DE102009058169B4

DE102009058169B4 - Protein or polypeptide for binding to tubulin and / or microtubule structures

Info

Publication number: DE102009058169B4
Application number: DE200910058169
Authority: DE
Inventors: Patentinhaber gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-12-15
Filing date: 2009-12-15
Publication date: 2012-06-28
Anticipated expiration: 2029-12-16
Also published as: DE102009058169A1; WO2011072647A1

Abstract

Protein oder Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend e) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder eine Teilsequenz davon; oder f) eine von SEQ ID NO: 3 durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, wobei das Protein oder Polypeptid mindestens einen lysinreichen Sequenzbereich umfasst und an Tubulin bindet.Protein or polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group comprising e) an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3 or a partial sequence thereof; or f) a sequence derived from SEQ ID NO: 3 by substitution, insertion or deletion of amino acids, the protein or polypeptide comprising at least one lysine-rich sequence region and binding to tubulin.

Description

Die Erfindung betrifft ein Protein oder Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend

a) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder eine Teilsequenz davon; oder
b) eine von SEQ ID NO: 3 durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz,

wobei das Protein oder Polypeptid mindestens einen lysinreichen Sequenzbereich umfasst und an Tubulin bindet. Vorzugsweise bezieht sich die Erfindung auf einen Biomarker für Tubulin, sowie auf einen Mikrotransporter zur Einbringung von Wirkstoffen in Zellen, umfassend das Protein oder Polypeptid gemäß Anspruch 1.The invention relates to a protein or polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group comprising

a) an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3 or a partial sequence thereof; or
b) a sequence derived from SEQ ID NO: 3 by substitution, insertion or deletion of amino acids,

wherein the protein or polypeptide comprises at least one lysine-rich sequence region and binds to tubulin. Preferably, the invention relates to a biomarker for tubulin, as well as to a microtransporter for delivery of drugs into cells, comprising the protein or polypeptide according to claim 1.

Mikrotubuli sind neben Mikrofilamenten und Intermediärfilamenten ein wichtiger Bestandteil der Zytoskelettstruktur eukaryontischer Zellen. Das Zytoskelett erfüllt nicht nur statische, strukturelle Aufgaben, es ist auch an der Entwicklung und der Funktion einzelner Zelltypen maßgeblich beteiligt. Grundbaustein der hohlzylindrisch aufgebauten Mikrotubuli sind Protofilamente, welche vornehmlich aus α- und β-Tubulin Heterodimeren gebildet werden. Im Zentrosom der Zelle wird zudem auch γ-Tubulin exprimiert, welches an der Bildung neuer Mikrotubuli im Zentrosombereich beteiligt ist. Mikrotubuli bilden das Gerüst für intrazelluläre Transportprozesse und sind an der Bildung des Spindelapparats während der Zellteilung maßgeblich beteiligt. Der Auf- und Abbauprozess der Mikrotubuli ist sehr dynamisch und wird durch das MTOC (microtubule organizing center) zentral gesteuert.In addition to microfilaments and intermediary filaments, microtubules are an important part of the cytoskeleton structure of eukaryotic cells. The cytoskeleton not only performs static, structural tasks, it is also involved in the development and function of individual cell types. The basic building block of the hollow-cylindrical microtubules are protofilaments, which are predominantly formed from α- and β-tubulin heterodimers. In the centrosome of the cell also γ-tubulin is expressed, which is involved in the formation of new microtubules in the centrosome region. Microtubules form the framework for intracellular transport processes and are involved in the formation of the spindle apparatus during cell division. The microtubule assembly and disassembly process is very dynamic and centrally controlled by the MTOC (microtubule organizing center).

Ein intaktes Zytoskelett, insbesondere eine intakte Mikrotubulistruktur ist physiologisch von großer Bedeutung, um den korrekten Transport und eine gleichmäßige Verteilung verschiedener wichtiger Proteine und Zellorganellen zu gewährleisten. Defekte in der Funktionalität der Mikrotubulistrukturen oder deren assoziierten Proteinen können zu schwere Krankheiten wie beispielsweise Alzheimer führen. Zudem werden Chemotherapeutika, wie Vinblastin oder Paclitaxel gezielt eingesetzt, um den korrekten Aufbau von Mikrotubuli in Krebszellen zu stören. Eine unkontrollierte Zellteilung wird dadurch gehemmt. Für das bessere Verständnis der Zytoskelettstrukturen und dem möglichen Einfluss von Medikamenten auf Mikrotubuli ist es von erheblicher Bedeutung, Zytoskelettstrukturen, insbesondere Mikrotubulistrukturen und ihre Veränderungen in Zellen nachzuweisen.An intact cytoskeleton, especially an intact microtubule structure, is physiologically important in order to ensure the correct transport and uniform distribution of various important proteins and cell organelles. Defects in the functionality of the microtubule structures or their associated proteins can lead to serious diseases such as Alzheimer's disease. In addition, chemotherapeutic agents such as vinblastine or paclitaxel are used selectively to disrupt the correct assembly of microtubules in cancer cells. An uncontrolled cell division is thereby inhibited. For a better understanding of the cytoskeletal structures and the possible influence of drugs on microtubules, it is of considerable importance to detect cytoskeletal structures, especially microtubule structures, and their changes in cells.

Im Stand der Technik sind bereits spezifische Antikörper bekannt, die zum Nachweis von Tubulin in vitro oder in vivo verwendet werden können. WO 2007/095359 A2 offenbart beispielsweise den Nachweis von Tubulin in Zellen durch die Antikörper DM1-α, YL1-2 und 3A2. Dem Fachmann sind viele weitere tubulinspezifische Antikörper bekannt. Der Nachweis von Tubulin und damit auch Mikrotubulistruturen mit Hilfe von Antikörper hat jedoch grundsätzlich einen erheblichen Nachteil. Der Nachweis über Antikörper muss in der Regel in einem mehrschrittigen Verfahren durchgeführt werden. Hierzu wird zunächst ein tubulinspezifischer Primärantikörper an Tubulin gebunden. Dieser wird dann einem zweiten Schritt mit einem gegen den Primärantikörper gerichteten, chemisch markierten Sekundärantikörper über Fluorochrome oder andere chemische Markierungen detektiert. Zwar können spezifische Antikörper auch direkt chemisch markiert werden – beispielsweise mit einem fluoreszierenden Molekül oder einem Enzym – jedoch ist diese Methode sehr aufwendig, kostenintensiv und meist in ihrer Sensitivität unbefriedigend.Specific antibodies are already known in the art which can be used to detect tubulin in vitro or in vivo. WO 2007/095359 A2 for example, discloses the detection of tubulin in cells by the antibodies DM1-α, YL1-2 and 3A2. Many further tubulin-specific antibodies are known to the person skilled in the art. However, the detection of tubulin and thus also microtubule suspensions with the aid of antibodies generally has a considerable disadvantage. The detection of antibodies usually has to be carried out in a multi-step procedure. For this purpose, a tubulin-specific primary antibody is first bound to tubulin. This is then detected in a second step with a directed against the primary antibody, chemically labeled secondary antibody via fluorochromes or other chemical markers. Although specific antibodies can also be directly chemically labeled - for example, with a fluorescent molecule or an enzyme - but this method is very expensive, expensive and usually unsatisfactory in their sensitivity.

Es besteht daher die Notwendigkeit, ein schnelleres, jedoch auch hinsichtlich des Kostenaufwands und der Nachweisgenauigkeit optimiertes Nachweismittel für Tubulin, bzw. Mikrotubulistrukturen bereitzustellen.

1. Gelöst wird die obenstehende Aufgabe durch die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids nach Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend
c) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder eine Teilsequenz davon; oder
d) eine von SEQ ID NO: 3 durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz,

wobei das Protein oder Polypeptid mindestens einen lysinreichen Sequenzbereich umfasst und an Tubulin bindet.. SEQ ID NO: 3 betrifft die Aminosäuren 20 bis 78 des N-terminalen Bereichs des humanen peroxisomalen Biogenesefaktors PEX14. Erfindungsgemäß ist auch ein Teilbereich aus diesem Abschnitt für die Bindung ausreichend, insbesondere sofern er zwei lysinreiche Sequenzbereiche aufweist, d. h. Sequenzbereiche in denen mindestens ein Lysinrest vorhanden ist. Ebenso ist erfindungsgemäß eine Aminosäuresequenz geeignet, sofern sie eine durch Substitution, Insertion oder Addition von Aminosäuren abgewandelte Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 umfasst. Bevorzugt sind die die Lysinreste umgebenden Sequenzbereiche reich an den Aminosäuren Alanin, Threonin und Arginin.There is therefore a need to provide a faster, but also in terms of cost and accuracy of detection optimized detection means for tubulin, or Mikrotubulistrukturen.

1. The above object is achieved by providing the protein or polypeptide according to the invention of claim 1, comprising an amino acid sequence selected from the group comprising
c) an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3 or a partial sequence thereof; or
d) a sequence derived from SEQ ID NO: 3 by substitution, insertion or deletion of amino acids,

wherein the protein or polypeptide comprises at least one lysine-rich sequence region and binds to tubulin. SEQ ID NO: 3 relates to amino acids 20 to 78 of the N-terminal region of the human peroxisomal biogenesis factor PEX14. According to the invention, a partial region from this section is also sufficient for the binding, in particular if it has two lysine-rich sequence regions, ie sequence regions in which at least one lysine radical is present. Likewise, an amino acid sequence according to the invention is suitable provided that it comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 modified by substitution, insertion or addition of amino acids. Preferably, the sequence regions surrounding the lysine residues are rich in the amino acids alanine, threonine and arginine.

Unter einem lysinreichen Sequenzbereich ist ein Sequenzbereich zu verstehen, der mindestens einen Lysinrest, bevorzugt jedoch mehrere, in unmittelbarer Nähe angeordnete Lysinreste aufweist. Erfindungsgemäß handelt es sich um ein künstlich hergestelltes Polypeptid oder um ein isoliertes Protein oder einen daraus isolierten Unterabschnitt. A lysine-rich sequence region is to be understood as meaning a sequence region which has at least one lysine residue, but preferably a plurality of lysine residues arranged in the immediate vicinity. According to the invention, it is an artificially produced polypeptide or an isolated protein or a subsection isolated therefrom.

Überraschenderweise wurde in Laboruntersuchungen festgestellt, dass der peroxisomale Biogenesefaktor PEX14 mit hoher Affinität an Tubulin bindet. Die Untersuchungen zeigten, dass der Bindungsbereich des Proteins an Tubulin mindestens einen Sequenzabschnitt aufweist, der lysinhaltig ist. Dieser Sequenzabschnitt ist entscheidend an der Bindung des peroxisomalen Biogenesefaktors PEX14 an Tubulin beteiligt. Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid umfasst mindestens einen solchen lysinreichen Sequenzabschnitt. Vorteilhafterweise kann das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid biochemisch markiert werden und so unmittelbar als Biomarker zum Nachweis von Tubulinstrukturen eingesetzt werden. Ebenso ist auch die Kopplung an einen medizinischen Wirkstoff möglich, der in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid seinen Wirkort in der Zelle erreichen kann.Surprisingly, it has been found in laboratory studies that the peroxisomal biogenesis factor PEX14 binds to tubulin with high affinity. The investigations showed that the binding region of the protein to tubulin has at least one sequence segment which contains lysine. This sequence section plays a crucial role in the binding of the peroxisomal biogenesis factor PEX14 to tubulin. The protein or polypeptide according to the invention comprises at least one such lysine-rich sequence segment. Advantageously, the protein or polypeptide according to the invention can be biochemically labeled and thus used directly as a biomarker for the detection of tubulin structures. Likewise, the coupling to a medicinal agent is possible, which can reach its site of action in the cell in conjunction with the protein or polypeptide according to the invention.

Die Erfindung betrifft auch ein Protein oder Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4. Diese Sequenz betrifft die Aminosäuren 1–78 des N-terminalen Bereichs des humanen peroxisomalen Biogenesefaktors PEX14.The invention also relates to a protein or polypeptide comprising an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 4. This sequence relates to amino acids 1-78 of the N-terminal region of the human peroxisomal biogenesis factor PEX14.

Bevorzugt bildet das Protein oder Polypeptid eine dreidimensionale Struktur aus, welche mindestens drei α-Helices umfasst. Die Bindung an Tubulin ist optimal, wenn die drei α-Helices in etwa U-förmig angeordnet sind. Sie können durch eine vierte diagonale Helix stabilisiert werden. Ein Beispiel einer bevorzugt ausgebildeten dreidimensionalen Struktur des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids ist in abgebildet.Preferably, the protein or polypeptide forms a three-dimensional structure comprising at least three α-helices. Binding to tubulin is optimal when the three α-helices are approximately U-shaped. They can be stabilized by a fourth diagonal helix. An example of a preferably designed three-dimensional structure of the protein or polypeptide according to the invention is disclosed in displayed.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform liegt das Protein oder Polypeptid in seiner Bindung an Tubulin als Dimer vorliegt. Bevorzugt liegt das Protein oder Polypeptid an Glutathion-S-Transferase (GST) gekoppelt vor. GST fördert die Bildung von Dimeren fördert. Die Dimerisierung findet erfindungsgemäß bereits vor der Bindung an das Zielprotein Tubulin statt. Beispielsweise handlet es sich bei dem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid um ein Fusionsprotein umfassend GST und die an Tubulin bindende Aminosäuresequenz.In another embodiment, the protein or polypeptide is present as a dimer in its binding to tubulin. Preferably, the protein or polypeptide is coupled to glutathione-S-transferase (GST). GST promotes the formation of dimers promotes. According to the invention, the dimerization already takes place before the binding to the target protein tubulin. For example, the protein or polypeptide of the present invention is a fusion protein comprising GST and the tubulin-binding amino acid sequence.

Das Protein oder Polypeptid weist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine hohe Dissoziationskonstante auf. Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid bindet damit mit hoher Affinität an Tubulin.The protein or polypeptide has a high dissociation constant according to a preferred embodiment of the invention. The protein or polypeptide according to the invention thus binds to tubulin with high affinity.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Protein oder Polypeptid mit mindestens einem heterologen Molekül gekoppelt. Das Protein oder Polypeptid kann dabei über den C- oder den N-Terminus der Aminosäurekette, sowie auch über Seitenketten einzelner Aminosäuren mit dem heterologen Molekül verknüpft sein. Eine Verknüpfung mit mehreren gleichartigen oder untereinander verschiedenen heterologen Molekülen ist möglich. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid als Fusionsprotein mit dem heterologen Molekül vorliegen.In one embodiment of the invention, the protein or polypeptide is coupled to at least one heterologous molecule. The protein or polypeptide can be linked to the heterologous molecule via the C- or the N-terminus of the amino acid chain, as well as via side chains of individual amino acids. A linkage with several similar or mutually different heterologous molecules is possible. For example, the protein or polypeptide of the invention may be present as a fusion protein with the heterologous molecule.

Erfindungsgemäß kann das heterologe Molekül ein Markermolekül sein. Dieses kann fluoreszierende Eigenschaften aufweisen, wie z. B. FITC (Fluoreszeinisothiocyanat). Ein fluoreszierendes Markermolekül ist bevorzugterweise ein Polypeptid, beispielsweise GFP (green fluorescent Protein), YFP (yellow fluorescent Protein), CFP (cyan fluorescent Protein), BFP (blue fluorescent Protein) oder drFP583 (red fluorescent Protein). Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid als Fusionsprotein vorliegen, wobei es mit GFP oder YFP am C-Terminus der Aminosäurenkette verbunden ist. Erfindungsgemäß ist jedes andere fluoreszierende Polypeptid ebenfalls zur Kopplung an das Protein oder Polypeptid geeignet.According to the invention, the heterologous molecule can be a marker molecule. This may have fluorescent properties, such as. B. FITC (fluorescein isothiocyanate). A fluorescent marker molecule is preferably a polypeptide, for example GFP (green fluorescent protein), YFP (yellow fluorescent protein), CFP (cyan fluorescent protein), BFP (blue fluorescent protein) or drFP583 (red fluorescent protein). For example, the protein or polypeptide of the invention may be present as a fusion protein, being linked to GFP or YFP at the C-terminus of the amino acid chain. In the invention, any other fluorescent polypeptide is also suitable for coupling to the protein or polypeptide.

Des Weiteren kann das Markermolekül in einer anderen Ausführungsform der Erfindung auch ein nicht-fluoreszierendes Markermolekül sein. Als nicht-fluoreszierende Markermoleküle werden alle Markermoleküle bezeichnet, die kein fluoreszierende Markierung, sondern einen durch einen chemische Reaktion hervorgerufene farbige Reaktion auf dem Versuchsmedium erzeugen. Diese werden üblicherweise lichtmikroskopisch nachgewiesen. Insbesondere sind hier Peroxidasen, NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid), welches mit BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) farbig reagiert, oder DAB (Diaminobenzidin) zu nennen. Jeder andere histochemische Farbstoff ist ebenfalls als nicht-fluoreszierendes Markermolekül geeignet. Das nicht-fluoreszierende Markermolekül kann beispielsweise in Form eines Fusionsproteins zusammen mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid vorliegen.Furthermore, in another embodiment of the invention, the marker molecule may also be a non-fluorescent marker molecule. Non-fluorescent marker molecules are all marker molecules which do not produce a fluorescent label but produce a colored reaction on the test medium caused by a chemical reaction. These are usually detected by light microscopy. In particular, peroxidases, NBT (nitro blue tetrazolium chloride), which reacts with BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate) in color, or DAB (diaminobenzidine) are mentioned here. Any other histochemical dye is also suitable as a non-fluorescent marker molecule. The non-fluorescent marker molecule can be present, for example, in the form of a fusion protein together with the protein or polypeptide according to the invention.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäß Protein oder Polypeptid an einen medizinischen Wirkstoff gekoppelt. Dieser kann erfindungsgemäß unmittelbar an das Protein oder Polypeptid gekoppelt sein oder über ein weiteres Molekül, z. B. einem so genannten Linker, mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid verbunden sein. Ein Markermolekül kann bei einer besonderen Ausführungsform der Erfindung zusätzlich zu dem medizinischen Wirkstoff an das Protein oder Polypeptid gekoppelt sein. Ebenso ist es möglich, dass das zusätzliche Markermolekül nicht an das Protein oder Polypeptid selbst, sondern an den medizinischen Wirkstoff gekoppelt ist, welcher mit dem Protein oder Polypeptid verbunden ist. In a further embodiment of the invention, the protein or polypeptide according to the invention is coupled to a medicinal active substance. This can be coupled according to the invention directly to the protein or polypeptide or via another molecule, for. As a so-called linker, be connected to the protein or polypeptide of the invention. A marker molecule in a particular embodiment of the invention may be coupled to the protein or polypeptide in addition to the medicinal agent. Likewise, it is possible that the additional marker molecule is not coupled to the protein or polypeptide itself, but to the medicinal agent that is linked to the protein or polypeptide.

Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Verwendung eines Proteins oder Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 als Biomarker zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen. Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid kann zur Herstellung eines Biomarkers verwendet werden. Dieser kann kostengünstig direkt mit einem Markermolekül markiert werden. So kann der Biomarker direkt und schnell zur Darstellung von Mikrotubulistrukturen eingesetzt werden. Dies ist nicht nur in der Grundlagenforschung zur weiteren Erforschung des Cytoskeletts und seiner assoziierten Proteine von Bedeutung, sondern insbesondere auch in der Diagnose von ungewöhnlichen Mikrotubulistrukturen aufgrund von Tumorbildungen oder anderen krankhaften Veränderungen von Zellen. Mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Peptid liegt ein kostengünstiger Biomarker vor, der eine spezifische Markierung von Tubulin gewährleistet. Der Biomarker lässt sich vorteilhafterweise sowohl in lebenden als auch in fixierten Zellen zur Darstellung von Mikrotubulistrukturen verwenden. Auch aufgereinigte Mikrotubulistrukturen können unabhängig von einer Zellumgebung detektiert werden. Er ist erfindungsgemäß ebenso dazu geeignet, den Mikrotubuli-Baustein Tubulin zu markieren. So findete der Biomarker ebenfalls Verwendung in Zelllysaten, ELISA-Assays oder membranbasierten Versuchen.The invention particularly relates to the use of a protein or polypeptide according to any one of claims 1 to 10 as a biomarker for the detection of tubulin and / or Mikrotubulistrukturen. The protein or polypeptide of the invention may be used to produce a biomarker. This can be marked inexpensively directly with a marker molecule. Thus, the biomarker can be used directly and quickly for the representation of microtubule structures. This is important not only in basic research for the further investigation of the cytoskeleton and its associated proteins, but in particular also in the diagnosis of unusual microtubule structures due to tumor formation or other lesions of cells. With the protein or peptide according to the invention is a cost-effective biomarker, which ensures a specific labeling of tubulin. The biomarker can be advantageously used both in living and in fixed cells for the representation of microtubule structures. Purified microtubule structures can also be detected independently of a cellular environment. It is also suitable according to the invention for labeling the microtubule building block tubulin. Thus, the biomarker also found use in cell lysates, ELISA assays or membrane-based experiments.

Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid kann zudem als Bestandteil eines Mikrotransporters zur Einbringung von Wirkstoffen in Zellen genutzt werden. Dabei kann die Shuttle-Funktion des Proteins oder Polypeptids genutzt werden. Durch seine Bindungseigenschaft an Tubulin können so medizinische oder andere Wirkstoffe zielgerichtet an ihren Wirkort, z. B. die Mikrotubuli einer Zelle transportiert werden. Das Protein oder Polypeptid kann somit auch zu therapeutischen Zwecken, beispielsweise in der Krebstherapie eingesetzt werden.The protein or polypeptide according to the invention can also be used as part of a microtransporter for introducing active substances into cells. In this case, the shuttle function of the protein or polypeptide can be used. By virtue of its binding property to tubulin, medicinal or other active ingredients can be targeted to their site of action, eg. B. the microtubules of a cell are transported. The protein or polypeptide can thus also be used for therapeutic purposes, for example in cancer therapy.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Biomarkers zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen. Erfindungsgemäß wird dazu zunächst ein Konstrukt erstellt, welches eine entsprechende Nukleinsäure kodierend für ein Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 umfasst. Zusätzlich umfasst das Konstrukt eine für ein Markermolekül kodierenden Nukleinsäure, sowie alle weiteren Faktoren, die zur korrekten Expression des Biomarkers benötigt werden, wie beispielsweise Promotoren oder Enhancer. Zur Expression des Konstrukts wird dieses in geeignete Empfängerzellen transfiziert. Als geeignete Empfängerzellen sind im Rahmen der Erfindung alle gängigen Klonierungszelllnien zu verstehen, insbesondere Zellen des Bakteriums Escherichia coli, jedoch sind auch Zellen pilzlicher Herkunft oder Algenzellen zur Klonierung geeignet. Nach Selektion erfolgreich transformierter Zellen und deren Vermehrung wird der Biomarker umfassend das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid sowie ein aus den Empfängerzellen aufgereinigt. Der Biomarker liegt dann beispielsweise in Form eines Fusionsproteins vor, welches zum direkten Nachweis von Tubulin eingesetzt werden kann.The invention also provides a method for producing a biomarker for the detection of tubulin and / or microtubule structures. According to the invention, a construct is first prepared for this purpose, which comprises a corresponding nucleic acid encoding a protein or polypeptide according to one of claims 1 or 2. In addition, the construct comprises a nucleic acid encoding a marker molecule, as well as any other factors needed for the correct expression of the biomarker, such as promoters or enhancers. For expression of the construct, this is transfected into suitable recipient cells. Suitable recombinant cells in the context of the invention are all common cloning cells, in particular cells of the bacterium Escherichia coli, but also cells of fungal origin or algal cells are suitable for cloning. After selection of successfully transformed cells and their multiplication, the biomarker comprising the protein or polypeptide according to the invention and one from the recipient cells is purified. The biomarker is then, for example, in the form of a fusion protein, which can be used for the direct detection of tubulin.

Das Konstrukt kann erfindungsgemäß zusätzlich eine Nukleinsäure kodierend für einen Protein-Tag umfassen. Im Rahmen der Erfindung ist jeder Protein-Tag, der die Aufreinigung des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids ermöglicht geeignet Insbesondere ist hier der Protein-Tag Glutathion-S-Transferase (GST) zu erwähnen. Vorteilhafterweise fördert GST die Dimerisierung seiner fusionierten Proteine.The construct according to the invention may additionally comprise a nucleic acid encoding a protein tag. In the context of the invention, any protein tag which makes possible the purification of the protein or polypeptide according to the invention is suitable. In particular, the protein tag glutathione-S-transferase (GST) should be mentioned here. Advantageously, GST promotes dimerization of its fused proteins.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen, Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid gekoppelt an ein Markermolekül wird in einem ersten Schritt zu lebenden Zellen, fixierten Zellen oder Zellfraktionen zugegeben. Im Falle von intakten Zellen wird vorausgesetzt, dass die Membran der Zellen durchlässig für das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid ist oder dafür durchlässig gemacht wurde. Anschließend wird eine Hybridisierung des erfindungsgemäßen Biomarkers an Tubulin durchgeführt. Dabei ist es unerheblich, ob das Tubulin als Bestandteil von Mikrotubulistrukturen oder als Protein frei in einer Lösung oder gebunden an eine Membran vorliegt. Das hybridisierte Protein oder Polypeptid wird nach entsprechenden Waschschritten je nach gewünschter Stringenz detektiert. Die Detektion kann in Form einer Visualisierung stattfinden. Die Detektion erfolgt bevorzugt mikroskopisch mit entsprechend dem Markermolekül angepassten Lichtquellen.The invention also relates to a method for the detection of tubulin and / or microtubule structures. The protein or polypeptide according to the invention coupled to a marker molecule is added in a first step to living cells, fixed cells or cell fractions. In the case of intact cells, it is assumed that the membrane of the cells is permeable to, or rendered permeable to, the protein or polypeptide of the invention. Subsequently, a hybridization of the biomarker according to the invention to tubulin is carried out. It is irrelevant whether the tubulin is present as a component of Mikrotubulistrukturen or as protein freely in a solution or bound to a membrane. The hybridized protein or polypeptide is detected after appropriate washing steps depending on the desired stringency. The detection can take place in the form of a visualization. The detection is preferably carried out microscopically with light sources adapted to the marker molecule.

Die Erfindung betrifft zudem ein Kit zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen umfassend ein Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10. Das Kit umfasst das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid, welches bereits mit einem Markermolekül in Form eines Fusionsproteins verbunden ist. Alternativ wird das Protein oder Polypeptid separat zu einem Marker bereitgestellt. Das Kit umfasst diese Bestandteile erfindungsgemäß als einsatzbereite Lösungen oder in konzentrierter Form. Auch umfasst das Kit ein Anweisung für den Verwender. Optional sind zudem weitere Lösungen, beispielsweise Pufferlösungen in dem erfindungsgemäßen Kit enthalten.The invention also relates to a kit for the detection of tubulin and / or microtubule structures comprising a protein or polypeptide according to any one of claims 1 to 10. The kit comprises the inventive Protein or polypeptide which is already linked to a marker molecule in the form of a fusion protein. Alternatively, the protein or polypeptide is provided separately to a marker. The kit comprises these components according to the invention as ready-to-use solutions or in concentrated form. Also, the kit includes an instruction for the user. Optionally, further solutions, for example buffer solutions are contained in the kit according to the invention.

Des Weiteren betrifft die Erfindung eine rekombinante eukaryontische Zelle, die mit einem Konstrukt transfiziert oder stabil transformiert ist, welches mindestens eine Nukleinsäure umfasst, die für das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 kodiert. Die korrekte Expression des Konstrukts wird durch entsprechende Promotoren oder andere zusätzliche Faktoren gewährleistet. Das in die rekombinante eukaryontische Zelle transfizierte oder stabil transformierte Konstrukt umfasst gemäß einer Ausführungsform der Erfindung auch eins Nukleinsäure kodierend für ein Markermolekül, beispielsweise GFP oder YFP, die operativ mit der Nukleinsäure kodierende für das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid verbunden ist.Furthermore, the invention relates to a recombinant eukaryotic cell which is transfected or stably transformed with a construct which comprises at least one nucleic acid which codes for the protein or polypeptide according to any one of claims 1 or 2. Correct expression of the construct is ensured by appropriate promoters or other additional factors. According to one embodiment of the invention, the construct transfected or stably transformed into the recombinant eukaryotic cell also comprises one nucleic acid coding for a marker molecule, for example GFP or YFP, which is operatively linked to the nucleic acid coding for the protein or polypeptide according to the invention.

Ein zellbasiertes Screeningsystem für medizinische Wirkstoffe ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Das Screeningsystem kann beispielsweise in Form eines Kits vorliegen und umfasst erfindungsgemäß die oben beschriebenen rekombinanten eukaryontischen Zellen.A cell-based screening system for medicinal agents is also an object of the invention. The screening system can be present for example in the form of a kit and according to the invention comprises the above-described recombinant eukaryotic cells.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Screeningverfahren für medizinische Wirkstoffe, in welchem die beschriebenen rekombinanten eukaryontischen Zellen zum Einsatz kommen. Dabei werden rekombinante eukaryontische Zellen umfassend mindestens ein Konstrukt mit einer Nukleinsäure kodierend für ein erfindungsgemäßes Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 bereitgestellt. Nach Zugeben mindestens eines medizinischen Wirkstoffes zu den rekombinanten eukaryontischen Zellen reagieren die Zellen mit diesem. Gegebenenfalls müssen die Zellen für den Wirkstoff entsprechend durchlässig gemacht werden. Der Einfluss des Wirkstoffs auf die in der Zelle vorhandenen Mikrotubulistrukturen, bzw. frei vorliegendes Tubulin wird anschließend ausgewertet. Bevorzugt erfolgt die Auswertung mikroskopisch. Beispielsweise ist jedoch auch eine Sortierung nach lebenden und abgestorbenen Zellen (z. B. durch FACS – fluorescent activated cell sorting) möglich.The invention also provides a screening method for medicinal active ingredients in which the described recombinant eukaryotic cells are used. In this case, recombinant eukaryotic cells comprising at least one construct with a nucleic acid encoding a protein or polypeptide according to the invention according to one of claims 1 or 2 are provided. After adding at least one medicinal agent to the recombinant eukaryotic cells, the cells react with it. Optionally, the cells must be made permeable to the active ingredient accordingly. The influence of the active ingredient on the microtubule structures present in the cell or free tubulin is subsequently evaluated. Preferably, the evaluation is carried out microscopically. However, sorting for living and dead cells (eg by FACS - fluorescent activated cell sorting) is also possible, for example.

Beispiel 1example 1

Das Konstrukt GST-PEX14(1-78) und Fusionsproteine mit fluoreszierenden Proteinen (z. B. GST-eYFP-PEX14(1-78) Aminosäuren 1 bis 78 des humanen peroxisomalen Biogenesefaktors PEX14 gekoppelt an Glutathion-S-Transferase und den Fluoreszenzmarker enhanced Yellow Fluorescent Protein) wurden in pGEX4T1-Vektoren kloniert. Die Expression erfolgte über Nacht bei 20°C mit 1 mM IPTG. Die GST-Fusionsproteine wurden mittels Glutathion-Sepharose 4B (GE Healthcare) nach Herstellerangaben aufgereinigt.The construct GST-PEX14 (1-78) and fusion proteins with fluorescent proteins (e.g., GST-eYFP-PEX14 (1-78) amino acids 1-78 of the human peroxisomal biogenesis factor PEX14 coupled to glutathione-S-transferase and the fluorescence label enhanced Yellow Fluorescent Protein) were cloned into pGEX4T1 vectors. Expression was overnight at 20 ° C with 1 mM IPTG. The GST fusion proteins were purified by Glutathione-Sepharose 4B (GE Healthcare) according to the manufacturer's instructions.

Für die Fluoreszenzmikroskopie wurden eine humane Fibroblastenzelllinie, eine Astrozytenzelllinien (Ratte), primäre Nervenzellenkulturen des Rattenkleinhirns und der Spinalganglien des Huhns, sowie einzelne Trypanosomen genutzt:For fluorescence microscopy, a human fibroblast cell line, an astrocyte cell line (rat), primary neuronal cultures of the rat cerebellum and the dorsal root ganglia of the chicken, and individual trypanosomes were used:

Humane Fibroblasten:Human fibroblasts:

GM5756T (SV-40 transformed GM5756, Corial Cell Repository, Camden NJ)
Medium:
DMEM High Glucose (PAA)
+ 10% FCS (Gibco)
+ Pen / Strep (Gibco)
+ 2mM L-glutamine (PAA)
Culture Conditions
37 ° C; 8.5% CO 2

Rollkulturen Körnerzellen bzw. Purkinjezellen:Roll cultures of granule cells or Purkinje cells:

Sagitalschnitte (400 μm) von Ratten (Postnataltag10) wurden als Rollkulturen für 16 Tage kultiviert und mit 4% Formaldehyd fixiert. Aufgrund der größeren Schichtdicke gegenüber den Monolayer-Kulturen wurden alle Inkubationszeiten des Färbeprotokolls verdoppelt.

(Meller, Krah, Theiss, 2005, Development Brain Research 160: 101–105)

Sagittal sections (400 μm) of rats (postnatal day10) were cultured as roll cultures for 16 days and fixed with 4% formaldehyde. Due to the greater layer thickness compared to the monolayer cultures, all incubation times of the staining protocol were doubled.

(Meller, Krah, Theiss, 2005, Development Brain Research 160: 101-105)

Astrocyten: astrocytes:

isolated from rat cortex cell line.
(Theiss & Heller, 2002, Cell & Tissue Research 310: 143-154)

Chicken DRG (dorsal root ganglion, Spinalganglion)Chicken DRG (dorsal root ganglion, spinal ganglion)

Aus Hühnchen (Embryonaltag 10) explantierte Spinalganglienneurone wurden für 3 Tage kultiviert und mit 4% Formaldehyd fixiert.

(Theiss & Meller, 2001, Journal of Neurocytology 30: 59–71)

Spinal ganglia neurons explanted from chicken (embryonic day 10) were cultured for 3 days and fixed with 4% formaldehyde.

(Theiss & Meller, 2001, Journal of Neurocytology 30: 59-71)

Sämtliche Lösungen für die Detektion von Mikrotubulistrukturen der o. g. Zellen wurden in D'PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) angesetzt. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt.All solutions for the detection of microtubule structures o. G. Cells were seeded in D'PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline). All steps were carried out at room temperature (RT).

Die Zellen wurden, soweit nicht anders angegeben, mit 3% Formaldehyd für 20 min oder 2% Glutaraldehyd für 30 min fixiert, anschließend mit 1% Triton-X100 für 5 min solubilisiert, worauf unspezifische Anbindungsstellen mit einer 3%-igen BSA-Lösung (bovines Serumalbumin) blockiert wurden. Zwischen diesen Inkubationsschritten wurde jeweils dreimal mit D'PBS gewaschen. Zwischen den folgenden Inkubationsschritten wurde jeweils dreimal für 5 Minuten mit 0,1% BSA in D'PBS gewaschen. Die Inkubationen mit dem Biomarker (10–1000 ng/μl) in 0,1% BSA erfolgten für 30 min. Für Marker ohne Fluoreszenzmarkierung erfolgte eine weitere Inkubation mit einem monoklonalen anti-GST-Primär- und einem fluoreszenzmarkierten Sekundär-Antikörper (Alexa 488 bzw. Alexa 594). Anschließend wurden die Zellen dreimal für 5 Minuten mit 0,1% BSA in D'PBS und zweimal mit D'PBS gewaschen und mit Mowiol-Einbettmedium auf Objektträgern eingedeckelt.Unless otherwise stated, the cells were fixed with 3% formaldehyde for 20 min or 2% glutaraldehyde for 30 min, then solubilized with 1% Triton-X100 for 5 min, whereupon nonspecific attachment sites with a 3% BSA solution ( bovine serum albumin) were blocked. Between these incubation steps, three times each was washed with D'PBS. Between the following incubation steps, each was washed three times for 5 minutes with 0.1% BSA in D'PBS. The incubations with the biomarker (10-1000 ng / μl) in 0.1% BSA were carried out for 30 min. For markers without fluorescence labeling, a further incubation was carried out with a monoclonal anti-GST primary and a fluorescently labeled secondary antibody (Alexa 488 or Alexa 594). The cells were then washed three times for 5 minutes with 0.1% BSA in D'PBS and twice with D'PBS and capped with slides on Mowiol embedding medium.

Zur weiteren Überprüfung der korrekten Markierung von Mikrotubuli wurden außerdem Doppelmarkierungen mit dem oben beschriebenen rekombinanten Protein sowie kommerziellen, spezifischen Tubulin-Antikörpern durchgeführt. Das Protokoll entspricht dem vorgestellten, wobei die Mikrotubuli mit Hilfe des Zweischrittverfahrens (Primär- und Sekundärantikörper) immunhistochemisch dargestellt wurden.In order to further verify the correct labeling of microtubules, double-labeling was also performed with the recombinant protein described above as well as commercial specific tubulin antibodies. The protocol corresponds to the one presented, in which the microtubules were displayed immunohistochemically using the two-step method (primary and secondary antibodies).

Das folgende Protokoll beschreibt die einzelnen Schritte des Nachweisverfahrens für Mikrotubuli:

1. Zellen 3x waschen mit D'PBS (Gibco)
2. Fixierung mit 4% Formaldehyd 4% Glutaraldehyd für 20 min
3. 2x waschen mit D'PBS
4. Permeabilisierung der Zellmembran mit 1% Triton-X100 für 5 min
5. 2x waschen mit D'PBS
6. Blockieren von unspezifischen Bindungen mit 3% BSA
7. Inkubation mit dem neuen Tubulin-Marker (0,2 μg/μl) bzw. Erstantikörper (1:200) in 0,1% BSA für 30 min
8. 3x für je 5 min Waschen mit 0,1% BSA
9. Inkubation mit Zweitantikörper (1:200) für 30 min
10. 3x für je 5 min Waschen mit 0,1% BSA
11. 2x waschen mit D'PBS
12. Deckgläschen auf Objektträger mounten (Mowiol)

The following protocol describes the individual steps of the microtubule detection method:

1. Wash cells 3x with D'PBS (Gibco)
2. fixation with 4% formaldehyde 4% glutaraldehyde for 20 min
3. Wash 2x with D'PBS
4. Permeabilization of cell membrane with 1% Triton-X100 for 5 min
5. Wash 2x with D'PBS
6. Block unspecific binding with 3% BSA
7. Incubation with the new tubulin marker (0.2 μg / μl) or first antibody (1: 200) in 0.1% BSA for 30 min
8. 3x for 5 min each wash with 0.1% BSA
9. Incubation with second antibody (1: 200) for 30 min
10. 3x for 5 min each wash with 0.1% BSA
11. Wash 2x with D'PBS
12. Mount coverslips on microscope slides (Mowiol)

Für die Verwendung des erfindungsgemäßen Biomarkers GST-eYFP-PEX14(1-78) entfallen die Schritte 8 und 9.For the use of the biomarker GST-eYFP-PEX14 (1-78) according to the invention, steps 8 and 9 are omitted.

Bei Verwendung von GST-PEX14(1-78), also ohne fluoreszierenden Fusionsanteil, werden insgesamt drei Inkubationsschritte (GST-PEX14N, anti-GST-Erstantikörper, fluoreszenzmarkierter Zweitantikörper) entsprechend den Schritten 7 und 8 bzw. 9 und 10 durchgeführt.When using GST-PEX14 (1-78), ie without fluorescent fusion, a total of three incubation steps (GST-PEX14N, anti-GST first antibody, fluorescently labeled second antibody) are performed according to steps 7 and 8 or 9 and 10 respectively.

Bei Fixierung mit Methanol wird an Stelle von Schritt 2 für 5 Minuten mit –20°C-kaltem Methanol-Fixationsreagenz (90% (v/v) Methanol, 10 mM MES pH6,9; 0,1 mM EGTA, 0,1 mM MgCl₂) inkubiert, die Permeabilisierung der Zellmembran (Schritte 3 und 4) ist nicht notwendig.When fixed with methanol, instead of step 2 for 5 minutes with -20 ° C cold methanol fixative reagent (90% (v / v) methanol, 10 mM MES pH6.9, 0.1 mM EGTA, 0.1 mM MgCl ₂ ) is incubated, permeabilization of the cell membrane (steps 3 and 4) is not necessary.

Soweit nicht anders angegeben wurde immer mit Formaldehyd fixiert und nach obigem Protokoll markiert. Bei der Färbung der Rollkulturen (Körnerzellen bzw. Purkinje-Zellen) wurden jedoch alle Inkubationszeiten verdoppelt.Unless otherwise stated, it was always fixed with formaldehyde and labeled according to the above protocol. However, in the staining of the roll cultures (granule cells or Purkinje cells) all incubation times were doubled.

Zum mikroskopischen Nachweis der Mikrotubulistrukturen wurde ein Zeiss LSM 510 meta konfokales Laserscanning Mikroskop verwendet. Zur Vergrößerung wurden die Objektive Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil, Plan-Neofluar 40x/1.3 Oil und Plan-Neofluar 10x/0.3 verwendet. Die Fluoreszenzmarkierung eYFP (enhanced Yellow Fluorescent Protein) wurde bei den Wellenlängen 514 nm (Anregung) und 530–600 nm (Emission) nachgewiesen. Für den Sekundärantikörper Alexa 594 (rot) wurden die Wellenlängen 543 nm (Anregung) und 585 nm (Emission) genutzt. Für Fluorescein wurden die Wellenlängen 488 nm (Anregung) und 505–550 nm (Emission) genutzt.For microscopic detection of microtubule structures, a Zeiss LSM 510 meta confocal laser scanning microscope was used. To magnify the objectives Plan-Apochromat 63x / 1.4 Oil, Plan Neofluar 40x / 1.3 Oil and Plan Neofluar 10x / 0.3 used. The fluorescence label eYFP (enhanced Yellow Fluorescent Protein) was detected at the wavelengths 514 nm (excitation) and 530-600 nm (emission). For the secondary antibody Alexa 594 (red), the wavelengths 543 nm (excitation) and 585 nm (emission) were used. For fluorescein, the wavelengths 488 nm (excitation) and 505-550 nm (emission) were used.

Zusammenfassend ist für die oben dargestellten Nachweisverfahren Folgendes festzuhalten:
Der erfindungsgemäße Biomarker PEX14(1-78) wurde in Form von GST-Fusionsproteinen rekombinant in E. coli exprimiert und mit Hilfe des GST-Tags aufgereinigt. Zur Fluoreszenzmarkierung wurde entweder zusätzlich ein eYFP-Fusionsanteil exprimiert (GST-eYFP-PEX14(1-78)), oder das aufgereinigte GST-PEX14(1-78) wurde an den exponierten Cystein-Resten des GST-Fusionsanteils spezifisch mit 5-Iodoaceto-Fluorescein (5-IAF) markiert.In summary, for the detection methods presented above, the following should be stated:
The biomarker PEX14 (1-78) according to the invention was expressed recombinantly in E. coli in the form of GST fusion proteins and purified by means of the GST tag. For fluorescent labeling, either an eYFP fusion moiety was expressed (GST-eYFP-PEX14 (1-78)) or the purified GST-PEX14 (1-78) was specific to 5-iodoaceto on the exposed cysteine residues of the GST fusion moiety Fluorescein (5-IAF) labeled.

Die getesteten Zellen wurden mit einem üblichen Protokoll für Immunofluoreszenz behandelt, wobei der erfindungsgemäße Biomarker wie ein Antikörper verwendet wurde, allerdings ohne Inkubation mit einem Zweitantikörper, da der Biomarker bereits fluoreszenzmarkiert war.The cells tested were treated with a standard protocol for immunofluorescence using the biomarker of the invention as an antibody, but without incubation with a second antibody, since the biomarker was already fluorescently labeled.

In allen getesteten Zellen konnten mit Hilfe des erfindungsgemäßen Biomarkers Mikrotubuli mit einer sehr guten Qualität markiert werden. In allen Fällen wurde das humane PEX14(1-78) verwendet. Der Marker kann demnach speziesübergreifend verwendet werden, was insbesondere bei den evolutionär weit vom Menschen entfernten Trypanosomen erwähnenswert ist. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der Marker sowohl als fluoreszierendes Fusionsprotein (GST-eYFP-PEX14(1-78)) als auch mit einem chemischen Fluoreszenzlabel (5-IAF) gleichermaßen verwendbar ist.In all cells tested microtubules could be labeled with a very good quality using the biomarker according to the invention. In all cases, the human PEX14 (1-78) was used. The marker can therefore be used cross-species, which is particularly worth mentioning in the evolutionary far from human trypanosomes. In addition, it has been shown that the marker is equally useful as both a fluorescent fusion protein (GST-eYFP-PEX14 (1-78)) and a chemical fluorescent label (5-IAF).

Zum Nachweis, dass es sich bei den markierten Strukturen tatsächlich um Mikrotubuli handelt. wurde in einigen Fällen die Mikrotubuli zusätzlich mit anti-Tubulin-Antikörper markiert. Die Doppelmarkierungen zeigen eine nahezu identische Markierung von Mikrotubuli mit dem neuen Marker und mit den Antikörpern.To prove that the labeled structures are indeed microtubules. In some cases, the microtubules were additionally labeled with anti-tubulin antibody. The double labels show a nearly identical labeling of microtubules with the new marker and with the antibodies.

Beispiel 2Example 2

Zur genaueren Charakterisierung der Bindungsbereiche von PEX14(1-78) an Tubulin wurde ein so genannter Peptide Scan durchgeführt. Peptide Scans werden zur Darstellung spezifischer Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt.For a more detailed characterization of the binding regions of PEX14 (1-78) to tubulin, a so-called peptide scan was performed. Peptide scans are used to visualize specific protein-protein interactions.

Zur Lokalisierung spezifischer Bindungsstellen wurde jedes zweite 15mer-Peptid von PEX14(1-78) synthetisiert und auf einer Zellulose-Membran fixiert, Kontrollversuche zeigten, dass die verwendeten Antikörper nicht mit den synthetischen Peptiden kreuzreagierten (Daten nicht dargestellt). Die auf der Membran fixierten 15-mer-Peptide wurden dann mit 1 nM reinem Tubulin inkubiert und mit Anti-Tubulin-Antikörpern hybridisiert.To localize specific binding sites, every other 15mer peptide from PEX14 (1-78) was synthesized and fixed on a cellulose membrane; control experiments showed that the antibodies used did not cross-react with the synthetic peptides (data not shown). The 15-mer peptides fixed on the membrane were then incubated with 1 nM of pure tubulin and hybridized with anti-tubulin antibodies.

Wie in dargestellt, hybridisierten einige der 15-mer-Peptide mit Tubulin und geben damit einen Hinweis auf den Bindungsbereich des PEX14(1-78) an Tubulin. Der Peptide Scan zeigt, dass Tubulin im Sequenzbereich der Aminosäuren 1–33 und 58–78 nicht bindet. Eine hohe Bindungsaffinität an Tubulin wurde jedoch insbesondere bei den Peptiden festgestellt, die Lysin an Position 34 des PEX14(1-78) enthalten. Ebenso konnte eine gute Bindung an Tubulin bei Peptiden festgestellt werden, die Phenylalanin an Position 52 des PEX14(1-78) enthalten. Die Intensität der Bindung war besonders stark bei Peptiden, die Phenylalanin an Position 52 und Lysinreste an den Positionen 54, 55 und 56 des PEX14(1-78) enthalten. Die Intensität der Hybridsierung der 15-mer-Peptide an Tubulin nahm ab, sobald kein Alanin, Threonin und Arginin in unmittelbarer Nähe zu Lysin (34) und Phenylalanin (52) vorhanden war. Dies zeigt, dass möglicherweise auch Alanin, Threonin und Arginin eine wichtige Rolle bei der Bindung des PEX14(1-78) an Tubulin spielen, womöglich sind sie für eine korrekte Faltung des Peptids oder für den freien Zugang von Lysin an Tubulin notwendig.As in As shown, some of the 15-mer peptides hybridized with tubulin, giving an indication of the binding range of PEX14 (1-78) to tubulin. The peptide scan shows that tubulin does not bind in the sequence region of amino acids 1-33 and 58-78. However, a high binding affinity for tubulin was found particularly in the peptides containing lysine at position 34 of PEX14 (1-78). Likewise, good binding to tubulin was found in peptides containing phenylalanine at position 52 of PEX14 (1-78). The intensity of binding was particularly strong in peptides containing phenylalanine at position 52 and lysine residues at positions 54, 55 and 56 of PEX14 (1-78). The intensity of hybridization of the 15-mer peptides to tubulin decreased as soon as alanine, threonine and arginine were present in close proximity to lysine (34) and phenylalanine (52). This indicates that alanine, threonine and arginine may also play an important role in the binding of PEX14 (1-78) to tubulin, possibly being necessary for correct folding of the peptide or for free access of lysine to tubulin.

Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids sowie seiner Verwendung als Biomarker werden zusätzlich durch die folgenden bis verdeutlicht:Exemplary embodiments of the protein or polypeptide according to the invention and of its use as a biomarker are additionally described by the following to clarifies:

zeigt die dreidimensionale Struktur des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids bezogen auf die aus dem humanen peroxisomalen Biogenesefaktor PEX14 stammenden Aminosäuren 20 bis 78. Wie aus der Darstellung ersichtlich ist, sind drei α-Helices U-förmig zueinander angeordnet. Eine vierte diagonale Helix stabilisiert die U-förmige Struktur. shows the three-dimensional structure of the protein or polypeptide according to the invention based on the amino acids 20 to 78 derived from the human peroxisomal biogenesis factor PEX14. As can be seen from the illustration, three α-helices are arranged in a U-shape relative to one another. A fourth diagonal helix stabilizes the U-shaped structure.

zeigt Zellen aus dem Spinalganglion des Huhns (Gallus gallus). Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Biomarkerkonstrukts GST-eYFP-PEX14(1-78) (Aminosäuren 1 bis 78 des humanen peroxisomalen Biogenesefaktors PEX14 gekoppelt an Glutathion-S-Transferase und den Fluoreszenzmarker enhanced Yellow Fluorescent Protein) wurden Mikrotubulistrukturen in diesen Zellen fluoreszenzgefärbt. Auf dem rechten Bild ist ein Wachstumskegel mit hoher Auflösung sichtbar. shows cells from the spinal ganglion of the chicken (gallus gallus). With the aid of the biomarker construct GST-eYFP-PEX14 (1-78) according to the invention (amino acids 1 to 78 of the human peroxisomal biogenesis factor PEX14 coupled to glutathione S-transferase and the fluorescence marker-enhanced yellow fluorescent protein), microtubule structures were fluorescence-stained in these cells. On the right image a growth cone with high resolution is visible.

zeigt die Anfärbung von Mikrotubulistrukturen in Fibroblasten des Huhns (Gallus gallus) durch Hybridisierung des Biomarkerkonstrukts GST-eYFP-PEX14(1-78) an Tubulin. shows the staining of microtubule structures in chicken fibroblasts (Gallus gallus) by hybridization of the biomarker construct GST-eYFP-PEX14 (1-78) to tubulin.

zeigt die Anfärbung von Mikrotubulistrukturen an Astrozyten aus der Ratte (Rattus rattus) durch Hybdrisierung des Biomarkerkonstrukts GST-eYFP-PEX14(1-78) an Tubulin. shows the staining of microtubule structures on rat astrocytes (Rattus rattus) by hybridization of the biomarker construct GST-eYFP-PEX14 (1-78) to tubulin.

zeigt die Markierung von Mikrotubuli in humanen Fibroblasten (GM5756) mit GST-PEX14N, welches nach der Aufreinigung mit 5-IAF (5-Iodoaceto-Fluorescein, Sigma-Aldrich) nach Herstellerangaben an Cysteinen gelabelt wurde. shows the labeling of microtubules in human fibroblasts (GM5756) with GST-PEX14N, which was labeled after the purification with 5-IAF (5-iodoaceto-fluorescein, Sigma-Aldrich) according to the manufacturer on cysteines.

zeigt Mikrotubuli in humane Fibroblasten (GM5756), die mit GST-eYFP-PEX14(1-78) markiert wurden. Figure 4 shows microtubules in human fibroblasts (GM5756) labeled with GST-eYFP-PEX14 (1-78).

zeigt Mikrotubuli in einem Körnerzellen-Präparat (Ratte), die mit GST-eYFP-PEX14(1-78) markiert wurden. shows microtubules in a granule preparation (rat) labeled with GST-eYFP-PEX14 (1-78).

zeigt Mikrotubuli in Trypanosomen (T. brucei), welche gleichzeitig mit GST-eYFP-PEX14(1-78) und mit Anti-Tubulin-Antikörpern, sowie einem roten Sekundärantikörper markiert wurden, Die linke Spalte zeigt die eYFP-Markierung, die mittlere Spalte zeigt die Markierung mit Anit-Tubulin-Antikörpern und rotem Sekundärantikörper. Die rechte Spalte zeigt die Überlagerung des ersten und des zweiten Nachweisverfahrens. shows microtubules in trypanosomes (T. brucei) simultaneously labeled with GST-eYFP-PEX14 (1-78) and with anti-tubulin antibodies, as well as a red secondary antibody. The left column shows the eYFP label, the middle column shows the label with anti-tubulin antibodies and red secondary antibody. The right column shows the superimposition of the first and second detection methods.

zeigt das Ergebnis der Hybridisierung von 1 nM reinem Tubulin an eine mit 15-mer-Peptiden aus PEX14(1-78) besetzte Membran. Die Detektion erfolgte mit Anti-Tubulin-Antikörpern (1:3000). Auf der rechten Seite sind die Aminosäuresequenzen der 15-mer-Peptide schematisch dargestellt. Eine starke Hybridisierung von Tubulin zeigt sich insbesondere bei den 15-mer-Peptiden A3, B3, C3, D3 und A4 – diese enthalten Lysin an der ursprünglichen Position 34 von PEX14(1-78). Eine starke Bindung an Tubulin zeigt sich auch bei den 15-mer-Peiltiden E4, A5, B5, C5, D5 und E5 – diese enthalten Phenylalanin an der ursprüngliche Position 52 von PEX14(1-78) und zudem 3 Lysinreste an den urprünglichen Positionen 54, 55 und 56. shows the result of hybridization of 1 nM pure tubulin to a membrane populated with 15-mer peptides from PEX14 (1-78). The detection was carried out with anti-tubulin antibodies (1: 3000). On the right side, the amino acid sequences of the 15-mer peptides are shown schematically. A strong hybridization of tubulin is particularly evident in the 15-mer peptides A3, B3, C3, D3 and A4 - these contain lysine at the original position 34 of PEX14 (1-78). Strong binding to tubulin is also evident in the 15-mer peptides E4, A5, B5, C5, D5 and E5 - these contain phenylalanine at the original position 52 of PEX14 (1-78) and also 3 lysine residues at their original positions 54, 55 and 56.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.This is followed by a sequence protocol according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can be downloaded from the official publication platform of the DPMA.

Claims

A protein or polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group comprising e) an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3 or a partial sequence thereof; or f) a sequence derived from SEQ ID NO: 3 by substitution, insertion or deletion of amino acids, wherein the protein or polypeptide comprises at least one lysine-rich sequence region and binds to tubulin.

A protein or polypeptide according to any one of the preceding claims comprising an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 4.

Protein or polypeptide according to one of the preceding claims, characterized in that the protein or polypeptide forms a three-dimensional structure comprising at least three α-helices.

Protein or polypeptide according to one of the preceding claims, characterized in that the protein or polypeptide is present in its binding to tubulin as a dimer.

Protein or polypeptide according to one of the preceding claims, characterized in that the protein or polypeptide is coupled to at least one heterologous molecule.

Protein or polypeptide according to claim 5, characterized in that the heterologous molecule is a marker molecule.

Protein or polypeptide according to claim 6, characterized in that the marker molecule is a fluorescent marker molecule.

Protein or polypeptide according to claim 7, characterized in that the fluorescent marker molecule is a polypeptide.

A protein or polypeptide according to claim 8, characterized in that the polypeptide is a fluorescent polypeptide selected from the group comprising GFP, YFP, CFP, BFP, drFP583 or another fluorescent polypeptide.

A protein or polypeptide according to claim 6, characterized in that the marker molecule is a non-fluorescent marker molecule selected from the group comprising peroxidases, NBT-BCIP, DAB or another non-fluorescent marker molecule.

Protein or polypeptide according to claim 6, characterized in that the heterologous molecule is a medicinal agent which is directly or indirectly coupled to the protein or polypeptide.

Protein or polypeptide according to claim 11, characterized in that the protein or polypeptide is additionally coupled to a marker molecule.

Use of a protein or polypeptide according to any one of claims 1 to 10 as a biomarker for the detection of tubulin and / or Mikrotubulistrukturen.

Use of a protein or polypeptide according to claim 13 in living cells or fixed cells or cell fractions or membrane-based assays.

Use of a protein or polypeptide according to claim 11 as a component of a microtransporter for introducing active substances into cells.

Method for producing a biomarker for the detection of tubulin and / or microtubule structures comprising the following steps: a) cloning a construct comprising a nucleic acid encoding a protein or polypeptide according to any one of claims 1 or 2 and a nucleic acid coding for a marker molecule in a vector; b) transfecting the vector into a recipient cell, especially in E. coli; c) increasing the transfected cells; d) Purification of the biomarker from the recipient cells.

A method according to claim 16, characterized in that the construct comprises a nucleic acid encoding a protein tag, in particular a nucleic acid encoding the protein-tag glutathione-S-transferase, with the nucleic acid encoding the protein or polypeptide according to any one of claims 1 or 2 is operatively linked.

Method for the detection of tubulin and / or microtubule structures comprising the following steps: a) adding a protein or polypeptide according to any one of claims 5 to 10 to living cells or fixed cells or cell fractions; b) carrying out a hybridization of the protein or polypeptide according to any one of claims 9 to 14 to tubulin; c) detecting the hybridized protein or polypeptide.

Kit for the detection of tubulin and / or microtubule structures comprising a protein or polypeptide according to one of claims 1 to 10.

Recombinant eukaryotic cell, characterized in that the cell is transfected or stably transformed with a construct comprising at least one nucleic acid coding for the protein or polypeptide according to one of claims 1 or 2.

A recombinant eukaryotic cell according to claim 20, characterized in that the construct comprises a marker molecule-encoding nucleic acid operably linked to the nucleic acid encoding the protein or polypeptide according to claim 1 or 2.

A cell-based medical drug screening system comprising recombinant eukaryotic cells according to claim 20 or 21.

Screening method for medical agents comprising the following steps: a) providing recombinant eukaryotic cells according to claim 20 or 21; b) adding at least one medicinal agent; c) Evaluation of the reaction result.