DE10203628A1

DE10203628A1 - Preparation of biologically active microcapsules, useful e.g. for implantation and production of active compounds, comprises fusion of encapsulated cells

Info

Publication number: DE10203628A1
Application number: DE10203628A
Authority: DE
Inventors: Ulrich Zimmermann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-01-30
Filing date: 2002-01-30
Publication date: 2003-07-31

Abstract

Preparation of biologically active microcapsules (MC) comprises encapsulating cells in a coating of biocompatible polymer (I), where the new feature is that the cells are subjected to a fusion treatment. An Independent claim is also included for MC made of (I) and containing fused cells.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verkapselung von biologischen Zellen, insbesondere Verfahren zur Herstellung von biologisch wirksamen Mikrokapseln, die Zellen enthalten, durch Einschließen der Zellen in einem Polymermaterial. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Behandlung von Zellen, insbesondere Verfahren zur Fusion von Zellen, und Mikrokapseln, die biologische Zellen enthalten. The present invention relates to encapsulation methods of biological cells, in particular methods of production of biologically active microcapsules containing cells by enclosing the cells in a polymer material. The The invention further relates to methods for treating cells, in particular processes for the fusion of cells and microcapsules, that contain biological cells.

Es ist bekannt, bei allogenen oder xenogenen Transplantationen Immunreaktionen des Wirtsorganismus durch eine Mikroverkapselung des Transplantats zu dessen Immunisolation zu begegnen (s. F. Lim et al. in "Science", Bd. 210, 1980, S. 908-910, H. A. Clayton et al in "Acta Diabetol.", Bd. 30, 1993, S. 181-189). Für die Verkapselung von allogenen oder xenogenen, endokrinen Gewebes haben sich sphärische Alginatkapseln als vorteilhaft erwiesen (s. z. B. T, Zekorn et al in "Acta Diabetol.", Bd. 29, 1992, S. 41-52, P. De Vos et al. in "Biomaterials", Bd. 18, 1997, S. 273-278, C. Hasse et al. in "Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes", Bd. 105, 1997, S. 53-56 und in "J. Microencapsulation", Bd. 14, 1997, S. 617-626). It is known in allogeneic or xenogeneic transplants Immune reactions of the host organism through a Microencapsulation of the graft to counteract its immune isolation (See F. Lim et al. in Science, Vol. 210, 1980, pp. 908-910, H.A. Clayton et al in "Acta Diabetol.", Vol. 30, 1993, pp. 181-189). For encapsulation of allogeneic or xenogeneic, endocrine tissue have become spherical alginate capsules proven to be advantageous (see, for example, T, Zekorn et al in "Acta Diabetol.", Vol. 29, 1992, pp. 41-52, P. De Vos et al. in "Biomaterials", Vol. 18, 1997, pp. 273-278, C. Hasse et al. in "Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes ", Vol. 105, 1997, pp. 53-56 and in" J. Microencapsulation ", Vol. 14, 1997, pp. 617-626).

Die Alginate sind Ca²⁺- oder Ba²⁺-vernetzt und für die Immunisolation besonders wirksam, wenn sie gereinigt, d. h. möglichst frei von mitogenen Kontaminationen sind (s. U. Zimmermann et al. in "Electrophoresis", Bd. 13, 1992, S. 269-274, G. Klöck et al. in "Biomaterials", Bd. 18, 197, S. 707-713, DE-OS 198 36 960). Aus DE-OS 199 04 785 ist bekannt, die Stabilität von Mikrokapseln durch Zusatz von Proteinen und/oder Perfluorkarbonen zum Polymermaterial und/oder eine Nachbehandlung mit Sulfat- oder anderen Anionen zu erhöhen. The alginates are Ca ²⁺ or Ba ²⁺ crosslinked and are particularly effective for immunoisolation if they are cleaned, ie are as free as possible of mitogenic contamination (see U. Zimmermann et al. In "Electrophoresis", Vol. 13, 1992 , Pp. 269-274, G. Klöck et al. In "Biomaterials", vol. 18, 197, pp. 707-713, DE-OS 198 36 960). From DE-OS 199 04 785 it is known to increase the stability of microcapsules by adding proteins and / or perfluorocarbons to the polymer material and / or aftertreatment with sulfate or other anions.

Die Transplantation alginatumhüllten Gewebes wurde nicht nur in Tierversuchen, sondern auch in der Humanmedizin getestet. So wird beispielsweise von C. Hasse et al. in "The Lancet", Bd. 350, 1997, S. 1296, die Mikroverkapselungstechnik bei einer allogenen Nebenschilddrüsentransplantation im Muskelgewebe zweier Patienten mit permanenter symptomatischer Unterfunktion der Nebenschilddrüsen beschrieben. Nach der Behandlung mit Algiriat- immunisoliertem Nebenschilddrüsengewebe konnten die Patienten aus dem Krankenhaus entlassen werden, ohne hypokalzämische Symptome zu zeigen und ohne eine Therapie zur Unterdrückung von Immunreaktionen zu benötigen. The transplantation of alginate-covered tissue was not only in Animal testing, but also tested in human medicine. So is described, for example, by C. Hasse et al. in "The Lancet", vol. 350, 1997, p. 1296, the microencapsulation technology at one Allogeneic parathyroid graft in the muscle tissue of two Patients with permanent symptomatic underfunction of the Parathyroid glands described. After treatment with algiriat The patients were able to isolate parathyroid tissue to be discharged from the hospital without hypocalcaemic To show symptoms and without therapy to suppress Need immune responses.

Obwohl mit der herkömmlichen Technik untoxische und für den Empfänger verträgliche Verkapselungsmaterialien zur Verfügung stehen, treten oftmals Probleme bei der Implantation verkapselter und gegebenenfalls gentechnologisch veränderter Zellen auf. So zeigte sich, wie schon bei Tierversuchen, dass die von C. Hasse et al. beschriebenen Transplantate nur für eine beschränkte Zeit wirksam waren, was auf das Verschwinden der Al- ginatumhüllungen zurückzuführen ist. Es ist ferner beobachtet worden, dass Kapseln bereits kurze Zeit nach der Transplantation Risse zeigen oder gesprengt werden, so dass die erwünschte Immunisolation unwirksam wird. Es wurde auch festgestellt, dass Zellen aus den Kapseln herauswachsen und damit zu unerwünschten Immunabwehrreaktionen seitens des Immunsystems des Empfängers führen. Diese Erscheinungen sind darauf zurückzuführen, dass die in der Kapsel befindlichen Zellen proliferieren, d. h. die Zellen wachsen weiter unter ständiger Zellteilung. Ein weiterer Nachteil der Proliferation von Zellen in Mikrokapseln ergibt sich daraus, dass häufig die Proliferation und Produktion von therapeutisch wirksamen Substanzen umgekehrt korreliert sind. Damit sind die Produktion und Sezernierung von Faktoren, Hormonen und anderen Regulationsstoffen bei herkömmlichen Kapseln in der Regel sehr gering. Although non-toxic with conventional technology and for the Recipient compatible encapsulation materials are available problems often arise during implantation encapsulated and possibly genetically modified cells. As was already the case with animal experiments, it was found that C. Hasse et al. described grafts only for one were effective for a limited time, indicating the disappearance of the Al ginate wrappings. It is also observed been that capsules a short time after Transplant cracks show or be blown up so that the desired one Immunisolation becomes ineffective. It was also found that Cells grow out of the capsules and thus become undesirable Immune response by the recipient's immune system to lead. These phenomena are due to the fact that the cells in the capsule proliferate, i. H. the Cells continue to grow with constant cell division. Another Disadvantage of the proliferation of cells in microcapsules results derive from the fact that the proliferation and production of therapeutically active substances are correlated in reverse. So the production and secretion of factors Hormones and other regulatory substances in conventional capsules in usually very low.

Es ist allgemein bekannt, die Proliferation der Zellen chemisch durch die Zugabe von sogenannten Proliferationshemmern zu inhibieren. Dazu gehören beispielsweise Entkopplersubstanzen, die auf die Mitochondrien wirken, wie CCCP und FCCP. Diese Proliferationshemmer haben allerdings nachweislich den Nachteil, dass sie toxisch und daher medizinisch nicht zugelassen sind. Es ist ferner bekannt, die Teilungsfähigkeit von Zellen durch radioaktive Bestrahlung zu beeinträchtigen. Nachteilig ist jedoch, dass durch die Bestrahlung nicht alle Zellen ihre Proliferationsfähigkeit verlieren und damit nur eine zeitlich beschränkte Hemmung der Proliferation möglich ist. It is well known chemical proliferation of cells by adding so-called proliferation inhibitors inhibit. These include, for example, decoupling substances that act on the mitochondria, like CCCP and FCCP. This However, proliferation inhibitors have been shown to have the disadvantage that they are toxic and therefore not medically approved. It is also known the ability of cells to divide affect radioactive radiation. However, the disadvantage is that not all cells are affected by the radiation Loss of proliferation ability and thus only one in time limited inhibition of proliferation is possible.

Ein weiteres Problem bei herkömmlichen Transplantationen löesteht darin, dass durch Scherkräfte oder andere physikalische und chemische Kräfte Haarrisse an der Kapsel auftreten können, so dass die eingeschlossenen Fremdzellen in Kontakt mit den Komponenten des Immunsystems kommen, was zu unerwünschten Immunabwehrreaktionen des Empfängers führt. Another problem with conventional transplants solves that by shear forces or other physical and chemical forces hairline cracks can occur on the capsule so that the trapped foreign cells come into contact with the Components of the immune system come up, leading to unwanted ones Immune response of the recipient leads.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Verfahren zur Herstellung von biologisch wirksamen Mikrokapseln zur Verfügung zu stellen, die biologische Zellen enthalten und mit denen die Nachteile herkömmlicher Verkapselungstechniken überwunden werden. Es sollen insbesondere Mikrokapseln mit einer erhöhten Stabilität hergestellt werden können, die bei Lagerung und/oder nach Implantation in den Empfänger intakt und wirksam bleiben. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, verbesserte Mikrokapseln für Zelltransplantationen bereitzustellen, die sich durch eine erhöhte Langzeitstabilität auszeichnen. It is an object of the present invention to improve Process for the production of biologically active microcapsules for To make available that contain and with biological cells which have the disadvantages of conventional encapsulation techniques be overcome. In particular, microcapsules with a increased stability can be produced during storage and / or intact and effective after implantation in the recipient stay. The object of the invention is also to improve To provide microcapsules for cell transplantation that are characterized by increased long-term stability.

Diese Aufgaben werden mit Verfahren und Mikrokapseln mit den Merkmalen gemäß Patentanspruch 1, 19 oder 20 gelöst. Die Unteransprüche definieren bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. These tasks are performed using procedures and microcapsules Features according to claim 1, 19 or 20 solved. The Subclaims define preferred embodiments of the Invention.

Eine Grundidee der Erfindung ist es, biologisch wirksame Mikrokapseln mit biologischen Zellen bereitzustellen, die einer Fusionsbehandlung unterzogen worden sind. Durch diese Maßnahme wird vorteilhafterweise sichergestellt, dass die in den Mikrokapseln befindlichen Zellen nicht proliferieren. Nach Herstellung der Mikrokapseln wird eine Belastung der Kapseln von innen her vermieden. Eine Rissbildung oder gar Durchbrüche werden ausgeschlossen. Die in den Mikrokapseln befindlichen Zellen bleiben vom Kapselmaterial eingeschlossen. Die Kapseln bleiben für die Immunisolierung der Zellen wirksam. A basic idea of the invention is to be biologically effective To provide microcapsules with biological cells that are one Have undergone fusion treatment. By this measure is advantageously ensured that the in the Microcapsule cells do not proliferate. To Manufacturing the microcapsules will load the capsules from the inside avoided here. Cracking or even breakthroughs locked out. The cells in the microcapsules remain enclosed by the capsule material. The capsules stay effective for immune isolation of cells.

Die Erfinder haben festgestellt, dass die Proliferation der in der Kapsel eingeschlossenen fusionierten Zellen verhindert wird. Damit bleibt die Kapsel unbeschadet erhalten und kann über einen langen Zeitraum die immunisolierende Wirkung ausüben. Da die Proliferation unterdrückt ist, kommt es in vielen Fällen in erfindungsgemäß hergestellten Mikrokapseln zu einer erhöhten Produktion der therapeutisch wirksamen Faktoren. Dies wirkt sich besonders vorteilhaft aus, wenn diese Faktoren ein hohes Molekulargewicht besitzen. Durch die hohe Substanzkonzentration in der Mikrokapsel wird die Abgabe an die Umgebung des Transplantationsortes gefördert. The inventors have found that the proliferation of the in the capsule enclosed fused cells prevented becomes. This means that the capsule remains undamaged and can the immune-isolating effect over a long period of time exercise. Since proliferation is suppressed, it happens in many Cases in microcapsules produced according to the invention into one increased production of the therapeutically effective factors. This is particularly beneficial when these factors come into play have high molecular weight. Due to the high Substance concentration in the microcapsule is released into the environment of the transplant site.

Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn mindestens drei fusionierte Zellen verkapselt werden, weil dann eine Proliferation bereits weitgehend ausgeschlossen ist. Es ist allerdings auch möglich, die Zellen zu sogenannten "Riesenzellen" von mehr als drei Zellen (bis zu etwa 106 Zellen) zu fusionieren. In einer erfindungsgemäß hergestellten Mikrokapsel können ferner mehrere Zellen enthalten sein, die jeweils aus mehreren Zellen fusioniert sind. It has proven to be particularly advantageous if at least three fused cells are encapsulated because then one Proliferation is already largely excluded. It is however, it is also possible to convert the cells into so-called "giant cells" from more than three cells (up to about 106 cells) merge. In a microcapsule produced according to the invention also contain several cells, each of several Cells are fused.

Als biologische Zellen für die Fusion und Verkapselung können erfindungsgemäß alle Zellen verwendet werden, allein oder kombiniert Wirkstoffe in ihre Umgebung sezernieren oder abgeben. Can be used as biological cells for fusion and encapsulation all cells are used according to the invention, alone or combined secrete or release active ingredients into their environment.

Zu den Wirkstoffen zählen im weitesten Sinne alle therapeutischen Faktoren für die Behandlung verschiedenster Erkrankungen. Die biologischen Zellen können dabei aus Gewebe stammen oder in Form von Zelllinien verwendet werden. In the broadest sense, the active ingredients include everyone therapeutic factors for the treatment of various diseases. The biological cells can come from tissue or in Form of cell lines can be used.

Praktisch alle Zellen besitzen Oberflächenantigene. Diese Zelloberflächenproteine sind an der Regulation der Immunantwort sowie der Transplantatabstoßung beteiligt. Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden Zellen verwendet, die frei von Oberflächenantigenen sind, die MHC- Antigene der Klasse I umfassen. Da die MHC-Moleküle über Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen entdeckt wurden, erhielten sie die Bezeichnung "Transplantationsantigene" bzw. "Gewebsverträglichkeitskomplexe" (Major Histo Compatibility Complex; MHC). Der Vorteil dieser Zellen besteht darin, dass auch im Fall einer Verletzung der Mikrokapsel (z. B. Bildung von Haarrissen durch äußere Einflüsse) keine Immunreaktion ausgelöst wird. Erfindungsgemäß können Zellen ohne MHCl-Antigene, wobei diese Zellen gegebenenfalls zur Expression bestimmter merkmalspezifischer Gene genetisch transformiert sind, auch ohne die beschriebene Fusionsbehandlung verkapselt werden. Virtually all cells have surface antigens. This Cell surface proteins are involved in the regulation of the immune response as well as graft rejection. According to one particularly advantageous embodiment of the invention are cells that are free of surface antigens that use MHC Class I antigens include. Because the MHC molecules over Rejection reactions in transplants were discovered, they received the designation "transplantation antigens" or "Tissue Compatibility Complexes" (Major Histo Compatibility Complex; MHC). The advantage of these cells is that also in the event of an injury to the microcapsule (e.g. education of hairline cracks due to external influences) no immune reaction is triggered. According to the invention, cells without MHCl antigens, where appropriate, these cells for expression trait-specific genes are genetically transformed, too are encapsulated without the fusion treatment described.

Die MHC-Antigene sind meist Glycoproteine, die in der Zelloberfläche verankert sind und aus zwei Polypeptidketten bestehen. Ihrer Funktion nach werden sie in verschiedene Klassen eingeordnet, d. h. in die Klassen I, II und III. Alle drei Klassen binden Peptidfragmente, die sie den Zellen des Immunsystems präsentieren. Die MHCI-Antigene lassen sich auf allen kernhaltigen Zellen nachweisen. Sie präsentieren endogene Antigene und ermöglichen die Interaktion mit T₈-Zellen. Durch Stimulation zytotoxischer T-Zellen ist eine Transplantationsabstoßung auslösbar. The MHC antigens are mostly glycoproteins that are anchored in the cell surface and consist of two polypeptide chains. According to their function, they are classified into different classes, ie classes I, II and III. All three classes bind peptide fragments, which they present to the cells of the immune system. The MHCI antigens can be detected on all nucleated cells. They present endogenous antigens and enable interaction with T ₈ cells. A transplant rejection can be triggered by stimulation of cytotoxic T cells.

Es hat sich nun überraschenderweise gezeigt, dass, wenn die biologischen Zellen keine Oberflächenantigene insbesondere des Typs MHCI aufweisen, vom Immunsystem ein Empfängers nicht als fremd erkannt werden, falls sie aus der schützenden Kapsel heraustreten. Surprisingly, it has now been shown that if the biological cells no surface antigens in particular Type MHCI, not considered a recipient by the immune system be recognized by others if they come out of the protective capsule stepping out.

Es werden als Oberflächenantigen-freie Zellen vorzugsweise Zellen verwendet, die zu einer Zelllinie von Burkitt-Zellen, insbesondere zur Burkitt-Zelllinie Ramos, gehören. Cells are preferred as surface antigen-free Cells used to form a cell line from Burkitt cells, in particular belong to the Burkitt cell line Ramos.

Falls die Oberflächenantigen-freien Zellen nicht die gewünschten Wirkstoffe produzieren, so werden sie gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung einer genetischen Transformation unterzogen, bei der den Zellen genetisches Material zugefügt wird, das die Produktion des mindestens einen Wirkstoffs kodiert. If the surface antigen-free cells are not the produce the desired active ingredients, they are according to another Embodiment of the invention of a genetic transformation subjected to genetic material added to the cells is the production of at least one active ingredient coded.

Die genetische Transformation umfasst ein Einschleusen von Genen, die die gewünschten Wirkstoffe kodieren, bspw. in Burkitt- Zellen. Das Einschleusen erfolgt nach an sich bekannten Techniken, z. B. durch Elektroporation oder unter Verwendung von Kalziumphosphat. The genetic transformation involves infiltrating Genes that encode the desired active ingredients, for example in Burkitt Cells. The infiltration takes place according to known Techniques, e.g. B. by electroporation or using Calcium phosphate.

Als Material für die Verkapselung können alle Polymere verwendet werden, die vom Empfänger ohne Weiteres akzeptiert werden. Dazu zählen natürliche oder synthetische Polymere. Welches Polymer verwendet wird, hängt von der Biokompatibilität und damit auch vom Transplantationsort ab. Fusionierte Zellen werden mit dem Polymermaterial in Kontakt gebracht und darin eingeschlossen, gefolgt von einer Vernetzung des Polymermaterials. All polymers can be used as encapsulation material used, which are easily accepted by the recipient. These include natural or synthetic polymers. which Polymer used depends on the biocompatibility and therefore also from the transplant site. Fusion cells with brought into contact with the polymer material and therein included, followed by crosslinking of the polymeric material.

Es hat sich in der Praxis herausgestellt, dass als Material für die Verkapselung am günstigsten ein natürliches Polymer verwendet wird. Unter diesen natürlichen Polymeren werden bevorzugt Alginatpolymere verwendet. Die Herstellung von Mikrokapseln mit Alginat als Kapselmaterial erfolgt vorzugsweise nach an sich bekannten Verfahren, wie sie beispielsweise in DE-OS 198 36 960, DE-OS 199 04 785 und DE-OS 42 04 012 beschrieben sind. It has been found in practice that as a material for the encapsulation most conveniently a natural polymer is used. Among these natural polymers are preferred Alginate polymers used. The production of microcapsules with Alginate as the capsule material is preferably per se known methods, such as those described in DE-OS 198 36 960, DE-OS 199 04 785 and DE-OS 42 04 012 are described.

Erfindungsgemäße Mikrokapseln können die verschiedensten Formen besitzen, z. B. sphärische Farmen oder insbesondere bei Verkapselung adhärenter Zellern je nach Gestalt der Festphase auch nicht-sphärische Formen. Microcapsules according to the invention can take a wide variety of forms own, e.g. B. spherical farms or in particular Encapsulation of adherent cells depending on the shape of the solid phase non-spherical shapes.

Die Fusion der Zellen kann durch Behandlung im elektrischen Feld, mit chemischen Substanzen oder mit Viren erfolgen. Auf welche Weise die Fusion durchgeführt wird, hängt in der Regel von der späteren Verwendung der Zellen ab. Bei einer medizinischen Verwendung werden elektrische Verfahren bevorzugt, cla die Behandlung mit Chemikalien oder inaktivierten Viren eine medizinische Zulassung erschwert. The fusion of the cells can be done by treatment in electrical Field, with chemical substances or with viruses. On which way the fusion is performed usually depends on the later use of the cells. At a electrical methods are preferred for medical use, cla die Treatment with chemicals or inactivated viruses medical approval difficult.

Die Fusion im elektrischen Feld (Elektrofusion) ist mittlerweile eine an sich bekannte und entwickelte Methode (siehe U. Zimmermann et al. in "Electromanipulation of Cells" CRC Publisher, Boca Raton, USA, 1996 und U. Zimmermann in "Biochimica et Biophysica Acta", Bd. 694, 1982, Seite 227-277). Die Elektrofusion wurde beispielsweise erfolgreich zur Hybridisierung tierischer Zellen, wie Hybridomzellen, und Hefen angewendet. Die Elektrofusion hat gegenüber den anderen Fusionsverfahren den besonderen Vorteil, dass die Zahl der zu fusionierenden Zellen gezielt eingestellt werden kann. Außerdem besitzt sie den Vorteil einer hohen Fusionsausbeute. In den Fusionspräparaten treten keine toxischen oder immunogenen Produkte oder Viren auf, was in Bezug auf die medizinische Zulassung erfindungsgemäß hergestellter Mikrokapseln von Vorteil ist. Die Elektrofusion wird nach an sich bekannten Fusionsprotokollen durchgeführt. Beispielsweise erfolgt die Fusion suspendierter Zellen mittels elektrischer Impulse in zwei Stufen. The fusion in the electric field (electrofusion) is meanwhile a known and developed method (see U. Zimmermann et al. in "Electromanipulation of Cells" CRC Publisher, Boca Raton, USA, 1996 and U. Zimmermann in "Biochimica et Biophysica Acta ", Vol. 694, 1982, pages 227-277). The For example, electrofusion has been successfully used for hybridization animal cells such as hybridoma cells and yeast. Electrofusion has compared to the other fusion processes the particular advantage that the number of merged Cells can be set specifically. She also owns the advantage of a high fusion yield. In the Fusion products do not occur toxic or immunogenic Products or viruses on what is related to medical Approval of microcapsules produced according to the invention is advantageous is. The electrofusion is known per se Fusion protocols carried out. For example, the merger takes place suspended cells using electrical impulses in two stages.

Zunächst werden die zu fusionierenden Zellen einem elektrischen Wechselfeld ausgesetzt, in dem sie sich infolge von Dielektrophorese gegenseitig anziehen. Im zweiten Schritt wird die Elektrofusion durch kurze elektrische Gleichstrompulse ausgelöst. Dabei kommt es zu Interaktionen von Membranteilen, die zur Fusion führen. Zur Fusion von adhärenten Zellen kann auf die dielektrophoretische Ausrichtung im Wechselfeld verzichtet werden, da die Zellen bereits vorab im engen Membrankontakt stehen. First, the cells to be fused are electrical Alternating field exposed in which they are due to Attract each other to dielectrophoresis. In the second step the Electrofusion through short electrical DC pulses triggered. This leads to interactions of membrane parts that lead to the merger. For the fusion of adherent cells can on the dielectrophoretic alignment in the alternating field is dispensed with because the cells are already in close contact with the membrane stand.

Sollte beispielsweise aufgrund von Umgebungsbedingungen oder der Natur der Zelle eine Elektrofusion nicht angebracht sein, so kann im erfindungsgemäßen Verfahren eine chemische Fusion durchgeführt werden. Dafür sind bereits verschiedene chemische Substanzen, wie z. B. Polyethylenglykol (PEG), bekannt. Should, for example, due to environmental conditions or the nature of the cell is not appropriate for electrofusion, a chemical fusion can be carried out in the process according to the invention be performed. There are already various chemical ones for this Substances such as B. polyethylene glycol (PEG) known.

In einigen Fällen kann es auch von Vorteil sein, erfindungsgemäß für die Fusion der Zellen Viren einzusetzen. Die Fusion erfolgt beispielsweise mit inaktiviertem Sendai-Virus, Herpes simplex-Virus oder Epstein-Barr-Virus. In some cases, it can also be beneficial to use viruses according to the invention for the fusion of the cells. The merger for example, with inactivated Sendai virus, herpes simplex virus or Epstein-Barr virus.

Es hat sich in der Praxis als günstig etwiesen, die Fusion der biologischen Zellen vor dem Einschließen in das Polymermaterial (Verkapselung) durchzuführen, um ggf. nicht fusionierte Zellen abtrennen zu können. Durch Abtrennung nicht fusionierter Zellen werden diese von der Verkapselung ausgeschlossen. Vorteilhafterweise ergibt sich eine erhöhte Proliferationsunterdrückung. In practice, the merger of the biological cells before inclusion in the polymer material (Encapsulation) to carry out possibly unfused cells to be able to separate. By separating unfused cells these are excluded from the encapsulation. This advantageously results in increased proliferation suppression.

Die Abtrennung der fusionierten Zellen von den nicht fusionierten Zellen vor der Verkapselung kann nach verschiedenen Methoden erfolgen. In Abhängigkeit der fusionierten Zelllinien kann eine Abtrennung über Selektionsmedien durchgeführt werden, wozu beispielsweise die HAT-Selektion zählt. Bei dieser Selektion sterben nicht fusionierte Zellen ab, während die fusionierten Zellen überleben. Allerdings ist dieses Abtrennungsverfahren nur für bestimmte selektive Zelllinien geeignet. The separation of the fused cells from the non fused cells before encapsulation can be different Methods are done. Depending on the fused cell lines can a separation can be carried out via selection media, for which purpose for example, the HAT selection counts. With this selection unfused cells die while the fused Cells survive. However, this is a separation process only suitable for certain selective cell lines.

Weitere Trennmethoden basieren auf einer

- Nährstofflimitierung in der Proliferation (Absterben der nicht fusionierten Zellen),
- Auftrennung nach der Zellengröße (fusionierte Zellen sind größer als nicht fusionierte Zellen, Trennung z. B. durch Anwendung eines Siebes mit einer definierten Maschenweite),
- Abtrennung mit elektrischen Feldern, insbesondere dielektrophoretische Trennung,
- Erfassung von Dichtegradienten, und/oder
- Erfassung von Größenunterschieden nach der Fusion mittels Durchflußzytometrie (FACS).

Other separation methods are based on one

- nutrient limitation in proliferation (death of unfused cells),
- separation according to the cell size (fused cells are larger than unfused cells, separation e.g. by using a sieve with a defined mesh size),
Separation with electric fields, in particular dielectrophoretic separation,
- Detection of density gradients, and / or
- Acquisition of size differences after fusion using flow cytometry (FACS).

Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren zur Abtrennung der nicht fusionierten Zellen besteht in der Ausübung eines hypotonen Schocks. Diese Methode beruht auf der Eigenschaft, dass die fusionierten Zellen einen großen Überschuss an Plasmamembran besitzen und damit eine größere osmotische Resistenz aufweisen. Bei dieser Anwendung müssen für jede Zelllinie bestimmte Gsmolaritäten (0 bis 200 mOsm), bestimmte Inkubationszeiten (3 bis 30 min) und bestimmte Ausheilzeiten (10 min bis 2 h) zwischen Fusion und hypotonem Schock ausgewählt werden. Another advantageous method for separating the fused cells consists in the exercise of a hypotonic Shocks. This method is based on the property that the cells fused a large excess of plasma membrane possess and thus have a greater osmotic resistance. In this application, certain cell lines have to be determined Gsmolarities (0 to 200 mOsm), certain incubation times (3 to 30 min) and certain healing times (10 min to 2 h) between Fusion and hypotonic shock can be selected.

Schließlich können die zu fusionierenden Zellchargen, gleicher oder unterschiedlicher Art, vor der Fusion mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markiert werden (FACS, Fluoreszenzmikroskopie), um nach der Fusion über Fluoreszenzanalyse die fusionierten Zellen von den nicht fusionierten zu unterscheiden und damit abzutrennen. Finally, the batches of cells to be fused can be the same or different types, before merging with different fluorescent markers (FACS, Fluorescence microscopy) to determine the fusion after fusion via fluorescence analysis distinguish fused cells from unfused cells and separate with it.

Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, die beschriebenen Methoden zur Abtrennung der nicht fusionierten Zellen zu kombinieren. According to the invention, those described can be provided Methods to separate the unfused cells combine.

Alternativ kann die Fusionsbehandlung der Zellen auch nach dem Einschließen in das Polymermaterial, vor oder nach dessen Vernetzung zur Bildung der Mikrokapsel erfolgen. Hierzu wird ciie Zahl pro Volumeneinheit zu verkapselnden Zellen so hoch gewählt, dass sich durch Dielektrophorese ein Membrankontakt ausbilden kann. Die Fusionsbedingungen werden unter Berücksichtigung der Beeinflussung des elektrischen Feldes durch das Kapselmaterial eingestellt. Alternatively, the fusion treatment of the cells can also be carried out after the Include in the polymer material, before or after it Crosslinking to form the microcapsule is done. For this, ciie Number of cells to be encapsulated per unit volume so high chosen that there is a membrane contact by dielectrophoresis can train. The merger conditions are under Taking into account the influence of the electric field by the Capsule material set.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden Mikrokapseln mit Zellen hergestellt, die zunächst adhärent auf einer Festphase aufgewachsen sind. Als Festphase werden beispielsweise Kunststoffkugeln (sogenannte Beads), wie z. B. Cytodex, Alginatkugeln (siehe EP 98 101 337) oder Collagenbeschichtete Hydrogelmatrizen, oder planare Oberflächen verwendet. Die Verwendung adhärent gewachsener Zellen ist für die Fusion der Zellen vor oder ggf. nach der Verkapselung von Vorteil. Die Zellen befinden sich auf der Festphase in direktem Kontakt, so dass zur Fusion auf eine Ausrichtung der Zellen verzichtet werden kann. Dies ist von besonderem Vorteil, wenn die Fusion nach der Verkapselung erfolgt. According to an advantageous embodiment of the invention Microcapsules are made with cells that are initially adherent grew up in a solid phase. As a solid phase for example plastic balls (so-called beads), such as. B. Cytodex, alginate spheres (see EP 98 101 337) or Collagen coated hydrogel matrices, or planar surfaces used. The use of adherently grown cells is for the Fusion of the cells before or possibly after the encapsulation of Advantage. The cells are in direct on the solid phase Contact, allowing fusion to align cells can be dispensed with. This is of particular advantage, though the fusion takes place after encapsulation.

Gemäß einer abgewandelten Ausführungsform der Erfindung werden die adhärenten Zellen der Fusion unterzogen, anschließend von der Festphase in eine Suspension überführt und schließlich in einem Polymermaterial verkapselt. Die Überführung in die Suspension erfolgt durch Ablösen von der Festphase nach an sich bekannten Verfahren, z. B. durch enzymatische oder mechanische Einwirkungen. According to a modified embodiment of the invention subjected the adherent cells to fusion, then by the solid phase is converted into a suspension and finally in encapsulated in a polymer material. The transfer to the Suspension takes place by detaching itself from the solid phase known methods, e.g. B. by enzymatic or mechanical Impacts.

Die Erfindung umfasst die Verkapselung von Zellen gleicher oder verschiedener Spezies. Die erfindungsgemäß vorgesehene Fusion ist entsprechend eine homologe Fusion, bei der gleichartige Zellen verschmolzen werden, oder eine heterologe Fusion zwischen verschiedenartigen Zellen. Ein besonderer Vorteil der heterologen Fusion besteht dann, wenn die verschiedenen Zellarten verschiedene Wirksubstanzen erzeugen. Falls beispielsweise eine erste Zellart A einen Faktor 1 und eine zweite Zellart B einen Faktor 2 sezerniert, können fusionierte Zellen A + B beide Faktoren sezernieren. Dies ist für die therapeutische Verwendung transplantierter Mikrokapseln von großem Vorteil. The invention includes the encapsulation of cells of the same or different species. The proposed fusion is accordingly a homologous fusion, in which the like Cells are fused, or a heterologous fusion between different types of cells. A particular advantage of heterologous fusion exists when the different cell types generate different active substances. For example, if first cell type A a factor 1 and a second cell type B a If factor 2 is secreted, fused cells A + B can both Secrete factors. This is for therapeutic use transplanted microcapsules of great advantage.

Die heterologe Fusion wirkt sich auch bei der Erzeugung von Wirksubstanzen mit besonders großen, therapeutisch wirksamen Molekülen aus, die aus verschiedenen Domänen bestehen. Zwei verschiedene Zelllinien generieren beispielsweise zwei verschiedene Domänen. Das aus beiden Domänen gebildete therapeutische Molekül wird in der Mikrokapsel und bei genügend hoher Expression auch außerhalb der Mikrokapsel am Ort der Transplantation bereitgestellt. Die Domänen werden außerhalb der Mikrokapsel kombiniert und damit zur aktiven Form überführt. The heterologous fusion also affects the generation of Active substances with particularly large, therapeutically effective Molecules that consist of different domains. Two for example, different cell lines generate two different domains. The one formed from both domains therapeutic molecule is in the microcapsule and when sufficiently high Expression also outside the microcapsule at the site of Transplant provided. The domains are outside of the Combined microcapsule and thus converted to the active form.

Zur Herstellung der Mikrokapseln werden beispielsweise gemäß DE-OS 42 04 012 fusionierte Zellen in einer Lösung eines hochgereinigten Alginats suspendiert. Diese Suspension wird dann durch eine Sprühdüse geblasen. Bei dem am Düsenausgang entstehenden Tropfen umschließt die äußere Alginatlösung die in der Alginatlösung suspendierten fusionierten Zellen. Die Zellen liegen gleichsam als in der Alginatmatrix eingeschlossen vor. Die Alginattropfen werden anschließend mit einer Vernetzerlösung (z. B. Bariumsalzlösung) vernetzt, wonach die Kapseln dann mit isotoner Kochsalzlösung gewaschen werden. To produce the microcapsules, for example, according to DE-OS 42 04 012 fused cells in a solution of a highly purified alginate suspended. This suspension will then blown through a spray nozzle. The one at the nozzle outlet The resulting drops enclose the outer alginate solution in the Alginate solution suspended fused cells. The cells are, as it were, included in the alginate matrix. The alginate drops are then washed with a Crosslinker solution (e.g. barium salt solution) crosslinked, then the capsules be washed with isotonic saline.

Beispiele für erfindungsgemäß verkapselte Gewebezellen sind fusionierte Zellen aus dem Nebenschilddrüsengewebe, der Bauchspeicheldrüse, der Nebennierenrinde, sowie Knochenmarkszellen, Lymphknotenzellen, Knorpelzellen und Osteoblasten. Examples of tissue cells encapsulated according to the invention are fused cells from the parathyroid tissue, the Pancreas, the adrenal cortex, and bone marrow cells, Lymph node cells, cartilage cells and osteoblasts.

Des Weiteren ist es auch möglich, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Zelllinien zu verkapseln, die den Vorteil haben, dass Plasmide mit Genen, die für einen therapeutischen Faktor codieren, eingeschleust und exprimiert werden können. Zu den Zellinien zählen beispielsweise
VERO (kidney cells, adulter African green Monkey),
CHO (Chinese hamster ovary cells),
hEK 293 (human embryonal kidney cells),
Hep G2 (Leberkarzinomzelllinie als Test für EPO-Freisetzung),
TF1 (human erythroleukaemia),
Burkitt (B-Zellenlymphoma), und
primäre Zellen und Stammzellen. Furthermore, it is also possible with the method according to the invention to encapsulate cell lines which have the advantage that plasmids with genes which code for a therapeutic factor can be introduced and expressed. The cell lines include, for example
VERO (kidney cells, adult African green monkey),
CHO (Chinese hamster ovary cells),
HEK 293 (human embryonic kidney cells),
Hep G2 (liver carcinoma cell line as a test for EPO release),
TF1 (human erythroleukaemia),
Burkitt (B-cell lymphoma), and
primary cells and stem cells.

Vor Implantation in den Empfänger ist es empfehlenswert, die Zellen einem Funktionstest (Ermittlung der Lebendzellzahl) zu unterwerfen. Die Funktion kann getestet werden, indem der Faktor, den die fusionierte Zelle sezerniert, im Überstand, vor und nach der Verkapselung gemessen wird. Darüber hinaus können ebenfalls gängige Vitalitätstests durchgeführt werden. Dazu gehören der Propidiumiodid-Nachweis und der Trypanblau- Nachweis. Bei adhärent wachsenden Zellen wird auch ihre Fähigkeit untersucht, wieder adhärent zu werden. Zusätzlich werden Differenzierungstests nach der Aktivierung, z. B. DMSO bei Friend-Zellen zum Nachweis von Hämoglobin, angewandt. Before implantation in the recipient it is recommended that Cells to a function test (determination of the number of living cells) submit. The function can be tested by the Factor that the fused cell secretes in the supernatant and is measured after encapsulation. In addition, you can common vitality tests are also carried out. To include the propidium iodide detection and the trypan blue Proof. In the case of adherently growing cells, too Ability to become adherent again. additionally are differentiation tests after activation, e.g. B. DMSO for friend cells for the detection of hemoglobin.

Die nach dem erfindungsgemäß hergestellten verkapselten biologischen Zellen sind hervorragend in der Transplantationschirurgie, in der immunisolierten Transplantation sowie in der Produktion von Wirkstoffen, insbesondere Arzneimittel, Metabolite, Nährstoffe, Vorstufen von Chemikalien usw., z. B. in einem Bioreaktor, einsetzbar. The encapsulated according to the invention biological cells are excellent in the Transplantation surgery, in immunisolated transplantation as well as in Production of active substances, in particular drugs, metabolites, Nutrients, precursors of chemicals etc., e.g. B. in one Bioreactor, can be used.

Beispielsweise können die folgenden Wirkstoffe durch Transplantation verkapselter biologischer Zellen in den Empfänger abgegeben werden:
Parathormon,
Insulin,
Erythropoietin (Dialysepatienten),
Interferon alpha (Hepatitis),
Interferon beta (Multiple Sklerose),
Endostatin (Tumorbekämpfung),
Angiostatin (Tumorbekämpfung),
Glukozerebrosid Glukosidase (Morbus Gaucher),
TNF alpha Rezeptor oder Antikörper (rheumatoide Arthritis),
Gerinnungsfaktoren, z. B. Faktor VIII oder Faktor IX (Hämophilie), und
Dopamin (Parkinson). For example, the following agents can be delivered to the recipient by transplanting encapsulated biological cells:
Parathyroid hormone,
Insulin,
Erythropoietin (dialysis patients),
Interferon alpha (hepatitis),
Interferon beta (multiple sclerosis),
Endostatin (tumor control),
Angiostatin (tumor control),
Glucocerebroside glucosidase (Gaucher disease),
TNF alpha receptor or antibody (rheumatoid arthritis),
Coagulation factors, e.g. B. factor VIII or factor IX (hemophilia), and
Dopamine (Parkinson's).

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten verkapselten biologischen Zellen als immunisolierte Transplantate in der Transplantationschirurgie. The present invention also relates to the use of the Encapsulated biological cells produced according to the invention as immunisolated grafts in the Transplant surgery.

Claims

1. A method for producing biologically active microcapsules by enclosing biological cells in an envelope made of a biocompatible polymer material, characterized in that the cells are subjected to a fusion treatment.

2. The method according to claim 1, wherein the Fusion treatment at least three cells are fused.

3. The method according to claim 1 or 2, wherein the Fusion treatment of the cells before encapsulation is carried out.

4. The method according to claim 3, wherein according to the Fusion treatment and before enclosing in the sheath fused cells are removed.

5. The method of claim 4, wherein the not fused cells by selection, nutrient limitation in the Proliferation, cell size separation, electric fields, one Density gradient, flow cytometry, formation of a hypotonic shocks and / or fluorescent labeling from fused Cells are separated and removed.

6. The method according to claim 1 or 2, wherein the Fusion treatment of the cells after being enclosed in the sheath is carried out.

7. Method according to at least one of the preceding Claims in which the cells are in the freely suspended state or undergo fusion treatment in the adherent state.

8. Method according to at least one of the preceding Claims in which the fusion treatment is an electrofusion of the Cells or a treatment of cells with chemical Contains substances or with viruses.

9. The method according to claim 8, wherein the chemical Fusion treatment with polyethylene glycol is carried out.

10. The method according to claim 8, in which for viral fusion Viruses are used that are inactivated Sendai virus, herpes include simplex virus or Epstein-Barr virus.

11. Method according to at least one of the preceding Claims in which the polymer material is natural and / or synthetic polymers are used.

12. The method according to claim 11, in which as a natural Polymeric alginate polymers can be used.

13. Method according to at least one of the preceding Claims using cells that have at least secrete an active ingredient into their environment.

14. The method of claim 13, wherein cells are used be made from biological tissue or from cultivated Cell lines originate.

15. The method according to claim 13 or 14, wherein the cells are used that do not have surface antigens that Class I MHC antigens.

16. The method of claim 15, wherein cells are used that belong to a cell line of Burkitt cells.

17. The method of claim 16, wherein cells are used that belong to the Burkitt cell line Ramos.

18. The method according to any one of claims 15 to 17, in which Cells are used that have a genetic transformation have undergone genetic engineering of the cells is added that the production of at least one Active ingredient coded.

19. Process for the production of biologically active Microcapsules by enclosing biological cells in an envelope made of a biocompatible polymer material, characterized in that the cells make up the Burkitt cell line Ramos belong and undergo a treatment that a includes genetic transformation and fusion treatment, with the genetic transformation the cells to Production of at least one active ingredient set up and at Fusion treatment to be merged.

20. microcapsule made of a biocompatible polymer material, which contains fused biological cells.

21. The microcapsule according to claim 20, which homologously fused Contains cells.

22. A microcapsule according to claim 20 which is heterologous contains fused cells.

23. Microcapsule according to one of claims 20 to 22, which the cells are adherent to solid phases.

24. Microcapsule according to one of claims 20 to 23, which the cells are free of surface antigens, the MHC Class I antigens include.

25. The microcapsule according to claim 24, wherein the cells for Burkitt cell line belonging to Ramos.

26. The microcapsule of claim 25, wherein the cells genetically transformed cells of the Burkitt cell line are Ramos.

27. Microcapsule according to one of claims 20 to 26, which comprises the polymer material alginate material.

28. Use of a method or a microcapsule according to at least one of the preceding claims:
in transplant surgery,
for immunisolated transplantation, and / or
in the production of active substances, in particular drugs, metabolites, nutrients and precursors of chemicals.