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Die Erfindung betrifft ein Probenreaktionsgefäß zum Aufschluss einer Probe biologischen Materials sowie dessen Verwendung für die Proteomik.
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Die Präparation von biologischen Materialien für nachfolgende proteomische Untersuchungen auf Basis von Massenspektrometrie ist mit den derzeitigen Standardprotokollen komplex, zeitaufwändig und kostenintensiv. Auch bei Standardproben wie Gewebe und Körperflüssigkeiten sind häufig viele aufeinanderfolgende Arbeitsschritte zum vollständigen Probenaufschluss erforderlich, was sich negativ auf den Probendurchsatz und die Reproduzierbarkeit der Untersuchungen auswirkt.
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Ein weiteres grundsätzliches Problem in der Proteomik resultiert aus der Instabilität und zeitlichen Veränderlichkeit des Proteoms biologischer Materialien. Nach Entnahme einer Gewebeprobe, nach der Blutentnahme oder nach der Entnahme von Stuhlproben für (meta-)proteomische Untersuchungen werden biochemische Prozesse wie Proteinabbau, z. B. bei Geweben oder Stuhlproben, nicht gestoppt. Damit ändert sich die komplexe Zusammensetzung der Proben auch nach der Probennahme, was sich in nachfolgenden proteomischen Untersuchungen häufig sehr negativ auf die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Untersuchungsergebnisse auswirkt.
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Derzeit werden native biologische Materialien mittels etablierter Standardverfahren für die proteomische Probenprozessierung wie ISD-Urea (In-solution Digestion), FASP (Filter Aided Sample Preparation), SP3 (Singlepot Solid-phase-enhanced Sample Preparation) und weitere präpariert. Die Präparation von Proteomik-Proben anhand der aufgeführten Protokolle erfolgt derzeit fast ausschließlich durch spezialisierte Laboratorien.
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Nach dem aktuellen Stand der Technik sollten, falls möglich, die nativen biologischen Materialien unmittelbar nach Entnahme eingefroren werden, z. B. mittels flüssigem Stickstoff oder in einem Ultratiefkühlschrank. Dies erfordert zusätzliche Materialien und Gerätschaften für den Einfrierprozess (Flüssigstickstoff, Trockeneis, Ultratiefkühlschrank, etc.), für Probenlagerung und den Transport zum spezialisierten Labor. Die erforderlichen Materialien und Gerätschaften sind jedoch häufig nicht am Ort der Probennahme vorhanden, so dass sich zeitabhängige Veränderungen des Proteoms negativ auf die Reproduzierbarkeit nachfolgender proteomischer Untersuchungen auswirken können. Die Zuverlässigkeit nachfolgender proteomischer Untersuchungen ist daher häufig nicht gewährleistet.
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Zusammengefasst sind die gegenwärtig realisierten Lösungen zur proteomischen Analyse biologischen Materials komplex, (zeit)aufwändig, kostenintensiv und bislang nur wenig standardisiert. Eine qualifizierte Proteomik-kompatible Probenpräparation vor Ort ist v. a. im Rahmen größerer Studien mit erheblichem Aufwand verbunden und erfordert speziell geschultes Personal. Vor dem Hintergrund des großen Potentials der Proteomik, beispielsweise im Rahmen der personalisierten Medizin, wäre eine einfache, direkte und kostengünstige Probenpräparation, z. B. in der Klinik oder in Arztpraxen, von unschätzbarem Vorteil.
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Mit dem in DOELLINGER, J., SCHNEIDER, A., HOELLER, M., LASCH, P. Sample Preparation by Easy Extraction and Digestion (SPEED) - A Universal, Rapid, and Detergent-free Protocol for Proteomics based on Acid Extraction. doi: https://doi.org/10.1101/393249 vorgeschlagenen SPEED-Präparationsprotokoll für biologische Proben werden signifikante Vereinfachungen und Verbesserungen erzielt. Insbesondere wird die Komplexität des präparativen Verfahrens aufgrund einer verminderten Anzahl von Präparationsschritten reduziert, einhergehend mit einer reduzierten Anzahl an erforderlichen Reagenzien. Dies führt in der Summe zu einem deutlich verminderten Zeitaufwand der Methodik bei höherer Probenausbeute, verbesserter analytischer Sensitivität und höherer Reproduzierbarkeit, was u. a. völlig neue Möglichkeiten zur Automatisierung der Präparation eröffnet.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Probenreaktionsgefäß anzugeben, das zur zumindest teilweisen Durchführung eines Präparationsprotokolls, z. B. des SPEED-Präparationsprotokolls, unmittelbar am Ort der Probennahme geeignet ist und dessen Durchführung vereinfacht.
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Gelöst wird diese Aufgabe durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche. Die abhängigen Ansprüche enthalten Ausführungsvarianten dieser erfindungsgemäßen Lösungen. Weitere vorteilhafte Ausführungsformen und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Figuren und den Ausführungsbeispielen. Die Ausführungsformen der Erfindung sind in vorteilhafter Weise miteinander kombinierbar. Für einen Fachmann naheliegende Abwandlungen und Änderungen der Erfindung fallen unter den Schutzumfang der Patentansprüche.
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Grundgedanke der Erfindung ist es, ein Probenreaktionsgefäß zur Präparation biologischer Materialien vorzuschlagen, mit welchem zur Präparation erforderliche Reagenzien, wie z. B. die nach dem SPEED-Protokoll zu verwendenden Reagenzien Trifluoressigsäure (TFA) und Tris(hydroxymethyl)-aminomethan)-Puffer (TRIS-Neutralisationslösung), vorzugsweise alle Reagenzien, in den notwendigen Mengen und Konzentrationen bereitgestellt werden können. Das Probenreaktionsgefäß weist eine Kammer zur Aufnahme des biologischen Materials (Probenkammer) sowie von der Probenkammer separierte Reservoire für die Reagenzien, d. h. mindestens eine Kammer zur Aufnahme der Säure (Säurekammer) und mindestens eine Kammer zur Aufnahme der Neutralisationslösung (Neutralisationskammer) auf.
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Nach Einbringen der biologischen Probe, z. B. als Gewebestück, Zellsuspension oder als Körperflüssigkeit, wird das Probenreaktionsgefäß dicht verschlossen. Sodann wird, z. B. mittels einer geeigneten, von außen zu bedienenden mechanischen oder elektronisch auslösbaren Vorrichtung eine Verbindung zwischen Proben- und Säurekammer hergestellt, beispielsweise indem eine zwischen Proben- und Säurekammer angeordnete Trennmembran eingedrückt wird, was die Lyse der Probe einleitet (Säurelyse). Eine weitere Möglichkeit zur Initialisierung der Säurelyse stellt das Einfüllen von Säure aus der Säurekammer in die Probenkammer dar, welche beispielsweise mittels Pumpen oder Methoden der Mikrofluidik realisiert werden kann. Im Ergebnis wird die Probe infolge Säureeinwirkung innerhalb kurzer Zeit, z. B. innerhalb weniger Minuten, vollständig aufgelöst, wobei die Proteine vollständig extrahiert werden, ohne dass deren Primärstruktur verändert wird.
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Nach vollständiger Auflösung der Probe oder zu einem vordefinierten Zeitpunkt wird die Säure durch Freisetzung einer Neutralisationslösung, z. B. 2 M TRIS-Lösung (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) aus der Neutralisationskammer neutralisiert, beispielsweise indem eine zwischen Säure- und Neutralisationskammer befindliche Trennmembran eingedrückt wird. Eine weitere Möglichkeit zur Initialisierung der Neutralisation stellt das Einfüllen der Neutralisationslösung in die Probenkammer mit der lysierten Probe, z. B. mittels Pumpen oder Methoden der Mikrofluidik dar.
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Die neutralisierte Probenlösung bleibt vorteilhaft über einen längeren Zeitraum stabil. Selbst nach wochenlanger Lagerung bei Raumtemperatur konnten nur geringfügige Veränderungen der proteomischen Profile nachgewiesen werden.
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Mit dem Einsatz des vorgeschlagenen Probenreaktionsgefäßes für die Präparation biologischer Materialien werden Anwender bei nur minimalem apparativem Aufwand in die Lage versetzt, Proben noch am Ort der Probennahme, z. B. in der Klinik, in einer Arztpraxis, oder auch zu Hause für nachfolgende proteomische Untersuchungen sicher und ohne Gefahr eines Säurekontakts zu präparieren.
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Daraus ergeben sich weitere nachfolgend genannte Vorteile. Aufgrund der hohen Proteinstabilität nach Präparation entsprechend dem SPEED-Präparationsprotokoll bleibt die Primärstruktur der Proteine über Wochen intakt. Die Probe kann nach Neutralisation direkt für den Proteinverdau eingesetzt werden.
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Biologische Materialien können nicht nur durch nicht speziell geschultes Personal, sondern z. B. auch durch die Patienten selbst für proteomische Anschlussuntersuchungen außerhalb eines Speziallabors schnell, sicher und unkompliziert aufbereitet werden.
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Der Aufbau des Probenreaktionsgefäßes schließt den Kontakt des Anwenders mit den Reagenzien bei der Probenpräparation weitgehend aus. Damit können Unfälle durch unsachgemäßen Umgang mit den Reagenzien vermieden werden. Dies ist insbesondere aufgrund der Verwendung von hochkonzentrierten Säuren, wie z. B. TFA, von besonderer Bedeutung.
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Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein Probenreaktionsgefäß zum Aufschluss einer Probe biologischen Materials, das mindestens Folgendes aufweist: (i) eine Probenkammer zur Aufnahme der Probe, (ii) eine Säurekammer zur Aufnahme einer organischen Säure, (iii) eine Neutralisationskammer zur Aufnahme einer Neutralisationslösung und (iv) einen Gefäßverschluss zum Verschließen, bevorzugt flüssigkeitsdichten Verschließen, des Probenreaktionsgefäßes.
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Erfindungsgemäß ist die Probenkammer mit der Säurekammer und der Neutralisationskammer verbindbar, d. h. das Probenreaktionsgefäß weist Einrichtungen auf, die dazu ausgebildet sind, Probe und Säure bzw. lysierte Probe und Neutralisationslösung in geeigneter Weise zusammenzuführen. Der Begriff verbindbar schließt ein, dass die Kammern miteinander vereinbar sind, also aus zwei oder mehr Kammern eine gemeinsame Kammer gebildet werden kann, da auch in einem solchen Fall eine Verbindung der ursprünglichen Kammern hergestellt wird.
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Das Probenreaktionsgefäß ist insbesondere zur Durchführung eines Probenaufschlusses, d. h. einer Lyse bzw. Extraktion, gemäß dem SPEED-Probenpräparationsprotokoll geeignet. An den Probenaufschluss können sich ein Verdau, z. B. mittels Enzymen wie Trypsin, und eine Peptidaufreinigung anschließen. Der Probenaufschluss ermöglicht u. a. nachfolgende proteomische Analysen der biologischen Proben, beispielsweise mittels Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (LC-MS).
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Unter einem biologischen Material ist ein Material zu verstehen, das genetische Informationen und Proteine enthält und sich selbst reproduzieren oder in einem biologischen System reproduziert werden kann. Beispiele für biologische Materialien sind Zellen, Gewebe, Mikroorganismen, Körperflüssigkeiten, Blut- und Blutprodukte, Abstriche sowie Fäzes. Vorzugsweise ist das biologische Material menschlichen, tierischen, mikrobiellen oder pflanzlichen Ursprungs.
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Unter einer organischen Säure ist eine organische chemische Verbindung zu verstehen, die über mindestens eine funktionelle Gruppe verfügt, die ein Proton an Wasser oder ein anderes geeignetes Lösungsmittel abgeben kann, so dass die entstehende Lösung einen pH-Wert kleiner 7 aufweist. Ein Beispiel für organische Säuren sind Carbonsäuren, die optional substituiert sein können. Die organische Säure kann in einer wässrigen Lösung vorliegen.
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Unter einer Neutralisationslösung ist eine wässrige, insbesondere basische, Lösung zu verstehen, mit welcher der pH-Wert einer sauren Lösung erhöht werden kann. Beispielsweise stellen wässrige Lösungen mit Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS), Tetramethylethylendiamin (TEMED), Ammoniumbicarbonat, Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) und/oder Ammoniumacetat, Neutralisationslösungen dar. Die Neutralisationslösung kann beispielsweise eine wässrige Pufferlösung sein, die mindestens eine schwache Säure und ihre konjugierten bzw. korrespondierenden Basen oder eine schwache Base und ihre konjugierten bzw. korrespondierenden Säuren oder Ampholyte enthält. Bei Mischung der Neutralisationslösung mit der organischen Säure kann sich ein Puffersystem mit einem pH-Bereich von 6 bis 10 ausbilden.
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Unter einer Kammer ist ein von einer Wandung umgebener Raum zu verstehen, wobei die Wandung an mindestens einer Seite offen oder öffenbar ist, um ein Material, z. B. eine Probe oder eine Flüssigkeit, in die Kammer einzubringen oder wieder entnehmen zu können. Die Kammern können über eine gemeinsame Wandung verfügen, d. h. eine Wandung kann z. B. sowohl die Probenkammer als auch die Säurekammer oder sowohl die Säurekammer als auch die Neutralisationskammer begrenzen. Verbindungen zwischen Kammern können alternativ auch über Kanäle, Röhrchen oder Schläuche hergestellt werden.
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Der Gefäßverschluss dient dem Öffnen und Verschließen des Probenreaktionsgefäßes. In verschlossenen Zustand wird das Probenreaktionsgefäß mittels des Gefäßverschlusses dicht, bevorzugt flüssigkeitsdicht, verschlossen. Der Gefäßverschluss kann über ein Gewinde verfügen, dass bei einem Öffnen bzw. Verschließen des Probenreaktionsgefäßes in ein Gewinde des Probenreaktionsgefäßes eingreift. Der Gefäßverschluss kann derart angeordnet sein, dass im geöffneten Zustand die Probenkammer von außen zugänglich ist und z. B. eine Probe in der Probenkammer platziert werden kann. Mit anderen Worten kann der Gefäßverschluss eine Wandung der Probenkammer bilden.
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Erfindungsgemäß ist die Probenkammer sowohl mit der Säurekammer als auch mit der Neutralisationskammer verbindbar. Mit anderen Worten ist das Probenreaktionsgefäß derart ausgebildet, dass eine in der Probenkammer angeordnete Probe mit einer in der Säurekammer vorgehaltenen organischen Säure und einer in der Neutralisationskammer vorgehaltenen Neutralisationslösung in Kontakt gebracht werden kann.
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Vorzugsweise ist das Probenreaktionsgefäß zumindest teilweise aus einem transparenten Material ausgebildet, so dass der Inhalt des Probenreaktionsgefäßes von außen sichtbar ist. Dies ermöglicht vorteilhaft eine einfache visuelle Verfolgung im Probenreaktionsgefäß ablaufender physikalischer und/oder chemischer Prozesse. Weitere Ausführungsvarianten können geeignete Fenster zur spektroskopischen Charakterisierung der ablaufenden physikalischen und/oder chemischen Prozesse, z. B. mittels UV-Vis-Spektroskopie, aufweisen.
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Weiter bevorzugt weist das Probenreaktionsgefäß zumindest an den mit der Probe in Kontakt kommenden Flächen ein biokompatibles Material auf. Besonders bevorzugt besteht das Probenreaktionsgefäß aus einem biokompatiblen Material. Eine Beeinflussung der Probe durch Kontakt mit dem Probenreaktionsgefäß kann hierdurch verhindert werden.
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Der unterteilte Aufbau des Probenreaktionsgefäßes ermöglicht ein Vorabbefüllen mit den Reagenzien, d. h. der organischen Säure sowie der Neutralisationslösung, vor der eigentlichen Verwendung, d. h. bevor die Probe in die Probenkammer eingeführt und aufgeschlossen wird. Durch die Anordnung der Reagenzien in (zunächst) verschlossenen Kammern kann ein unerwünschtes Freisetzen in die Umgebung verhindert werden, so dass der Transport und die Handhabung des Probenreaktionsgefäßes einfach und sicher ist.
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Gemäß verschiedenen Ausführungsvarianten können die Probenkammer und die Säurekammer direkt miteinander verbindbar und die Probenkammer und die Neutralisationskammer indirekt über die Säurekammer miteinander verbindbar sein.
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Eine direkte Verbindung zwischen Probenkammer und Säurekammer kann z. B. ausgebildet werden, indem eine gemeinsame Wandung der Probenkammer und der Säurekammer zumindest teilweise geöffnet wird. Eine weitere Möglichkeit der Ausbildung einer direkten Verbindung kann durch eine mikrofluidische Pumpeinrichtung geschaffen werden, mittels derer Säure in die Probenkammer gepumpt wird.
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Beispielsweise kann die Neutralisationskammer am Boden, die Säurekammer in der Mitte und die Probenkammer im oberen Bereich des Probenreaktionsgefäßes angeordnet sein, wobei das Probenreaktionsgefäß nach oben hin mittels des Gefäßverschlusses verschlossen wird.
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Eine Verbindung zwischen Neutralisationskammer und Probenkammer kann in dieser Ausführungsform nur dann hergestellt werden, wenn zuvor bereits eine Verbindung zwischen Probenkammer und Säurekammer hergestellt wurde. Dies verhindert eine versehentliche Vermischung der Probe in der Probenkammer mit der in der Neutralisationskammer angeordneten Neutralisationslösung, bevor die Probe mit der in der Säurekammer angeordneten organischen Säure in Kontakt gebracht wurde.
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Fehler bei der Durchführung des Probenaufschlusses können dadurch vorteilhaft verringert werden.
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Gemäß verschiedenen Ausführungsvarianten können die Probenkammer, die Säurekammer und die Neutralisationskammer mittels Membranen voneinander getrennt sein, wobei die Probenkammer, die Säurekammer und die Neutralisationskammer mittels zumindest teilweisem Öffnen der Membranen miteinander verbindbar sind.
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Unter einer Membran ist eine dünne Trennwand zwischen zwei Kammern zu verstehen, die die jeweiligen Kammern voneinander separiert. Die Membran kann eine gemeinsame Wandung zweier benachbarter Kammern bilden. Die Membranen sind derart ausgebildet, dass sie sich einfach zumindest teilweise öffnen lassen, um eine Verbindung zwischen den Kammern herstellen zu können. Hierfür kann die Membran z. B. durchstoßen werden.
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Durch die Verwendung von Membranen kann das Probenreaktionsgefäß materialsparend gefertigt werden und eine Verbindung der Kammern untereinander lässt sich einfach realisieren.
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Gemäß weiteren Ausführungsvarianten kann das Probenreaktionsgefäß eine Öffnungseinrichtung aufweisen, die zum zumindest teilweisen Öffnen zumindest einer der Membranen ausgebildet ist.
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Die Öffnungseinrichtung kann beispielsweise in Form eines Dorns ausgebildet sein, wobei der Dorn dem Durchstechen und damit Öffnen der Membran dient. Bevorzugt kann die Öffnungseinrichtung derart ausgebildet sein, dass ein Öffnen einer oder mehrere Membranen ermöglicht wird, ohne dass das Probenreaktionsgefäß geöffnet werden muss.
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Eine Kontamination sowie eine unerwünschte Freisetzung des Inhalts des Probenreaktionsgefäßes während des Öffnens der einen oder mehreren Membranen kann dadurch vermieden werden.
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Die Öffnungseinrichtung kann am Gefäßverschluss angeordnet bzw. mit dem Gefäßverschluss verbunden sein. Beispielsweise kann die Öffnungseinrichtung mittels Bewegen, z. B. Drehen, des Gefäßverschlusses bewegt werden, so dass mittels Bewegen des Gefäßverschlusses eine oder mehrere Membranen geöffnet werden können.
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Gemäß weiteren Ausführungsvarianten können die Probenkammer und die Säurekammer und/oder die Probenkammer und die Neutralisationskammer mittels mikrofluidischer Einrichtungen, z. B. mittels Kanälen, Röhrchen, Schläuchen, Pumpeinrichtungen etc., verbindbar sein. Hierdurch können beispielsweise Säure bzw. Neutralisationslösung nacheinander in die Probenkammer gepumpt werden, wobei die Prozesse vorzugsweise elektronisch initiiert und überwacht werden können.
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Gemäß weiteren Ausführungsvarianten besteht das Probenreaktionsgefäß aus einem Trifluoressigsäure-resistenten Material, z. B. einem geeigneten Kunststoff. Trifluoressigsäure-resistent bedeutet, dass das Material unter Gebrauchsbedingungen, d. h. einer Temperatur zwischen -200 °C und + 100 °C, durch Einwirken von Trifluoressigsäure nicht geschädigt wird. Eine unerwünschte Freisetzung von Trifluoressigsäure aus dem Probenreaktionsgefäß sowie eine Kontamination der Probe mit Materialbestandteilen des Probenreaktionsgefäßes können dadurch verhindert werden.
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Gemäß weiteren Ausführungsvarianten kann das Verhältnis des Volumens der Probenkammer zum Volumen der Säurekammer im Bereich von 10 : 1 bis 1 : 10, beispielsweise im Bereich von 1 : 1 bis 1 : 10, liegen.
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Dies ermöglicht vorteilhaft ein Vermischen einer in der Probenkammer angeordneten Probe mit einer in der Säurekammer angeordneten Säure im Volumenverhältnis 10 : 1 bis 1 : 10 (Probe zu Säure). Einerseits wird dadurch die Durchführung des SPEED-Probenpräparationsprotokolls ermöglicht, dass ein Vermischen in besagtem Verhältnis vorsieht und andererseits kann das Probenreaktionsgefäß möglichst klein und damit materialsparend gestaltet werden.
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Gemäß weiteren Ausführungsvarianten kann das Verhältnis des Volumens der Probenkammer zum Volumen der Neutralisationskammer im Bereich von 10 : 1 bis 1 : 1000, beispielsweise im Bereich von 1 : 8 bis 1 : 15, liegen.
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Dies ermöglicht vorteilhaft ein Hinzufügen einer Menge an Neutralisationslösung, die beispielsweise dem 8-fachen bis 15-fachen des Volumens der Probe entspricht. Einerseits wird dadurch die Durchführung des SPEED-Probenpräparationsprotokolls ermöglicht, dass ein Vermischen in besagtem Verhältnis vorsieht und andererseits kann das Probenreaktionsgefäß möglichst klein und damit materialsparend gestaltet werden.
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Gemäß weiteren Ausführungsvarianten kann die Säurekammer eine organische Säure, bevorzugt eine Carbonsäure, weiter bevorzugt eine Halogencarbonsäure und besonders bevorzugt reine Trifluoressigsäure oder ein Trifluoressigsäurederivat, enthalten. Die genannten Säuren und Säurederivate können in Form einer wässrigen Lösung in der Säurekammer enthalten sein.
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Gemäß weiteren Ausführungsvarianten enthält die Neutralisationskammer eine Neutralisationslösung, bevorzugt eine wässrige Lösung enthaltend Tris(hydroxymethyl)-am inomethan, Tetramethylethylendiam in, Ammoniumbicarbonat, Triethylammoniumbicarbonat und/oder Ammoniumacetat. Weiter bevorzugt enthält die Neutralisationskammer eine 2 M wässrige Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Lösung.
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Die Neutralisationslösung kann bei Mischung mit einer für den Probenaufschluss zu verwendenden Säure, z. B. mit der in der Säurekammer enthaltenen organischen Säure, ein Puffersystem ausbilden, das einen Pufferbereich zwischen pH 6 und 10 aufweisen kann.
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Durch das Bereitstellen des Probenreaktionsgefäßes mit befüllter Säurekammer und/oder befüllter Neutralisationskammer kann das Probenreaktionsgefäß schnell und einfach auch von nicht besonders geschulten Personen eingesetzt werden. Der Probenaufschluss kann vorteilhaft an nahezu jedem Ort erfolgen, ohne dass die Probe eingefroren werden muss. Im Ergebnis kann die Proteomanalyse zuverlässiger durchgeführt werden, so dass die Qualität der erhaltenen Daten gegenüber dem Stand der Technik verbessert ist.
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Zudem wird ein unerwünschtes Freisetzen der Reagenzien vermieden, da diese bereits vorab, z. B. bei der Herstellung des Probenreaktionsgefäßes, in dieses eingebracht werden können.
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Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung des Probenreaktionsgefäßes zum Aufschluss einer Probe biologischen Materials zur Proteomanalyse, wobei die Proteomanalyse beispielsweise mittels eines massenspektrometrischen Verfahrens erfolgen kann.
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Hierbei kann vorteilhaft ein Probenreaktionsgefäß verwendet werden, dessen Säurekammer bereits eine Säure und dessen Neutralisationskammer bereits eine Neutralisationslösung enthält. Anderenfalls wird zunächst die Säurekammer mit einer Säure und die Neutralisationskammer mit einer Neutralisationslösung befüllt.
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Der Aufschluss der Probe kann insbesondere gemäß dem SPEED-Probenpräparationsprotokoll erfolgen, das nachstehend beispielhaft erläutert wird und allgemein die folgenden Schritte umfasst: Bereitstellen der Probe in dem Probenreaktionsgefäß, Zugabe einer bestimmten Menge einer organischen Säure zu der Probe, Inkubation des Ansatzes und Zugabe einer neutralisierenden Lösung zum Ansatz. Mit anderen Worten kann das vorstehend beschriebene Probenreaktionsgefäß zum Aufschluss einer Probe gemäß dem SPEED-Probenpräparationsprotokoll verwendet werden.
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Zum Probenaufschluss wird die Probe in die Probenkammer eingeführt. Anschließend wird das Probenreaktionsgefäß mittels des Gefäßverschlusses verschlossen. In einem nächsten Schritt wird die Probe mit der Säure aus der Säurekammer in Kontakt gebracht, indem eine Verbindung zwischen Säurekammer und Probenkammer hergestellt wird.
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Die Probe kann mit der Säure ohne weiteres bis zu 60 min bei Raumtemperatur inkubiert werden, ohne dass die Qualität der Proteine leidet. Dabei kann die Lyse beendet werden, sobald eine klare Lösung erhalten wird, was bei den meisten Proben bereits nach 2 - 10 Min der Fall ist.
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Optional kann die Probe, insbesondere bei schwer aufschließbaren Proben, beispielsweise Proben mit hohem Kollagenanteil, einer elektromagnetischen Strahlung, z. B. Mikrowellenstrahlung, ausgesetzt werden. Dabei wird die Probe für einen Zeitraum von 5 - 30 s, besonders für 10 s, einer Mikrowellenleistung von 800 W ausgesetzt. Vorteilhaft kann das Probenreaktionsgefäß hierfür mit einer zusätzlichen Umhüllung, z. B. einem weiteren Gefäß aus Plastik, umgeben werden. Es hat sich herausgestellt, dass die Mikrowellenbehandlung für jede Art von biologischem Material, insbesondere jedoch für schwer zu lysierendes Material, vorteilhaft für eine effektive Lyse ist.
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Eine thermische Behandlung bei Temperaturen > 40 °C zeigt vergleichbare Effekte.
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In einem weiteren Schritt erfolgt die Neutralisation der Probenlösung, indem die in der Neutralisationskammer vorgehaltene Neutralisationslösung zugegeben wird. Hierfür wird eine Verbindung zwischen Probenkammer und Neutralisationskammer hergestellt.
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Die Neutralisation der Probe erfolgt, um die Proteine für den Verdau vorzubereiten. Es wird dabei ein pH-Wert angestrebt, der im Bereich des pH-Optimums für die für den Verdau verwendeten Proteasen liegt. Beispielsweise kann ein pH-Wert zwischen 7 und 9, idealerweise zwischen 8 und 8,5, eingestellt werden.
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Die Vorteile der Verwendung des Probenreaktionsgefäßes entsprechen den Vorteilen des Probenreaktionsgefäßes.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figuren und der zugehörigen Beschreibung näher erläutert. Es zeigen:
- 1 ein Längsschnitt einer beispielhaften Ausführungsform eines Probenreaktionsgefä ßes;
- 2 das Probenreaktionsgefäß der 1 in gefülltem Zustand.
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In 1 ist ein beispielhaftes Probenreaktionsgefäß 1 im Längsschnitt in einer Gebrauchsposition dargestellt, in der sich der Boden 11 unten und der Gefäßverschluss 5 oben befindet. Alle Richtungsangaben (oben, unten, oberhalb, unterhalb etc.) beziehen sich auf diese Gebrauchsposition.
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Das Probenreaktionsgefäß 1 basiert auf einem handelsüblichen Mikroreaktionsgefäß mit kreiszylinderförmiger Grundgestalt und einem spitz zulaufenden Boden 11 wie in 1 gezeigt. Alternativ kann der Boden 11 halbkugelförmig ausgebildet sein oder eine beliebige andere Form aufweisen. Das Gesamtvolumen der Probenreaktionsgefäßes 1 kann beispielsweise 2 ml betragen, wobei die Erfindung nicht auf ein bestimmtes Volumen des Probenreaktionsgefäßes 1 beschränkt ist.
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Das Probenreaktionsgefäß 1 weist im Bereich des Bodens 11 eine Neutralisationskammer 4 auf, die der Aufnahme einer Neutralisationslösung 14, z. B. einer wässrigen TRIS-Lösung, dient. Die Neutralisationskammer 4 wird nach unten und seitlich von einer Wandung 12 begrenzt. Nach oben hin, d. h. auf der dem Boden 11 gegenüberliegenden Seite, erfolgt die Begrenzung mittels einer Membran 6b.
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Die Membran 6b grenzt die Neutralisationskammer 4 von einer oberhalb der Neutralisationskammer 4 angeordneten Säurekammer 3 ab, so dass eine Vermischung des Inhalts der Neutralisationskammer 4 mit einem Inhalt der Säurekammer 3 zumindest zeitweise vermieden werden kann. Die Säurekammer 3 dient der Aufnahme einer organischen Säure 13, z. B. von Trifluoressigsäure. Die Säurekammer 3 wird seitlich ebenfalls von der Wandung 12, nach unten durch die Membran 6b und nach oben durch eine weitere Membran 6a begrenzt.
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Die Membran 6a grenzt die Säurekammer 3 von einer oberhalb der Säurekammer 3 angeordneten Probenkammer 2 ab, so dass eine Vermischung des Inhalts der Säurekammer 3 mit einem Inhalt der Probenkammer 2 zumindest zeitweise vermieden werden kann. Die Probenkammer 2 wird seitlich ebenfalls von der Wandung 12 und nach unten durch die Membran 6a begrenzt.
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Die Probenkammer 2 dient der Aufnahme einer Probe biologischen Materials, z. B. einer Gewebeprobe, einer Blutprobe, einer Suspension oder einem Pellet von Zellen oder festen Gewebestrukturen. Das Probenreaktionsgefäß 1 wird zum Aufschluss der Probe genutzt, z. B. um nachfolgend eine Proteomanalyse, z. B. mittels eines massenspektrometrischen Verfahrens, durchführen zu können. Mit anderen Worten kann das Probenreaktionsgefäß 1 zum Aufschluss der Probe biologischen Materials entsprechend dem SPEED-Probenpräparationsprotokoll zur Proteomanalyse verwendet werden.
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Die Probenkammer 2 ist mit der Säurekammer 3 und der Neutralisationskammer 4 verbindbar, wobei die Probenkammer 2 und die Säurekammer 3 direkt miteinander verbindbar sind, in dem die Membran 6a zumindest teilweise geöffnet wird und wobei die Probenkammer 2 und die Neutralisationskammer 4 indirekt über die Säurekammer miteinander verbindbar sind, indem beide Membranen 6a, 6b zumindest teilweise geöffnet werden.
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Nach oben abgeschlossen wird das Probenreaktionsgefäß 1 mittels eines Gefäßverschlusses 5, der im verschlossenen Zustand zugleich die obere Begrenzung der Probenkammer 2 bildet. Zum Befüllen der Probenkammer 2 wird der Gefäßverschluss 5 entfernt, so dass eine Probe in die Probenkammer 2 eingeführt werden kann. Anschließend wird die Probenkammer 2 mittels des Gefäßverschlusses 5 verschlossen und die Probe kann aufgeschlossen werden. Zur flüssigkeitsdichten Abdichtung der Wandung 12 gegenüber dem Gefäßverschluss 5 sind zwei Dichteinrichtungen 8 vorgesehen, die im Ausführungsbeispiel als Ringdichtungen ausgebildet sind.
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Am Gefäßverschluss 5 ist eine Öffnungseinrichtung 7 angeordnet, die im Ausführungsbeispiel dornförmig ausgebildet ist. Mittels der Öffnungseinrichtung 7 können die Membranen 6a, 6b durchstochen und damit geöffnet werden.
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Die Membranen 6a, 6b können durchstochen werden, indem eine Drehbewegung des Gefäßverschlusses 5 ausgeführt wird. Wird der Gefäßverschluss 5 gedreht, greift ein Außengewinde 10 des Gefäßverschlusses 5 in ein Innengewinde 9 der Wandung 12 ein, so dass die Öffnungseinrichtung 7 nach unten in Richtung der Membranen 6a, 6b bewegt wird. Hierdurch kann eine Kraft auf die Membranen 6a, 6b ausgeübt werden, die zu einem Durchstechen der Membranen 6a, 6b führt.
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Optional können mehrere Arretierungsstufen vorgesehen sein. In einer ersten Arretierungsstufe befindet sich die Öffnungseinrichtung, wie in 1 gezeigt, oberhalb der Membranen 6a, 6b und die Membranen 6a, 6b verbleiben unbeschädigt.
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In einer zweiten Arretierungsstufe hat die Öffnungseinrichtung 7 die Membran 6a zwischen Probenkammer 2 und Säurekammer 3 durchstochen, so dass die Probenkammer 2 und die Säurekammer 3 miteinander verbunden werden und eine in der Säurekammer 2 befindliche organische Säure 13 mit der in der Probenkammer 2 befindlichen Probe in Kontakt gebracht werden kann. Hierdurch kann die Probe aufgelöst werden und es bildet sich eine Probenlösung.
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In einer dritten Arretierungsstufe hat die Öffnungseinrichtung 7 zusätzlich die Membran 6b zwischen Säurekammer 3 und Neutralisationskammer 4 durchstochen, so dass die Probenkammer 2, die Säurekammer 3 und die Neutralisationskammer 4 miteinander verbunden werden und der Probenlösung eine zuvor in der Neutralisationskammer 4 befindliche Neutralisationslösung 14 zugeführt werden kann.
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Insgesamt besteht das Probenreaktionsgefäß aus einem TFA-resistenten Material, z. B. einem TFA-resistenten Kunststoff.
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2 zeigt das Probenreaktionsgefäß 1 in einem gefüllten Zustand, in dem die Säurekammer 3 eine organische Säure 13, z. B. TFA, und die Neutralisationskammer 4 eine Neutralisationslösung 14, z. B. eine wässrige TRIS-Lösung, enthält.
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Das Probenreaktionsgefäß 1 der 2 ist sofort einsatzbereit, d. h. eine Probe kann in die Probenkammer 2 eingefüllt und, z. B. gemäß dem SPEED-Probenpräparationsprotokoll, aufgeschlossen werden.
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Der Aufschluss kann beispielsweise wie nachstehend beschrieben durchgeführt werden.
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In einem ersten Schritt wird die Probe eines biologischen Materials bereitgestellt und in die Probenkammer 2 eingeführt. In einem zweiten Schritt wird die Membran 6a zwischen Probenkammer 2 und Säurekammer 3 geöffnet, so dass die in der Säurekammer 3 enthaltene organische Säure 13, z. B. TFA, mit der Probe in Kontakt gebracht wird. Idealerweise sollte das Volumenverhältnis Probe zu Säure zwischen 1 : 1 und 1 : 10 liegen. Der Ansatz wird gemischt, z. B. mittels eines Vortex-Gerätes, und bei Raumtemperatur für 1 - 10 min inkubiert. Die Probe wird dabei lysiert. Der Lyseverlauf kann visuell verfolgt werden. Sobald eine klare Probenlösung vorliegt, ist die Probe lysiert worden.
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Ist die Proteinkonzentration der Probe zu hoch, um mit der angegeben Säuremenge extrahiert zu werden, kann ein angemessenes weiteres Volumen an Säure 13, z. B. 100 µl, hinzugefügt werden. In einem optionalen Schritt, der den Aufschluss schwer zu lysierender Proben unterstützt, wird der Ansatz, d. h. die mit der Säure 13 in Kontakt gebrachte Probe, für 10 s bei einer Leistung von 800 W in einem Mikrowellengerät inkubiert.
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In einem dritten Schritt wird die Probenlösung mit der Neutralisationslösung 14, z. B. einer wässrigen 2 M TRIS-Lösung, neutralisiert. Hierfür wird die Membran 6b zwischen Neutralisationskammer 4 und Säurekammer 3 geöffnet, so dass die Neutralisationslösung 14 mit der Probenlösung in Kontakt kommt. Zum Neutralisieren eines Volumens der Probe sollte etwa das 8 - 15-fache Volumen der Neutralisationslösung 14 hinzugefügt werden, d. h. für 100 µl Probenlösung werden 1000 µl an Neutralisationslösung 14 hinzugefügt.
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Beim Neutralisieren wird ein pH-Wert angestrebt, der zwischen 7 und 9, idealerweise zwischen 8 und 8,5 liegt. Zum Erreichen des angestrebten pH-Wertes kann ggf. durch Zugabe von Neutralisationslösung 14 oder Säure 13 nachgesteuert werden, bis der optimale pH-Wert erreicht ist.
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Die neutralisierte Probenlösung ist über längere Zeiträume bei Raumtemperatur stabil und kann mehrere Wochen gelagert werden. Die neutralisierte Probenlösung kann zudem direkt für einen Proteinverdau eingesetzt werden. Optional kann zunächst eine Reduktion- und/oder Alkylierung der Proteine durchgeführt werden.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Probenreaktionsgefäß
- 2
- Probenkammer
- 3
- Säurekammer
- 4
- Neutralisationskammer
- 5
- Gefäßverschluss
- 6a, 6b
- Membran
- 7
- Öffnungseinrichtung
- 8
- Dichteinrichtung
- 9
- Innengewinde
- 10
- Außengewinde
- 11
- Boden
- 12
- Wandung
- 13
- organische Säure
- 14
- Neutralisationslösung
