DE102017125150A1

DE102017125150A1 - Endosialin (CD248) als epigenetischer Marker zur Identifizierung von Immunzellen, insbesondere naïver CD8+ T-Zellen

Info

Publication number: DE102017125150A1
Application number: DE102017125150.2A
Authority: DE
Inventors: Sven Olek; Janika Josephin Schulze
Original assignee: Epiontis GmbH
Current assignee: Precision for Medicine GmbH
Priority date: 2017-10-26
Filing date: 2017-10-26
Publication date: 2019-05-02
Anticipated expiration: 2037-10-27
Also published as: US11667973B2; JP2021502804A; DE102017125150B4; EP3669000B1; WO2019081642A1; US20200370117A1; CN111278988A; CA3080065A1; AU2018356473A1; EP3669000A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, insbesondere ein in vitro Verfahren, zur Identifizierung von spezifischen Immunzellen, insbesondere von naiven CD8+ T-Zellen, umfassend die Analyse des Methylierungsstatus von mindestens einer CpG-Position in der Säugetier-Genregion für Endosialin (CD248), wobei eine Demethylierung oder fehlende Methylierung dieser Genregion für eine naive CD8+ T-Zelle indikativ ist, wenn diese mit einer nicht-naiven CD8+ T-Zelle oder einem anderen (Blut-) Zelltyp verglichen wird. Die Analysen gemäß der Erfindung können naive CD8+ T-Zellen auf epigenetischer Ebene identifizieren und von allen anderen Zellen in komplexen Proben unterscheiden, wie zum Beispiel andere Blut- oder Immunzellen. Zudem stellt die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Quantifizierung von naiven CD8+ T-Zellen, insbesondere in komplexen Proben, zur Verfügung. Das Verfahren kann ohne einen Schritt der Aufreinigung und/oder Anreicherung der Zellen, vorzugsweise durch Verwendung von Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe, durchgeführt werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, insbesondere ein in vitro Verfahren, zur Identifizierung spezifischer Immunzellen, insbesondere naïver CD8+ T-Zellen, umfassend die Analyse der Modifikation, wie beispielsweise des Methylierungsstatus, von mindestens einer CpG-Position in der Säuger-Genregion für Endosialin (CD248), wobei eine Demethylierung oder fehlende Modifikation, wie z.B. Methylierung, in dieser Genregion für eine CD8+ T-Zelle indikativ ist, wenn diese mit einer nicht-naiven CD8+ T-Zelle oder einem anderen (Blut-) Zelltyp verglichen wird. Die Analysen gemäß der Erfindung können naive CD8+ T-Zellen auf epigenetischer Ebene identifizieren und sie von allen anderen Zellen in komplexen Proben, wie zum Beispiel anderen Blut- oder Immunzellen, unterscheiden. Zudem stellt die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Quantifizierung naiver CD8+ T-Zellen, insbesondere in komplexen Proben, zur Verfügung. Das Verfahren kann mit oder ohne einem Schritt der Aufreinigung und/oder Anreicherung der Zellen, vorzugsweise durch Verwendung von Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe, durchgeführt werden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur Durchführung der oben genannten Verfahren sowie dessen jeweilige Anwendungen. Es ist ein Ziel dieser Erfindung, ein neuartiges, robusteres Mittel zum quantitativen Nachweis und zur Messung von naiven CD8+ T-Zellen in einer Körperflüssigkeit, wie beispielsweise Blut, in allen soliden Organen oder Geweben eines Säugers, bereitzustellen.
Hintergrund der Erfindung
Naive CD8+ T-Zellen sind T-Zellen, die sich im Knochenmark differenziert haben und erfolgreich die positiven und negativen Prozesse der zentralen Selektion im Thymus durchlaufen haben und die naive Form von zytotoxischen T-Zellen (CD8+) bilden. Eine naive T-Zelle gilt als reif und ist im Gegensatz zu aktivierten oder Gedächtnis-T-Zellen nicht auf ihr kognitives Antigen in der Peripherie gestoßen. Naive T-Zellen sind im Allgemeinen durch die Oberflächenexpression von L-Selektin (CD62L), das Fehlen der Aktivierungsmarker CD25, CD44 oder CD69; und das Fehlen der Gedächtnis-Isoform CD45RO gekennzeichnet. Sie werden außerdem als funktionelle IL-7-Rezeptoren exprimierend beschrieben, bestehend aus den Untereinheiten IL-7 Rezeptor-α, CD127, und gewöhnliche-γ Kette, CD132.
Obwohl nahezu alle Zellen in einem Individuum das exakt gleiche Komplement des DNA-Codes enthalten, müssen höhere Organismen unterschiedliche Muster der Genexpression in den verschiedenen Gewebetypen aufweisen und aufrechterhalten. Die meisten Genregulationen sind vorübergehend, abhängig vom aktuellen Zustand der Zelle und Veränderungen der äußeren Reize. Persistente Regulation hingegen ist eine primäre Rolle der Epigenetik - vererbbare Regulationsmuster, die die grundlegende genetische Codierung der DNA nicht verändern. Die DNA-Methylierung ist die archetypische Form der epigenetischen Regulation; sie dient als stabiles Gedächtnis für Zellen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung der langfristigen Identität verschiedener Zelltypen. Kürzlich wurden andere Formen der epigenetischen Regulation entdeckt. Neben der „fünften Base“ 5-Methylcytosin (mC), finden sich eine sechste (5-Hydroxymethylcytosin, hmC), siebte (5-Formylcytosin, fC) und achte (5-Carboxycytosin, cC) (Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937).
Das primäre Ziel der genannten DNA-Modifikationen ist die Zwei-Nukleotidsequenz Cytosin-Guanin (eine ‚CpG-Position‘); in diesem Zusammenhang kann Cytosin (C) einer einfachen chemischen Modifikation unterzogen werden, um formyliert, methyliert, hydroxymethyliert oder carboxyliert zu werden. Im menschlichen Genom ist die CG-Sequenz viel seltener als erwartet, außer in bestimmten, relativ dichten Clustern, den sogenannten ,CpG-Inseln‘. CpG-Inseln sind häufig mit Gen-Promotern assoziiert, und es wird geschätzt, dass mehr als die Hälfte der menschlichen Gene CpG-Inseln aufweisen (Antequera und Bird, Proc Natl Acad Sci USA 90: 11995-9, 1993).
Eine abweichende Methylierung der DNA ist häufig mit der Transformation von gesunden zu kanzerogenen Zellen verbunden. Zu den beobachteten Effekten gehören genomweite Hypomethylierung, erhöhte Methylierung von Tumorsuppressorgenen, und Hypomethylierung vieler Onkogene (zusammengefasst zum Beispiel von Jones und Laird, Nature Genetics 21:163-167, 1999; Esteller, Oncogene 21:5427-5440, 2002; und Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003). Methylierungsprofile wurden als tumorspezifisch erkannt (d.h. Veränderungen im Methylierungsmuster bestimmter Gene oder sogar einzelner CpGs sind diagnostisch für bestimmte Tumorarten), und es gibt jetzt eine umfassende Sammlung an diagnostischen Markern für Blut-, Brust-, Darm-, Speiseröhren-, Magen-, Leber-, Lunge-, und Prostata-Krebs (z.B. zusammengefasst von: Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003).
Für eine der kürzlich beschriebenen Modifikationen des Cytosins, 5-Hydroxymethylierung, wurde der Nutzen einer oxidativen Bisulfit-Sequenzierung zur Kartierung und Quantifizierung von 5hmC in den CpG-Inseln gezeigt (Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937). Hohe Konzentrationen von 5hmC wurden in CpG-Inseln in Verbindung mit Transkriptionsregulatoren und in langgestreckten Kernelementen gefunden. Es wird vermutet, dass sich diese Regionen in embryonalen Stammzellen epigenetischer Reprogrammierung unterziehen können.
Die Isolierung von naiven CD8+ T-Zellen kann in einem zweistufigen Verfahren durchgeführt werden. Zuerst werden naive T-Zellen durch die Abnahme von nicht-naiven T-Zellen und NK-Zellen angereichert, die indirekt magnetisch mit einem Cocktail aus Biotinkonjugierten Antikörpern und Anti-Biotin MicroBeads markiert sind. In einem zweiten Schritt werden die angereicherten naiven T-Zellen mit CD8 Micro-Beads markiert, um anschließend die naiven CD8+ T-Zellen positiv zu selektieren.
WO 98/10284 beschreibt Verfahren zum Fangen, Aufreinigen und Expandieren von antigenspezifischen T-Lymphozyten. WO 2006/060719 offenbart Verfahren zum Nachweis und Isolieren von Endosialin-positiven Zellen unter Verwendung von Antikörpern, Derivaten und Fragmenten.
WO 2012/162660 beschreibt Verfahren unter der Verwendung von DNA-Methylierungsarrays zur Identifizierung einer Zellen oder eines Zellgemischs und zur Quantifizierung von Veränderungen in der Verteilung von Zellen im Blut oder in Geweben sowie zur Diagnose, Prognose und Behandlung von Krankheitserscheinungen, insbesondere Krebs. Die Verfahren verwenden frische und archivierte Proben.
WO 2013/014122 betrifft ein Verfahren, insbesondere ein in vitro Verfahren, zur Identifizierung von natürlichen Killerzellen und deren Untergruppen in einem Säuger, vorzugsweise CD3-negative, nicht von T-Lymphozyten abstammende NK-Zellen, die üblicherweise die Oberflächenproteine CD56 und/oder CD16 exprimieren, umfassend die Analyse der Zugänglichkeit der genomischen DNA für OSBPL, wie z.B. OSBPL5, zur Bisulfit-Konversion und/oder den Methylierungsstatus von mindestens einer CpG-Position in den Genen für OSBPL, wie z.B. OSBPL5.
Hardie D. L. et al. (in: The stromal cell antigen CD248 (endosialin) is expressed on naive CD8+ human T cells and regulates proliferation. Immunology 133, 288-295 (2011)) offenbart, dass CD248 ausschließlich von humanen, aber nicht Maus- (C57BL/6), naiven CD8+ T-Zellen exprimiert wird. Ihre Daten zeigen gegensätzliche Funktionen für CD248 auf hämatopoietischen (CD8+) gegenüber stromalen Zellen und deuten darauf hin, dass CD248 dazu beiträgt, humane naive CD8+ T-Zellen in einem Ruhezustand zu halten.
Tserel et al. (in: Tserel L, Kolde R, Limbach M, et al. Age-related profiling of DNA methylation in CD8+ T cells reveals changes in immune response and transcriptional regulator genes. Scientific Reports. 2015;5:13107) offenbart altersbedingte Veränderungen in der DNA-Methylierung und Genexpression in CD4+ und CD8+ T-Zellen von jüngeren und älteren Individuen. Sie beobachteten einen signifikanten Unterschied zwischen T-Zell-Untergruppen, mit einer erhöhten Anzahl von Methylierungsänderungen und einer höheren Methylom-Variation im Alter in CD8+-Zellen. Die Mehrheit der altersbedingten hypermethylierten Stellen befand sich auf CpG-Inseln von stillgelegten Genen und war mit repressiven Histonmarkern angereichert. Insbesondere in CD8+ T-Zell-Untergruppen identifizierten sie eine starke inverse Korrelation zwischen Methylierungs- und Expressionslevel in Genen, die mit T-Zell-vermittelter Immunantwort (LGALS1, IFNG, CCL5, GZMH, CCR7, CD27 und CD248) und Differenzierung (SATB1, TCF7, BCL11B und RUNX3) assoziiert sind. Ihre Ergebnisse deuten demnach auf einen Zusammenhang zwischen altersbedingten epigenetischen Veränderungen und einer beeinträchtigten T-Zellfunktion hin. Ältere Individuen zeigten eine erhöhte Methylierung und eine verringerte Expression von CD248, aber auch Impfstoffreaktionsprobleme.
Vor diesem Hintergrund ist es Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein verbessertes und vor allem robusteres Verfahren basierend auf der DNA-Methylierungsanalyse als überlegenes Werkzeug bereitzustellen, um insbesondere naive CD8+ T-Zellen komfortabler und zuverlässiger nachzuweisen, zu identifizieren, zu unterscheiden und zu quantifizieren.
Die vorliegende Erfindung löst das oben genannte Problem durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung von CD8+ T-Zellen in einer von einem Menschen abgeleiteten Probe, umfassend ein Analysieren der Modifikation, vorzugsweise des Methylierungsstatus, von mindestens einer CpG-Position der humanen Genregion für Endosialin (CD248), wobei die analysierte Genregion vorzugweise gemäß SEQ ID Nr. 1 positioniert ist, wobei eine Demethylierung oder fehlende Modifikation, vorzugsweise Methylierung, der Genregion für eine naive CD8+ T-Zelle indikativ ist, wenn diese mit einer nicht-naiven CD8+ T-Zelle verglichen wird.
Das Gen für das humane CD248 befindet sich auf Ensembl-ID: ENSG0000000174807.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll ein „Gen“ oder eine „Genregion“ die gesamte genomische Region umfassen, die das CD248 betrifft und dieses kodiert. Dazu zählen Enhancer-Regionen, Promoter-Region(en), Introns, Exons und nicht-kodierende Regionen (5'- und/oder 3'-Regionen), die zu CD248 gehören. Bevorzugt ist demnach ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die mindestens eine CpG-Position in der 5'-Region stromaufwärts vom Transkriptionsstart, der Promoterregion, den 5'- oder 3'- nicht translatierten Regionen, Exon, Intron, Exon/Intron-Grenzen und/oder in der 3'-Region stromabwärts vom Transkriptionsstopp des analysierten Gens vorhanden ist.
Die vorliegende Erfindung basiert weiterhin auf der überraschenden Identifizierung einer Region des CD248-Gens durch die Erfinder als spezifischer epigenetischer Marker, der die Identifizierung von naiven CD8+ T-Zellen, ebenso wie die klinische Routineanwendung dieser Analyse erlaubt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ermöglicht die genomische Region von CD248, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 1, die Identifizierung von naiven CD8+ T-Zellen. Überraschenderweise ist das unterscheidende Muster der Bisulfit-konvertierbaren und nicht-konvertierbaren Cytosine für naive CD8+ T-Zellen besonders und sogar ausschließlich auf die genomische Region gemäß SEQ ID Nr. 1 beschränkt, wie durch Verwendung des Amplikons gemäß SEQ ID Nr. 1 und insbesondere der Bisulfit-konvertierten Sequenz gemäß der SEQ ID Nr. 2 oder 3 gezeigt wird.
Die Erfinder konnten zeigen, dass in den naiven CD8+ T-Zellen die CpG-Motive wie offenbart nahezu vollständig demethyliert sind (d.h. zu mehr als 70%, vorzugsweise 80%, vorzugsweise mehr als 90% und am meisten bevorzugt mehr als 95%), wobei die gleichen Motive in allen anderen Immunzellen vollständig methyliert sind.
Die differentielle Methylierung der CpG-Motive innerhalb der zuvor genannten Regionen ist ein wertvolles Werkzeug zur Identifizierung von naiven CD8+ T-Zellen, wie es benötigt wird/oder zumindest wertvoll ist zur Identifizierung und Quantifizierung dieser Zellen bei Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßungen, Krebs, Allergien, primären und sekundären Immundefekten, wie z.B. HIV-Infektionen und AIDS, Graft versus Host (GvH), hämatologischen Malignomen, rheumatoider Arthritis, Multipler Sklerose, oder einem zytotoxischen T-Zell-abhängigen Immunstatus in jedem vorstellbaren diagnostischem Zusammenhang. Der Assay ermöglicht die Messung von naiven CD8+ T-Zellen ohne Aufreinigung oder Färbeverfahren.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst dann weiterhin eine Quantifizierung der relativen Menge an naiven CD8+ T-Zellen basierend auf dem Vergleich der relativen Menge der Methylierungsfrequenz in der analysierten Region mit der relativen Menge der Methylierungsfrequenz in einem Kontrollgen, wie z.B. GAPDH. Diese Quantifizierung wird somit auf der Grundlage des Verhältnisses der Bisulfit-konvertierbaren DNA zur nicht-konvertierbaren DNA in der genetischen Region von CD248 (z.B. von SEQ ID Nr. 1), wie hierin beschrieben und analysiert, erreicht. Weiter bevorzugt ist eine Quantifizierung der relativen Menge an naiven CD8+ T-Zellen, basierend auf einer (vorzugsweise parallelen oder gleichzeitigen) Analyse der relativen Menge an Bisulfit-konvertierbarer DNA der zellspezifischen Region für CD248 und der relativen Menge an Bisulfit-konvertierbarer DNA der nicht-zellspezifischen Gene (vorzugsweise ausgewählte „Kontrollgene“ oder „Kontrollregionen“, wie z.B. das Gen für GAPDH).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Analyse der Bisulfit-Konvertibilität die Amplifikation mit mindestens einem Primer passender Primerpaare, die basierend auf SEQ ID Nr. 1 geeignet gestaltet werden können, vorzugsweise Oligomere gemäß einer der SEQ ID Nrn. 4 bis 14.
Im Gegensatz zu FACS- und mRNA-Messungen können durch Anwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung die Messung(en) und Analysen unabhängig von der Aufreinigung, Lagerung - und bis zu einem gewissen Grad auch in Bezug auf die Gewebequalität - durchgeführt werden.
Vorzugsweise erfolgt die Amplifikation durch ein Polymerase-Enzym, eine PCR oder eine chemische Amplifikationsreaktion oder andere Amplifikationsverfahren, die dem Fachmann wie nachfolgend beschrieben bekannt sind, d.h. im Rahmen von MSP, HeavyMethyl, Scorpion, MS-SNUPE, MethylLight, Bisulfit-Sequenzierung, methylspezifischen Restriktionsassays und/oder digitaler PCR (siehe, zum Beispiel Kristensen und Hansen PCR-Based Methods for Detecting Single-Locus DNA Methylation Biomarkers in Cancer Diagnostics, Prognostics, and Response to Treatment Clinical Chemistry 55:8 1471-1483 (2009)).
Mit der Amplifikation wird ein Amplikon der CD248-Genregion erzeugt, das ein besonders bevorzugtes Werkzeug zur Durchführung des/der Verfahren(s) gemäß der vorliegenden Erfindung ist. Folglich stellen Oligomere gemäß einer der SEQ ID Nrn. 4 bis 14 oder ein amplifiziertes Amplikon unter Verwendung eines Primerpaars basierend auf SEQ ID Nr. 4 und 5, 6 und 7, 9 und 10, und 12 und 13, wie hierin erwähnt, eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. So können die SEQ ID Nrn. 1 bis 3 (und, sofern benötigt, die dazu komplementäre Sequenzen) verwendet werden, um Primer für die Amplifikation zu gestalten, d.h. in der relevanten Sequenz als „beacons“ dienen. Gleichermaßen können zusätzliche Primer und Sonden basierend auf dem Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 1 aufgebaut werden. Die Amplifikation kann entweder in der genomischen und/oder der Bisulfit- (d.h. „konvertierten“) DNA-Sequenz erfolgen.
Der Fachmann wird darüber hinaus in der Lage sein, spezifische Untergruppen der CpG-Positionen auszuwählen, um so die Anzahl der zu analysierenden Stellen zu minimieren, beispielsweise mindestens eine der CpG-Positionen, die aus einer CpG-Position in einem Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 1 ausgewählt ist, und vorzugsweise aus den CpG-Positionen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, und 20 im Amplikon Nr. 1817 gemäß der SEQ ID Nr. 1. Die Positionen werden numerisch vom 5'-Ende eines generierten und amplifizierten Amplikons gezählt und werden in 1 bezeichnet als: AMP1871:118, 133, 145, 175, 207, 212, 224, 231, 243, 274, 292, 296, 319, 327, 331, 345, 363, 373, 400, 406, und 415. Bevorzugt sind Kombinationen aus 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Positionen, deren Analyse ausreichend Daten und/oder Informationen liefert, um im Kontext der vorliegenden Erfindung aussagekräftig zu sein.
Der Fachmann wird darüber hinaus im Stande sein, spezifische Untergruppen der CpG-Positionen auszuwählen, um die Anzahl der zu analysierenden Stellen zu minimieren, beispielsweise mindestens eine der CpG-Positionen CpG1 bis CpG20 im Amplikon Nr. 1817 der CD248-spezifischen Bisulfit-konvertierbaren Region (SEQ ID Nr. 1), oder alle in den Bisulfit-konvertierbaren Region gemäß SEQ ID Nr. 1 vorhandenen Positionen. Eine oder mehrere der Positionen 118, 133, 363, 373, 400, 406, und/oder 415 können ausgeschlossen werden.
Um die Bisulfit-Konvertibilität der CpG-Positionen zu analysieren, kann jedes bekannte Verfahren zur Analyse der DNA-Methylierung verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Analyse des Methylierungsstatus ein Verfahren ausgewählt aus Methylierungs-spezifischem enzymatischem Verdau, Bisulfit-Sequenzierung, einer Analyse ausgewählt aus Promotermethylierung, CpG-Insel-Methylierung, MSP, HeavyMethyl, MethyLight, Ms-SNuPE oder anderen Methoden, die auf dem Nachweis amplifizierter DNA beruhen. Diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und finden sich in der entsprechenden Literatur.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren für Routineanwendungen, beispielsweise auf einem DNA-Chip, geeignet. Basierend auf den obigen Informationen und der entsprechenden Literatur kann der Fachmann das obere Verfahren wie oben beschrieben an diese Gegebenheiten anpassen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird dieses Verfahren ohne einen Aufreinigungs- und/oder Anreicherungsschritt der zu identifizierenden Zellen durchgeführt, vorzugsweise durch Verwendung von Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Identifizierung eine Unterscheidung der naiven CD8+ T-Zellen von allen wesentlichen peripheren Blutzelltypen und/oder nicht-Blutzellen, vorzugsweise, aber nicht ausschließlich, CD56+ NK-Zellen, follikulären Helfer-T-Zellen, zytotoxischen T-Zellen, Granulozyten, Monozyten, B-Zellen, CD56++ („bright“) NK-Zellen, T-Helfer-Zellen und NKT-Zellen und andere Zelltypen, die von anderen Organen als Blut stammen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Probe aus einer Körperflüssigkeit eines Menschen, einschließlich menschlicher Blutproben, oder einem Gewebe, Organ oder einer Probe von Leukozyten oder einer aufgereinigten oder separierten Fraktion eines solchen Gewebes, Organs oder Leukozyten oder einer Zelltypprobe ausgewählt. Die Proben können bei Bedarf entsprechend gepoolt werden.
Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst dann weiter den Schritt des Schlussfolgerns auf den Immunstatus des Säugers, basierend auf den naiven CD8+ T-Zellen. Die naiven CD8+ T-Zellen können quantifiziert werden und als Richtwert zur relativen Quantifizierung weiterer detaillierter Unterpopulationen verwendet werden oder sie können als prädiktiv und/oder zum Screening und/oder diagnostischer und/oder prognostischer und/oder unerwünschter Ereignisfaktor verwendet werden oder sie können verwendet werden, um diese Population letztendlich zur Bestimmung des gesamten Immunaktivierungsstatus nachzuweisen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung leidet der Säuger oder leidet wahrscheinlich an Autoimmunkrankheiten, Transplantatabstoßungen, Infektionskrankheiten, Krebs und/oder Allergien, wie unter anderem an Trypansosoma Cruzi-Infektion, Malaria und HIV-Infektion, hämatologischen Malignomen, wie chronischer myeloischer Leukämie, multiplem Myelom, Non-Hodgkin-Lymphom, Hodgkin-Krankheit, chronischer lymphatischer Leukämie, Graft versus Host- und Host versus Graft-Krankheit, Mycosis fungoides, extranodalem T-Zell-Lymphom, kutanen T-Zell-Lymphomen, anaplastischem Großzell-Lymphom, Angioimmunblastischem T-Zell-Lymphom und anderen T-Zell-, B-Zell- und NK-Zell-Neoplasien, T-Zell-Mangel, wie unter anderem Lymphozytopenie, schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID), Omenn-Syndrom, Knorpel-Haar-Hypoplasie, erworbenem Immundefizienz-Syndrom (AIDS) und Erbkrankheiten, wie DiGeorge-Syndrom (DGS), Chromosomenbruchsyndrom (CBS), Multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus Erythematodes, Sjögren-Syndrom, systemischer Sklerose, Dermatomyositis, primärer biliärer Zirrhose, primärer sklerosierender Cholangitis, Colitis Ulcerosa, Morbus Crohn, Psoriasis, Vitiligo, bullösem Pemphigoid, Alopecia Areata, idiopathischer dilatativer Kardiomyopathie, Typ 1 Diabetes mellitus, Morbus Basedow, Hashimoto-Thyreoiditis, Myasthenia gravis, IgA-Nephropathie, membranöser Nephropathie und perniziöser Anämie; und B-Zell- und T-Zell-Kombinationsstörungen wie Ataxie-Telangiektasien (AT) und Wiskott-Aldrich-Syndrom (WAS); und Karzinomen wie unter anderem Brustkrebs, Darmkrebs, Magenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberzellkarzinom, Cholangiokarzinom, Melanom sowie Kopf- und Halskrebs.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren wie oben, das weiterhin die Messung und/oder Überwachung der Menge an naiven CD8+ T-Zellen als Reaktion auf chemische und/oder biologische Substanzen, die dem Säuger verabreicht werden, d.h. als Reaktion auf eine Behandlung des Patienten, umfasst. Das Verfahren umfasst die Schritte wie oben und den Vergleich der relativen Menge der identifizierten Zellen mit einer früher oder gleichzeitig genommenen Probe von demselben Säuger und/oder mit einer Kontrollprobe. Basierend auf den Ergebnissen wie erhalten durch die/das Verfahren der Erfindung kann der behandelnde Arzt auf den Immunstatus des Patienten schließen und eine Behandlung der zugrunde liegenden Erkrankung anpassen.
Vorzugsweise wird das Verfahren ohne einen Schritt der Aufreinigung und/oder Anreicherung von Zellen durchgeführt, vorzugsweise durch Verwendung von Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe oder jeder anderen biologischen Probe, die potentiell die naiven CD8+ T-Zellen enthält, wie z.B. einer Probe für den Zelltransfer in einen Patienten.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren wie oben, das weiterhin die Formulierung der identifizierten naiven CD8+ T-Zellen für die Transplantation in einen Patienten umfasst. Pharmazeutische Präparate für diese Zwecke und Verfahren zu ihrer Herstellung werden nach den bekannten Verfahren in der Transplantationsmedizin durchgeführt.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft ein Oligomer gemäß einer der SEQ ID Nrn. 4 bis 14, oder ein Amplikon gemäß SEQ ID Nrn. 1 bis 3.
Noch ein weiterer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Kit zur Identifizierung, Quantifizierung, und/oder Überwachung von naiven CD8+ T-Zellen in einem Menschen, basierend auf der Analyse der Bisulfitzugänglichkeit von CpG-Positionen in der Genregion von CD248, umfassend Komponenten zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, insbesondere ein Kit, umfassend a) ein Bisulfitreagenz und b) Materialien zur Analyse des Methylierungsstatus der CpG-Positionen ausgewählt aus den CpG-Positionen in der Region gemäß SEQ ID Nr. 1, wie etwa ein Oligomer ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nrn. 4 bis 14.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Oligomeren oder Amplikons, oder eines Kits gemäß der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung und/oder Überwachung naiver CD8+ T-Zellen in einem Menschen wie hier beschrieben.
Wie bereits erwähnt, wurden kürzlich drei neue Cytosin-Modifikationen entdeckt. Deshalb wird erwartet, dass zukünftige wissenschaftliche Erkenntnisse die in der Vergangenheit beschriebenen epigenetischen Modifikationsmuster korrigieren. Diese bisherigen Muster der Cytosin-Modifikationen umfassen Bisulfit-konvertierbares (nicht-methyliertes, nicht-modifiziertes) und nicht-konvertierbares (methyliertes, modifiziertes) Cytosin. Beide Termini müssen wie beschrieben korrigiert werden. Nach den neueren wissenschaftlichen Erkenntnissen (i) umfasst nicht-konvertierbares Cytosin 5-Methylcytosin (mC) und 5-Hydroxymethylcytosin (hmC), und (ii) Bisulfit-konvertierbares (d.h. die „Bisulfit-Konvertibilität“) Cytosin 5-Formylcytosin (fC), 5-Carboxycytosin (cC), ebenso wie nicht-modifiziertes Cytosin.
Zusätzlich basieren bisherigen Erfindungen auf i) dem Verhältnis von Bisulfit-konvertierbarem Cytosin zur gesamten Chromatinmenge (Zelltyp-unabhängiger, 100 % Bisulfit-konvertierbarer DNA-Lokus) oder ii) auf dem Verhältnis von Bisulfit-konvertierbarem Cytosin (fC, cC, nicht-modifiziertem Cytosin) zu nicht-Bisulfit-konvertierbarem Cytosin (hmC und mC). Diese Verhältnisse charakterisieren Zelltyp, Zelldifferenzierung, Zellstadium sowie pathologische Zellstadien. Daher werden neue Techniken zu neuartigen spezifischeren Ergebnisse führen und könnten aktuelle zellspezifische, Zellstadium-spezifische sowie pathologische Muster epigenetischer Modifikationen ergänzen und somit potenzielle neue Biomarker definieren. Es können neue Verhältnisse, die als Biomarker bestimmt werden sollen, definiert werden als: $Biomarker Verhältnis = a / b$
a = ∑ (C und/oder mC und/oder hmC und/oder fC und/oder cC)
b = ∑ (C und/oder mC und/oder hmC und/oder fC und/oder cC),
wobei a und b sich durch eine bis vier Arten von Modifikationen voneinander unterscheiden. Die Auffindung neuer DNA-Modifikationen wird diese Aufzählung erweitern.
Für die Zwecke der Definition für die vorliegende Anwendung beziehen sich „epigenetische Modifikationen“ in der DNA-Sequenz durch die Terminologie auf (i) Bisulfit-konvertierbares Cytosin (5-Formylcytosin, (fC) und/oder 5-Carboxycytosin (cC)) und (ii) nicht-Bisulfit-konvertierbares Cytosin ((einschließlich 5-Methylcytosin (mC), 5-Hydroxymethylcytosin, (hmC)). Da beide Methylierungsarten, mC und hmC, nicht Bisulfit-konvertierbar sind, ist es nicht möglich, zwischen diesen beiden zu unterscheiden. Ebenso sind fC, cC und nicht-modifiziertes Cytosin Bisulfit-konvertierbar und können auch nicht voneinander unterschieden werden. Die Bezeichnung „methylierte“ DNA umfasst sowohl mC als auch hmC. Die Bezeichnung „nicht-methylierte“ DNA umfasst fC, cC, und nicht-modifizierte DNA. Es wird erwartet, dass in Zukunft neue Varianten von DNA-Modifikationen entdeckt werden. Jede Art der Modifikation wird entweder Bisulfit-konvertierbar sein oder nicht. Da die vorliegende Erfindung jedoch zuverlässig zwischen den beiden Gruppen unterscheidet, werden diese neuartigen Modifikationen auch als Marker einsetzbar sein.
Darüber hinaus werden neben den DNA-Modifikationen auch Histone post-translational modifiziert, was deren Interaktion mit der DNA und nuklearen Proteinen verändert. Zu den Modifikationen gehören Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung, Sumoylierung, Citrullinierung und ADP-Ribosylierung. Der Kern der Histone H2A, H2B und H3 kann ebenfalls modifiziert werden. Histon-Modifikationen sind an verschiedenen biologischen Prozessen, wie etwa der Genregulation, DNA-Reparatur, Chromosomenkondensation (Mitose) und Spermatogenese (Meiose) beteiligt. Auch für diese Modifikationen ist ein spezifisches Modifikationsmuster für verschiedene Zelltypen, Zellstadien, Differenzierungsstatus spezifisch, und ein solches Muster kann auf Bisulfit-Konvertibilität oder ähnliche Verfahren analysiert werden, um bestimmte Zellen und Zellstadien zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung dieser Modifikationen.
Zusammenfassend identifizierten, quantifizierten und insbesondere unterschieden die Erfinder unter Verwendung der genetischen Region CD248 und insbesondere des hier beschriebenen Amplikons als Marker sehr spezifisch naive CD8+ T-Zellen und ihr Verhältnis zu anderen Zelltypen in einer Probe, wie zum Beispiel zu anderen Blutzellen.
Die Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren und das Sequenzprotokoll näher beschrieben, ohne darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden alle hier zitierten Referenzen in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
1 zeigt die Analyse der CpG-Positionen auf dem Amplikon Nr. 1817 (SEQ ID Nr. 1) gemäß der Erfindung. Die horizontalen Kästchen in der Tabelle entsprechen den CpG-Positionen im analysierten Amplikon (z.B. CpG 1, 2, etc.) mit den angegebenen Positionen (118, 133, 145, 175, 207, 212, 224, 231, 243, 274, 292, 296, 319, 327, 331, 345, 363, 373, 400, 406, und 415, entsprechend zu CpG 1, 2, 3, 4, ...etc.), und die Spalten entsprechen den analysierten Zelltypen.
Tabelle Nr. 2 zeigt die Spezifizität des TpG-spezifischen PCR-Systems unter Verwendung von Test-Templates d.h., Mischungen aus TpG- und CpG-spezifischer Plasmid-DNA.
SEQ ID Nr. 1 zeigt die genomische Region des Amplikons AMP1817 gemäß der vorliegenden Erfindung.
SEQ ID Nrn. 2 bis 3 zeigen Beispiele der Bisulfit-konvertierten Sequenzen von SEQ ID Nr. 1.
SEQ ID Nrn. 4 bis 14 zeigen die Sequenzen der spezifischen Oligomere (Primer und Sonden) gemäß der vorliegenden Erfindung. FAM=Fluoresceinamidit; BHQ1=Black Hole Quencher.
BEISPIELE
Beispiel 1
Um naive CD8+ T-Zellen zu identifizieren, wurde eine qPCR mit Bisulfit-konvertierten Proben aus dem humanen Genombereich entsprechend der folgenden Sequenz durchgeführt (AMP1817, SEQ ID Nr. 1), relevante CpGs sind fett dargestellt:
Die folgenden Sequenzen zeigen Beispiele der Bisulfit-konvertierten Sequenzen von SEQ ID Nr. 1:


 B1F (SEQ ID Nr. 2): 
 TATTTTTTTTATTTTTTTTGTTATTTAGTAATTTATTTTTGAGGTTTTGGGAAGTTTG
 GGTATTTATGGTTTTTGTAGGGTTGTAGTTGATGTTATTAGTTTTTAGTTTATGTTT
 TTTGTTATAATAATATTTGAAGTTATTAATGTAGTTGATATATATTTGTTGGTATA
 TATTGGTAATTTGGTATTTATTTGTGTTTATATAGTGGTGTGGATTATTTTTTGTTG
 GTTGGAAATTTAGGTGATAGTGGTAGTTGTAGTTTTGTGGTTTATTGGGTTTATAT
 TGTTGTTTGTATGGAGTTTGGGTATAGGGGTTTTTGTAATTGTGTTTGTTTGTTGTT
 AGTTGGAAGTTTTTAGTGTAGTGGTAGGATATGTGATTATTTATTTTTTTTATATA
 TTTGTGTTTGTAGTTTTTGTTGTTAGGGTTGTAGTTGATTT

 B2F (SEQ ID Nr. 3): 
 CATCTTCCTCATCCTCCCCGTCATCCAACAACTCATCTCCGAAATCCTAAAAAACC
 TAAACACCCATAACCCCTACAAAACTACAACTAATACCATCAACCTCCAACTCAT
 ATCCCTCGCTACAATAACACTCGAAACCACCAACGTAATTAACACACATCTACTA
 ACACACACCGACAATCTAACACTCATCTATATCCACACAACGATACGAATCATCC
 TCCGCTAACCGAAAACCCAAACGACAATAACAACTATAACCTTATAACCCACCGA
 ACTCACACTACTACTCGCACGAAACCTAAACACAAAAATCCTCGCAACTACGCCC
 GTCTACTACCAACCGAAAACCCTCAATACAACGACAAAACACGTAACCATCCACC
 TCCTCCACACATTCGTATTCGCAACCCCCGTTATCAAAACTACAACCAATCCC

Für die eigentliche epigenetische Profilerstellung der Amplikon-Region in Blutzell-Subtypen waren die Immunzellpopulationen wie analysiert wie folgt (siehe 1):

CTL01 = CD8+ zytotoxische T-Zellen
BLC25 = B-Lymphozyten
GRC52 = Granulozyten
MOC26 = CD14+ Monozyten
NKC = CD56+ NK-Zellen
NKT = CD56+ CD3+ NKT-Zellen
THC14 = CD4+ Helfer-T-Zellen

Die folgende Tabelle 1 zeigt Primer und Sonden, die für die qPCR (TpG-Varianten, Demethyl-spezifisch; CpG-Varianten, methyl-spezifisch) verwendet wurden:

Vorwärts-Amplifizierungsprimer	1817-fwd	CATCTTCCTCATCCTCCC (SEQ ID Nr. 4)
Rückwärts-Amplifizierungsprimer	1817-rev	GGGATTGGTTGTAGTTTTGATA (SEQ ID Nr. 5)

Naï ve CD 8	qPCR1 6	AMP18 17	qPCR16_F w_C	CTATATCCACACAACGATACGA (SEQ ID Nr. 6)
			qPCR16_R v_C	GTTTTCGGTTGGTAGTAGAC (SEQ ID Nr. 7)
			qPCR16_P_ C	AATCCTCGCAACTACGCCCGT (SEQ ID Nr. 8)	5'FA M/ 3'BH Q1
			qPCR16_F w_T	TATATAGTGGTGTGGATTATTTTTT (SEQ ID Nr. 9)
			qPCR16_R v_T	TAACAACAAACAAACACAATTACA (SEQ ID Nr. 10)
			qPCR16_P_ T	CAAACTCCATACAAACAACAATATA AACCCAA (SEQ ID Nr. 11)	5'FA M/ 3'BH Q1
Naï ve CD 8	qPCR1 6-2	AMP18 17	qPCR16_F w_C	CTATATCCACACAACGATACGA (SEQ ID Nr. 6)
			qPCR16_R v_C	GTTTTCGGTTGGTAGTAGAC (SEQ ID Nr. 7)
			qPCR16_P_ C	AATCCTCGCAACTACGCCCGT (SEQ ID Nr. 8)	5'FA M/ 3'BH Q1
			qPCR16-2_Fw_T	GTGTTTATATAGTGGTGTGGATTATT TTTT (SEQ ID Nr. 12)
			qPCR16-2_Rv_T	CT AACAACAAACAAACACAATT ACA (SEQ ID Nr. 13)
			qPCR16_P_ T	CAAACTCCATACAAACAACAATATA AACCCAA (SEQ ID Nr. 13)	5'FA M/ 3'BH Q1

Die Spezifität des TpG-spezifischen PCR-Systems wurde durch Verwendung von Test-Templaten (Plasmid-DNA) gezeigt, wie in der folgenden Tabelle Nr. 2 gezeigt ist:

Pipettiertes „TpG“ Plasmid [%]	Gemessenes TpG [%]	Abweichung
100	100	0.00
99	99.07	0.07
97.5	97.9	0.41
95	95.27	0.28
90	89.1	-1.00
75	71.11	-5.19
50	51.09	2.18
25	28.6	14.40
10	12.81	28.10
5	5.92	18.40
2.5	2.76	10.40
1	0.36	-64.00
0	0	-

Hierfür wurden die entworfenen „TpG“-Plasmide mit „CpG“-Plasmiden gemischt, um Methylierungswerte in einem Bereich zwischen 100% und 0% zu simulieren. Anschließend wurde der Anteil (in %) der TpG-Templates in diesen Mischungen mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Assays bestimmt.

Die Zelltyp-Spezifität (gemessen mit qPCR) wurde wie folgt ermittelt (Tabelle 3):

Immunzelltyp	qPCR-Detektion [%]
CD8+ naive T-Zellen	95.94
CD8+ Gedächtnis T-Zellen	6.67
alle CTLs	76.88
T-Helferzellen	0.95
B-Zellen	0.15
CD14+ Monozyten	0
CD56 NK	0
CD56 NK T-Zellen	1.33
CD15+ Granulozyten	0

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Patentliteratur

WO 9810284 [0009]
WO 2006/060719 [0009]
WO 2012/162660 [0010]
WO 2013/014122 [0011]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937 [0004, 0007]
Antequera und Bird, Proc Natl Acad Sci USA 90: 11995-9, 1993 [0005]
Jones und Laird, Nature Genetics 21:163-167, 1999 [0006]
Esteller, Oncogene 21:5427-5440, 2002 [0006]
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Hardie D. L. et al. (in: The stromal cell antigen CD248 (endosialin) is expressed on naive CD8+ human T cells and regulates proliferation. Immunology 133, 288-295 (2011)) [0012]
Tserel et al. (in: Tserel L, Kolde R, Limbach M, et al. Age-related profiling of DNA methylation in CD8+ T cells reveals changes in immune response and transcriptional regulator genes. Scientific Reports. 2015;5:13107) [0013]
Kristensen und Hansen PCR-Based Methods for Detecting Single-Locus DNA Methylation Biomarkers in Cancer Diagnostics, Prognostics, and Response to Treatment Clinical Chemistry 55:8 1471-1483 (2009) [0025]

Claims

Verfahren zur Identifizierung naïver CD8+ T-Zellen in einer von einem Menschen stammenden Probe, umfassend das Analysieren einer Modifikation, wie z.B dem Methylierungsstatus von mindestens einer CpG Position in der humanen Genregion für Endosialin (CD248), wobei vorzugsweise die analysierte Genregion gemäß der Sequenz SEQ ID Nr. 1 positioniert ist, wobei eine fehlende Modifikation, wie z.B. eine Demethylierung oder fehlende Methylierung der Genregion für eine naive CD8+ T-Zelle im Vergleich zu einer nicht-naiven CD8+ T-Zelle indikativ ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine CpG Position in der 5'-Position stromaufwärts vom Transkriptionsstarts, der Promoterregion, der 5'- oder 3'- nicht translatierten Regionen, Exon, Intron, Exon/Intron Grenze und/oder in der 3'- Region stromabwärts des Transkriptionsstopps der analysierten Genregion vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mindestens eine CpG Position ausgewählt ist aus einem CpG der CpG Positionen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, und 21 im Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 1 und vorzugsweise aus den CpG Positionen 10, 11, 12, und 13 in einem Fragment des Amplikons Nr. 1817 gemäß der Bisulfit-konvertierten Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 oder 3 ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Analyse der Bisulfit-Konvertibilität ein Verfahren ausgewählt aus methylierungsspezifischen enzymatischem Verdau, Bisulfitsequenzierung, einer Analyse ausgewählt aus Promotermethylierung, CpG-Insel-Methylierung, MSP, HeavyMethyl, MethyLight, Ms-SNuPE, und anderen Verfahren, die auf dem Nachweis amplifizierter DNA beruhen, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiter umfassend eine Quantifizierung der relativen Menge an naiven CD8+ T-Zellen, basierend auf dem Vergleich der relativen Mengen der Methylierungsfrequenz in der analysierten Region, mit den relativen Mengen der Methylierungsfrequenz in einem Kontrollgen, wie beispielsweise GAPDH.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Probe aus einer Körperflüssigkeit eines Säugers, einschließlich menschlicher Blutproben, oder einer Gewebe-, Organ- oder Zelltyp-Blutprobe, einer Probe von Blutlymphozyten oder einer Fraktion davon ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiter umfassend ein Unterscheiden der naiven CD8+ T-Zellen von allen oder von mindestens einem der Zelltypen ausgewählt aus CD56+ NK Zellen, follikuläre T-Helfer-Zellen, B-Zellen, zytotoxische T-Zellen, Granulozyten, Monozyten, CD56++ (bright) NK-Zellen, T-Helfer-Zellen und NKT-Zellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Verfahren ohne einen Schritt der Aufreinigung und/oder Anreicherung der zu identifizierenden Zellen durchgeführt wird, vorzugsweise unter Verwendung von Vollblut und/oder nicht-trypsinisiertem Gewebe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, weiter umfassend den Schritt des Schlussfolgerns auf den Immunstatus des Säugers basierend auf den identifizierten naiven CD8+ T-Zellen.
Verfahren zur Überwachung der Menge an naiven CD8+ T-Zellen in einem Menschen, umfassend die Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 5 bis 9 und weiterhin einen Vergleich der relativen Menge der identifizierten Zellen mit einer früher oder gleichzeitig entnommenen Probe desselben Menschen und/oder mit einer Kontrollprobe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, weiter umfassend die Messung und/oder die Überwachung der Menge an naiven CD8+ T-Zellen als Reaktion auf chemische und/oder biologische Substanzen, die dem Menschen verabreicht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Mensch an Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßungen, Infektionskrankheiten, Krebs und/oder Allergie leidet oder wahrscheinlich daran leidet.
Kit zur Identifizierung, Quantifizierung und/oder Überwachung von naiven CD8+ T-Zellen in einem Menschen basierend auf der Analyse der Bisulfit-Zugänglichkeit der CpG-Positionen in der Genregion von CD248, umfassend Komponenten zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12, insbesondere ein Kit umfassend a) ein Bisulfitreagenz, und b) Materialien zur Analyse des Methylierungsstatus der CpG-Positionen ausgewählt aus den CpG-Positionen in der Region gemäß SEQ ID Nr. 1, sowie ein Oligomer, ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nrn. 4 bis 14.
Oligomer gemäß einer der SEQ ID Nrn. 4 bis 14, oder Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 1.
Verwendung des Kits nach Anspruch 13, oder des Oligomers oder Amplikons nach Anspruch 14 zur Identifizierung, Quantifizierung und/oder Überwachung von naiven CD8+ T-Zellen in einem Menschen.