DE10216772A1 - Verfahren zur verlustfreien Einführung von Hydrokolloiden in Sporopollenin-Mikrokapseln - Google Patents

Description

• Die Bindung von hydrophilen Polymeren bzw. Kolloiden (Hydrokolloiden) an gut filtrierbare Trägerpartikeln ist für verschiedene biotechnologische Prozesse, insbesondere die Biokatalyse und Chromatographie, von Bedeutung. Werden die Hydrokolloide kovalent oder adsorptiv an die Trägerpartikeln gebunden, ist mit einer Begrenzung der Bindungskapazität der Trägerpartikeln durch die Menge der zugänglichen reaktiven Gruppen oder die zugängliche Oberfläche zu rechnen. Bei der Verkapselung, z. B. in Polyelektrolyt-Komplex-Kapseln kann eine sehr hohe Kapazität der Trägerbindung erreicht werden, da ein beträchtlicher Volumenanteil des Trägers als Verteilungsraum für die zu immobilisierenden Hydrokolloide genutzt wird. Der Einschluss in Mikrokapseln erfolgt im allgemeinen durch Membranbildung an der Oberfläche kleiner Tropfen, die das zu immobilisierende Hydrokolloid enthalten. Mikrokapseln mit eingeschlossenen Enzymen können potentiell als filtrierbare Biokatalysatoren eingesetzt werden. Hierbei wird der Vorteil der hohen Enzymkonzentration, die bei einer Verkapselung erreichbar ist, nur dann voll wirksam, wenn die Mikrokapseln sehr klein sind. Bei Kapseln einer Größe von 0,2 mm bis zu einigen Millimetern, wie sie bei der gegenwärtig verfügbaren Technologie im präparativen Maßstab herstellbar sind, ist der Umsatz der immobilisierten Enzyme bei hohen Enzym-Konzentrationen diffusionslimitiert. Die Herstellung sehr kleiner Mikrokapseln (unter 50 µm) durch Umhüllung von Polymerphasen ist im präparativen Maßstab mit den allgemein verfügbaren Technologien nicht möglich. Da mit den gegenwärtigen Verkapselungsverfahren durch Membrancoating keine druckfesten sondern nur deformierbare Mikrokapseln entstehen, sind der Verkleinerung der Mikrokapseln nicht allein durch die Herstellungsverfahren sondern auch durch die notwendige Filtrierbarkeit technische Grenzen gesetzt. Die Gefahr der Filterverstopfung im Scherfeld des fließenden Mediums nimmt bekanntlich mit abnehmender Partikelgröße zu. Die Chromatographie stellt noch höhere Anforderungen an die Geschwindigkeit des Diffusionsaustausches und die mechanische Stabilität der Kapseln in der durchströmten Packung als die Biokatalyse mit trägerfixierten Enzymen. Die Herstellung von kleinen und gleichzeitig gut filtrierbaren Mikrokapseln mit eingeschlossenen Hydrokolloiden für die Anwendung in einem scherdruckbelasteten durchströmten Festbett ist bisher technisch nicht befriedigend gelöst. Spezifische Hydrokolloide werden daher für die Chromatographie bisher vor allem durch Trägerbindung an die Oberfläche von druckfesten Partikeln nutzbar gemacht.
• Im Gegensatz zu künstlichen Mikrokapseln, die durch Membranbildung an der Grenze zweier Phasen entstehen, besitzen bestimmte biologisch entstandene, poröse Mikrokapseln, die aus dem Sporopollenin der Pollenexine bestehen, bei geringem Partikeldurchmesser sehr gute strömungsmechanische Eigenschaften. Sie können aus verdünnten wäßrigen Lösungen getrocknet werden, ohne dabei zu verkleben, wobei die Flüssigphase eingesaugt wird. Werden die Sporopolleninkapseln in dünner Schicht, z. B. auf einer Glasplatte an der Luft oder in geringen Mengen aus wäßriger Lösung getrocknet, wird beim Verdampfen des Lösungsmittels die Flüssigphase durch die Keimporen in das Lumen der Kapsel gezogen, so daß die Flüssigphase im Inneren der Kapsel trocknet. Die Festigkeit der Sporopolleninwand ist ausreichend, um unter diesen Bedingungen der Kohäsionsspannung bzw. der Gasdurchbruchspannung durch die Keimpore zu widerstehen, so daß beim Trocknen der Hohlraum erhalten bleibt. Auf diese Weise können Polymere in gut filtrierbaren Mikrokapseln eingeschlossen werden (Ehwald, R., Woehlecke, H. und Lerche, D., Offenlegungsschrift DE 199 02 724).
• Die verlustfreie Bindung von Polymeren an Sporopolleninkapseln durch deren Trocknung aus der Polymerlösung ist jedoch im präparativen Maßstab technisch aufwändig. Wird die Trocknung bei höheren Schichtdicken im Rotationsverdampfer oder in einem Schichttrockner durchgeführt, kommt es auf Grund der Kohäsion des Wassers zur Bildung feuchter Klumpen oder Aggregate. Hierbei werden die Kapseln kohäsionsbedingt zusammengepresst. Daher werden die Hydrokolloide nicht vollständig in den Hohlraum gezogen, sondern sie verbleiben z. T. zwischen den Mikrokapseln, die hierdurch verkleben.
• Die trocknungsbedingte Einführung der Polymeren in die Sporopolleninkapseln kann durch Sprühtrocknung oder Wirbelschichttrocknung ohne Bildung größerer Klumpen erfolgen. Diese Verfahren sind aber bekanntlich nur bei relativ großen Produktmengen ökonomisch. Es steht kein bekanntes Trocknungsverfahren zur Verfügung, mit dessen Hilfe das Einführen und Aufkonzentrieren wäßriger Hydrokolloide in Sporopolleninkapseln im präparativen Maßstab mit einfachen Laborgeräten durchgeführt werden kann. Mit Hilfe der Sprühtrocknung und der Wirbelschichttrocknung ist es nicht möglich, den Konzentrierungsvorgang kontrolliert bis zu einem bestimmten Wassergehalt zu führen, so daß die Hydrokolloide nach verlustfreier Einführung in die poröse Sporopolleninkapsel als wäßrige Lösung oder Dispersion vorliegen.
• Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dessen Hilfe polymere Hydrokolloide im präparativen Maßstab (g bis kg Mengen) mit einfachen Laborgeräten aus einer wäßrigen Lösung oder Dispersion verlustfrei in Sporopolleninkapseln eingeführt und konzentriert werden können. Das angestrebte Verfahren soll die Möglichkeit bieten, daß die wäßrige Polymerphase verlustfrei in die Mikrokapseln auch ohne vollständige Entwässerung eingeführt und dort konzentriert werden.
• Das Verfahren nutzt erfindungsgemäß die bisher nicht in der Literatur beschriebene und nicht erwartete experimentelle Beobachtung, daß Sporopollenin mit Wasser, Butanol, Ethanol, anderen Alkoholen, Aceton und zahlreichen amphiphilen und hydrophoben organischen Flüssigkeiten gut benetzbar ist und mit bestimmten amphiphilen organischen Flüssigkeiten eine geringere Oberflächenspannung aufweist als mit Wasser. Werden Sporopolleninkapseln daher mit einer wäßrigen Lösung oder Dispersion von Hydrokolloiden und einer geeigneten mit Wasser nur begrenzt mischbaren organischen amphiphilen Flüssigkeit dispergiert, wird das Sporopollenin mit der organischen Phase benetzt. Geeignet für das Verfahren sind mit Wasser nur begrenzt mischbare organische Flüssigkeiten, die in der Mischung mit Wasser zwei Phasen bilden, von denen die wäßrige Phase das Sporopollenin schlechter benetzt als die organische Phase. Geeignet sind nach der bisherigen Erfahrung z. B. Butanol, Isobutanol sowie Mischungen aus einem Alkan, Ester oder Ether und n-Propanol. Zweifellos gibt es, unter den amphiphilen organischen Flüssigkeiten noch zahlreiche andere, die für das Verfahren geeignet sind, weil sie mit Wasser nicht unbegrenzt mischbar sind und das Sporopollenin besser benetzen als Wasser. Werden die Sporopolleninkapseln in einem Zweiphasensystem, bestehend aus der geeigneten organischen Flüssigkeit und einer wäßrigen Lösung oder Dispersion des einzuführenden Hydrokolloids suspendiert, befinden sich Tröpfchen der wäßrigen Phase mit den Hydrokolloiden innerhalb und außerhalb der Kapseln. Heftiges Rühren und langsamer Zusatz einer wasserbindenden organischen Flüssigkeit führen zum vorübergehenden Auftreten sehr kleiner Tröpfchen und Mizellen in der wasserhaltigen Polymerphase außerhalb der Kapseln, die durch die Makroporen in das Kapselinnere gelangen und sich dort mit den Tröpfchen im konvektionsfreien Innenraum der Kapseln vereinigen. Dieser bisher nicht bekannte Vorgang kann durch Zusatz eines Detergenz beschleunigt werden und wird erfindungsgemäß zur verlustfreien Einführung hydrophiler Kolloide in die Sporopolleninkapseln genutzt. Als wasserlösende organische Flüssigkeit kann die gleiche organische Flüssigkeit verwendet werden, die zur Herstellung der Ausgangsdispersion verwendet wurde. In diesem Fall wird sie wasserfrei oder mit einem deutlich unter dem Sättigungswert liegenden Wassergehalt eingesetzt, um das Volumen der wäßrigen Phase zu reduzieren. Es ist jedoch ebenfalls möglich eine mit Wasser unbegrenzt lösliche, wasserarme organische Flüssigkeit, z. B. Ethanol, Isopropanol oder Methanol einzusetzen, weil der Zusatz dieser Flüssigkeiten ebenfalls dazu führt, daß das Volumen der wäßrigen Phase reduziert wird. Das Verfahren ist nur deshalb möglich, weil die Poren in den Sporopolleninkapseln ausreichend groß für die Permeation der Wassertröpfchen mit den gelösten Hydrokolloiden bzw. der wasserhaltigen kolloidalen Mizellen sind. Die Einführung in die Kapseln ist mit dem Aufkonzentrieren der Hydrokolloide verbunden.
• Besonders günstig gestaltet sich das Verfahren, wenn trockene Mikrokapseln erfindungsgemäß vor dem Zusatz der organischen Flüssigkeit zu der wäßrigen kolloidhaltigen Phase hinzugesetzt werden, bis eine viskose, breiartige Masse entsteht. Es wurde festgestellt, daß die leicht geschrumpften Kapseln nach Zugabe der amphiphilen organischen Flüssigkeit, z. B. wassergesättigtes n-Butanol, quellen, wobei in jeder Kapsel ein Tropfen mit der wäßrigen Polymerphase entsteht. Diese Tropfen binden in der gerührten Suspension die noch außerhalb der Kapsein befindliche fein dispergierte wäßrige Phase mit den gelösten Hydrokolloiden, wenn durch die allmähliche Zugabe einer Wasser lösenden organischen Flüssigkeit das Volumen der wäßrigen Phase insgesamt reduziert wird. Die Einführung der Hydrokolloide erfolgt verlustfrei, wenn sie sich in der organischen Phase nicht lösen oder dispergieren lassen und das Volumen der wäßrigen Phase durch Zusatz der wasserlösenden organischen Flüssigkeit soweit reduziert wird, daß die wäßrige Phase außerhalb der Kapseln vollständig verschwindet. Das Verfahren bietet die Möglichkeit des kontrollierten Aufkonzentrierens der Hydrokolloide in den Kapseln.
• Das Verfahren kann erfindungsgemäß geputzt werden, um Proteine, Kohlenhydrate oder andere Hydrokolloide aus konzentrierten viskosen Lösungen in ein frei fließendes trockenes Pulver zu überführen, aus dem sich die Hydrokolloide ohne Klumpenbildung sehr schnell wieder in Wasser oder wäßrigen Lösungen auflösen oder dispergieren lassen.
• Eine weitere Möglichkeit zur erfindungsgemäßen Nutzung des Verfahrens besteht darin, ein hydrophiles chirales Biopolymer in den Sporopolleninkapseln einzuschließen, um ein Trägermaterial für die Enantiomerentrennung durch Chromatographie mit organischen Elutionsmitteln zu gewinnen.
• Das Verfahren kann erfindungsgemäß genutzt werden, die Gelbildung in partikelgebundener feindisperser Form durch kovalente oder nichtkovalente Vernetzung vorzubereiten. Die verlustfreie Einführung der Hydrokolloide in die Mikrokapseln kann ohne vollständige Entwässerung durchgeführt werden. Diese können erfindungsgemäß anschließend in wäßriger Dispersion oder organischer Dispersion vernetzt werden. Falls die zum Einschluß verwendeten organischen Flüssigkeiten (beispielsweise Alkohole) mit der Vernetzungsreaktion nicht kompatibel sind, können sie erfindungsgemäß durch eine inerte organische Flüssigkeit (z. B. ein Alkan) auf dem durchströmten Festbett ausgetauscht werden, ohne das Wasser aus der eingeschlossenen Flüssigkeit mit den Hydrokolloiden vollständig zu entfernen. Nach erfolgter Vernetzung bilden die immobilisierten Hydrokolloide in wäßrigen Medien unlösliche Gele und können zur Biokatalyse oder Chromatographie eingesetzt werden.
• Für bestimmte Anwendungen, z. B. den Einsatz von immobilen Enzymen in nichtwäßriger Phase, ist es erwünscht, die Partikeln mit den eingeschlossenen Hydrokolloiden vor dem Einsatz durch vollständige Entwässerung zu stabilisieren und als Trockenprodukt zu lagern. In diesem Fall läßt sich das Produkt mit dem eingeschlossenen Hydrokolloid bzw. Enzym schonend aus einer wasserfreien Flüssigkeit (z. B. Aceton) trocknen.
• Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das in den folgenden Merkmalen beschriebene Verfahren gelöst:

Claims (8)

1. Verfahren zur Einführung von Hydrokolloiden in Sporopolleninkapseln, bei dem einem stark gerührten oder anderweitig bewegten Dreiphasensystem, welches aus der wäßrigen Lösung oder Dispersion der Hydrokolloide, den Sporopolleninkapseln und einer mit Wasser begrenzt mischbaren oder nicht mischbaren organischen Flüssigkeit besteht, eine mit Wasser nicht gesättigte oder mit Wasser unbegrenzt mischbare wasserlösende organische Flüssigkeit allmählich hinzugefügt wird.

2. Verfahren mit dem Merkmal 1, bei dem die wasserlösende organische Flüssigkeit so lange hinzugefügt wird, bis die wäßrige Phase mit den Hydrokolloiden außerhalb der Mikrokapseln verschwunden ist und sich nur noch in den Mikrokapseln befindet.

3. Verfahren mit dem Merkmal 1, bei dem das Dreiphasensystem durch Zusatz der trockenen Sporopolleninkapseln zu der Lösung der Hydrokolloide und anschließendes Dispergieren der erhaltenen feuchten Masse in der organischen Flüssigkeit hergestellt wird.

4. Verfahren mit dem Merkmal 1, bei dem das Dreiphasensystem ein Detergenz enthält.

5. Verfahren mit dem Merkmal 1, bei dem die Sporopolleninkapseln nach dem Einschluss der wasserhaltigen Dispersion oder Lösung der Hydrokolloide in ein Festbett gepackt und mit einer annähernd wasserfreien und wasserlösenden flüchtigen organischen Flüssigkeit extrahiert werden.

6. Verfahren mit dem Merkmal 5, bei dem die flüchtige organische Flüssigkeit aus den entwässerten Sporopolleninkapseln durch Trocknen an der Luft oder im Vakuum entfernt wird.

7. Verfahren mit dem Merkmal 2, bei welchem die Sporopolleninkapseln nach Verschwinden der wäßrigen Phase ausserhalb der Mikrokapseln von der sie umgebenden organischen Phase durch Filtration getrennt und durch Verdrängung der mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit auf dem Filter in eine chemisch beständige, mit Wasser nicht oder nur in geringem Maße mischbare organische Flüssigkeit überführt wird.

8. Verfahren mit dem Merkmal 1-7, bei welchem die in den Mikrokapseln eingeführten Hydrokolloide zu einem wasserunlöslichen Gel vernetzt werden.