DE102020111786A1

DE102020111786A1 - Verfahren für die beschleunigte Mikroskopie großer Proben

Info

Publication number: DE102020111786A1
Application number: DE102020111786.8A
Authority: DE
Inventors: Christian SEEBACHER; Andreas Deeg; Rainer Uhl
Original assignee: Till I D GmbH
Current assignee: Till I D GmbH
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2021-06-10
Anticipated expiration: 2040-05-01
Also published as: EP4143620A1; DE102020111786B4; US20230168479A1; WO2021219613A1

Abstract

Ein Verfahren zum Aufnehmen eines Mikroskopbildes einer Probe, die größer als ein Sichtfeld eines Mikroskops ist, wobei das Verfahren Folgendes beinhaltet: Herbeiführen, durch mindestens eine Steuereinheit, einer kontinuierlichen relativen Bewegung zwischen einer Probe und dem Mikroskop, wobei die optische Achse eines Mikroskopobjektivs im Wesentlichen senkrecht zu dem Vektor der relativen Bewegung ist, Beleuchten, durch eine durch die mindestens eine Steuereinheit gesteuerte Lichtquelle, eines Teils der Probe durch das Mikroskopobjektiv, wobei der beleuchtete Teil der Probe kleiner als das Sichtfeld ist und einen Beleuchtungsspalt bildet, Bewegen, durch eine durch die mindestens eine Steuereinheit gesteuerte Scaneinheit, des Beleuchtungsspaltes in eine Scanrichtung über das Sichtfeld und Detektieren, durch einen durch die mindestens eine Steuereinheit gesteuerten Detektor, von Licht von der Probe, das durch das Mikroskopobjektiv aufgefangen wird, wobei die Probe in die gleiche Richtung wie die Scanrichtung oder in eine zu der Scanrichtung senkrechte Richtung bewegt wird, während der Beleuchtungsspalt durch das Scannen über das Sichtfeld bewegt wird.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Offenbarung betrifft das Gebiet der Mikroskopie. Insbesondere ein Mikroskopbild einer Probe, die größer als ein Sichtfeld eines Mikroskops ist. Außerdem betrifft die Offenbarung ein Computerprogrammprodukt und einen computerlesbaren Datenträger. Der computerlesbare Datenträger beinhaltet computerausführbare Befehle, die, wenn ausgeführt durch die mit Prozessoren ausgestattete(n) jeweilige(n) Vorrichtung(en), bewirken, dass die Vorrichtung(en) die Verfahrensschritte der Offenbarung auf der jeweiligen Vorrichtung durchführt/durchführen.
Hintergrund
Das Sichtfeld eines Mikroskops hängt von seiner Vergrößerung und somit von der Vergrößerung der verwendeten Objektivlinse ab. In einem kamerabasierten Mikroskop bewirken die Abmessungen des Sensors zusätzliche Einschränkungen, da der (üblicherweise) rechteckige Sensor in den durch die Mikroskopoptik abgebildeten kreisförmigen Bereich passen muss. Im Falle einer Mikroskopabbildung mithilfe einer in die Bildebene eines Mikroskops platzierten Kamera sind die Chip-Abmessungen gemeint, wann immer auf das Sichtfeld des Mikroskops Bezug genommen wird, oder die Chip-Abmessungen können als äquivalent zu dem Sichtfeld des Mikroskops angesehen werden.
Wann immer das Ziel ist, Proben zu kartieren, die größer als das Sichtfeld des Mikroskops sind, zum Beispiel bei Screening-Anwendungen, bei denen Probenbereiche auf einer Mikrotiterplatte in Form von Wells gruppiert werden und bei denen jedes Well über den durch ein individuelles Kameraeinzelbild erfassten Bereich hinausgeht, erfordert das Untersuchen der ganzen Mikrotiterplatte üblicherweise das Bewegen der Probe und das Erfassen mehrerer Bilder. Diese Bilder werden dann zusammengefügt, um ein zusammengesetztes Bild der gesamten Probe zu erzeugen. Das Bewegen der Probe auf eine solche Weise, dass die individuellen Bilder teilweise überlappen, erleichtert die Erzeugung des zusammengesetzten Bildes. Je höher die Vergrößerung, desto mehr Bilder müssen jedoch gemacht werden und desto häufiger muss die Probe beschleunigt, angehalten und gemessen werden. Zum Beispiel: mit einem 60x-Objektiv und einer Kamerachip-Größe von 13,2 x 13,2 mm erfordert das Kartieren einer 96-Well-Platte 76 000 Stop-and-Go-Zyklen! Selbst mit der bestmöglichen Ausrüstung benötigt dies mehrere Stunden.
Die Patentveröffentlichung WO/2020/038754 lehrt ein Konzept zum Erfassen von Bildern von einer sich kontinuierlich bewegenden Probe, das in einseitig gestauchten Bildern der Probe resultiert, wobei ein spaltförmiges Beleuchtungsmuster, das zu der Probenbewegung senkrecht ausgerichtet ist, mit einem spaltförmigen Detektionsfenster einer Kamera synchronisiert wird und sich beide in entgegengesetzter Richtung zu der Probenbewegung bewegen. Das Ausmaß, in dem das resultierende Bild in der Scanrichtung gestaucht wird, hängt davon ab, wie schnell sich die Probe in eine und die Spaltbeleuchtung in die entgegengesetzte Richtung bewegen. Wenn sich zum Beispiel beide mit identischer Geschwindigkeit bewegen, führt dies zu einer zweifachen einseitigen Stauchung des Bildes. Wenn dies mit einem äquivalenten Zusammenlegen (Binning) zweier Pixel in einer zu der Scan- und Spaltbewegung senkrechten Richtung übereinstimmt, ist das Resultat eine symmetrische, zweifach reduzierte „virtuelle Vergrößerung“ des aufgenommenen Bildes. Diese reduzierte Auflösung ist gewollt, da das Ziel darin besteht, den herkömmlichen Stop-and-Go-Ansatz zu ersetzen, der üblicherweise das Wechseln zu einem Objektiv geringer Vergrößerung, das Erhalten eines Überblicks auf die übliche Stop-and-Go-Weise und das anschließende Wechseln zu einem Objektiv hoher Vergrößerung, um die Bereich von Interesse erneut aufzusuchen, beinhaltet.
Demgemäß besteht ein Bedarf an der Verbesserung der Möglichkeiten zum Aufnehmen eines Mikroskopbildes einer Probe, die größer als ein Sichtfeld eines Mikroskops ist, z. B. um die Beschränkung in Hinsicht auf Geschwindigkeit und Genauigkeit zu überwinden.
Übersicht der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zielt darauf hin, ausgedehnte Bereiche (die größer als das Sichtfeld der Kamera sind) einer mikroskopischen fluoreszierenden Probe zu scannen, ohne mit der üblichen Stop-and-Go-Prozedur aufgenommene Kacheln zusammenzufügen, um mindestens einige der Beschränkungen des Stands der Technik zu überwinden. Dies wird dadurch erreicht, dass eine sich kontinuierlich bewegende Probe mit einer spaltförmigen Beleuchtung, die sich wie nachstehend beschrieben wiederholt über die Probe bewegt, angeregt wird. Hierin ist „oder“ einschließend und nicht ausschließend gemeint, außer dies wird ausdrücklich anderweitig angegeben oder durch den Zusammenhang anderweitig angezeigt. „A oder B“ bedeutet hierin daher „A, B oder beide“, außer ausdrücklich anderweitig angegeben oder durch den Zusammenhang anderweitig angezeigt. Außerdem ist „und“ sowohl zusammen als auch einzeln gemeint, außer ausdrücklich anderweitig angegeben oder durch den Zusammenhang anderweitig angezeigt. „A und B“ bedeutet hier daher „A und B zusammen oder einzeln“, außer ausdrücklich anderweitig angegeben oder durch den Zusammenhang anderweitig angezeigt.
Demgemäß stellt die vorliegende Offenbarung eine oder mehrere Lösungen für die Probleme und Nachteile des Stands der Technik bereit. Andere technische Vorteile der vorliegenden Offenbarung werden einem Fachmann aus der nachfolgenden Beschreibung und den nachfolgenden Patentansprüchen leicht ersichtlich sein. Demgemäß richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren und eine Vorrichtung gemäß den angehängten Patentansprüchen zum Scannen ausgedehnter Bereiche (die größer als das Sichtfeld der Kamera sind) einer mikroskopischen fluoreszierenden Probe, ohne mit der üblichen Stop-and-Go-Prozedur aufgenommene Kacheln zusammenzufügen, indem eine sich kontinuierlich bewegende Probe mit einer spaltförmigen Beleuchtung, die sich wiederholt über die Probe bewegt, angeregt wird. Da diese Erfindung Mikroskopabbildungen mit der Hilfe eines Detektors wie etwa einer in die Bildebene eines Mikroskops platzierten Kamera betrifft, sind dessen Chip-Abmessungen, vorzugsweise rechteckige Chip-Abmessungen gemeint, wann immer auf das Sichtfeld des Mikroskops Bezug genommen wird.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Aufnehmen eines Mikroskopbildes einer Probe, die größer als ein Sichtfeld eines Mikroskops ist, bereitgestellt, wobei das Verfahren Folgendes beinhaltet: Herbeiführen, durch eine Steuereinheit, einer kontinuierlichen relativen Bewegung zwischen einer Probe und dem Mikroskop, wobei die optische Achse eines Mikroskopobjektivs zu dem Vektor der relativen Bewegung im Wesentlichen senkrecht ist;
Beleuchten, durch eine durch die mindestens eine Steuereinheit gesteuerte Lichtquelle, eines Teils der Probe durch das Mikroskopobjektiv, wobei der beleuchtete Teil der Probe kleiner als das Sichtfeld ist und einen Beleuchtungsspalt bildet;
Bewegen, durch eine durch die mindestens eine Steuereinheit gesteuerte Scaneinheit, des Beleuchtungsspaltes in eine Scanrichtung über das Sichtfeld; und Detektieren, durch einen durch die mindestens eine Steuereinheit gesteuerten Detektor, von Licht von der Probe, das durch das Mikroskopobjektiv aufgefangen wird;
dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in die gleiche Richtung wie die Scanrichtung oder in eine zu der Scanrichtung senkrechte Richtung bewegt wird, während der Beleuchtungsspalt durch das Scannen über das Sichtfeld bewegt wird. Herbeiführen einer kontinuierlichen relativen Bewegung zwischen einer Probe und dem Mikroskop ist in dem Sinne der vorliegenden Erfindung so zu verstehen, dass entweder die Probe bewegt wird, d. h. unter Verwendung eines motorisierten Tisches, der durch die mindestens eine Steuereinheit bewegt wird, und das Mikroskop stationär ist, sodass die Probe relativ zu dem Mikroskop bewegt wird, oder so, dass die Probe stationär ist und das Mikroskop bewegt wird. Demgemäß kann statt des Bewegens der Probe relativ zu dem Mikroskop im Prinzip auch das Mikroskop relativ zu der Probe bewegt werden. Angesichts dessen, dass das Mikroskop üblicherweise ein viel massigeres Instrument als der Tisch und die Probe zusammen ist, ist ein sich bewegender Tisch die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. Es ist zu beachten, dass in dem Fall, dass das Mikroskop relativ zu der Probe bewegt wird, die später verwendeten Begriffe für Scanrichtungen umgekehrt werden. Des Weiteren ist der Ausdruck im Wesentlichen senkrecht so zu verstehen, dass der Vektor der relativen Bewegung zwischen der Probe und dem Mikroskop ungeachtet dessen, ob die Probe in Bezug auf das Mikroskop bewegt wird oder das Mikroskop in Bezug auf die Probe bewegt wird, innerhalb einer Spannweite von +/-10° zu einer Senkrechten zu der optischen Achse des Mikroskops ist, vorzugsweise innerhalb einer Spannweite von +/- 5° zu einer Senkrechten der optischen Achse des Mikroskops. Der Bewegungsvektor zwischen der Probe und dem Mikroskop ist so zu verstehen, dass er die Bewegung der Probe in Bezug auf das Mikroskop beschreibt, ungeachtet dessen, welcher Teil, d. h. die Probe, das Mikroskop oder beide, aktiv bewegt wird.
Eine Lichtquelle in dem Sinne der vorliegenden Erfindung kann jegliche Art von dem Fachmann bekannter Lichtquelle sein, die geeignet ist, in einer Probe Fluoreszenz hervorzurufen, und von den Eigenschaften der zu untersuchenden Probe abhängt.
Die mindestens eine Steuereinheit ist mindestens ein Computersystem, das konfiguriert ist, um einen oder mehrere Schritte eines oder mehrerer hierin beschriebener oder veranschaulichter Verfahren durchzuführen. In bestimmten Ausführungsformen stellen ein oder mehrere Computersysteme hierin beschriebene oder veranschaulichte Funktionalität bereit. In bestimmten Ausführungsformen führt auf einem oder mehreren Computersystemen ausgeführte Software einen oder mehrere Schritte eines oder mehrerer hierin beschriebener oder veranschaulichter Verfahren durch oder stellt hierin beschriebene oder veranschaulichte Funktionalität bereit. Die Steuereinheit kann eine Speichereinrichtung für Daten oder Befehle umfassen. Beispielhaft und nicht beschränkend kann die Speichereinrichtung ein Festplattenlaufwerk (HDD), ein Diskettenlaufwerk, einen Flash-Speicher, eine optische Platte, eine magnetooptische Diskette, Magnetband oder ein Universal-Serial-Bus(USB)-Laufwerk oder eine Kombination von zwei oder mehr von diesen umfassen. Die Speichereinrichtung kann entfernbare oder nicht entfernbare (oder feste) Datenträger umfassen, wo angemessen. Die Speichereinrichtung kann innerhalb oder außerhalb des Computersystems befindlich sein, wo angemessen. In bestimmten Ausführungsformen ist die Speichereinrichtung ein nichtflüchtiger Festkörperspeicher. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Speichereinrichtung einen Festwertspeicher (ROM). Wo angemessen, kann dieser ROM ein maskenprogrammierter ROM, programmierbarer ROM (PROM), löschbarer PROM (EPROM), elektrisch löschbarer PROM (EEPROM), elektrisch umprogrammierbarer ROM (EAROM) oder ein Flash-Speicher oder eine Kombination von zwei oder mehr von diesen sein. Die Speichereinrichtung kann ein oder mehrere Speichereinrichtungssteuereinheiten umfassen, die die Kommunikation zwischen einem Prozessor der Steuereinheit und der Speichereinrichtung erleichtern, wo angemessen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren ferner das Korrigieren des aufgenommenen mikroskopischen Bildes zum Kompensieren 1-dimensionaler Bildverformungen oder 2-dimensionaler Bildverformungen, die durch die kontinuierliche Bewegung der Probe verursacht werden, beinhalten. In dem Fall, dass die Probe in die gleiche Richtung wie die Scanrichtung bewegt wird, kann die Korrektur eine Bildschrumpfung in der Scanrichtung beinhalten, wobei das Ausmaß der Schrumpfung von der relativen Geschwindigkeit der Probenbewegung und der Bewegung des Spaltes der Spaltbeleuchtung abhängt. Alternativ beinhaltet die Korrektur in dem Fall, dass die Probe in eine zu der Scanrichtung senkrechte Richtung bewegt wird, eine Bildscherung senkrecht zu der Scanrichtung, wobei das Ausmaß der Scherung von der relativen Geschwindigkeit der Probenbewegung und der Bewegung des Spaltes der Spaltbeleuchtung abhängt.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Detektor eine Kamera sein, die durch die mindestens eine Steuereinheit gesteuert werden kann. Die von der Erfindung verwendete Kamera wird vorzugsweise auf eine derartige Weise gesteuert, dass die Bildfrequenz der Bildaufnahme mindestens ungefähr mit der Zeit synchronisiert ist, die zum Bewegen der Spaltbeleuchtung von einer Ausgangsposition an einem Ende des Detektors zu einem entgegengesetzten Ende des Detektors benötigt wird. Die Kamera kann alternativ auf eine derartige Weise gesteuert werden, dass die Bildfrequenz der Bildaufnahme von der Zeit, die zum Bewegen der Spaltbeleuchtung von einer Ausgangsposition an einem Ende des Detektors zu einem entgegengesetzten Ende des Detektors benötigt wird, unabhängig ist. Alternativ oder zusätzlich dazu wird der Detektor durch die mindestens eine Steuereinheit auf eine derartige Weise gesteuert, dass zu einer Zeit nur eine streifenartige Zone des Detektors zum Detektieren von Licht aktiviert wird, wobei die aktivierte Zone in mindestens ungefährer Synchronizität mit der Bewegung des Bildes des Beleuchtungsspaltes auf dem Detektor über den Detektor bewegt wird, um das Bild des beleuchteten Teils der Probe in der Mitte der aktivierten Zone des Detektors zu halten, und wobei die aktive Zone von einer Ausgangsposition an einem Ende des Detektors zu einem entgegengesetzten Ende des Detektors bewegt wird.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung des Verfahrens kann die Probe unter Verwendung strukturierter Beleuchtung beleuchtet werden, das heißt mit einer räumlich modulierten Spaltbeleuchtung, die eine Probenregion mehrere Male passieren muss, bevor jedes Anregungsvolumen mindestens einmal beleuchtet worden ist.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens, in der die Probe in die gleiche Richtung wie die Scanrichtung bewegt wird, kann die Probe mit einer Geschwindigkeit bewegt werden, die sich auf 5 % bis 50 % der Geschwindigkeit der Bewegung des Beleuchtungsspaltes beläuft, vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit, die sich auf (i) 12,5 %, (ii) 25 %, (iii) 33 % oder (iv) 50 % der Geschwindigkeit der Bewegung des Beleuchtungsspaltes beläuft. Somit wird jede Probenposition in einem einzigen Überstreichen 7-mal, 3-mal, 2-mal bzw. 1-mal abgebildet. Ein Überstreichen in dem Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Ausführung einer kontinuierlichen relativen Bewegung ohne Anhalten und optional ohne Änderung der Richtung zwischen der Probe und dem Mikroskop, ungeachtet dessen, ob die Probe in Bezug auf das Mikroskop bewegt wird oder das Mikroskop in Bezug auf die Probe bewegt wird, bis der gesamte, vordefinierte oder benutzerausgewählte Bereich der Probe in das Sichtfeld des Mikroskops gebracht worden ist. In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann die Geschwindigkeit der Bewegung der Probe in Bezug auf die Geschwindigkeit der Bewegung des Beleuchtungsspaltes abgestimmt werden, um Verzögerungen zu kompensieren, die durch die zum Rückkehren des Beleuchtungsspaltes in seine Anfangsposition benötigte Zeit verursacht werden. Diese hardwarespezifischen Korrekturen an den oben erwähnten Bewegungsgeschwindigkeitsverhältnissen liegen gleichfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung.
In noch einer anderen Ausführungsform des Verfahrens, in der die Probe in eine zu der Scanrichtung senkrechte Richtung bewegt wird, kann die Probe mit der gleichen Geschwindigkeit wie die Geschwindigkeit der Bewegung des Beleuchtungsspaltes bewegt werden. In Ausführungsformen kann die Probe mit einer Geschwindigkeit bewegt werden, die sich auf (i) 100 %, (ii) 50 % oder (iii) 33 % der Geschwindigkeit der Bewegung des Beleuchtungsspaltes beläuft. Jede Probenposition kann in einem einzigen Überstreichen 1-mal, 2-mal bzw. 3-mal abgebildet werden. In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann die Geschwindigkeit der Bewegung der Probe in Bezug auf die Geschwindigkeit der Bewegung des Beleuchtungsspaltes abgestimmt werden, um Verzögerungen zu kompensieren, die durch die zum Rückkehren des Beleuchtungsspaltes in seine Anfangsposition benötigte Zeit verursacht werden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wobei mindestens eine, vorzugsweise jede Position der Probe mehrere Male gescannt werden kann, vorzugsweise 7-mal (i), 3-mal (ii), 2-mal (iii) oder einmal (iv).
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der mindestens eine Position der Probe mehrere Male gescannt wird, kann mindestens ein Parameter des Scanverfahrens zwischen wiederholten Scanereignissen der gescannten Position geändert werden. Parameter, die geändert werden können, können aus der Art der Beleuchtung oder der Fokusposition ausgewählt werden, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Art der Beleuchtung kann gemäß der vorliegenden Erfindung das Beleuchtungsmuster, wie etwa z. B. Beleuchtung mit strukturiertem Licht, die Beleuchtungswellenlänge und/oder Kombinationen von Beleuchtungswellenlängen oder die Beleuchtungsintensität beinhalten.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Geschwindigkeit der Bewegung der Probe in Bezug auf die Geschwindigkeit der Bewegung des Beleuchtungsspaltes abgestimmt werden, um Verzögerungen zu kompensieren, die durch die zum Rückkehren des Beleuchtungsspaltes in seine Anfangsposition benötigte Zeit verursacht werden. Die Abstimmung kann mathematisch erfolgen.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Scaneinheit durch die mindestens eine Steuereinheit derart gesteuert werden, dass, wenn die aktivierte Zone auf dem Detektor das Ende der Länge des Detektors erreicht, die Beleuchtung der Probe durch die Lichtquelle unterbrochen wird, während der Beleuchtungsspalt zurück zur Ausgangsposition bewegt wird, um einen Scanzyklus zu vollenden. Zusätzlich kann der Scanzyklus wiederholt werden, während die Probe bewegt wird, bis ein gewünschter Bereich der Probe durch den Beleuchtungsspalt abgedeckt worden ist, wobei in jedem Scanzyklus ein Bild der Probe oder eines Bereichs oder Abschnitts der Probe produziert wird. Bilder eines Bereichs oder Abschnitts der Probe können Bilder, die von benachbarten Bereichen oder Abschnitten der Probe produziert wurden, mindestens teilweise überlappen. Produzierte Bilder können zusammengefügt werden, um ein zusammengesetztes Bild des gesamten Bereichs der gescannten Probe zu produzieren. Die Kompensation 1-dimensionaler Bildverformungen oder 2-dimensionaler Bildverformungen, welche durch die kontinuierliche Bewegung der Probe verursacht werden, können auf der Basis der während individueller Scanzyklen aufgenommenen Bilder oder auf der Basis des zusammengesetzten Bildes durchgeführt werden.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung richtet sich ferner auf eine Mikroskopvorrichtung, die Folgendes beinhaltet: ein Mikroskopobjektiv, mindestens eine Steuereinheit, einen Probentisch zum Halten einer Probe, ein Mittel zum Herbeiführen einer relativen Bewegung zwischen einer Probe und dem Mikroskop, eine Lichtquelle, ein Beleuchtungsspalt formendes Element, eine Scaneinheit und einen Detektor, wobei die Vorrichtung konfiguriert ist, das Verfahren gemäß den verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie oben und in der ausführlichen Beschreibung beschrieben, durchzuführen. Das Mittel zum Herbeiführen der relativen Bewegung im Sinne der vorliegenden Erfindung kann ein motorisierter Tisch sein, der die Probe hält und durch die mindestens eine Steuereinheit gesteuert wird, um die Probe relativ zu dem Mikroskop, welches stationär gehalten wird, zu bewegen. Alternativ kann das Mittel zum Herbeiführen der Bewegung das Mikroskop bewegen, während die Probe in dem Tisch stationär gehalten wird. Alternativ kann die Bewegung durch eine Kombination von einem motorisierten Tisch, der die Probe bewegt, und einem zusätzlichen Mittel zum Bewegen des Mikroskops herbeigeführt werden.
Die mindestens eine Steuereinheit ist mindestens ein Computersystem, das konfiguriert ist, um einen oder mehrere Schritte eines oder mehrerer hierin beschriebener oder veranschaulichter Verfahren durchzuführen. In bestimmten Ausführungsformen stellen ein oder mehrere Computersysteme hierin beschriebene oder veranschaulichte Funktionalität bereit. In bestimmten Ausführungsformen führt auf einem oder mehreren Computersystemen ausgeführte Software einen oder mehrere Schritte eines oder mehrerer hierin beschriebener oder veranschaulichter Verfahren durch oder stellt hierin beschriebene oder veranschaulichte Funktionalität bereit. Die Steuereinheit kann eine Speichereinrichtung für Daten oder Befehle umfassen. Beispielhaft und nicht beschränkend kann die Speichereinrichtung ein Festplattenlaufwerk (HDD), ein Diskettenlaufwerk, einen Flash-Speicher, eine optische Platte, eine magnetooptische Diskette, Magnetband oder ein Universal-Serial-Bus(USB)-Laufwerk oder eine Kombination von zwei oder mehr von diesen umfassen. Die Speichereinrichtung kann entfernbare oder nicht entfernbare (oder feste) Datenträger umfassen, wo angemessen. Die Speichereinrichtung kann innerhalb oder außerhalb des Computersystems befindlich sein, wo angemessen. In bestimmten Ausführungsformen ist die Speichereinrichtung ein nichtflüchtiger Festkörperspeicher. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Speichereinrichtung einen Festwertspeicher (ROM). Wo angemessen, kann dieser ROM ein maskenprogrammierter ROM, programmierbarer ROM (PROM), löschbarer PROM (EPROM), elektrisch löschbarer PROM (EEPROM), elektrisch umprogrammierbarer ROM (EAROM) oder ein Flash-Speicher oder eine Kombination von zwei oder mehr von diesen sein. Die Speichereinrichtung kann ein oder mehrere Speichereinrichtungssteuereinheiten umfassen, die die Kommunikation zwischen einem Prozessor der Steuereinheit und der Speichereinrichtung erleichtern, wo angemessen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung richtet sich ferner auf einen nicht transitorischen computerlesbaren Datenträger, der darauf Befehle beinhaltet, die, wenn sie auf einem Prozessor ausgeführt werden, bewirken, dass eine Mikroskopvorrichtung gemäß der Erfindung, wie oben und in der ausführlichen Beschreibung beschrieben, das Verfahren gemäß den verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie oben und in der ausführlichen Beschreibung beschrieben, durchführt. Ein computerlesbarer, nicht transitorischer Speicherungsdatenträger oder computerlesbare, nicht transitorische Speicherungsdatenträger kann/können ein oder mehrere halbleiterbasierte oder andere integrierte Schaltungen (ICs) (wie beispielsweise frei programmierbare logische Anordnungen (FPGAs) oder anwendungsspezifische ICs (ASICs)), Festplattenlaufwerke (HDDs), Hybridfestplatten (HHDs), optische Platten, Laufwerke für optische Platten (ODDs), magnetooptische Disketten, magnetooptische Laufwerke, Disketten, Diskettenlaufwerke (FDDs), Magnetbänder, Festkörperlaufwerke (SSDs), RAM-Laufwerke, SECURE-DIGITAL-Karten oder - Laufwerke, beliebige anderen geeigneten computerlesbaren, nicht transitorischen Speicherungsdatenträger oder jegliche geeignete Kombination von zwei oder mehr von diesen umfassen, wo angemessen. Ein computerlesbarer, nicht transitorischer Speicherungsdatenträger kann flüchtig, nicht flüchtig oder eine Kombination von flüchtig und nicht flüchtig sein, wo angemessen.
Figurenliste

1 zeigt, wie die Auflösung mit zunehmender Geschwindigkeit der Tisch-/Probenbewegung relativ zu der Geschwindigkeit des Beleuchtungsspaltes reduziert wird, wenn sich beide senkrecht oder antiparallel bewegen.
2 skizziert die Bildaufnahme und Korrekturprozedur für eine senkrechte Bewegung von Probe und Beleuchtung.
3 skizziert die Bildaufnahme und Korrekturprozedur für eine parallele Bewegung von Probe und Beleuchtung.
4 zeigt die erreichte Auflösung in Scanrichtung als eine Funktion der Geschwindigkeit des Beleuchtungsspaltes relativ zu der Probengeschwindigkeit.
5 zeigt schematisch die Verwendung einer räumlich modulierten Spaltbeleuchtung in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
6 zeigt eine schematische Übersicht eines erfindungsgemäßen Mikroskops.

Die beiliegenden Zeichnungen veranschaulichen beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung und dienen der beispielhaften Erläuterung der Grundsätze der Erfindung.
Ausführliche Beschreibung
Die vorliegende Erfindung wird nun hiernach mit Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen, in denen bevorzugten Ausführungsformen gezeigt sind, näher beschrieben. Das Verfahren kann jedoch in vielen verschiedenen Formen verkörpert werden und sollte nicht als auf die hier dargelegten Ausführungsformen beschränkt ausgelegt werden. Es sei angemerkt, dass diese Figuren zur Veranschaulichung der allgemeinen Merkmale der in gewissen Ausführungsformen genutzten Verfahren vorgesehen sind. Diese Figuren geben jedoch die exakte Struktur oder das exakte Leistungsmerkmal einer gegebenen Ausführungsform möglicherweise nicht exakt wieder. Zudem bezeichnen gleiche Bezugszeichen in den Figuren entsprechende Teile über die verschiedenen Ansichten oder Ausführungsformen hinweg.
Die vorliegende Erfindung zielt auch darauf ab, große Probenbereiche mit einer sich kontinuierlich bewegenden Probe zu kartieren, um ein vollständig aufgelöstes Mikroskopbild mit der gewünschten Endvergrößerung aufzunehmen, ohne Auflösung in der Scanrichtung zu opfern. Zu diesem Zweck wird die Richtung einer sich kontinuierlich bewegenden Probe nicht antiparallel zu der Bewegung eines spaltförmigen Beleuchtungsmusters gemacht. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Probe senkrecht zu der Scanrichtung kontinuierlich bewegt. In einer anderen Ausführungsform wird die Probe parallel zur, d. h. in die gleiche Richtung wie die Scanrichtung bewegt.
1 zeigt, wie die Auflösung mit zunehmender Scangeschwindigkeit relativ zu der Geschwindigkeit des Beleuchtungsspaltes abfällt in dem Fall, dass sich beide auf antiparallele Weise bewegen, wie aus Verfahren zum Aufnehmen von Bildern sich kontinuierlich bewegender Proben gemäß dem Stand der Technik bekannt ist. Wie oben skizziert, verschwimmen in dem Fall, dass sich die Spaltbeleuchtung und der Tisch mit gleicher Geschwindigkeit bewegen, Bildstauchung und -bewegung miteinander, was einen mehr als zweifachen Auflösungsabfall in der Scanrichtung entsprechend einer (unidirektionalen) virtuellen Vergrößerung von 50 % der nominalen Objektiv-Vergrößerung verursacht.
Wie auch in 1 gezeigt, beträgt der einseitige Auflösungsabfall jedoch nur 25 % anstelle von 45 %, wenn sich der Probentisch und die Spaltbeleuchtung in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mit gleicher Geschwindigkeit senkrecht zueinander bewegen. Somit ist es möglich, ein 40x-Objektiv in ein virtuelles 30x mit sehr geringem Auflösungsverlust zu verwandeln, und wenn sich der Tisch noch langsamer bewegt, bleibt die virtuelle Vergrößerung noch dichter an der nominalen Vergrößerung und der Auflösungsverlust verringert sich noch weiter. Wenn die Tischbewegung auf 1/3 der Geschwindigkeit der Spaltbeleuchtung verlangsamt wird, ist die Auflösung in der Scanrichtung nahezu unbeeinträchtigt und fällt weniger als 5 % ab. Angesichts der Geschwindigkeit moderner Hochgeschwindigkeitskameras ist es somit möglich, Bilder von einem Beleuchtungsspalt zu erfassen, der sich mit einer Geschwindigkeit von 30 mm/s über die Probe bewegt, und da es möglich ist, Bildstreifen von einer Probe, die sich mit 1/3 dieser Geschwindigkeit bewegt, aufzuzeichnen, ist es möglich, hochauflösende Bilder „rasenmäherartig“ ohne Stop-and-Go und ohne eine signifikant reduzierte Auflösung aufzunehmen.
Bilder, die in Übereinstimmung mit Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung aufgenommen werden, sind jedoch in 2 Dimensionen verzerrt und müssen mathematisch begradigt werden, wie schematisch in 2 gezeigt. Die entsprechende Korrektur des aufgenommenen mikroskopischen Bildes zum Kompensieren 2-dimensionaler Bildverformungen, die durch die kontinuierliche Bewegung der Probe verursacht werden, kann direkt nach der Bildaufnahme oder nachträglich vorgenommen werden.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist schematisch in 3 dargestellt. In dieser Ausführungsform wird die Probe parallel zur, d. h. in die gleiche Richtung wie die Spaltbeleuchtung bewegt und die Spaltbeleuchtung wird jedes Mal, nachdem sie das Sichtfeld der Kamera überstrichen hat, zurück in ihre Ausgangsposition auf dem Kamerachip gesetzt. In einem Beispiel, das die Ausführungsform verwendet, bewegt sich der Beleuchtungsspalt zweimal so schnell wie die Probe, sodass jede Kamerabelichtung ein Bildfeld erfasst, das 50 % des Sichtfeldes der Kamera entspricht. Infolge der Bewegung der Probe in Bezug auf den Beleuchtungsspalt wird das aufgenommene Bild in der Scanrichtung gestreckt (in diesem Beispiel zweifach) und muss somit gestaucht werden (in dem gegebenen Beispiel zweifach), um die ursprüngliche Vergrößerung herzustellen. Die entsprechende Korrektur des aufgenommenen mikroskopischen Bildes zum Kompensieren 1-dimensionaler Bildverformungen, die durch die kontinuierliche Bewegung der Probe verursacht werden, kann direkt nach der Bildaufnahme oder nachträglich vorgenommen werden.
Es sei angemerkt, dass die in der obigen Ausführungsform gegebenen numerischen Werte eine Idealisierung darstellen, da dies eine vernachlässigbare Rücklaufzeit für den Beleuchtungsspaltscanner annimmt. Um eine realistische Rücklaufzeit zu berücksichtigen, ist es notwendig, die Geschwindigkeit der sich bewegenden Probe dementsprechend zu senken, ansonsten werden Anteile der Probe verpasst. Um 50 % des Kamerasichtfeldes zu scannen, braucht es somit die Zeit zum Vollenden des Kameraüberstreichens plus die Rücklaufzeit. Jeweilige hardwarespezifische Anpassungen fallen ebenfalls in den Umfang der vorliegenden Erfindung.
4 ist eine Auftragung der erreichten Auflösung in Scanrichtung als Funktion der Geschwindigkeit des Beleuchtungsspaltes relativ zu der Probengeschwindigkeit in Bezug auf die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der die Probe parallel zur, d. h. in die gleiche Richtung wie die Spaltbeleuchtung bewegt wird. In 4 bedeutet null eine stationäre Probe und 0,5 bedeutet, dass sich die Probe mit der halben Geschwindigkeit der Spaltbeleuchtung bewegt. Verhältnisse > 0,5 ergeben diskontinuierliche Bilder mit fehlenden Zonen.
Die Ordinate zeigt die einseitige Auflösung in Scanrichtung, wobei 1 eine beugungsbegrenzte Auflösung bedeutet, wohingegen Werte > 1 eine Auflösungsverbesserung anzeigen. Da die erreichte Auflösung von der Zeit abhängt, die ein gegebenes Probenelement während des Scans innerhalb des Beleuchtungsspaltes verbleibt, hängt sie nicht nur von der relativen Geschwindigkeit der Probenbewegung, sondern auch von der Breite des Beleuchtungsspaltes ab. Die in 3 gezeigten Werte zeigen die maximal erhaltene Auflösung unter Verwendung einer beugungsbegrenzten Spaltbreite.
Es sei angemerkt, dass in dieser Variante der Erfindung, in der die Probe parallel zur, d. h. in die gleiche Richtung wie die Spaltbeleuchtung bewegt wird, die sich bewegende Probe niemals die Auflösung herabsetzt, sondern sogar eine (einseitige) Auflösungssteigerung bereitstellt, die maximal (V2-fold) ist, wenn sich die Probe mit der maximal zulässigen Geschwindigkeit (1/2 der Geschwindigkeit der Spaltbeleuchtung), der Grenze, nach der das resultierende Bild diskontinuierlich wird, bewegt.
Wie oben skizziert, ist das zugrundeliegende Prinzip der Erfindung, dass ein Signal, besonders ein fluoreszierendes Signal von einem gegebenen Fluorophor in einer sich kontinuierlich bewegenden Probe, nur während der kurzen Zeit angeregt wird, wenn die sich bewegende Spaltbeleuchtung und das sich bewegende Probenelement überlappen, und emittierte Photonen werden nur während dieser kurzen Zeit räumlicher Überlappung durch den Detektor erfasst. In Fällen, in denen die Spaltbeleuchtung in Brennebenen oberhalb und unterhalb der Brennebene des Objektivs gestreut wird, fängt die Kamera jedoch ein Hintergrundsignal von Fluorophoren auf, die nicht direkt beleuchtet werden, und dies verursacht wiederum Bildunschärfe. Dieser abträgliche Effekt wird reduziert, indem der aktive Bereich der Kamera unidirektional eingeschränkt wird, um ein aktives Fenster zu bilden, das der Spaltbeleuchtung folgt, während sie von einem Ende des Sichtfeldes der Kamera zu dem anderen Ende gescannt wird. Je kleiner dieses aktive Fenster gemacht wird, desto weniger Emissionsphotonen, die von nicht direkt beleuchteten Regionen emanieren, können zu dem Bild beitragen und desto besser wird somit Unschärfe unterdrückt.
Der Vorzug der Erfindung gegenüber dem aktuellen Stand der Technik wird durch das folgende Experiment skizziert:
Das Ziel besteht darin, 96 Wells einer Mikrotiterplatte bei beugungsbegrenzter (unter Verwendung eines 40x-Objektiv mit NA 1,25 und Nyquist-Abtastung bei 525 nm) Pixelauflösung von 107 nm zu scannen. Unter Verwendung zum Beispiel eines Rolling-Shutter-Chips von 4,432 × 2,368 Pixeln mit 4,6-µm-Pixelgröße und einer Bildfrequenz von 120 BpS (wie zum Beispiel durch einen Fairchild LTN 4323 bereitgestellt) ist es möglich, die Probe mit 15,2 mm/s zu bewegen und somit einen Bildstreifen von 474 µm Breite und 110 mm Länge in 7,2 s aufzunehmen. Es werden 16 derartige Streifen benötigt, um eine einzelne Reihe von Wells zu scannen, und acht derartige Reihen ergeben eine ganze Platte. Somit gestattet die Erfindung das Scannen einer ganzen Mikrotiterplatte in 8 × 16 × 7,2 s, das heißt wenig mehr als 16 Minuten. Das Abdecken des gleichen Bereichs durch das Zusammenfügen einzelner Bildkacheln, die mit dem herkömmlichen Stop-and-Go-Ansatz gemäß dem Stand der Technik aufgenommen werden, würde das ca. 45.000-malige Beschleunigen und Stoppen erfordern. Selbst mit den schnellsten Tischen werden maximal 6 Positionen/s aufgesucht, sodass ein Lesen der ganzen Mikrotiterplatte auf herkömmliche Weise mindestens zwei Stunden benötigen würde, das heißt 7,5-mal länger.
Wie in 4 gezeigt, wird die Bildauflösung in der Scanrichtung über die nominale Auflösung der orthogonalen Richtung hinaus verbessert. Sie kann in der Richtung der Scanachse bis zu V2-fach gesteigert werden, während sie entlang der Spaltachse unverändert bleibt. Das Konzept der Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) unter Verwendung einer räumlich modulierten Spaltbeleuchtung wie auf dem Stand der Technik würde es gestatten, die Auflösung auch entlang dieser Achse zu steigern, und würde eine weiter gesteigerte Unterteilung über die Spaltkonfokalität hinaus bereitstellen.
Dies ist in 5 skizziert, wobei ein - in Spaltrichtung intensitätsmodulierter - Beleuchtungsstreifen (Füllfaktor 50 %) gescannt wird, um einen kontinuierlichen Bildstreifen aufzuzeichnen. Drei derartige Bildstreifen, jeweils um 1/3 einer Periode relativ zu dem vorhergehenden seitenverschoben, müssen von einer gegebenen Probenregion aufgezeichnet werden, bevor es möglich ist, ein unterteiltes Bild aus diesen drei „Phasenbildern“ zu berechnen. Um diese individuellen Bildstreifen aufzuzeichnen, ist es möglich, die Probe kontinuierlich von einem Ende des gewünschten Bereichs zu dem anderen zu scannen, dort zu wenden und nach einem Phasenverschieben des Musters um 1/3 einer Periode in umgekehrter Richtung zu scannen. Durch das Wiederholen dieser Prozedur an dem Ausgangspunkt des Scans wird das dritte Phasenbild erhalten. Die drei derart erhaltenen Phasenbilder können eine geeignete SIM-Analyse durchlaufen und kombiniert werden, um Bildbahnen zu ergeben, die nicht nur auch eine Auflösungsverbesserung in der Richtung der Spaltbeleuchtung bieten, sondern außerdem eine weitere Entfernung von Außer-Fokus-Informationen über die durch den spaltkonfokalen Scan gebotene hinaus. In Bezug auf das obige Beispiel gestattet ein kontinuierlicher SIM-Ansatz, ein unterteiltes SIM-Bild von einer vollständigen Mikrotiterplatte in wenig mehr als 1/2 Stunde zu erhalten, immer noch 4-mal schneller als ein spaltkonfokaler Stop-and-Go-Ansatz.
Wie in 4 skizziert, stellt eine Tischgeschwindigkeit von so viel wie 50 % der Geschwindigkeit des Beleuchtungsspaltes lückenlose Bildstreifen bereit, die aus aufeinanderfolgenden Belichtungen zusammengesetzt sind. Wenn die Tischgeschwindigkeit auf 1/3 der Spaltgeschwindigkeit gesenkt wird, wird jeder emittierende Bereich zweimal neu aufgesucht, wenn sie auf 1/4 der Spaltgeschwindigkeit gesenkt wird, wird jeder emittierende Bereich dreimal neu aufgesucht, und so weiter. Die obigen drei Belichtungen für ein SIM-Bild könnten somit auch durch das Senken der Scangeschwindigkeit erreicht werden, sodass der Emissionsspalt jeden Bereich der Probe dreimal passiert, mit einer orthogonalen Phasenverschiebung zwischen jeder der drei Passagen. Im Vergleich zu dem obengenannten „Rasenmäher“-Ansatz, bei dem zwischen Wendepunkten lange Streifen aufgezeichnet werden, bietet dies einen 1,5-mal schnelleren Scan, da die Scangeschwindigkeit nur zweimal reduziert werden muss, um drei Phasenbilder zu erhalten. Allerdings fällt die resultierende Auflösungsverbesserung auf 1,4x bis 1,25x ab. Derselben Argumentation folgend wäre es auch möglich, SIM-Bilder aufzunehmen, die aus 7 Phasenbildern zusammengesetzt sind, indem die Tischgeschwindigkeit auf 1/8 der Geschwindigkeit der Spaltbeleuchtung reduziert wird, wodurch jeder Probenbereich 7-mal neu aufgesucht wird.
Das obige Merkmal der Erfindung, nämlich dass Bereiche der Probe mehrere Male in einem einzigen, ununterbrochenen Scan abgebildet werden können, d. h. während eines einzigen Überstreichens, kann auch für andere Anwendungen als SIM angewendet werden. Zum Beispiel (i) ist es möglich, die Anregungswellenlänge des Beleuchtungsstreifens zwischen Abbildungsereignissen desselben Bereichs oder an derselben Position der Probe zu ändern, um in einem einzigen Überstreichen ein mehrfarbiges Bild zu erhalten, (ii) ist es möglich, die Brennebene zwischen Abbildungsereignissen desselben Bereichs oder an derselben Position der Probe zu ändern, um in einem einzigen Überstreichen einen Bildstapel aufzunehmen, oder (iii) ist es möglich, eine absichtlich geneigte Probenebene zu verwenden, was automatisch Bilder ergibt, die in so vielen Brennebenen gemacht werden, wie es Abbildungsereignisse für denselben Bereich oder an derselben Position der Probe gibt.
6 zeigt eine schematische Übersicht eines erfindungsgemäßen Mikroskops, das zum Durchführen des Verfahrens gemäß der Erfindung geeignet ist. Das Mikroskop beinhaltet Folgendes: Eine Probe (1), die in der Brennebene (2) eines Mikroskopobjektivs (3) platziert und gehalten wird, kann kontinuierlich und mit konstanter Geschwindigkeit durch einen Tisch (4) bewegt werden, der sich orthogonal zu den Chip-Koordinaten eines Bereichsdetektors (5) bewegen kann, auf dem, nach dem Passieren des Objektivs (3) und einer Tubuslinse (6), ein Bild der Probe (1) aufgezeichnet wird. Das Fluoreszenzbild wird durch eine spaltförmige Beleuchtung (7) hervorgerufen, die durch eine Lichtquelle (8) und ein spaltformendes optisches Element (9), zum Beispiel eine Powell-Linse, erzeugt wird, und sie wird mithilfe eines Ablenkelements (10), das den Beleuchtungsspalt (7) streng parallel zu einer der bewegten Achsen des Tisches (4) bewegen kann, über die Probe gerastert. Beleuchtungs- und Emissionsstrahl werden mittels eines geeigneten dichroitischen Elements (11) kombiniert. Mindestens eine Steuereinheit (12) synchronisiert den Tisch (4), die Kamera (5), die Lichtquelle (8) und die Scaneinheit (10). Die mindestens eine Steuereinheit (12) ist ferner konfiguriert, das Verfahren wie oben beschrieben durchzuführen.
In bestimmten Ausführungsformen ist die mindestens eine Steuereinheit mindestens ein Computersystem, das konfiguriert ist, um einen oder mehrere Schritte eines oder mehrerer hierin beschriebener oder veranschaulichter Verfahren durchzuführen. In bestimmten Ausführungsformen stellen ein oder mehrere Computersysteme hierin beschriebene oder veranschaulichte Funktionalität bereit. In bestimmten Ausführungsformen führt auf einem oder mehreren Computersystemen ausgeführte Software einen oder mehrere Schritte eines oder mehrerer hierin beschriebener oder veranschaulichter Verfahren durch oder stellt hierin beschriebene oder veranschaulichte Funktionalität bereit. Die Steuereinheit kann eine Speichereinrichtung für Daten oder Befehle umfassen. Zum Beispiel und nicht beschränkend kann die Speichereinrichtung ein Festplattenlaufwerk (HDD), ein Diskettenlaufwerk, einen Flash-Speicher, eine optische Platte, eine magnetooptische Diskette, Magnetband oder ein Universal-Serial-Bus(USB)-Laufwerk oder eine Kombination von zwei oder mehr von diesen umfassen. Die Speichereinrichtung kann entfernbare oder nicht entfernbare (oder feste) Datenträger umfassen, wo angemessen. Die Speichereinrichtung kann innerhalb oder außerhalb des Computersystems befindlich sein, wo angemessen. In bestimmten Ausführungsformen ist die Speichereinrichtung ein nichtflüchtiger Festkörperspeicher. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Speichereinrichtung einen Festwertspeicher (ROM). Wo angemessen, kann dieser ROM ein maskenprogrammierter ROM, programmierbarer ROM (PROM), löschbarer PROM (EPROM), elektrisch löschbarer PROM (EEPROM), elektrisch umprogrammierbarer ROM (EAROM) oder ein Flash-Speicher oder eine Kombination von zwei oder mehr von diesen sein. Diese Offenbarung erwägt, dass der Massenspeicher 96 jede beliebige geeignete Form annimmt. Die Speichereinrichtung kann eine oder mehrere Speicherungssteuereinheiten umfassen, die die Kommunikation zwischen dem Prozessor und der Speichereinrichtung erleichtern, wo angemessen. Wo angemessen, kann die Speichereinrichtung eine oder mehrere Speichereinrichtungen umfassen.
Der Umfang dieser Offenbarung schließt alle Änderungen, Ersetzungen, Variationen, Abwandlungen und Modifikationen an den hierin beschriebenen oder veranschaulichten Ausführungsbeispielen ein, die ein durchschnittlicher Fachmann begreifen würde. Der Schutzumfang dieser Offenbarung ist nicht auf die hierin beschriebenen oder veranschaulichten Ausführungsbeispiele beschränkt. Obwohl diese Offenbarung jeweilige Ausführungsformen hierin als bestimmte Komponenten, Elemente, Merkmale, Funktionen, Operationen oder Schritte umfassend beschreibt und veranschaulicht, können zudem beliebige dieser Ausführungsformen beliebige Kombinationen oder Permutationen beliebiger der Komponenten, Elemente, Merkmale, Funktionen, Operationen oder Schritte, die irgendwo hierin beschrieben oder veranschaulicht sind, umfassen, die ein durchschnittlicher Fachmann begreifen würde. Ein Verweis in den angehängten Patentansprüchen darauf, dass ein Verfahren oder eine Vorrichtung oder eine Komponente einer Vorrichtung oder ein System zum Durchführen einer bestimmten Funktion angepasst, eingerichtet, fähig, konfiguriert, befähigt, betriebsfähig oder betriebsbereit ist, schließt des Weiteren dieses Gerät, dieses System oder diese Komponente ein, unabhängig davon, ob es/sie oder diese bestimmte Funktion aktiviert, eingeschaltet oder freigegeben ist, solange dieses Gerät, dieses System oder diese Komponente dazu angepasst, eingerichtet, fähig, konfiguriert, befähigt, betriebsfähig oder betriebsbereit ist. Obwohl diese Offenbarung bestimmte Ausführungsformen als bestimmte Vorteile bereitstellend beschreibt oder veranschaulicht, können zudem bestimmte Ausführungsformen keine, einige oder alle diese Vorteile bereitstellen.

Claims

Ein Verfahren zum Aufnehmen eines Mikroskopbildes einer Probe, die größer als ein Sichtfeld eines Mikroskops ist, wobei das Verfahren Folgendes beinhaltet: Herbeiführen, durch mindestens eine Steuereinheit, einer kontinuierlichen relativen Bewegung zwischen einer Probe und dem Mikroskop, wobei die optische Achse eines Mikroskopobjektivs zu dem Vektor der relativen Bewegung im Wesentlichen senkrecht ist; Beleuchten, durch eine durch die mindestens eine Steuereinheit gesteuerte Lichtquelle, eines Teils der Probe durch das Mikroskopobjektiv, wobei der beleuchtete Teil der Probe kleiner als das Sichtfeld ist und einen Beleuchtungsspalt bildet; Bewegen, durch eine durch die mindestens eine Steuereinheit gesteuerte Scaneinheit, des Beleuchtungsspaltes in eine Scanrichtung über das Sichtfeld; und Detektieren, durch einen durch die mindestens eine Steuereinheit gesteuerten Detektor, von Licht von der Probe, das durch das Mikroskopobjektiv aufgefangen wird; dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in die gleiche Richtung wie die Scanrichtung oder in eine zu der Scanrichtung senkrechte Richtung bewegt wird, während der Beleuchtungsspalt durch das Scannen über das Sichtfeld bewegt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, das ferner Folgendes beinhaltet: Korrigieren des aufgenommenen Mikroskopbildes zum Kompensieren 1-dimensionaler Bildverformungen oder 2-dimensionaler Bildverformungen, die durch die kontinuierliche Bewegung der Probe verursacht werden.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei in dem Fall, dass die Probe in die gleiche Richtung wie die Scanrichtung bewegt wird, die Korrektur eine Bildschrumpfung in der Scanrichtung beinhaltet, wobei das Ausmaß der Schrumpfung von der relativen Geschwindigkeit der Probenbewegung und der Bewegung des Spaltes der Spaltbeleuchtung abhängt.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei in dem Fall, dass die Probe in eine zu der Scanrichtung senkrechte Richtung bewegt wird, die Korrektur eine Bildscherung senkrecht zu der Scanrichtung beinhaltet, wobei das Ausmaß der Scherung von der relativen Geschwindigkeit der Probenbewegung und der Bewegung des Spaltes der Spaltbeleuchtung abhängt.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Detektor eine Kamera ist, die durch die mindestens eine Steuereinheit auf eine derartige Weise gesteuert wird, dass die Bildfrequenz der Bildaufnahme mindestens ungefähr mit der Zeit synchronisiert ist, die zum Bewegen der Spaltbeleuchtung von einer Ausgangsposition an einem Ende des Detektors zu einem entgegengesetzten Ende des Detektors benötigt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Detektor durch die mindestens eine Steuereinheit auf eine derartige Weise gesteuert wird, dass zu einer Zeit nur eine streifenartige Zone des Detektors zum Detektieren von Licht aktiviert wird, wobei die aktivierte Zone in mindestens ungefährer Synchronizität mit der Bewegung des Bildes des Beleuchtungsspaltes auf dem Detektor über den Detektor bewegt wird, um das Bild des beleuchteten Teils der Probe in der Mitte der aktivierten Zone des Detektors zu halten, und wobei die aktive Zone von einer Ausgangsposition an einem Ende des Detektors zu einem entgegengesetzten Ende des Detektors bewegt wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe unter Verwendung strukturierter Beleuchtung beleuchtet wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5 bis 7, wobei die Probe in die gleiche Richtung wie die Scanrichtung bewegt wird, mit einer Geschwindigkeit, die sich auf 5 % bis 50 % der Geschwindigkeit der Bewegung des Beleuchtungsspaltes beläuft, vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit, die sich auf (i) 12,5 %, (ii) 25 %, (iii) 33 % oder (iv) 50 % der Geschwindigkeit der Bewegung des Beleuchtungsspaltes beläuft.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1, 2, 4 oder 5 bis 8, wobei die Probe in eine zu der Scanrichtung senkrechte Richtung bewegt wird, mit einer Geschwindigkeit, die sich auf 5 % bis 100 % der Geschwindigkeit der Bewegung des Beleuchtungsspaltes beläuft, vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit, die sich auf (i) 100 %, (ii) 50 % oder (iii) 33 % der Geschwindigkeit der Bewegung der Beleuchtung beläuft.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jede Position der Probe mehrere Male abgebildet wird, vorzugsweise 7-mal (i), 3-mal (ii) oder 2-mal (iii) während eines einzigen Überstreichens.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei Parameter des Scanverfahrens zwischen wiederholten Scanereignissen der gescannten Position geändert werden, wobei die änderbaren Parameter die Art der Beleuchtung oder die Fokusposition umfassen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 11, wobei die Geschwindigkeit der Bewegung der Probe in Bezug auf die Geschwindigkeit der Bewegung des Beleuchtungsspaltes abgestimmt wird, um Verzögerungen zu kompensieren, die durch die zum Rückkehren des Beleuchtungsspaltes in seine Anfangsposition benötigte Zeit verursacht werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Scaneinheit derart gesteuert wird, dass, wenn die aktivierte Zone auf dem Detektor das Ende der Länge des Detektors erreicht, die Beleuchtung der Probe durch die Lichtquelle unterbrochen wird, während der Beleuchtungsspalt zurück zur Ausgangsposition bewegt wird, um einen Scanzyklus zu vollenden.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei der Scanzyklus wiederholt wird, während die Probe bewegt wird, bis ein gewünschter Bereich der Probe durch den Beleuchtungsspalt abgedeckt worden ist, wobei in jedem Scanzyklus ein Bild eines Abschnitts der Probe produziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Bilder von Abschnitten der Probe teilweise Bilder überlappen, die von benachbarten Abschnitten der Probe produziert wurden.
Eine Mikroskopvorrichtung, die Folgendes beinhaltet: ein Mikroskopobjektiv; mindestens eine Steuereinheit; einen Probentisch zum Halten einer Probe; einen Mechanismus zum Herbeiführen einer kontinuierlichen relativen Bewegung zwischen einer Probe und dem Mikroskop; eine Lichtquelle; ein Beleuchtungsspalt formendes Element; eine Scaneinheit; und einen Detektor; wobei die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 konfiguriert ist.
Ein nicht transitorischer, computerlesbarer Datenträger, der darauf Befehle beinhaltet, die bei Ausführung auf einem Prozessor bewirken, dass eine Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 16 das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 durchführt.