DE102020129179A1

DE102020129179A1 - Verfahren, computerprogramm und miniaturisierter optofluidischer chip zum untersuchen von partikeln in einer flüssigen probe

Info

Publication number: DE102020129179A1
Application number: DE102020129179.5A
Authority: DE
Inventors: Andreas Dietzel; Reza Ebrahimifard; Georg Garnweitner
Original assignee: Technische Universitaet Braunschweig
Current assignee: Technische Universitaet Braunschweig
Priority date: 2020-11-05
Filing date: 2020-11-05
Publication date: 2022-05-05

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Computerprogramm mit Instruktionen zum Untersuchen von Partikeln in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines miniaturisierten optofluidischen Chips. Die Erfindung betrifft zudem einen für das Verfahren geeigneten miniaturisierten optofluidischen Chip sowie ein Messsystem, das einen erfindungsgemäßen miniaturisierten optofluidischen Chip verwendet. Bei dem Verfahren wird die flüssige Probe durch einen Flüssigkeitskanal des miniaturisierten optofluidischen Chips geführt (30). Dabei wird ein Messbereich des Flüssigkeitskanals mit einem primären Lichtstrahl beleuchtet (31) und es wird Licht erfasst (32), das aus Rückstreuung des primären Lichtstrahls an einem Partikel resultiert, welches sich durch den Messbereich bewegt. Zusätzlich wird Licht erfasst (33), das aus Vorwärtsstreuung und/oder Seitenstreuung des primären Lichtstrahls an dem Partikel resultiert, welches sich durch den Messbereich bewegt. Anhand von Messwerten für das aus Rückstreuung resultierende Licht in Kombination mit Messwerten für das aus Vorwärtsstreuung oder Seitenstreuung resultierende Licht erfolgt schließlich eine Diskriminierung (34) nach Größe oder Material der Partikel.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Computerprogramm mit Instruktionen zum Untersuchen von Partikeln in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines miniaturisierten optofluidischen Chips. Die Erfindung betrifft zudem einen für das Verfahren geeigneten miniaturisierten optofluidischen Chip sowie ein Messsystem, das einen erfindungsgemäßen miniaturisierten optofluidischen Chip verwendet.
Die Charakterisierung partikulärer Substanzen in flüssigen Systemen in niedrigen Konzentrationen ist von großer Bedeutung, beispielsweise bei der Analytik von Schadstoffen in Gewässern. Die Erfassung von Schadstoffpartikeln wie Mikroplastik in Gewässern wird zu einem immer wichtigeren Kriterium zur Bewertung der Gewässergüte. Während eine grundsätzliche Zählung und Vermessung der Partikel mittels Bildanalyse sowie Verfahren in Anlehnung an die Zytometrie kommerzialisiert ist, stellt die Unterscheidung unterschiedlicher organischer oder anorganischer Materialien eine große Herausforderung dar und erfordert beispielsweise die gleichzeitige Raman-Spektroskopie an den Partikeln.
Ein erster Ansatz für die Größenmessung und Analyse der chemischen Zusammensetzung von Partikelproben nutzt die Partikel-Lichtstreuung. Wenn ein Lichtstrahl auf ein Partikel trifft, wird das Licht in alle Richtungen gestreut. Die Intensität des gestreuten Lichts gibt Auskunft über die Partikelgröße. Die Auswertung der Lichtstreuung stellt eine leistungsstarke Methode für die Charakterisierung von Partikeln dar, die aufgrund der Empfindlichkeit der Streuung für die Größe, Morphologie und den Brechungsindex der Partikel häufig eingesetzt wird.
In diesem Zusammenhang beschreibt US 6,869,569 B2 eine Vorrichtung zur Unterscheidung einer Subpopulation von Blutzellen von anderen Blutzellen und Partikeln in einer Blutprobe. Die Vorrichtung umfasst eine optische Durchflusszelle, durch die die einzelnen Blutzellen und Partikel einer Blutprobe nacheinander hindurchgeführt werden können, eine Lichtquelle zum Beleuchten der durch die optische Durchflusszelle geführten Blutzellen und Partikel sowie einen optischen Detektor, der rückgestreute Strahlung von den beleuchteten Partikeln detektiert.
Ein weiterer Ansatz für die Größenmessung und Analyse der chemischen Zusammensetzung von Partikelproben basiert auf einer spektroskopischen Analyse. Dabei wird das Absorptions- oder Emissionsspektrum einer Probe aufgezeichnet, was eine gewisse Zeit erfordert um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten.
In diesem Zusammenhang beschreibt EP 2 742 337 B1 eine Vorrichtung zum Detektieren optischer Eigenschaften einer Probe einer Partikeldispersion. Die Vorrichtung umfasst eine Probenzelle zur Aufnahme einer Probe für eine Analyse, eine kohärente Lichtquelle zum Anregen der Probe, einen Lichtintensitätsdetektor zum Erfassen von elastischem Streulicht aus der angeregten Probe sowie einen Spektrallichtdetektor zum Erfassen von inelastischem Streulicht aus der angeregten Probe. Beim Erfassen des inelastischen Streulichts wird eine Raman-Spektroskopie durchgeführt.
Bei der Nanopartikel-Tracking-Analyse wird ein Lichtstrahl durch die Probenkammer geleitet. Die im Weg dieses Lichtstrahls in Suspension befindlichen Partikel streuen das Licht so, dass sie mit einem Mikroskop mit 20-facher Vergrößerung, auf dem eine Kamera montiert ist, leicht sichtbar gemacht werden können. Die Kamera arbeitet mit 30 Bildern pro Sekunde und nimmt eine Videodatei der Partikel auf, die Brownsche Bewegung zeigen. Die Software verfolgt viele Partikel einzeln und berechnet mit Hilfe der Stokes-Einstein-Gleichung ihre hydrodynamischen Durchmesser.
In diesem Zusammenhang beschreibt EP 2 739 955 A1 ein Verfahren zur Analyse einer Probe, die Submikronpartikel umfasst. Bei dem Verfahren werden mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse Informationen über die Größe der Partikel und die Anzahl der Partikel in der Probe bestimmt. Zudem werden mittels dynamischer Lichtstreuung Informationen über die durchschnittliche Partikelgröße der Partikel in der Probe bestimmt.
Bei den oben angeführten Lösungen handelt es sich um sperrige Messinstrumente, die eine Laborumgebung benötigen. Es ist daher sehr schwierig, sie für die Messung vor Ort oder die Inline-Analyse von Produkten einzusetzen.
Die meisten der Ansätze basieren zudem auf der Ensemble-Partikelmessung anstelle von Einzelpartikeln und bestimmen daher die Durchschnittswerte von Größe und Konzentration der Partikel anstelle der absoluten und individuellen Werte. Unterschiede zwischen Partikeln oder kleine Fraktionen von Partikeln mit stark unterschiedlichen Eigenschaften können daher nicht ausreichend erfasst werden.
Bei der Erfassung von Schadstoffpartikeln in Gewässern ist ähnlich wie bei der Vermessung der Partikelkonzentration in der Luft eine selektive Erfassung eines bestimmten Materials bzw. einer bestimmten Materialklasse erforderlich. In Gewässern sind meist in großer Zahl anorganische Sedimentpartikel enthalten, die von Polymerpartikeln unterschieden werden müssen. Auch die Unterscheidung anorganischer Materialien ist in der Gewässeranalytik oftmals von Bedeutung, beispielsweise die Unterscheidung zwischen harmlosen Sandpartikeln und schwermetallhaltigen Feststoffen. Umgekehrt ist die rasche und selektive Detektion seltener Stoffe für die Rohstoffgewinnung von großer Wichtigkeit, beispielsweise die Erfassung von Edelmetallpartikeln. Für diese Aufgaben ist die Erfassung und Charakterisierung von Einzelpartikeln statt eines Partikelkollektivs und die Bestimmung absoluter Konzentrationen erforderlich.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Lösungen zum Untersuchen von Partikeln in einer flüssigen Probe bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1, ein Computerprogramm mit Instruktionen mit den Merkmalen des Anspruchs 4 sowie durch einen miniaturisierten optofluidischen Chip mit den Merkmalen des Anspruchs 5 gelöst. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung umfasst ein Verfahren zum Untersuchen von Partikeln in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines miniaturisierten optofluidischen Chips die Schritte:

- Führen der flüssigen Probe durch einen Flüssigkeitskanal des miniaturisierten optofluidischen Chips;
- Beleuchten eines Messbereichs des Flüssigkeitskanals mit einem primären Lichtstrahl;
- Erfassen von Licht, das aus Rückstreuung des primären Lichtstrahls an einem Partikel resultiert, welches sich durch den Messbereich bewegt; und
- Erfassen von Licht, das aus Vorwärtsstreuung und/oder Seitenstreuung des primären Lichtstrahls an dem Partikel resultiert, welches sich durch den Messbereich bewegt.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst ein Computerprogramm Instruktionen, die bei Ausführung durch einen Computer den Computer zur Ausführung der folgenden Schritte zum Untersuchen von Partikeln in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines miniaturisierten optofluidischen Chips veranlassen:

- Erfassen von Licht, das aus Rückstreuung eines primären Lichtstrahls an einem Partikel in einem vom primären Lichtstrahl beleuchteten Messbereich eines Flüssigkeitskanals des miniaturisierten optofluidischen Chips resultiert, durch den die flüssige Probe geführt wird; und
- Erfassen von Licht, das aus Vorwärtsstreuung und/oder Seitenstreuung des primären Lichtstrahls an einem Partikel resultiert, welches sich durch den Messbereich bewegt.

Der Begriff Computer ist dabei breit zu verstehen. Insbesondere umfasst er auch Mikrocontroller, FPGAs (FPGA: Field Programmable Gate Array; vor Ort programmierbare (Logik-)Gatter-Anordnung) und andere prozessorbasierte Datenverarbeitungsvorrichtungen mit programmierbarer und nichtprogrammierbarer Logik.
Das Computerprogramm kann beispielsweise für einen elektronischen Abruf bereitgestellt werden oder auf einem computerlesbaren Speichermedium gespeichert sein.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung weist ein miniaturisierter optofluidischer Chip zum Untersuchen von Partikeln in einer flüssigen Probe auf:

- einen Flüssigkeitskanal zum Führen der flüssigen Probe durch einen Messbereich;
- eine optische Einheit zum Fokussieren eines primären Lichtstrahls in den Messbereich; und
- zumindest einen Optikkanal zum Aufnehmen von optischen Elementen zum Sammeln von Licht, das aus Rückstreuung des primären Lichtstrahls an einem Partikel resultiert, welches sich durch den Messbereich bewegt.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein erfindungsgemäßer miniaturisierter optofluidischer Chip in einem Messsystem zum Untersuchen von Partikeln in einer flüssigen Probe verwendet. Ein solches Messsystem weist weiterhin auf:

- eine Lichtquelle zum Erzeugen eines primären Lichtstrahls;
- eine optische Faser zum Führen des primären Lichtstrahls in den miniaturisierten optofluidischen Chip;
- Detektoren zum Erfassen von Licht, das aus Rückstreuung sowie aus Vorwärtsstreuung und/oder Seitenstreuung des primären Lichtstrahls an einem Partikel resultiert, welches sich durch einen Messbereich des miniaturisierten optofluidischen Chips bewegt;
- optische Fasern zum Führen des aus Rückstreuung, Vorwärtsstreuung und/oder Seitenstreuung resultierenden Lichts zu den Detektoren; und
- ein Auswertemodul zum Diskriminieren der Partikel nach Größe oder Material anhand von Messwerten für das aus Rückstreuung resultierende Licht in Kombination mit Messwerten für das aus Vorwärtsstreuung oder Seitenstreuung resultierende Licht.

Bei der erfindungsgemäßen Lösung wird ein miniaturisiertes optofluidisches Partikeldetektionssystem genutzt, um einzelne Partikel zu detektieren. Zudem ist die Erfassung der absoluten Konzentration einer Dispersion bei einer kontinuierlichen Durchflussmessung möglich. Die Detektion basiert auf dem Prinzip der Lichtstreuung und es können alle Arten von Feststoffen untersucht werden. Ein großer Vorteil besteht darin, dass bei der erfindungsgemäßen Lösung Rückstreuung parallel zur Vorwärtsstreuung und/oder Seitenstreuung für jedes einzelne Partikel detektiert wird. Zu diesem Zweck hat der miniaturisierte optofluidische Chip zumindest einen weiteren Optikkanal zum Aufnehmen eines optischen Elements zum Sammeln von Licht, das aus Vorwärtsstreuung oder Seitenstreuung des primären Lichtstrahls an einem Partikel resultiert, welches sich durch den Messbereich bewegt. Zudem kann zumindest ein weiterer Optikkanal zum Aufnehmen eines optischen Elements zum Sammeln von Licht, das aus Rückstreuung resultiert, vorgesehen sein. Dies ermöglicht es, ein entsprechendes Signal für einen anderen Streuwinkel zu erfassen.
In ersten Untersuchungen konnten Partikel ab einer Größe von ca. 200 nm detektiert werden. Durch Verbesserungen der Lichtquelle sowie der Detektoren kann erwartet werden, dass noch deutlich kleinere Nanopartikel ab einer Größe von ca. 20 nm erfasst und analysiert werden können.
Da das rückwärts gestreute Licht sowohl auf die Größe als auch die innere Struktur von Partikeln empfindlich ist, ist prinzipiell auch die Erfassung biologischer Partikel wie Zellen und Viren denkbar. Dies ist von besonderem Interesse für die biomedizinische Diagnostik.
Durch die Integration der optischen Einheit und der Optikkanäle sowie des fluidischen Manipulationsteils in einen Chip wird das Messsystem einfacher und es wird eine mobile Vor-Ort-Analyse ermöglicht. Darüber hinaus ergeben sich deutlich verringerte Gesamtkosten des Aufbaus.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung erfolgt anhand von Messwerten für das aus Rückstreuung resultierende Licht in Kombination mit Messwerten für das aus Vorwärtsstreuung oder Seitenstreuung resultierende Licht eine Diskriminierung nach Größe oder Material der Partikel. Ein Vergleich des aus Rückstreuung resultierenden Signals mit dem aus Vorwärtsstreuung oder Seitenstreuung resultierenden Signal ermöglicht die Unterscheidung und Sortierung von Partikeln nach Größe und Material für viele verschiedene Arten von Materialien, was im Vergleich zu einer Kombination aus Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung eine Unterscheidung mit deutlich höherer Zuverlässigkeit sowie die Anwendung des Prinzips auf Systeme mit geringerem Materialunterschied, d.h. ähnlicherem Brechungsindex, zulässt..
Gemäß einem Aspekt der Erfindung sind die Messwerte Spannungsäquivalente des erfassten Lichts. Zu diesem Zweck wird das erfasste Licht geeigneten Photodetektoren zugeführt. Diese wandeln die optischen Streusignale in Spannungssignale um. Die Spannungssignale können dabei in gewünschte Bereiche verstärkt werden. Die Nutzung von Spannungssignalen vereinfacht die nachfolgende Auswertung der Daten.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der Optikkanal für das aus Rückstreuung resultierende Licht in einem Winkel zwischen 120° bis 150° oder -120° bis -150° in Bezug auf die optische Achse des primären Lichtstrahls angeordnet. Vorzugsweise wird ein Winkel von ±135° genutzt, wobei grundsätzlich der gesamte Bereich geeignet ist. Die Festlegung einer konkreten Anordnung liegt im Ermessen des Fachmanns.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist ein Optikkanal für das aus Vorwärtsstreuung resultierende Licht in einem Winkel von ±15° in Bezug auf die optische Achse des primären Lichtstrahls angeordnet und/oder ein Optikkanal für das aus Seitenstreuung resultierende Licht ist in einem Winkel von ±60° in Bezug auf die optische Achse des primären Lichtstrahls angeordnet. Durch die Anordnung des Optikkanals für das aus Vorwärtsstreuung resultierende Licht in einem Winkel von ±15° in Bezug auf die optische Achse des primären Lichtstrahls wird verhindert, dass der direkte primäre Lichtstrahl in diesen Optikkanal einkoppelt. Die Anordnung des Optikkanals für das aus Seitenstreuung resultierende Licht in einem Winkel von ±60° in Bezug auf die optische Achse des primären Lichtstrahls sorgt dafür, dass es zu keinem räumlichen Konflikt zwischen diesem Optikkanal und dem Flüssigkeitskanal kommt.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung sind die Optikkanäle ausgestaltet, optische Fasern aufzunehmen. Die Verwendung optischer Fasern für die Beleuchtung und Detektion hat den Vorteil, dass die Lichtquelle und die Detektoren in einem getrennten, schützenden Gehäuse angeordnet werden können. Der miniaturisierte optofluidische Chip kann dann auf einfache Weise an die Lichtquelle bzw. die Detektoren angeschlossen werden, indem die optischen Fasern in die jeweiligen Optikkanäle eingeführt werden.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung weist die optische Einheit zwei oder mehr Mikrolinsen zur Kollimation und Fokussierung des primären Lichtstrahls auf. Dies ermöglicht es, den primären Lichtstrahl sehr exakt und reproduzierbar in den Messbereich einzustrahlen. Zugleich ist der Platzbedarf für die Mikrolinsen sehr gering.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung sind die zwei oder mehr Mikrolinsen durch Aussparungen des miniaturisierten optofluidischen Chips gebildet. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass die Mikrolinsen aus dem Material des optofluidischen Chips bestehen, dass also die Mikrolinsen in einem Arbeitsgang mit den Optikkanälen und dem Flüssigkeitskanal hergestellt werden können. Dies erleichtert die Herstellung des miniaturisierten optofluidischen Chips.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung weist der miniaturisierte optofluidische Chip zumindest eine Mikrolinse zum Sammeln von Licht auf, das aus Vorwärtsstreuung, Seitenstreuung oder Rückstreuung des primären Lichtstrahls an einem Partikel resultiert. Durch die Anordnung von Mikrolinsen bei den Optikkanälen für die Detektion von Streulicht sind diese in der Lage, mehr Licht zu erfassen. Auf diese Weise können bessere Signale bereitgestellt werden.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung hat der miniaturisierte optofluidische Chip in einen Probenzulauf mündende Zulaufkanäle zum Ausbilden einer Hüllströmung. Auf diese Weise kann zuverlässig eine hydrodynamische Fokussierung realisiert werden, d.h. die zugeführte flüssige Probe wird durch einen stabilen, von der Hüllströmung erzeugten Kanal geführt.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung hat der miniaturisierte optofluidische Chip Abmessungen von X≤15 mm, Y≤30 mm und Z≤8 mm. Mit diesen Abmessungen ist es problemlos möglich, alle erforderlichen Elemente des miniaturisierten optofluidischen Chips unterzubringen. Dabei ist eine weitere Reduzierung der Abmessungen möglich. In der Praxis konnten Abmessungen von X=10 mm, Y=20 mm und Z=5 mm realisiert werden.
Weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung und den angehängten Ansprüchen in Verbindung mit den Figuren ersichtlich.

1 zeigt schematisch ein Verfahren zum Untersuchen von Partikeln in einer flüssigen Probe
2 zeigt schematisch einen erfindungsgemäßen miniaturisierten optofluidischen Chip zum Untersuchen von Partikeln in einer flüssigen Probe;
3 zeigt eine Detailansicht einer Optik des miniaturisierten optofluidischen Chips aus 2;
4 zeigt ein Messsystem mit einem erfindungsgemäßen miniaturisierten optofluidischen Chip;
5 zeigt spannungsäquivalente Streusignale für die Rückstreuung, die Vorwärtsstreuung und die Seitenstreuung für Polystyrolpartikel und Siliziumdioxidpartikel mit einem Durchmesser von 10 µm;
6 zeigt spannungsäquivalente Streusignale für die Rückstreuung, die Vorwärtsstreuung und die Seitenstreuung für Polystyrolpartikel und Siliziumdioxidpartikel mit einem Durchmesser von 5 µm;
7 zeigt spannungsäquivalente Streusignale für die Rückstreuung, die Vorwärtsstreuung und die Seitenstreuung für Polystyrolpartikel und Siliziumdioxidpartikel mit einem Durchmesser von 2 µm;
8 zeigt Streudiagramme für Proben mit jeweils ausschließlich Polystyrolpartikeln oder Siliziumdioxidpartikeln mit unterschiedlichen Durchmessern; und
9 zeigt Streudiagramme für eine Probe mit einer Mischung von Polystyrolpartikeln und Siliziumdioxidpartikeln mit unterschiedlichen Durchmessern.

Zum besseren Verständnis der Prinzipien der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend Ausführungsformen der Erfindung anhand der Figuren detaillierter erläutert. Gleiche Bezugszeichen werden in den Figuren für gleiche oder gleichwirkende Elemente verwendet und nicht notwendigerweise zu jeder Figur erneut beschrieben. Es versteht sich, dass sich die Erfindung nicht auf die dargestellten Ausführungsformen beschränkt und dass die beschriebenen Merkmale auch kombiniert oder modifiziert werden können, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen, wie er in den angehängten Ansprüchen definiert ist.
1 zeigt schematisch ein Verfahren zum Untersuchen von Partikeln in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines miniaturisierten optofluidischen Chips. Bei dem Verfahren wird die flüssige Probe durch einen Flüssigkeitskanal des miniaturisierten optofluidischen Chips geführt 30. Dabei wird ein Messbereich des Flüssigkeitskanals mit einem primären Lichtstrahl beleuchtet 31 und es wird Licht erfasst 32, das aus Rückstreuung des primären Lichtstrahls an einem Partikel resultiert, welches sich durch den Messbereich bewegt.
Zusätzlich wird Licht erfasst 33, das aus Vorwärtsstreuung und/oder Seitenstreuung des primären Lichtstrahls an dem Partikel resultiert, welches sich durch den Messbereich bewegt. Anhand von Messwerten für das aus Rückstreuung resultierende Licht in Kombination mit Messwerten für das aus Vorwärtsstreuung oder Seitenstreuung resultierende Licht erfolgt schließlich eine Diskriminierung 34 nach Größe oder Material der Partikel. Die Messwerte können dabei insbesondere Spannungsäquivalente des erfassten Lichts sein.
2 zeigt schematisch einen erfindungsgemäßen optofluidischen Chip 1 zum Untersuchen von Partikeln in einer flüssigen Probe 18. Der Chip 1 besteht im Wesentlichen aus zwei Hauptteilen, der hydrodynamischen Fokussierung und der optischen Messung. Für die hydrodynamische Fokussierung münden zwei Zulaufkanäle 9 zum Ausbilden einer Hüllströmung seitlich in einen Probenzulauf 10. Die zu untersuchenden Probe 18 mit den darin dispergierten Partikeln 19 wird in den Probenzulauf 10 sowie ultrareines deionisiertes Wasser in die Zulaufkanäle 9 injiziert. Die drei resultierenden Ströme treten in einen geraden Flüssigkeitskanal 2 ein, der durch einen Messbereich 3 für die optische Messung verläuft. Der Probenstrom wird durch eine Einstellung der Durchflussraten von Proben- und Hüllstrom auf eine bestimmte Breite eingeengt, bei der nur noch einzelne Partikel 19 in den Messbereich 3 gelangen.
Die optische Messung umfasst Komponenten für die Beleuchtung und die Detektion. Für die Beleuchtung wird eine optische Einheit 4 genutzt, um einen einfallenden Lichtstrahl 13 in die Mitte des Flüssigkeitskanals 2 bzw. des Messbereich 3 zu fokussieren, die von den Partikeln 19 passiert wird. 3 zeigt eine Detailansicht der optischen Einheit 4. Die optische Einheit 4 umfasst zwei Mikrolinsen 40, 41, die durch Aussparungen 42 des Chips 1 gebildet sind. Anders formuliert, im Material des Chips 1 befinden sich Aussparungen 42, durch deren Form die Oberflächen der Mikrolinsen 40, 41 definiert werden.
Das aus Vorwärtsstreuung (FSC: Forward Scattering), Rückstreuung (BSC: Back Scattering) und in diesem Beispiel auch Seitenstreuung (SSC: Side Scattering) des Lichtstrahls 13 an einem Partikel 19 im Messbereich 3 resultierende Streulicht wird an verschiedenen Positionen gesammelt, z.B. an Positionen, die Winkeln von ±15°, ±60° oder ±135° in Bezug auf die optische Achse des Lichtstrahls 12 entsprechen. Für die Rückstreuung kommt dabei der gesamte Winkelbereich von 120° bis 150° oder -120° bis -150° in Betracht. Zu diesem Zweck sind Optikkanäle 5, 6, 7 zum Aufnehmen von optischen Elementen, wie z.B. optischen Fasern, in den optofluidischen Chip 1 integriert. Die Optikkanäle 5, 6, 7 sind bevorzugt so konzipiert, dass die optischen Fasern in den optofluidischen Chip 1 eingesteckt werden können. Die Enden der Optikkanäle 5, 6, 7 für das Sammeln von Streulicht befinden sich bevorzugt in gleicher Entfernung von der Mitte des optischen Fokuspunktes in der Mitte des Flüssigkeitskanals 2. Ein weiterer Optikkanal 8 dient dazu, den Lichtstrahl in den optofluidischen Chip 1 zu führen, vorzugsweise ebenfalls mittels einer optischen Faser. Im dargestellten Beispiel haben alle Kanäle 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 einen rechteckigen Querschnitt. Die Breite des Flüssigkeitskanals 2 und des Probenzulaufs 10 beträgt 100 µm, die Breite der Zulaufkanäle 9 beträgt 70 µm und die Breite der Optikkanäle 5, 6, 7, 8, 9 beträgt 130 µm. Die Höhe aller Kanäle 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 liegt jeweils bei 125 µm.
Die Herstellung des optofluidischen Chips 1 kann beispielsweise mittels Softlithographie erfolgen. In einem ersten Schritt kann eine Chrommaske mit dem Layout des optofluidischen Chips 1 mittels Laserschreibens in einen Fotolack, der chemischen Entwicklung des Fotolacks und Chromätzens hergestellt werden. Anschließend kann eine Masterstruktur auf einem Siliziumsubstrat hergestellt werden. Dazu kann zunächst ein Fotoresist mittels Rotationsbeschichtung (Spin-Coating) auf das Siliziumsubstrat aufgebracht und anschließend bei 70 und 100 °C mittels eines Soft-bake-Prozesses vorgetrocknet werden. Anschließend kann das Layout des optofluidischen Chips 1 in einem Fotolithografieprozess mittels Belichtung der Chrommaske mit UV-Licht auf die Fotoresistschicht projiziert werden. Die unbelichteten Bereiche der Fotoresistschicht werden durch chemische Entwicklung entfernt, während die UV-belichteten Bereiche der Fotoresistschicht auf dem Siliziumsubstrat verbleiben und eine Masterstruktur bilden. Im nächsten Schritt kann die Masterstruktur in das Material des optofluidischen Chips repliziert werden. Vorzugsweise wird aufgrund der Zuverlässigkeit und Robustheit für Anwendungen der Mikrofluidik und der optischen Transparenz im sichtbaren Wellenlängenbereich Polydimethylsiloxan (PDMS) als Material verwendet. Die Mischung aus PDMS und Vernetzer wird dazu auf den Master gegossen und ca. 1 Stunde lang bei 80 °C vernetzt und ausgehärtet. Anschließend kann das PDMS mit dem darin nachgebildeten Master vom Master abgezogen werden. Schließlich können Löcher für den Anschluss von Schläuchen für die Flüssigkeiten gestanzt und die PDMS-Chips auf Glasobjektträger geklebt werden. Um eine dichte Verklebung zu erreichen, können die Glasobjektträger und die PDMS-Chips mit einem Sauerstoffplasmaverfahren behandelt werden.
4 zeigt ein Messsystem 11 mit einem erfindungsgemäßen optofluidischen Chip 1. Das Licht 13 einer Lichtquelle 12, z.B. ein monochromatischer Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 780 nm, wird über eine Einmodenfaser 16 in den optofluidischen Chip 1 eingekoppelt. Das Streulicht aus Rückstreuung, Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung wird von Multimodefasern 14 gesammelt, die an die Photodetektoren 15 gekoppelt sind. Die optischen Streusignale werden in Spannungssignale umgewandelt und in gewünschte Bereiche verstärkt. Die äquivalenten Spannungssignale der Photodetektoren 15 werden mit einer Datenerfassungskarte für die weitere Datenverarbeitung digitalisiert und an ein Auswertemodul 17 übergeben. Für die Injektion der Probenflüssigkeit 18 und der Flüssigkeit für den Hüllstrom werden elektropneumatische Regler verwendet. Die Probenflüssigkeit 18 und die Flüssigkeit für den Hüllstrom werden in Teflonröhrchen injiziert, die durch gestanzte Löcher mit dem optofluidischen Chip 1 verbunden sind. Die hydrodynamische Strömungsfokussierung erfolgt dann über die Steuerung der Strömungsraten.
Nachfolgend sollen mit der erfindungsgemäßen Lösung erzielte Messergebnisse anhand von 5 bis 9 beschrieben werden.
Als Modellproben wurden stark verdünnte Dispersionen organischer Partikel und anorganischer Partikel mit unterschiedlichen Durchmessern untersucht. Als organische Partikeln wurden Polystyrol-Mikrokugeln (Po.) mit Durchmessern von 10,27±0,13 µm, 4,91±0,16 µm und 1,61±0,04 µm verwendet. Als anorganische Partikel wurden Siliziumdioxid (Kieselsäure)-Mikrokugeln (Si.) mit Durchmessern von 9,98±0,31 µm, 4,64±0,14 µm und 1,93±0,05 µm verwendet. Der Einfachheit halber werden die Partikelgrößen im folgend näherungsweise als 10 µm, 5 µm und 2 µm bezeichnet. Es wurden drei verschiedene Gruppen von Proben mit Partikelkonzentrationen von 10⁶-10⁷ Partikeln/ml untersucht. Die erste Gruppe bestand aus Proben, die jeweils ausschließlich Polystyrolpartikel oder Siliziumdioxidpartikel mit gleichem Durchmesser enthielten. Die zweite Gruppe bestand aus Proben, die jeweils ausschließlich Polystyrolpartikel mit unterschiedlichen Durchmessern oder Siliziumdioxidpartikel mit unterschiedlichen Durchmessern enthielten. Die dritte Gruppe bestand aus Proben, die eine Mischung von Polystyrolpartikeln und Siliziumdioxidpartikeln mit unterschiedlichen Durchmessern enthielten.
5 zeigt die spannungsäquivalenten Streusignale für die Rückstreuung (BSC), die Vorwärtsstreuung (FSC) und die Seitenstreuung (SSC) in Abhängigkeit von der Aufzeichnungszeit für Polystyrolpartikel (5a)) und Siliziumdioxidpartikel (5b)) mit einem Durchmesser von 10 µm. 5c) zeigt die relevanten Streudiagramme (oben: SSC-BSC; Mitte: FSC-BSC; unten: SSC-FSC) der gemessenen Partikel.
6 zeigt die spannungsäquivalenten Streusignale für die Rückstreuung (BSC), die Vorwärtsstreuung (FSC) und die Seitenstreuung (SSC) in Abhängigkeit von der Aufzeichnungszeit für Polystyrolpartikel (6a)) und Siliziumdioxidpartikel (6b)) mit einem Durchmesser von 5 µm. 6c) zeigt die relevanten Streudiagramme (oben: SSC-BSC; Mitte: FSC-BSC; unten: SSC-FSC) der gemessenen Partikel.
7 zeigt die spannungsäquivalenten Streusignale für die Rückstreuung (BSC), die Vorwärtsstreuung (FSC) und die Seitenstreuung (SSC) in Abhängigkeit von der Aufzeichnungszeit für Polystyrolpartikel (7a)) und Siliziumdioxidpartikel (7b)) mit einem Durchmesser von 2 µm. 7c) zeigt die relevanten Streudiagramme (oben: SSC-BSC; Mitte: FSC-BSC; unten: SSC-FSC) der gemessenen Partikel.
Die aufgezeichneten Streusignale in 5 bis 7 bestehen jeweils aus einzelnen Peaks, die mit Streusignalen von Einzelpartikeln assoziiert sind. Bei festen experimentellen Parametern (Wellenlänge und Leistung des Laserlichts, Höhe der Signalverstärkung in den Detektoren und Flussrate des Probenstroms und der Hüllströme) hängt die Höhe des Streusignals von der Größe und dem Brechungsindex der Partikel ab. Die kleineren Partikel weisen bei allen drei Arten von Streusignalen geringere Streusignalwerte auf.
Betrachtet man jede Partikelgrößenklasse von 10 µm, 5 µm und 2 µm in 5 bis 7, so ist der Signalwert der Rückstreuung von Polystyrolpartikeln signifikant höher als der von Siliziumdioxidpartikeln. Da der Brechungsindex von Polystyrol bei 780 nm mit n=1,58 größer ist als der Brechungsindex von Siliziumdioxid mit n=1,45, ist die Effizienz der Rückstreuung und die daraus resultierende Lichtintensität der Rückstreuung für die Polystyrolpartikel höher als für die Siliziumdioxidpartikel.
Solche Unterschiede können besonders gut in Streudiagrammen dargestellt werden. Die Streudiagramme in 5c) der Proben mit jeweils ausschließlich Polystyrolpartikeln oder Siliziumdioxidpartikeln zeigen die Lage jeder Probe auf der Grundlage der gemessenen Streusignalwerte. Jeder Punkt in den Streudiagrammen zeigt die Streusignalwerte eines einzelnen Partikels. Die Unterschiede zwischen Proben mit Polystyrolpartikeln und Proben mit Siliziumdioxidpartikeln sind in den Streudiagrammen mit dem Beitrag der Rückstreuung (FSC-BSC und SSC-BSC) im Vergleich zum Streudiagramm ohne Beitrag der Rückstreuung (SSC-FSC) signifikant besser zu erkennen.
Im Vergleich zu den Modellproben können realen Proben Partikel unterschiedlicher Größe und Materialien enthalten. Daher sind die gemischten Modellproben so gestaltet, dass sie den Zustand der realen Proben simulieren.
8 zeigt die Streudiagramme der Proben, die jeweils ausschließlich Polystyrolpartikel mit unterschiedlichen Durchmessern oder Siliziumdioxidpartikel mit unterschiedlichen Durchmessern enthielten. Die Ergebnisse veranschaulichen die Möglichkeit der Diskriminierung von Partikeln mit unterschiedlichen Größen sowohl für Proben mit Polystyrolpartikeln als auch für Proben mit Siliziumdioxidpartikeln. Im Allgemeinen nimmt mit abnehmender Partikelgröße die Streulichtintensität ab und die Streulichtverteilung bewegt sich in den Streudiagrammen von rechts oben nach links unten.
In der dritten Probengruppe, die eine realistischere reale Proben nachahmt, wurde eine Mischung von Polystyrolpartikeln und Siliziumdioxidpartikeln mit unterschiedlichen Durchmessern von 10 µm, 5 µm und 2 µm untersucht. 9 zeigt die Streudiagramme der Probe sowohl in logarithmischer als auch in linearer Darstellung. Sowohl das SSC-BSC-Streudiagramm als auch das FSC-BSC-Streudiagramm zeigen eine klare Unterscheidung zwischen Polystyrolpartikeln und Siliziumdioxidpartikeln, während im SSC-FSC-Streudiagramm der Unterschied nicht erkennbar ist. Eine solche Unterscheidung ist in den Streudiagrammen mit linearen Skalen deutlicher zu sehen, insbesondere im FSC-BSC-Streudiagramm mit zwei armförmigen, vertikalen und horizontalen Streuwertverteilungen für die Polystyrolpartikel und die Siliziumdioxidpartikel.
Die Effizienz der Partikelunterscheidung in FSC-BSC-Streudiagrammen ist im Vergleich zu den SSC-BSC-Streudiagrammen und den SSC-FSC-Streudiagrammen höher, da die Vorwärtsstreuung empfindlicher auf die Partikelgröße reagiert und die Rückstreuung sowohl von der Größe als auch der internen Struktur der Partikel abhängt. Zwar hat die Seitenstreuung ähnliche Eigenschaften wie die Rückstreuung, sie reagiert aber weniger empfindlich auf die innere Struktur. Dementsprechend haben Rückstreuung und Vorwärtsstreuung weniger Gemeinsamkeiten, sodass FSC-BSC-Streudiagramme die materiellen Unterschiede besser darstellen.
Im Ergebnis konnte das erfindungsgemäße Messsystem erfolgreich einzelne Partikel mit Durchmessern im Bereich von 10 µm bis 200 nm bei einer Mindestkonzentration von ca. 10⁶ Partikeln pro ml nachweisen und bei einem Probenfluss von 50 µl/min kontinuierlich zählen. Darüber hinaus konnten in Proben gemischter Größen und Materialien mit unterschiedlichen Brechungsindizes die Partikel auf der Grundlage ihrer Größe und Materialtypen durch die Auswertung der Rückstreuung erfolgreich sortiert werden.
Bezugszeichenliste

1: Optofluidischer Chip
2: Flüssigkeitskanal
3: Messbereich
4: Optische Einheit
5: Optikkanal
6: Optikkanal
7: Optikkanal
8: Optikkanal
9: Zulaufkanal
10: Probenzulauf
11: Messsystem
12: Lichtquelle
13: Primärer Lichtstrahl
14: Optische Faser
15: Detektor
16: Optische Faser
17: Auswertemodul
18: Probe
19: Partikel
30: Führen einer flüssigen Probe durch einen Flüssigkeitskanal
31: Beleuchten eines Messbereichs mit einem Lichtstrahl
32: Erfassen von Licht, das aus Rückstreuung resultiert
33: Erfassen von Licht, das aus Vorwärtsstreuung oder Seitenstreuung resultiert
34: Diskriminieren von Partikeln nach Größe oder Material
40: Mikrolinse
41: Mikrolinse
42: Aussparung

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 6869569 B2 [0004]
EP 2742337 B1 [0006]
EP 2739955 A1 [0008]

Claims

Verfahren zum Untersuchen von Partikeln (19) in einer flüssigen Probe (18) unter Verwendung eines miniaturisierten optofluidischen Chips (1), mit den Schritten: - Führen (30) der flüssigen Probe (18) durch einen Flüssigkeitskanal (2) des miniaturisierten optofluidischen Chips (1); - Beleuchten (31) eines Messbereichs (3) des Flüssigkeitskanals (2) mit einem primären Lichtstrahl (13); - Erfassen (32) von Licht, das aus Rückstreuung des primären Lichtstrahls (13) an einem Partikel (19) resultiert, welches sich durch den Messbereich (3) bewegt; und - Erfassen (33) von Licht, das aus Vorwärtsstreuung und/oder Seitenstreuung des primären Lichtstrahls (13) an dem Partikel (19) resultiert, welches sich durch den Messbereich (3) bewegt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei anhand von Messwerten für das aus Rückstreuung resultierende Licht in Kombination mit Messwerten für das aus Vorwärtsstreuung oder Seitenstreuung resultierende Licht eine Diskriminierung (34) nach Größe oder Material der Partikel (19) erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Messwerte Spannungsäquivalente des erfassten Lichts sind.
Computerprogramm mit Instruktionen, die bei Ausführung durch einen Computer den Computer zur Ausführung der Schritte eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Untersuchen von Partikeln (19) in einer flüssigen Probe (18) veranlassen.
Miniaturisierter optofluidischer Chip (1) zum Untersuchen von Partikeln (19) in einer flüssigen Probe (18), mit: - einem Flüssigkeitskanal (2) zum Führen der flüssigen Probe (18) durch einen Messbereich (3); - einer optischen Einheit (4) zum Fokussieren eines primären Lichtstrahls (13) in den Messbereich (3); und - zumindest einem Optikkanal (5) zum Aufnehmen von optischen Elementen (14) zum Sammeln von Licht, das aus Rückstreuung des primären Lichtstrahls (13) an einem Partikel (19) resultiert, welches sich durch den Messbereich (3) bewegt.
Miniaturisierter optofluidischer Chip (1) gemäß Anspruch 5, mit zumindest einem weiteren Optikkanal (5, 6, 7) zum Aufnehmen eines optischen Elements (14) zum Sammeln von Licht, das aus Rückwärtsstreuung, Vorwärtsstreuung oder Seitenstreuung des primären Lichtstrahls (13) an einem Partikel (19) resultiert, welches sich durch den Messbereich (3) bewegt.
Miniaturisierter optofluidischer Chip (1) gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei der Optikkanal (5) für das aus Rückstreuung resultierende Licht in einem Winkel zwischen 120° bis 150° oder -120° bis -150° in Bezug auf die optische Achse des primären Lichtstrahls (13) angeordnet ist.
Miniaturisierter optofluidischer Chip (1) gemäß Anspruch 7, wobei ein Optikkanal (6) für das aus Vorwärtsstreuung resultierende Licht in einem Winkel von ±15° in Bezug auf die optische Achse des primären Lichtstrahls (13) angeordnet ist und/oder ein Optikkanal (7) für das aus Seitenstreuung resultierende Licht in einem Winkel von ±60° in Bezug auf die optische Achse des primären Lichtstrahls (13) angeordnet ist.
Miniaturisierter optofluidischer Chip (1) gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei die Optikkanäle (5, 6, 7) ausgestaltet sind, optische Fasern (14) aufzunehmen.
Miniaturisierter optofluidischer Chip (1) gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei die optische Einheit (4) zwei oder mehr Mikrolinsen (40, 41) zur Kollimation und Fokussierung des primären Lichtstrahls (13) aufweist.
Miniaturisierter optofluidischer Chip (1) gemäß Anspruch 10, wobei die zwei oder mehr Mikrolinsen (40, 41) durch Aussparungen (42) des miniaturisierten optofluidischen Chips (1) gebildet sind.
Miniaturisierter optofluidischer Chip (1) gemäß einem der Ansprüche 5 bis 11, wobei der miniaturisierte optofluidische Chip (1) zumindest eine Mikrolinse (43) zum Sammeln von Licht aufweist, das aus Vorwärtsstreuung, Seitenstreuung oder Rückstreuung des primären Lichtstrahls (13) an einem Partikel (19) resultiert.
Miniaturisierter optofluidischer Chip (1) gemäß einem der Ansprüche 5 bis 12, mit in einen Probenzulauf (10) mündenden Zulaufkanälen (9) zum Ausbilden einer Hüllströmung.
Miniaturisierter optofluidischer Chip (1) gemäß einem der Ansprüche 5 bis 13, wobei der miniaturisierte optofluidische Chip (1) Abmessungen von X≤15 mm, Y≤30 mm und Z≤8 mm hat.
Messsystem (11) zum Untersuchen von Partikeln (19) in einer flüssigen Probe (18), mit: - einem miniaturisierten optofluidischen Chip (1) gemäß einem der Ansprüche 5 bis 14; - einer Lichtquelle (12) zum Erzeugen eines primären Lichtstrahls (13); - einer optischen Faser (14) zum Führen des primären Lichtstrahls (13) in den miniaturisierten optofluidischen Chip (1); - Detektoren (15) zum Erfassen (32, 33) von Licht, das aus Rückstreuung sowie aus Vorwärtsstreuung und/ oder Seitenstreuung des primären Lichtstrahls (13) an einem Partikel (19) resultiert, welches sich durch einen Messbereich (3) des miniaturisierten optofluidischen Chips (1) bewegt; - optischen Fasern (16) zum Führen des aus Rückstreuung, Vorwärtsstreuung und/oder Seitenstreuung resultierenden Lichts zu den Detektoren (15); und - einem Auswertemodul (17) zum Diskriminieren (34) der Partikel (19) nach Größe oder Material anhand von Messwerten für das aus Rückstreuung resultierende Licht in Kombination mit Messwerten für das aus Vorwärtsstreuung oder Seitenstreuung resultierende Licht.