Applikationen von Chromoprotein-MHC Multimeren:Obtained for the above reasons yourself the following options for in Vivo applications of chromoprotein MHC multimers:

Konventionelle MHC-Multimer Reagenzien werden – wie oben dargestellt – i.d.R. mit Hilfe von Avidin oder Streptavidin hergestellt. Avidin bzw. Streptavidin hat allerdings nach intravenöser Applikation eine sehr kurze in vivo Halbwertszeit, was insbesondere durch eine schnelle Aufnahme in der Leber bedingt ist. Entsprechend ist auch die in vivo Halbwertszeit konventioneller MHC-Multimer-Reagenzien nur sehr kurz. Für die erfindungsgemäßen Chromoprotein-MHC-Multimere wird eine deutlich längere in vivo Halbwertszeit erwartet; dazu ist der Farbstoff selber sehr resistent gegenüber schädigenden bzw. degradierenden in vivo Einflüssen. In vivo Anwendungen mit MHC-Multimeren sind von Bedeutung für grundlagenwissenschaftliche Fragestellungen (z.B. in vivo Färbung antigen-spezifischer T-Zellen und nachfolgende Detektion im Gewebeschnitt, antigen-spezifische Immunsierung bzw. Toleranz-Induktion) als auch klinische Anwendungen (antigen-spezifische Immunsierung bzw. Toleranz-Induktion, Konjugation der Reagenzien mit immunmodulatorischen Substanzen bzw. Tracern).Conventional MHC multimer reagents become - how shown above - usually made with the help of avidin or streptavidin. Avidin or However, streptavidin is very short after intravenous administration in vivo half-life, which is particularly due to a fast uptake in the liver. The in vivo half-life is also corresponding conventional MHC multimer reagents only very briefly. For the chromoprotein MHC multimers according to the invention a much longer one expected half-life in vivo; the dye itself is very good for that resistant to damaging or degrading in vivo influences. In vivo applications with MHC multimers are important for basic science Questions (e.g. in vivo staining antigen-specific T cells and subsequent detection in the tissue section, antigen-specific immunization or tolerance induction) as well clinical applications (antigen-specific immunization or tolerance induction, Conjugation of the reagents with immunomodulatory substances or Tracers).

Die vorliegende Erfindung wird nunmehr anhand von Beispielen und den beigefügten Abbildungen verdeutlicht, die Folgendes zeigen:The present invention will now illustrated with examples and the attached illustrations, which show the following:

1.: Schematische Darstellung einer MHC-HcRed1 Expressions-Kassette im Vektor pet3a. 1 .: Schematic representation of an MHC-HcRed1 expression cassette in the vector pet3a.

Dieses Konstrukt ist beispielhaft für verschiedene weitere Varianten. Die einzelnen Bestandteile sind in verschiedenen Farben markiert. Blau: Promotor bzw. Terminator für die überexpression in E.coli. Rot: Leserahmen für eine Mutante des HcRed1-Proteins. Grau: Leserahmen für die schwere Kette des MHC-Proteins. Grün: Fusionsprotein aus MHC und HcRed1. Cyan: Linkerregion, in diesem Fall repräsentiert durch ein Peptid dass zugleich ein Epitop-Tag darstellt. Zu beachten ist, dass der Leserahmen für HcRed1 kein internes Startcodon enthält und somit praktisch nur Fusionsprotein der vollen Länge exprimiert werden kann.This construct is exemplary for different other variants. The individual components are in different Colors marked. Blue: promoter or terminator for overexpression in E. coli. Red: reading frame for a mutant of the HcRed1 protein. Gray: reading frame for the heavy Chain of the MHC protein. Green: Fusion protein from MHC and HcRed1. Cyan: Left region, in this Case represented through a peptide that also represents an epitope tag. To be noted is that the reading frame for HcRed1 does not contain an internal start codon and therefore practically only Full length fusion protein can be expressed.

2.: Schematische Darstellung der wesentlichen Bestandteile einer weiteren MHC-HcRed1 Expressions-Kassette. 2 .: Schematic representation of the essential components of another MHC-HcRed1 expression cassette.

Diese besitzt im Gegensatz zum Konstrukt aus 1 kein Epitop-Tag als Linkerpeptid sondern einen Linker der sich aus mehreren Serinen und Glycinen zusammensetzt. Die Flexibilität des Linkers und die Beweglichkeit der miteinander verbundenen Proteine ist in diesem Fall wahrscheinlich deutlich höher.In contrast to the construct, this has 1 no epitope tag as linker peptide but a linker that is composed of several serines and glycines. The flexibility of the linker and the mobility of the linked proteins is probably significantly higher in this case.

3.: MHC-Protein (Schwerekette und β₂-Mikroglobulin). 3 .: MHC protein (heavy chain and β ₂ microglobulin).

Links ist die Darstellung gemäss der Sekundärstruktur des Proteins zu sehen, wie sie später auch in den 5 und 6 der Fusionsproteine verwendet wird (Helikale Strukturen in rot, β-Faltblätter in blau, unstrukturierte Regionen und Turns in weiss). Rechts zur Verdeutlichung die gesonderte Darstellung von schwerer Kette (in grün) und β₂-Mikroglobulin (in purpur).On the left you can see the representation according to the secondary structure of the protein, as you will find later in the 5 and 6 fusion proteins are used (helical structures in red, β-sheets in blue, unstructured regions and turns in white). On the right for clarification, the separate representation of the heavy chain (in green) and β ₂ -microglobulin (in purple).

4.: Räumliche Darstellung eines MHC-Chromoprotein-Tetramers. 4 .: Spatial representation of an MHC chromoprotein tetramer.

Die einzelnen Ketten des Homo-Tetramers sind in den Farben Orange, Rot, Grün und Cyan dargestellt. Rechts ist eine Seitenansicht, links eine Aufsicht auf das Tetramer zu sehen. Deutlich zu erkennen ist die symmetrische und kompakte Anordnung des Tetramers, die es zur beabsichtigten Anwendung befähigt. Diese Abbildung ist für die erfindungsgemäßen Multimere, insbesondere Tetramere, beispielhaft.The individual chains of the homo-tetramer are shown in the colors orange, red, green and cyan. Right is a side view, on the left a top view of the tetramer see. The symmetrical and compact arrangement is clearly visible of the tetramer, which enables it to be used as intended. This illustration is for the multimers according to the invention, in particular tetramers, for example.

5.: MHC- Chromoprotein Tetramer 5 .: MHC chromoprotein tetramer

Der MHC-Tetramer-Verband wurde gemäss den Erläuterungen von 4 dargestellt. Der C-Terminus jeweils eines MHC-Proteins wurde computerunterstützt an den N-Terminus einer Untereinheit des Chromoprotein-Tetramers angefügt. Die Darstellung zeigt nur eine mögliche Anordnung der MHC-Moleküle im Raum, die durch den flexiblen Peptidlinker einen Bewegunsspielraum erhalten. Diese Ansicht zeigt das Chromoprotein-Tetramer von der SeiteThe MHC Tetramer Association was founded according to the explanations by 4 shown. The C-terminus of each MHC protein was computer-assistedly attached to the N-terminus of a subunit of the chromoprotein tetramer. The illustration shows only one possible arrangement of the MHC molecules in space, which are given a range of motion by the flexible peptide linker. This view shows the chromoprotein tetramer from the side

6.: MHC- Chromoprotein Tetramer 6 .: MHC chromoprotein tetramer

Erläuterungen wie bei 5. Diese Ansicht zeigt das Chromoprotein-Tetramer von oben.Explanations as for 5 , This view shows the chromoprotein tetramer from above.

7.: MHC-DsRed-Fusionsprotein exprimierende Bakterien-Kolonien. 7 .: Bacterial colonies expressing MHC-DsRed fusion protein.

BL21 (DE3) Bakterien wurden mit pET3a/H2-K^d-DsRed transformiert und auf Ampicillinhaltiger Agarose kultiviert. Zu erkennen sind einzelne Bakterien-Kolonien mit tiefroter Farbe. Die rote Farbe kommt durch den DsRed-Anteil des rekombinant exprimierten Fusionsproteins.BL21 (DE3) bacteria were transformed with pET3a / H2-K ^d -DsRed and cultivated on agarose containing ampicillin. Individual bacterial colonies with a deep red color can be seen. The red color comes from the DsRed portion of the recombinantly expressed fusion protein.

8.: Rekombinante Expression von MHC-DsRed-Fusionsprotein 8th .: Recombinant expression of MHC-DsRed fusion protein

BL21 (DE3) Bakterien wurden mit pET3a/H2-K^d-DsRed transformiert. Nach Wachstum in Flüssigkultur (LB, 100μg/m1 auf Carbenicillin) wurde bei OD₆₀₀ von ca. 0.8 ein Aliquot entnommen („Nullwert"), der Rest wurde für 3 weitere Stunden in Gegenwart von IPTG (0.4 mM) inkubiert. Proben von „Nullwert" und „3 h" wurden anschließen gewaschen, in dH₂O lysiert, in Proteingel-Probenpuffer aufgekocht, und nachfolgend über SDS-PAGE aufgetrennt. Die Abbildung zeigt ein Proteingel nach Coomassie-Färbung von zwei verschiedenen Kulturen (links MHC-Fusionsprotein mit „Wildtyp" DsRed bzw. rechts mit einer DsRed-Mutante zur Optimierung der Faltungseigenschaften). Man beachte die deutliche zusätzliche Bande nach 3 h IPTG Induktion bei ca. 65 kD, die dem rekombinanten Fusionsprotein entspricht.BL21 (DE3) bacteria were transformed with pET3a / H2-K ^d -DsRed. After growth in liquid culture (LB, 100 μg / ml on carbenicillin), an aliquot of approximately 0.8 was removed at OD ₆₀₀ (“zero value”), the rest was incubated for 3 more hours in the presence of IPTG (0.4 mM). Zero value "and" 3 h "were then washed, lysed in dH ₂ O, boiled in protein gel sample buffer, and subsequently separated by SDS-PAGE. The figure shows a protein gel after Coomassie staining of two different cultures (with MHC fusion protein on the left with "Wild-type" DsRed or right with a DsRed mutant to optimize the folding properties). Note the significant additional band after 3 h IPTG induction at approx. 65 kD, which corresponds to the recombinant fusion protein.

9: Anregungs- und Emissionsspektren von AmCyan, ZsGreen, ZsYellow, DsRed2, AsRed2, und HcRed. 9 : Excitation and emission spectra from AmCyan, ZsGreen, ZsYellow, DsRed2, AsRed2, and HcRed.

Beispiele:Examples:

Aufgrund der hervorragenden Fluoreszenz-und Tetramerisierungseigenschaften in verschiedenen Versuchen wurden Experimente durchgeführt, um die Ausbildung von MHC-Multimeren durch die Fusion an die erfindungsgemäßen Chromoproteine zu erreichen.Because of the excellent fluorescence and Tetramerization properties have been used in various experiments Conducted experiments the formation of MHC multimers by the fusion to the chromoproteins according to the invention to reach.

Klonierung der Expressionskonstrukte:Cloning the Expression Constructs:

Alle Expressionskonstrukte wurden durch Standard-Klonierungsmethoden erzeugt, ausgehend von den von Clontech erhältlichen Vektoren, die für AmCyan1, ZsGreen1, ZsYellow1, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRed1 kodieren und die als PCR-Template fur alle weiteren Varianten dieser Proteine dienten. Die Erfindung wird im Folgenden anhand des Chromoproteins HcRed1 veranschaulicht.All expression constructs were generated by standard cloning methods, starting from those of Clontech available Vectors for AmCyan1, ZsGreen1, ZsYellow1, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRed1 code and as a PCR template for all other variants of this Proteins served. The invention is based on the chromoprotein HcRed1 illustrates.

Als Expressionsvektor des vollständigen Konstrukts und als Quelle des MHC-Proteins wurde der Vektor pET3a/H2-K^d verwendet. Mittels verschiedener Klonierungsstrategien, die die bereits vorhandene Restriktionsschnittstellen im Zielvektor pET3a/H2-K^d nutzten, wurden die für diverse Varianten der oben genannten Chromoproteine kodierende DNA eingefügt. Auf diese Weise wurden Vektoren erzeugt (wie z.B. pET3a/H2-K^d-HcRed1), die unter der Kontrolle des T7-Promotors ein Fusionsprotein aus MHC und einer HcRed1-Variante enthielten, die über unterschiedliche Linkerpeptide miteinander verknüpft waren (siehe 1 und 2).The vector pET3a / H2-K ^{d was} used as the expression vector of the complete construct and as the source of the MHC protein. Using different cloning strategies, which used the existing restriction sites in the target vector pET3a / H2-K ^d , the DNA coding for various variants of the above-mentioned chromoproteins was inserted. In this way, vectors were generated (such as, for example, pET3a / H2-K ^d -HcRed1) which, under the control of the T7 promoter, contained a fusion protein of MHC and an HcRed1 variant which were linked to one another via different linker peptides (see 1 and 2 ).

Als Translationsstart war dabei nur das Start-ATG des MHC-Proteins vorhanden, aber kein internes Start-Codon am Linker oder am HcRed1. Die Expression verkürzter Proteine kann dadurch weitgehend ausgeschlossen werden.As a translation start there was only the start ATG of the MHC protein is present, but no internal start codon on the linker or on the HcRed1. The expression of truncated proteins can thereby be largely excluded.

Folgende Sequenz aus dem Vektor pET3a/H2-K^d-SSGGlinkHcRed1 zeigt beispielhaft die Abfolge der Aminosäuren der letzten 12 AS des MHC-Moleküls und der ersten 12 AS einer HcRed1-Variante (in kursiv). Dazwischen befindet sich ein verwendetes Linkerpeptid (in fett gedruckt).
KLPPSTVSNTAS G G S S G G G VSGLLKESMRIKThe following sequence from the vector pET3a / H2-K ^d -SSGGlinkHcRed1 shows, by way of example, the sequence of the amino acids of the last 12 AS of the MHC molecule and the first 12 AS of an HcRed1 variant (in italics). In between is a used linker peptide (printed in bold).
KLPPSTVSNTAS GGSSGGG VSGLLKESMRIK

Die nächste Sequenz, die aus dem Vektor pET3a/H2-K^d-directHcRed1 stammt, zeigt wieder die Abfolge der Aminosäuren der letzten 12 AS des MHC-Moleküls und der ersten 12 AS einer HcRed-Variante (in kursiv). Dazwischen befindet sich ein Epitop-Tag, der als Linker fungieren kann und der ausserdem über seine Fähigkeit, spezifische Antikörper zu binden, nachgewiesen werden kann (in fett gedruckt).
KLPPSTVSNTAS Q P E L A P E D P E D G G H D SSYSGLLKESMR The next sequence, which originates from the vector pET3a / H2-K ^d -directHcRed1, again shows the sequence of the amino acids of the last 12 AA of the MHC molecule and the first 12 AA of an HcRed variant (in italics). In between there is an epitope tag, which can act as a linker and also over his Ability to bind specific antibodies can be demonstrated (printed in bold).
KLPPSTVSNTAS QPELAPEDPEDGGHD SSYSGLLKESMR

Für eine detaillierte Darstellung der MHC-HcRed1-Expressionskassette wird auf l und 2 verwiesen. HcRed1-MHC-Fusionsproteine wurden in pET3a (Novagen) Vektoren kloniert und anschließend in die Expressionsbakterien BL21(DE3) transformiert. Auch ohne gezielte Expressionsinduktion kann in diesem System eine geringe Generierung des rekombinanten Proteins beobachtet werden. Die Herstellung großer Mengen an rekombinanten MHC-HcRed1 Fusionproteinen konnte sowohl unter Verwendung der Originalsequenz von HcRed1, als auch unter Verwendung von HcRed1-Mutanten erreicht werden. Rekombinante MHC Klasse-I Moleküle werden i.d.R. durch in vitro Rückfaltung der in „inclusion bodies" exprimierten und aufgereinigten Teilkomponenten (Schwerekette und β₂-Mikroglobulin) in Gegenwart hoher Konzentrationen des jeweiligen MHC-bindenen Peptids (Epitop) hergestellt. Exprimiert man HcRed1 in gleicher weise in „inclusion bodies" und führt eine identische Aufreinigung und Rückfaltung in vitro durch, so erhält man ein farbgebendes Protein, daß alle Charakteristika von korrekt gefaltetem HcRed1-Fluoreszenzprotein hat.For a detailed presentation of the MHC-HcRed1 expression cassette, click on l and 2 directed. HcRed1-MHC fusion proteins were cloned into pET3a (Novagen) vectors and then transformed into the BL21 (DE3) expression bacteria. Even without specific expression induction, a low generation of the recombinant protein can be observed in this system. The production of large amounts of recombinant MHC-HcRed1 fusion proteins could be achieved using the original sequence of HcRed1 as well as using HcRed1 mutants. Recombinant MHC class I molecules are usually produced by in vitro refolding of the partial components expressed and purified in inclusion bodies (heavy chain and β ₂ -microglobulin) in the presence of high concentrations of the respective MHC-binding peptide (epitope). If HcRed1 is expressed in the same way in "inclusion bodies" and carries out an identical purification and refolding in vitro, a color-producing protein is obtained which has all the characteristics of correctly folded HcRed1 fluorescent protein.

Zusammengefaßt zeigen diese Daten, daß zwei wesentliche Grundvoraussetzungen für den erfolgreiche Einsatz von HcRed1-MHC Multimeren gegeben sind:

(1) Große Mengen an MHC-HcRed1-Fusionsprotein können im bakteriellen Expressionssystem hergestellt werden; dabei zeigt sich bereits bei in vivo Expression die „Funktionalität" des HcRed1-Anteils im Fusionsprotein durch die typische farbgebende Charakteristik.
(2) HcRed1-Fluoreszenzprotein kann unter den für die Herstellung von löslichen MHC-Molekülen optimierten Bedingungen aus „inclusion bodies" generiert werden.

In summary, these data show that there are two essential prerequisites for the successful use of HcRed1-MHC multimers:

(1) Large amounts of MHC-HcRed1 fusion protein can be produced in the bacterial expression system; the "functionality" of the HcRed1 component in the fusion protein is already evident in in vivo expression due to the typical coloring characteristic.
(2) HcRed1 fluorescence protein can be generated from “inclusion bodies” under the conditions optimized for the production of soluble MHC molecules.

Tabelle 1:

Table 1:

SEQUENCE LISTING

SEQUENCE LISTING

Claims

MHC multimer containing two or more MHC molecules and a multimerizing agent, characterized in that the multimerizing agent is a chromoprotein, with DsRedl being excluded as a multimerizing agent.

MHC multimer according to claim 1, wherein the chromoprotein a β-barrel or β-can-like Has structure.

MHC multimer according to claim 1 or 2, wherein the chromoprotein is extracted from corals.

MHC multimer according to one or more of claims 1-3, where the chromoprotein from AmCyanl, ZsGreen1, ZsYellow1, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRed1 is selected.

MHC multimer according to one or more of claims 1-4, wherein the multimerizing agent is a recombinant chromoprotein is.

MHC multimer according to one or more of the preceding Expectations, the chromoprotein over a linker molecule is coupled to the MHC protein.

MHC multimer according to one or more of the preceding Expectations, being the linker molecule several amino acids consists.

MHC multimer according to claim 7, wherein the linker from a sequence according to SEQ ID NO. 1-8 selected is.

MHC multimer according to claim 7, characterized in that this linker molecule is designed so that a Cleavage of the MHC molecules made possible by chromoprotein becomes.

MHC multimer according to claims 7-9, characterized in that this linker molecule a recognition sequence for contains a protease.

MHC multimer according to one or more of the preceding Expectations, characterized in that the MHC molecule is truncated.

MHC multimer according to one or more of the preceding Expectations, characterized in that the MHC molecule truncated by deletion of the transmembrane and / or the cytosol portion is.

MHC multimer according to one or more of the preceding Expectations, characterized in that it in the form of an epitope-specific chromoprotein-MHC-peptide complex, optionally in conjunction with a T cell receptor.

MHC multimer according to one or more of the preceding Expectations, characterized in that the MHC molecule a mammal, is preferably mouse or human MHC molecule.

MHC multimer according to one or more of the preceding Expectations, characterized in that it additionally contains one or more β-microglobulin molecules.

MHC monomer fusion protein, characterized in that it in combination with a chromoprotein suitable for multimerization, optionally connected via a linker molecule, is present, with DsRed1 being excluded as a multimerization agent.

The fusion protein of claim 16, wherein the chromoprotein a β-barrel or β-can-like Has structure.

The fusion protein of claim 16 or 17, wherein the Chromoprotein is extracted from corals.

Fusion protein according to one or more of claims 16-18, where the chromoprotein from AmCyanl, ZsGreen1, ZsYellow1, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRed1 is selected.

Fusion protein according to one or more of claims 16-19, being the MHC molecule is truncated.

The fusion protein of claim 20, wherein the MHC molecule is by Deletion of the transmembrane and / or the cytosol portion truncated is.

Fusion protein according to one or more of claims 16-21, that in addition contains one or more β-microglobulin molecules.

DNA that is for encodes a fusion protein according to one of claims 16-22.

RNA, which after transcription is a fusion protein Claims 16-23 results.

Containing prokaryotic cell or eukaryotic cell a DNA or RNA according to one or more of the preceding claims.

Use of a chromoprotein as a means of multimerization of MHC molecules, with the exception of DsRedl.

Use according to claim 26, wherein the chromoprotein a β-barrel or β-can type Has structure.

Use according to claim 26 or 27, wherein the chromoprotein is extracted from corals.

Use according to one or more of claims 26-28, where the chromoprotein from AmCyanl, ZsGreen1, ZsYellow1, DsRed2, DsRed-Express, AsRed2, HcRed1 is selected.

Process for the preparation of a fusion protein according to claims 16-22, characterized in that a) one for an MHC protein coding DNA, optionally via a left, with one for a DNA encoding a chromoprotein to one encoding a fusion protein DNA linked and the fusion protein is expressed; or on MHC protein, optionally via a linker that is linked to a chromoprotein to form a fusion protein; b) the fusion protein is optionally purified.

Process for the production of an MHC multimer, characterized in that a) one for DNA encoding an MHC protein, optionally via a linker, with a for a DNA encoding chromoprotein into one encoding a fusion protein DNA linked and the fusion protein is expressed; or on MHC protein, optionally via a linker that is linked to a chromoprotein to form a fusion protein; b) the fusion protein is optionally purified; c) the MHC fusion protein, optionally multimerized in the presence of the antigen-specific peptides becomes.

A method according to claim 31, characterized in that the Multimerization takes place in the presence of beta-2 microglobulin.

Procedure for examining an antigen-specific cellular Immune response, characterized in that a) an MHC multimer or its monomeric form according to one or more of the preceding Claims with T cells, preferably with CD8 + T cells, in the presence of a peptide contacted to obtain T-antigen-MHC multimers; b) the multimers obtained are detected, preferably by a Flow cytometry method or other detection methods suitable for the detection of fluorescence emissions, such as fluorescence microscopy or fluorescence scanning methods.

A method according to claim 33, characterized in that a) the T cells are used in whole blood or PBLs, or b) the T cells from lymph nodes or extralymphoid tissues be used.

Test system containing MHC monomers or MHC multimers according to one or more of the preceding claims.

Use of MHC multimers after one or more of the preceding claims for examining an antigen-specific immune response, for detection or for sorting T cells that are specifically T cell receptors on their surface wear, and for further use of T cells obtained in this way for recycling a patient.