CN111278988A

CN111278988A - 作为用于鉴定免疫细胞，特别是初始cd8+ t细胞的表观遗传标志物的内皮唾液酸蛋白(cd248)

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Publication number: CN111278988A
Application number: CN201880069377.9A
Authority: CN
Inventors: 斯文·欧莱克; 贾尼卡·约瑟芬·舒尔茨
Original assignee: Epiontis GmbH
Current assignee: Precision for Medicine GmbH
Priority date: 2017-10-26
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2020-06-12
Also published as: US20200370117A1; DE102017125150A1; JP2021502804A; AU2018356473A1; EP3669000A1; US11667973B2; DE102017125150B4; WO2019081642A1; EP3669000B1; CA3080065A1

Abstract

本发明涉及用于鉴定特异性免疫细胞(特别是初始CD8+ T细胞)的方法(特别是体外方法)，其包括分析哺乳动物内皮唾液酸蛋白(CD248)基因区中至少一个CpG位置的甲基化状态，其中当与非初始CD8+ T细胞或任何其它(血液)细胞类型相比时，所述基因区的脱甲基化或甲基化的缺乏指示初始CD8+ T细胞。根据本发明的分析可以在表观遗传水平上鉴定初始CD8+ T细胞，并将它们与复杂样品中的所有其它细胞(如例如其它血液细胞或免疫细胞)区分开。本发明还提供了用于定量初始CD8+ T细胞(特别是在初始CD8+ T细胞复杂样品中的初始CD8+ T细胞)的改进方法。所述方法可以在有或没有纯化和/或富集细胞的步骤的情况下进行，优选在全血和/或非胰蛋白酶消化的组织中进行。

Description

作为用于鉴定免疫细胞，特别是初始CD8+ T细胞的表观遗传标志物的内皮唾液酸蛋白(CD248)

本发明涉及用于鉴定特异性免疫细胞(特别是初始CD8+ T细胞)的方法(特别是体外方法)，其包括分析哺乳动物内皮唾液酸蛋白(CD248)基因区中至少一个CpG位置的修饰(如甲基化状态)，其中当与非初始CD8+ T 细胞或任何其它(血液)细胞类型相比时，所述基因区的脱甲基化或修饰 (如甲基化)的缺乏指示初始CD8+ T细胞。根据本发明的分析可以在表观遗传水平上鉴定初始CD8+ T细胞，并将它们与复杂样品中的所有其它细胞(如例如其它血液细胞或免疫细胞)区分开。本发明还提供了用于定量初始CD8+ T细胞(特别是在初始CD8+ T细胞复杂样品中的初始CD8+ T细胞) 的改进方法。所述方法可以在有或没有纯化和/或富集细胞的步骤的情况下进行，优选在全血和/或非胰蛋白酶消化的组织中进行。

此外，本发明涉及用于进行上述方法的试剂盒及其各自的用途。本发明的一个目的是提供一种新颖的，更稳健的方法来定量检测和测量任何体液(如血液)、任何实体器官或组织内的或哺乳动物的初始CD8+ T细胞。

发明背景

初始CD8+ T细胞是在骨髓中已分化的并且成功地经历了胸腺中中枢选择的阳性和阴性过程的T细胞，并且构成初始形式的细胞毒性T细胞 (CD8+)。初始T细胞被认为是成熟的，并且与激活的或记忆性T细胞不同，没有遇到它在外周内的同源抗原。通常初始T细胞的特征为：以L-选择素 (CD62L)的表面表达；不存在激活标志物CD25、CD44或CD69；并且不存在记忆性CD45RO同种型。它们也被描述为表达功能性IL-7受体，其由亚基IL-7受体α、CD127和共同γ链、CD132组成。

即使个体中几乎所有细胞都含有完全相同的DNA编码互补序列，高等生物体也必须在不同类型的组织中强加和维持不同模式的基因表达。大多数基因调控是暂时的，这取决于细胞的当前状态和外部刺激的变化。另一方面，持续调控是表观遗传学-可遗传调控模式的主要作用，所述表观遗传学-可遗传调控模式不改变DNA的基本遗传编码。DNA甲基化是表观遗传调控的典型形式；它用作细胞的稳定存储器，并在维持各种单元类型的长期身份方面发挥关键作用。最近，发现了其它形式的表观遗传调控。除了“第五个碱基”5-甲基胞嘧啶(mC)之外，还可以发现第六个(5- 羟甲基胞嘧啶，hmc)、第七个(5-甲酰基胞嘧啶，fC)和第八个(5-羧基胞嘧啶，cC)(Michael J.Booth等人，Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science，2012年5 月18日，Vol.336no.6083pp.934-937)。

所述DNA修饰的主要靶标是两核苷酸序列胞嘧啶-鸟嘌呤(‘CpG位点’)；在本文中，胞嘧啶(C)可以进行简单的化学修饰以变成甲酰化的、甲基化的、羟甲基化的或羧基化的。在人类基因组中，CG序列比预期的稀少得多，除了在被称为“CpG岛”的某些相对密集的簇中。CpG岛经常与基因启动子相关，并且据估计超过一半的人基因具有CpG岛(Antequera 和Bird,Proc Natl Acad Sci USA 90:11995-9,1993)。

DNA的异常甲基化经常与从健康细胞到癌细胞的转化有关。在所观察到的效果中包括基因组范围的低甲基化、肿瘤抑制基因的增加的甲基化和许多致癌基因的低甲基化(例如，Jones和Laird综述，Nature Genetics 21:163-167,1999；Esteller,Oncogene 21:5427-5440，2002；和Laird,Nature Reviews/Cancer 3:253-266，2003)。已经认识到甲基化谱是肿瘤特异性的 (即，特定基因或甚至单个CpG的甲基化模式的改变是特定肿瘤类型的诊断)，并且现在存在对膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌和前列腺癌的诊断标志物的广泛收集(例如，由Laird,Nature Reviews/Cancer 3:253-266，2003概述的)。

对于最近所描述的胞嘧啶的修饰之一(5-羟甲基化)显示了氧化性亚硫酸氢盐测序在CpG岛上作图和定量5hmC的效用(Michael J.Booth等人， Quantitative Sequencingof 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base ResolutionScience，2012年5月18日，Vol.336 no.6083 pp. 934-937)。在与转录调节子相关的CpG岛中和在长散在的核元件中发现高水平的5hmC。提示这些区域可能在胚胎干细胞中经历表观遗传重编程。

可以在两步程序中进行初始CD8+ T细胞的分离。首先，通过耗尽用生物素缀合的抗体和抗生物素微珠的混合物间接磁性标记的非初始T细胞和NK细胞富集初始T细胞。在第二步中，用CD8微珠标记富集的初始T 细胞，用于随后CD8⁺初始T细胞的阳性选择。

WO 98/10284描述了捕获、纯化和扩增抗原特异性T淋巴细胞的方法。 WO2006/060719公开了使用抗体、衍生物和片段检测和分离内皮唾液酸蛋白阳性细胞的方法。

WO2012/162660描述了使用DNA甲基化阵列的方法，其被提供用于鉴定细胞或细胞混合物以及用于定量血液或组织中的细胞分布的改变，以及用于诊断、预测和治疗疾病病况，特别是癌症。该方法使用新鲜的和存档的样品。

WO 2013/014122涉及用于鉴定通常表达表面蛋白CD56和/或CD16的哺乳动物中的自然杀伤细胞及它们的亚组(优选为CD3阴性、非T淋巴细胞源的NK细胞)的方法(特别是体外方法)，其包括分析OSBPL(如OSBPL5) 的基因组DNA对亚硫酸氢盐转化的可及性和/或OSBPL(如OSBPL5)的基因中至少一个CpG位置的甲基化状态。

Suarez-

等人(Phenotypic characteristics of aged CD4+ CD28null Tlymphocytes are determined by changes in the whole-genome DNA methylationpattern.Aging Cell.2017Apr；16(2):293-303.Epub 2016 Dec 27) 分析CD28无(CD28null)T细胞及其CD28+对应物的全基因组DNA甲基化和基因表达谱。比较分析揭示296个基因在两个细胞亚群之间差异甲基化。

Hardie D.L.等人(在：The stromal cell antigen CD248(endosialin)isexpressed on naive CD8+ human T cells and regulates proliferation. Immunology133,288–295(2011))公开了CD248由人而不是小鼠(C57BL/6) 的CD8⁺初始T细胞唯一地表达。它们的数据证明CD248对造血(CD8⁺)细胞与基质细胞的功能相反，并提示CD248有助于将初始的CD8⁺人T细胞维持在静止状态。

Tserel等人(在：Tserel L,Kolde R,Limbach M，等人，Age-related profilingof DNA methylation in CD8+ T cells reveals changes in immune response andtranscriptional regulator genes.Scientific Reports.2015；5:13107) 公开了来自更年轻个体和年长个体的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中DNA 甲基化和基因表达的年龄相关变化。他们在T细胞亚群之间观察到显著的差异，其中随着年龄的增加，在CD8+ T细胞中，甲基化变化的数目增加，并且甲基化组的变化更高。大多数与年龄相关的高甲基化位点位于沉默基因的CpG岛并富集抑制组蛋白标志物。具体地，在CD8+ T细胞亚群中，他们鉴定了与T细胞介导的免疫应答(LGALS1、IFNG、CCL5、GZMH、 CCR7、CD27和CD248)和分化(SATB1、TCF7、BCL11B和RUNX3)相关的基因中甲基化水平和表达水平之间的强负相关。因此，他们的结果提示与年龄相关的表观遗传变化和受损的T细胞功能之间的联系。年长个体表现出增加的甲基化和降低的CD248表达，以及疫苗应答问题。

考虑到上述情况，本发明的目的是提供改进的，特别是稳健的方法，该方法基于作为优越的工具的NA甲基化分析，以便更方便和可靠地检测、鉴定、辨别和定量特异性免疫细胞，特别是初始CD8+ T细胞。

本发明通过提供用于鉴定来源于人的样品中初始CD8+ T细胞的方法来解决上述目的，所述方法包括分析人内皮唾液酸蛋白(CD248)基因区中至少一个CpG位置的修饰(优选地，甲基化状态)，其中优选地，所分析的所述基因区根据SEQ ID No.1定位，其中当与非初始CD8+ T细胞相比时，所述基因区的脱甲基化或修饰(优选地，甲基化)的缺乏指示初始CD8+ T 细胞，。

人CD248的基因见于Ensembl-ID:ENSG00000174807。

在本发明的上下文中，“基因”或“基因区”应包括与CD248相关并编码CD248的所有基因组区。因此，所包括的是属于CD248的增强子区、启动子区、内含子、外显子和非编码区(5’区和/或3’区)。因此，优选的是根据本发明的方法，其中至少一个CpG位置存在于所分析的基因的转录起始上游的5’区、启动子区、5’或3’非翻译区、外显子、内含子、外显子 /内含子边界，和/或转录终止下游的3’区。

本发明还基于发明人出人意料地鉴定CD248基因的区域作为特异性表观遗传标志物，允许鉴定初始CD8+ T细胞以及所述分析的临床常规应用。

在本发明的上下文中，CD248的基因组区(特别是根据SEQ ID No.1 的CD248的基因组区)允许鉴定初始CD8+ T细胞。出人意料地是，亚硫酸氢盐可转化的和不可转化的胞嘧啶的有差别的模式特别地甚至排他地限于根据SEQ ID No.1的初始CD8+ T细胞的基因组区，其如使用根据SEQ ID No.1的扩增子所示的，并且特别是在根据SEQ ID No.2或3的亚硫酸氢盐转化的序列中。

发明人可以证明，在初始CD8+ T细胞中，所公开的CpG基序几乎完全是脱甲基化的(即达到超过70％，优选地80％，优选地超过90％，并且最优选超过95％)，而相同的基序在所有其它免疫细胞中是完全甲基化的。

前述区域内的CpG基序的差异甲基化是鉴定初始CD8+ T细胞的有价值的工具，诸如用于在任何可预见的诊断背景中的自身免疫病、移植排斥、癌症、过敏症、原发性和继发性免疫缺陷(诸如例如HIV感染和AIDS、移植物抗宿主(GvH))、血液恶性肿瘤、类风湿性关节炎、多发性硬化症或细胞毒性T细胞相关的免疫状态中鉴定和定量所述细胞将是所需要的(或至少具有某些价值)。测定允许测量初始CD8+ T细胞而无需纯化或任何染色程序。

然后根据本发明的方法的另一个优选方面还包括基于比较所分析的区域中所述甲基化频率的相对量与对照基因(诸如例如GAPDH)中的甲基化频率的相对量，对初始CD8+T细胞的相对量进行定量。因此，所述定量是基于本文所述和所分析的CD248(例如SEQ IDNo.1的)的遗传区中亚硫酸氢盐可转化DNA与不可转化DNA的比率来实现的。最优选的是对初始CD8+ T细胞的相对量的定量是基于对CD248的细胞特异性区域的亚硫酸氢盐可转化DNA的相对量，以及对细胞非特异性基因(优选命名为“对照基因”或“对照区”，诸如例如GAPDH的基因)的亚硫酸氢盐可转化DNA 的相对量的(优选并行或同时)分析。

在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，所述亚硫酸氢盐可转化性分析包括用合适引物对的至少一个引物扩增，所述引物对可基于 SEQ ID No.1(优选根据SEQ IDNo.4-14中任一项的寡聚物)适当设计。

与FACS和mRNA测量相比，使用根据本发明的方法，测量和分析可以在不依赖于纯化、储存的情况下进行，并且在一定程度上也可以进行组织质量的测量和分析。

优选地，扩增涉及聚合酶、PCR或化学扩增反应，或如下所述的本领域技术人员已知的其它扩增方法，例如在MSP、重甲基(Heavymethyl)、 Scorpion、MS-SnuPE、甲基化荧光检测(MethylLight)、亚硫酸氢盐测序，甲基特异性限制测定和/或数字PCR的上下文中(参见，例如Kristensen和 Hansen PCR-Based Methods for Detecting Single-Locus DNAMethylation Biomarkers in Cancer Diagnostics,Prognostics,and Response toTreatment Clinical Chemistry 55:8 1471–1483(2009))。

通过扩增，产生CD248基因区的扩增子，其是用于进行根据本发明的方法的特别优选的“工具”。因此，根据SEQ ID No.4-14中任一项的寡聚物或如本文所述由基于SEQ IDNo.4和5、6和7、9和10以及12和13的引物对扩增的扩增子构成本发明的优选实施方案。因此，SEQ ID No.1-3的序列(以及，如果需要的话，与其互补的序列)可被用于设计用于扩增的引物，即，作为相关序列中的“信标”。类似地，可以基于根据SEQ ID No.1 的扩增子设计另外的引物和探针。扩增可以在基因组和/或亚硫酸氢盐(即“转化的”)DNA序列中进行。

本领域技术人员还将能够选择CpG位置的特定子集以便最小化待分析的位点的量，例如选自根据SEQ ID No.1的扩增子中的CpG位置的至少一个CpG位置，并且优选地选自根据SEQ ID No.1的第1817号扩增子中 CpG位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19和20。从所产生和所分析的扩增子的5’端对位置进行数字计数，并在图1中命名为AMP1871:118、133、145、175、207、212、224、231、 243、274、292、296、296、319、327、331、345、363、373、400、406 和415。优选的是3、4、5、6、7、8、9或10个位置的组合，其分析产生足够的数据和/或信息以便在本发明的上下文中提供有用信息。

本领域技术人员还将能够选择CpG位置的特定子集，以便最小化待分析的位点的量，例如CD248特异性亚硫酸氢盐可转化区(SEQ ID No.1) 第1817号扩增子中的CpG位置CpG1至CpG20中的至少一个，或根据SEQ ID No.1存在于亚硫酸氢盐可转化区上的所有位点。可以排除位置118、 133、363、373、400、406和/或415中的一个或多个。

为了分析CpG位置的亚硫酸氢盐可转化性，可以使用任何已知方法来分析DNA甲基化。在根据本发明的方法的优选实施方案中，甲基化状态的分析包括选自甲基化特异性酶促消化、亚硫酸氢盐测序的方法，选自启动子甲基化、CpG岛甲基化、重甲基、甲基化荧光检测、Ms-SNuPE 的分析，或依赖于扩增DNA的检测的其它方法。这些方法是本领域技术人员熟知的，并且可以在相应的文献中找到。

在根据本发明的方法的优选实施方案中，所述方法适于常规应用，例如在DNA芯片上。基于上述信息和相应的文献，本领域技术人员将能够将上述方法调整到此类设置。

在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，所述方法在没有纯化和/或富集待鉴定的所述细胞的步骤的情况下进行，优选地使用全血和/ 或非胰蛋白酶消化的组织进行。

在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，所述鉴定包括所述初始CD8+ T细胞与所有主要外周血细胞类型和/或非血细胞(优选但不限于CD56+NK细胞、卵泡辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、粒细胞、单核细胞、B细胞、CD56++(“明亮的”)NK细胞、辅助性T细胞和NKT细胞和来源于非血液的其它器官的其它细胞类型)的区别。

在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，样品选自人体液，其包括人血液样品，或组织、器官或白细胞样品、或此类组织、器官或白细胞或细胞类型的样品的纯化或分离级分。如果需要，可以适当合并样品。

然后根据本发明的方法的另一个优选方面还包括基于所述初始 CD8+ T细胞推断所述人的免疫状态的步骤。初始CD8+ T细胞可被定量并用作相对定量进一步详细的亚群的基准，或它可以被用作预测和/或筛查和/或诊断和/或预后和/或不良事件检测因子，或它可以被用于最终检测该群体以确定总体免疫活性状态。

在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，哺乳动物患有或可能患有自身免疫病、移植排斥、感染疾病、癌症和/或过敏症，例如但不限于克氏锥虫感染、疟疾和HIV感染；血液恶性肿瘤，例如但不限于慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、慢性淋巴细胞性白血病、移植物抗宿主和宿主抗移植物病、蕈样真菌病、结外T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性 T细胞淋巴瘤和其它T细胞、B细胞和NK细胞肿瘤，T细胞缺陷如但不限于淋巴细胞减少症、重症联合免疫缺陷(SCID)、Omenn综合征，软骨-毛发发育不全、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，和遗传病况如迪乔治综合征(DGS)、染色体断裂综合征(CBS)、多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肖格伦综合征、系统性硬化、皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、银屑病、白癜风、大疱性类天疱疮、斑秃、特发性扩张性心肌病、1型糖尿病、格雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、IgA肾病、膜性肾病和恶性贫血；以及B细胞和T细胞组合病症，如但不限于共济失调毛细血管扩张(AT)和 Wiskott-Aldrich综合征(WAS)；以及癌症，如但不限于乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、肝细胞癌、胆管癌、黑色素瘤和头颈癌。

根据本发明的方法的另一个优选方面涉及上述方法，其还包括测量和/或监测响应于提供给所述哺乳动物的化学和/或生物物质(即，响应于所述患者的治疗)的初始CD8+T细胞的量。所述方法包括上述步骤，并将所鉴定的所述细胞的所述相对量与从同一哺乳动物早期或并行获取的样品和/或对照样品进行比较。基于由本发明的方法所提供的结果，主治医生将能够推断患者的免疫状态，并相应地调整潜在疾病的治疗。

优选地，所述方法在没有纯化和/或富集细胞的步骤的情况下进行，优选在全血和/或非胰蛋白酶消化的组织，或者作为例如用于细胞转移到患者体内的样品的可能含有所述初始CD8+ T细胞的任何其它生物样品中进行。

然后根据本发明的方法的另一个优选方面涉及上述方法，其还包括配制所述初始CD8+ T细胞，其被鉴定用于移植到患者体内。用于这些目的的药物制剂及其制备方法根据移植药物领域已知的方法进行。

根据本发明的方法的另一个优选方面涉及根据SEQ ID No.4-14任一项的寡聚物，或根据SEQ ID No.1-3的扩增子。

本发明的另一个优选方面涉及用于基于对CD248的基因区中CpG位置的亚硫酸氢盐可及性的分析来鉴定、定量和/或监测人的初始CD8+ T细胞的试剂盒，其包含用于进行权利要求1至12中任一项所述的方法的成分，特别是试剂盒包含a)亚硫酸氢盐试剂，和b)用于分析选自根据SEQ ID NO:1的区域中的CpG位置的CpG位置的甲基化状态的材料，诸如选自根据SEQ ID NO:4-14的序列的寡聚物。

本发明还包括根据本发明的寡聚物或扩增子或试剂盒用于鉴定和/或监测本文中所述的人的初始CD8+ T细胞的用途。

如上所述，最近发现了三种新的胞嘧啶修饰。因此，预期未来的科学发现将校正过去所描述的修饰的表观遗传模式。这些过去的胞嘧啶修饰模式包括亚硫酸氢盐可转化的(非甲基化的，未修饰的)和不可转化的 (甲基化的，修饰的)胞嘧啶。如上所述，两个末端都需要被校正。根据新的科学发现：(i)非亚硫酸氢盐可转化的胞嘧啶包括5-甲基胞嘧啶(mC)和 5-羟甲基胞嘧啶(hmC)，和(ii)亚硫酸氢盐可转化的(即“亚硫酸氢盐可转化性”)胞嘧啶包括5-甲酰基胞嘧啶(fC)、5-羧基胞嘧啶(cC)以及未修饰的胞嘧啶。

另外，过去的发明基于：(i)亚硫酸氢盐可转化的胞嘧啶与染色质总量的比率(细胞类型独立的，100％亚硫酸氢盐可转化的DNA基因座)或(ii) 亚硫酸氢盐可转化的胞嘧啶(fC、cC、未修饰的胞嘧啶)与非亚硫酸氢盐可转化的胞嘧啶(hm和mC)的比率。这些比率表征细胞类型、细胞分化、细胞阶段以及病理学细胞阶段。因此，新技术将导致新的、更特异性的比率，并且可以补充当前的细胞特异性、细胞状态特异性以及表观遗传修饰的病理学模式，并且因此限定潜在的新生物标志物。作为生物标志物发现的新比率可以限定为：

生物标志物比率＝a/b

a＝∑(C和/或mC和/或hmC和/或fC和/或cC)

B＝∑(C和/或mC和/或hmC和/或fC和/或cC)，

其中a和b彼此不同的是一种至四种类型的修饰。发现新的DNA修饰将扩大这种列举。

为了本申请的定义的目的，DNA序列中的“表观遗传修饰”被称为术语：(i)亚硫酸氢盐可转化的胞嘧啶(5-甲酰基胞嘧啶，(fC)和/或5-羧基胞嘧啶(cC))和(ii)非亚硫酸氢盐可转化的胞嘧啶(包括5-甲基胞嘧啶 (mC)，5-羟甲基胞嘧啶，(hmC))。由于两种甲基化mC和hmC都不是亚硫酸氢盐可转化的，因此不可能区分这两种甲基化。同样，fC、cC以及未修饰的胞嘧啶是亚硫酸氢盐可转化的，也不能相互区分。术语“甲基化的”DNA包括mC以及hmC。术语“非甲基化的”DNA包括fC、cC和未修饰的DNA。预期DNA修饰的新变体将在将来被发现。每种类型的修饰将是亚硫酸氢盐可转化的或不可转化的。然而，由于本方法可靠地区分两个组，因此这些新颖的修饰也可用作标志物。

此外，除了DNA的修饰之外，组蛋白还经历了翻译后修饰，其改变了它们与DNA以及核蛋白的相互作用。修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、类泛素化、瓜氨酸化和ADP-核糖基化。组蛋白H2A、H2B 和H3的核心也可以被修饰。组蛋白修饰在多种生物学过程中起作用，如基因调控、DNA修复、染色体浓缩(有丝分裂)和精子发生(减数分裂)。对于这些修饰，特定的修饰模式对于不同的细胞类型、细胞阶段、分化状态也是特异性的，并且可以分析亚硫酸氢盐可转化性或类似方法的此类模式，以便鉴定某些细胞和细胞阶段。本发明还包括这些修改的用途。

总之，使用如本文所述的CD248遗传区和特别是扩增子作为标志物，本发明人非常特异性地鉴定、定量和特别是分化初始CD8+ T细胞，以及它们与样品中其它细胞类型(例如与其它血细胞)的关系。

现在将基于以下实施例并参考附图和序列表进一步描述本发明，但不限于此。出于本发明的目的，如本文中所引用的所有参考文献通过引用整体并入。

图1显示了根据本发明的第1817号扩增子(SEQ ID No.1)上的CpG位点的分析。表中的水平框对应于所分析的扩增子中的CpG位置(例如 CpG1、2等)，具有所示位置(118、133、145、175、207、212、224、231、 243、274、292、296、319、327、331、345、363、373、400、406和415，对应于CpG1、2、3、4等)，并且列对应于所分析的细胞类型。

表2显示了使用测试模板，即TpG-和CpG-特异性质粒-DNA的混合物的TpG特异性PCR系统的特异性。

SEQ ID No.1显示了根据本发明的扩增子AMP1817的基因组序列。

SEQ ID No.2和3显示了SEQ ID NO:1的亚硫酸氢盐转化序列的实例。

SEQ ID No.4-14显示了根据本发明的特异性寡聚物(引物和探针)的序列。FAM＝荧光素亚酰胺(fluorescein amidite)；BHQ1＝黑洞淬灭器。

实施例

实施例1

为了鉴定初始CD8+ T细胞，根据以下序列(AMP1817，SEQ ID No.1) 对来源于人基因组区的亚硫酸氢盐转化的样品进行qPCR，相关的CpG以粗体表示：

以下序列显示了SEQ ID NO:1的亚硫酸氢盐转化序列的实例：

B1F(SEQ ID NO:2):

TATTTTTTTTATTTTTTTTGTTATTTAGTAATTTATTTTTGAGGTTTTGGGAAGTT TGGGTATTTATGGTTTTTGTAGGGTTGTAGTTGATGTTATTAGTTTTTAGTTTAT GTTTTTTGTTATAATAATATTTGAAGTTATTAATGTAGTTGATATATATTTGTTG GTATATATTGGTAATTTGGTATTTATTTGTGTTTATATAGTGGTGTGGATTATTT TTTGTTGGTTGGAAATTTAGGTGATAGTGGTAGTTGTAGTTTTGTGGTTTATTG GGTTTATATTGTTGTTTGTATGGAGTTTGGGTATAGGGGTTTTTGTAATTGTGTT TGTTTGTTGTTAGTTGGAAGTTTTTAGTGTAGTGGTAGGATATGTGATTATTTAT TTTTTTTATATATTTGTGTTTGTAGTTTTTGTTGTTAGGGTTGTAGTTAGTTTT

B2F(SEQ ID NO:3):

CATCTTCCTCATCCTCCCCGTCATCCAACAACTCATCTCCGAAATCCTAAAAAA CCTAAACACCCATAACCCCTACAAAACTACAACTAATACCATCAACCTCCAAC TCATATCCCTCGCTACAATAACACTCGAAACCACCAACGTAATTAACACACAT CTACTAACACACACCGACAATCTAACACTCATCTATATCCACACAACGATACG AATCATCCTCCGCTAACCGAAAACCCAAACGACAATAACAACTATAACCTTAT AACCCACCGAACTCACACTACTACTCGCACGAAACCTAAACACAAAAATCCTC GCAACTACGCCCGTCTACTACCAACCGAAAACCCTCAATACAACGACAAAACA CGTAACCATCCACCTCCTCCACACATTCGTATTCGCAACCCCCGTTATCAAAAC TACAACCAATCCC

对于血细胞亚型中扩增子区域的实际表观遗传谱分析，所分析的免疫细胞群如下(参见图1)。

CTL01＝CD8⁺细胞毒性T细胞

BLC25＝B淋巴细胞

GRC52＝粒细胞

MOC26＝CD14⁺单核细胞

NKC＝CD56⁺NK细胞

NKT＝CD56⁺CD3⁺NKT细胞

THC14＝CD4⁺辅助性T细胞

下表1显示了用于qPCR的引物和探针(TpG变体；脱甲基特异性；CpG 变体；甲基特异性)：

正向扩增引物	1817-fwd	CATCTTCCTCATCCTCCC(SEQ ID No.4)
			反向扩增引物	1817-rev	GGGATTGGTTGTAGTTTTGATA(SEQ ID No.5)

TpG特异性PCR系统的特异性使用如表2所示的测试模板(质粒DNA) 进行了证明，如下所示：

用移液器吸取的”TpG“质粒[％]	测量的TpG[％]	偏差
			100	100	0.00
99	99.07	0.07
			97.5	97.9	0.41
95	95.27	0.28
			90	89.1	-1.00
75	71.11	-5.19
			50	51.09	2.18
25	28.6	14.40
			10	12.81	28.10
5	5.92	18.40
			2.5	2.76	10.40
1	0.36	-64.00
			0	0	-

为此，将所设计的“TpG”质粒与“CpG”质粒混合，以模拟在100％和0％之间的范围内的甲基化值。然后，使用本发明的测定法测定这些混合物中TpG模板的比例(％)。

如下发现细胞类型特异性(如通过qPCR测量的)(表3)：

免疫细胞的类型	qPCR检测[％]
		CD8+初始T细胞	95.94
CD8+记忆性T细胞	6.67
		所有CTL	76.88
辅助性T细胞	0.95
		B细胞	0.15
CD14+单核细胞	0
		CD56 NK	0
CD56 NK T细胞	1.33
		CD15+粒细胞	0

序列表

<110> 艾皮恩蒂斯有限公司(Epiontis GmbH)

<120> 作为用于鉴定免疫细胞，特别是初始CD8+ T细胞的表观遗传标志物的内皮唾液酸蛋白(CD248)

<130> E31866WO

<150> DE 10 2017 125 150.2

<151> 2017-10-26

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 439

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

catcttcctc atcctccccg tcatccagca actcatctcc gaggtcctgg gaagcctggg 60

cacccatggc ccctgcaggg ctgcagctga tgccatcagc ctccagctca tgtccctcgc 120

tacaataaca ctcgaagcca ccaacgtagt tgacacacat ctgctggcac acaccggcaa 180

tctggcactc atctgtgtcc acacagcggt gcggatcatc ctccgctggc cggaaaccca 240

ggcgacagtg gcagctgtag ccttgtggcc caccgggctc acactgctgc tcgcacggag 300

cctgggcaca ggggtcctcg caactgcgcc cgtctgctgc cagccggaag ccctcagtgc 360

agcggcagga cacgtgacca tccacctcct ccacacattc gtgttcgcag cccccgttgt 420

cagggctgca gccagtccc 439

<210> 2

<211> 439

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

ggtgtgggtt tgagtttatt ttatagggta ggtttttgat tattagaagg tgttattgtt 60

tttatttggg atagatgtat atttttatat gtttttagat atttttaaat gggaggtgtt 120

ttttatattg agaataagat attatgaaaa tatgggaggg aagaaattaa tagttttggg 180

gtgtaaggag gttgggttaa gttgtgtatt gaggagggtg tatatggggg ttttgtggta 240

tttttataga gtagtgtagg ggaagaggtg gtttagggtt aagttgtgta ttgaggaggg 300

tgtatatggg ggttttgtgg tgttaagatg tagttgttgg attttattta agaaaagata 360

tttaattgtt ggggtggggt taatatttgg ttgttttgat tggttttaat ttgttttagt 420

aagaaggaaa ttaggggtt 439

<210> 3

<211> 439

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

ggtgtgggtt tgagtttatt ttatagggta ggtttttgat tattagaagg tgttattgtt 60

tttattcggg atagacgtat atttttatac gtttttagat atttttaaat gggaggcgtt 120

ttttatattg agaataagat attatgaaaa tacgggaggg aagaaattaa tagtttcggg 180

gcgtaaggag gttgggttaa gttgtgtatc gaggagggcg tatatggggg ttttgtggta 240

tttttataga gtagcgtagg ggaagaggcg gtttagggtt aagttgtgta tcgaggaggg 300

cgtatatggg ggttttgtgg cgttaagatg tagttgtcgg attttattta agaaaagata 360

tttaattgtc ggggcggggt taatattcgg tcgttttgat tggttttaat tcgttttagt 420

aagaaggaaa ttaggggtt 439

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

ggtgtgggtt tgagtttatt t 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

aacccctaat ttccttctta ct 22

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

gttttgtggt atttttatag agtagt 26

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

agatgggatg gaatggttgt 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

cctaaaccac ctcttcccct aca 23

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

ttttgtggta tttttataga gtagc 25

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

ccatatacgc cctcctcg 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

aaaccgcctc ttcccctacg 20

- 3 -

Claims

1.用于鉴定来源于人的样品中初始CD8+T细胞的方法，其包括分析人内皮唾液酸蛋白(CD248)基因区中至少一个CpG位置的修饰，诸如例如甲基化状态，其中优选地，所分析的所述基因区根据SEQ ID No.1定位，其中当与非初始CD8+T细胞相比时，所述基因区的所述修饰的缺乏，诸如脱甲基化或甲基化的缺乏指示初始CD8+T细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个CpG位置存在于所分析的所述基因区的转录起始上游的5’区、启动子区、5’或3’非翻译区、外显子、内含子、外显子/内含子边界，和/或转录终止下游的3’区。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个CpG位置选自这样的CpG，其选自根据SEQ ID No.1的扩增子中的CpG的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21，并且优选地选自根据根据SEQ ID No.2或3的亚硫酸氢盐转化序列的第1817号扩增子的片段中的CpG位置10、11、12和13。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述亚硫酸氢盐可转化性的分析包括选自甲基化特异性酶促消化、亚硫酸氢盐测序的方法，选自启动子甲基化、CpG岛甲基化、MSP、重甲基、甲基化荧光检测、Ms-SNuPE的分析，以及依赖于扩增DNA的检测的其它方法。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其还包括基于比较所分析的区域中所述甲基化频率的相对量与诸如例如GAPDH的对照基因中的甲基化频率的相对量，对初始CD8+T细胞的相对量进行定量。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述样品选自哺乳动物体液，其包括人血液样品，或组织、器官或细胞类型的血液样品，血液淋巴细胞样品或其级分。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其还包括将所述初始CD8+T细胞与选自CD56+NK细胞、卵泡辅助性T细胞、B细胞、细胞毒性T细胞、粒细胞、单核细胞、CD56++(明亮的)NK细胞、辅助性T细胞和NKT细胞的所有或至少一种细胞类型区分开。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法在没有纯化和/或富集待鉴定的所述细胞的步骤的情况下进行，优选地使用全血和/或非胰蛋白酶消化的组织进行。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其还包括基于所鉴定的所述初始CD8+T细胞推断所述哺乳动物的免疫状态的步骤。

10.用于监测人的初始CD8+T细胞水平的方法，其包括进行权利要求5至9中任一项所述的方法，并且还将所鉴定的所述细胞的所述相对量与从同一人早期或并行获取的样品和/或对照样品进行比较。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其还包括测量和/或监测响应于提供给所述人的化学和/或生物物质的所述初始CD8+T细胞的量。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述人患有或可能患有自身免疫病、移植排斥、感染疾病、癌症和/或过敏症。

13.用于基于对CD248的基因区中CpG位置的亚硫酸氢盐可及性的分析来鉴定、定量和/或监测人的初始CD8+T细胞的试剂盒，其包含用于进行权利要求1至12中任一项所述的方法的成分，具体地试剂盒包含a)亚硫酸氢盐试剂，和b)用于分析选自根据SEQ ID NO:1的区域中的CpG位置的CpG位置的甲基化状态的材料，诸如选自根据SEQ ID NO:4-14的序列的寡聚物。

14.SEQ ID No.4-14中任一项的寡聚物，或SEQ ID No.1的扩增子。

15.权利要求13所述的试剂盒，或权利要求14所述的寡聚物或扩增子用于鉴定、定量和/或监测人的初始CD8+T细胞的用途。