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Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein Verfahren zum Aufnehmen eines Stapels von mikroskopischen Bildern einer Probe. Die Bilder des Stapels werden mit unterschiedlichen Fokuspositionen aufgenommen. Im Weiteren betrifft die Erfindung ein digitales Mikroskop zum Mikroskopieren einer Probe.
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Aus der
US 7,345,816 B2 ist ein optisches Mikroskop bekannt, welches einen Spiegel mit einer steuerbar veränderlichen reflektierenden Oberfläche umfasst. Durch eine Veränderung der Oberfläche des Spiegels können Bilder aus unterschiedlichen fokalen Positionen aufgenommen werden.
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Das Produkt „3D Microscope“ des Herstellers SD Optics dient der schnellen Erzeugung von makroskopischen und mikroskopischen Bildern, welche eine erweiterte Schärfentiefe (EDoF - Extended Depth of Field) besitzen. Zur Realisierung der EDoF-Funktionalität dient ein als MALS-Modul bezeichnetes Spiegel-Array-Linsensystem. MALS steht für Mirror Array Lens System. Details dieses Systems sind beispielsweise in der
WO 2005/119331 A1 oder
WO 2007/134264 A2 offenbart.
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Die
EP 2 687 890 A1 beschreibt ein Gerät und ein Verfahren zur Komprimierung von Stapelbildern von mikroskopischen Aufnahmen.
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Aus der
EP 2 687 893 A1 ist ein Verfahren zur Verbesserung der Tiefenschärfe in der Mikroskopie bekannt. Ein Stapel von Bildern mit verschiedenen Fokuseinstellungen, welcher auch als z-Stack bezeichnet werden kann, wird als Sequenz aufgenommen.
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Die Bilder des Stapels werden überblendet, um ein Bild mit erweiterter Tiefenschärfe zu erhalten.
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Die
DE 10 2014 006 717 A1 beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung einer dreidimensionalen Information eines Objektes in einem Digitalmikroskop. Bei diesem Verfahren wird für jeweils eine Fokusposition ein Bild aufgenommen und mit der zugehörigen Fokusposition in einem Bildstapel abgelegt. Aus den aufgenommenen Bildern des Bildstapels wird ein EDoF-Bild berechnet. Während des Berechnungsprozesses des EDoF-Bildes wird eine Anzahl an Pixeldefekten detektiert, welche durch Interpolation mit benachbarten Pixeln korrigiert werden. Das korrigierte EDoF-Bild wird zur Berechnung einer Höhenkarte oder eines 3D-Modells des Objektes verwendet.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht ausgehend vom Stand der Technik darin, die Nachteile einer unangepassten Beleuchtung einer Probe beim Aufnehmen eines Stapels von mikroskopischen Bildern mit unterschiedlichen Fokuspositionen zu minimieren. Eine unangepasste Beleuchtung führt in den einzelnen aufgenommenen Bildern zu über- oder unterbelichteten Bereichen, welche beispielweise in Form von Reflexionen oder Schatten im Bild sichtbar sind. Der Stapel von mit unterschiedlichen Fokuspositionen aufgenommenen mikroskopischen Bildern dient zur Erzeugung von Bildern mit einer erweiterten Tiefenschärfe oder von dreidimensionalen Bildern.
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Die genannte Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß dem beigefügten Anspruch 1 sowie durch ein digitales Mikroskop gemäß dem beigefügten nebengeordneten Anspruch 10.
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Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Aufnehmen eines Stapels von mikroskopischen Bildern einer Probe mit einem Mikroskop, insbesondere mit einem digitalen Mikroskop. In dem digitalen Mikroskop erfolgt eine elektronische Bildwandlung. Das Mikroskop umfasst ein Objektiv und einen Bildsensor zum Wandeln eines von dem Objektiv auf den Bildsensor unmittelbar oder mittelbar abgebildeten Bildes. Die Fokusposition bzw. Fokusebene des Mikroskops ist manuell oder mit einem Aktuator veränderbar, wofür die Fokussierung des Mikroskops, insbesondere ein Aufnahmeabstand oder eine Brennweite veränderbar ist. Der Aufnahmeabstand zwischen der Probe und dem Objektiv ist bevorzugt durch einen Aktuator in Form eines Motors veränderbar. Die veränderbare Fokusposition des Mikroskops kann auch als veränderbare z-Koordinate der Fokusposition bzw. Fokusebene des Mikroskops beschrieben werden.
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Bei dem Stapel der mikroskopischen Bilder handelt es sich um eine Anzahl mikroskopischer Bilder, die mit unterschiedlichen Fokuspositionen aufgenommen wurden. Die Bilder bilden bevorzugt dieselbe Probe bzw. denselben Abschnitt der Probe ab. Die Bilder werden abgesehen von der Fokusposition und einer Beleuchtung bevorzugt mit den gleichen optischen Parametern des Mikroskops aufgenommen. Die unterschiedlichen Fokuspositionen sind bevorzugt durch unterschiedliche Aufnahmeabstände oder durch unterschiedliche Brennweiten bei der Aufnahme der Bilder gebildet. Die Bilder des Stapels unterscheiden sich in der z-Koordinate ihrer Aufnahme, sodass sie auch als z-Stapel oder z-Stack bezeichnet werden können.
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Gemäß dem Verfahren werden die mikroskopischen Bilder der Probe mit unterschiedlichen Fokuspositionen aufgenommen, um daraus den Stapel der Bilder erzeugen zu können. Zum Aufnehmen der mikroskopischen Bilder der Probe mit unterschiedlichen Fokuspositionen wird jeweils die Fokusposition manuell oder mit einem Aktuator verändert. Die Fokusposition wird bevorzugt über eine räumliche Ausdehnung der Probe hinweg ohne eine Veränderung eines Abstandes zwischen der Probe und einem Objektiv des Mikroskops verändert. Die Fokusposition wird bevorzugt durch ein Ansteuern eines Mikrosystems mit beweglichen Spiegeln oder durch ein Ansteuern einer verformbaren optischen Linse verändert. Die Fokusposition wird alternativ bevorzugt durch ein Verändern eines Aufnahmeabstandes oder einer Brennweite verändert. Der Aufnahmeabstand zwischen der Probe und dem Objektiv wird bevorzugt motorisch verändert. Hierzu kann beispielsweise die die Höhe eines die Probe tragenden Objekttisches motorisch verändert werden. Alternativ bevorzugt wird die Fokusposition manuell verändert. Dabei wird die Fokusposition bevorzugt gemessen, wofür bevorzugt ein Positionssensor verwendet wird. Die Daten der gemessenen Fokusposition werden bevorzugt kodiert und bevorzugt zusammen mit Daten, welche eine für eine optimale Qualität des mikroskopischen Bildes erforderliche Einstellung einer Beleuchtung beschreiben, gespeichert.
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Erfindungsgemäß werden zumindest mit einigen der unterschiedlichen Fokuspositionen jeweils mehrere der mikroskopischen Bilder der Probe unter unterschiedlichen Einstellungen einer Beleuchtung zum Beleuchten der Probe aufgenommen. Somit werden Bilder mit jeweils einer der Fokuspositionen aufgenommen, bei denen die Probe mit unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung beleuchtet wird, d. h. bei denen die Probe unterschiedlich beleuchtet wird. Die jeweilige Einstellung der Beleuchtung umfasst bevorzugt eine Auswahl einer Beleuchtungsart, eine Auswahl einer Beleuchtungsstärke, eine Auswahl einer Einzellichtquelle und/oder eine Auswahl einer Beleuchtungsrichtung. Die jeweilige Einstellung der Beleuchtung umfasst bevorzugt die Auswahl von einem oder mehreren Beleuchtungssegmenten der durch eine segmentierte Beleuchtung gebildeten Beleuchtung des Mikroskops. Erfindungsgemäß wird zumindest für mehrere der Fokuspositionen jeweils einzeln entschieden, unter welchen Einstellungen der Beleuchtung die mikroskopischen Bilder der Probe aufgenommen werden. Somit kommt es bevorzugt dazu, dass die unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung, unter denen die mikroskopischen Bilder an einer der Fokuspositionen aufgenommen wurden, sich von den unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung, unter denen die mikroskopischen Bilder an einer anderen der Fokuspositionen aufgenommen wurden, unterscheiden. Das Entscheiden, unter welchen Einstellungen der Beleuchtung das jeweilige der mikroskopischen Bilder der Probe aufgenommen wird, erfolgt bevorzugt zur Reduktion von Reflexionen und/oder Schatten in dem jeweiligen mikroskopischen Bild. Somit erfolgt dieses Entscheiden bevorzugt so, dass die ausgewählte Einstellung der Beleuchtung zu einem Minimum der Reflexionen und/oder Schatten in dem jeweiligen mikroskopischen Bild führt. Dieses Entscheiden kann manuell, halbautomatisch oder vollautomatisch erfolgen.
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Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die mit jeweils einer der Fokuspositionen und unter unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung aufgenommenen Bilder, welche jeweils unter- oder überbelichtete Bereiche aufweisen können, in ihrer Summe dazu geeignet sind, um daraus ein Bild zu generieren, in welchem unter- oder überbelichtete Bereiche vermieden sind. Somit kann ein Stapel von mit unterschiedlichen Fokuspositionen aufgenommenen mikroskopischen Bildern erzeugt werden, in welchem unter- oder überbelichtete Bereiche vermieden sind, sodass aus diesem Stapel verbesserte Bilder mit erweiterter Tiefenschärfe oder verbesserte dreidimensionale Bilder erzeugt werden können.
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Bevorzugt wird zumindest für eine Mehrzahl der Fokuspositionen jeweils einzeln entschieden, unter welchen Einstellungen der Beleuchtung die mikroskopischen Bilder der Probe aufgenommen werden. Bevorzugt wird für alle der Fokuspositionen jeweils einzeln entschieden, unter welchen Einstellungen der Beleuchtung die mikroskopischen Bilder der Probe aufgenommen werden.
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Weiterhin wird bevorzugt entschieden, unter welcher Einstellung der Beleuchtung mindestens ein mikroskopisches Bild mit einer dazwischen befindlichen Fokusposition aufgenommen wird, welche sich zwei anderen der mehreren Fokuspositionen befindet. Bevorzugt erfolgt eine Abschätzung der Einstellung der Beleuchtung für das jeweilige mikroskopische Bild mit der dazwischen befindlichen Fokusposition ausgehend von den zuvor bestimmten Einstellungen der Beleuchtung für die mikroskopischen Bilder mit denjenigen Fokuspositionen, zwischen denen sich die dazwischen befindliche Fokusposition befindet. Für diese Abschätzung erfolgt bevorzugt eine Mittelung der zuvor bestimmten Einstellungen der Beleuchtung für die mikroskopischen Bilder mit denjenigen Fokuspositionen, zwischen denen sich die dazwischen befindliche Fokusposition befindet.
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Bevorzugt werden die mikroskopischen Bildern der Probe unter unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung mit denjenigen der Fokuspositionen aufgenommen, bei denen in einem der mit der jeweiligen Fokusposition aufgenommenen Bilder überbelichtete und/oder unterbelichtete Bereiche vorhanden sind. Somit werden mehrere Bilder mit jeweils einer der Fokuspositionen unter unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung nur dann aufgenommen, wenn zumindest eines der mit dieser Fokusposition aufgenommenen Bilder überbelichtete und/oder unterbelichtete Bereiche, welche beispielsweise in Form von Reflexionen oder Schatten im Bild sichtbar sind, aufweist. Bevorzugt werden die mikroskopischen Bildern der Probe unter unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung mit denjenigen der Fokuspositionen aufgenommen, bei denen in einem ersten der mit der jeweiligen Fokusposition aufgenommenen Bilder überbelichtete und/oder unterbelichtete Bereiche vorhanden sind. Somit werden mehrere Bilder mit jeweils einer der Fokuspositionen unter unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung nur dann aufgenommen, wenn zumindest das erste mit dieser Fokusposition aufgenommene Bild überbelichtete und/oder unterbelichtete Bereiche aufweist.
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Eine erste bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst zunächst einen Schritt, in welchem eine erste Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe eingerichtet wird. Die erste Einstellung kann u. a. eine Auswahl von Beleuchtungsarten, eine Auswahl von Beleuchtungsstärken, eine Auswahl von Einzellichtquellen und eine Auswahl von Beleuchtungsrichtungen umfassen. Anschließend wird ein erster Satz der mikroskopischen Bilder mit den Fokuspositionen eines Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen und unter der ersten Einstellung der Beleuchtung aufgenommen. Dieser erste Satz der mikroskopischen Bilder stellt bereits einen Stapel von mikroskopischen Bildern dar, bei welchem die mikroskopischen Bilder der Probe mit unterschiedlichen Fokuspositionen aufgenommen wurden. Somit wird für jede der Fokuspositionen des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen jeweils ein mikroskopisches Bild aufgenommen. Die Anzahl der Fokuspositionen des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen entspricht der Anzahl der mikroskopischen Bilder des ersten Satzes der mikroskopischen Bilder. In einem nächsten Schritt dieser ersten bevorzugten Ausführungsform erfolgt ein Einrichten einer sich von der ersten Einstellung unterscheidenden zweiten Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe.
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Die zweite Einstellung der Beleuchtung kann wie die erste Einstellung u. a. eine Auswahl von Beleuchtungsarten, eine Auswahl von Beleuchtungsstärken, eine Auswahl von Einzellichtquellen und eine Auswahl von Beleuchtungsrichtungen umfassen. Anschließend wird ein zweiter Satz der mikroskopischen Bilder mit den Fokuspositionen des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen und unter der zweiten Einstellung der Beleuchtung aufgenommen. Somit wird ein zweiter Stapel von mikroskopischen Bildern aufgenommen, bei welchem die mikroskopischen Bilder der Probe mit unterschiedlichen Fokuspositionen aufgenommen wurden. Der erste Satz der mikroskopischen Bilder und der zweite Satz der mikroskopischen Bilder werden somit mit den gleichen Fokuspositionen, aber unter unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung aufgenommen.
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Bei der ersten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bevorzugt auch ein dritter Satz der mikroskopischen Bilder aufgenommen. Entsprechend erfolgt zunächst ein Einrichten einer dritten Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe. Anschließend erfolgt eine Aufnahme des dritten Satzes der mikroskopischen Bilder mit den Fokuspositionen des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen und unter der dritten Einstellung der Beleuchtung. Die erste Einstellung, die zweite Einstellung und die dritte Einstellung der Beleuchtung unterscheiden sich. Der erste Satz der mikroskopischen Bilder, der zweite Satz der mikroskopischen Bilder und der dritte Satz der mikroskopischen Bilder werden somit mit den gleichen Fokuspositionen, aber unter unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung aufgenommen.
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Bei der ersten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bevorzugt auch ein weiterer Satz der mikroskopischen Bilder aufgenommen. Entsprechend erfolgt zunächst ein Einrichten einer sich von den übrigen Einstellungen unterscheidenden weiteren Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe. Anschließend erfolgt eine Aufnahme des weiteren Satzes der mikroskopischen Bilder mit den Fokuspositionen des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen und unter der weiteren Einstellung der Beleuchtung. Die Sätze der mikroskopischen Bilder werden somit mit den gleichen Fokuspositionen, aber unter unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung aufgenommen.
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Bei der ersten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden bevorzugt mindestens vier der Sätze der mikroskopischen Bilder aufgenommen.
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Eine zweite bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst zunächst einen Schritt, in welchem eine erste Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe eingerichtet wird. Die erste Einstellung kann u. a. eine Auswahl von Beleuchtungsarten, eine Auswahl von Beleuchtungsstärken, eine Auswahl von Einzellichtquellen und eine Auswahl von Beleuchtungsrichtungen umfassen. Anschließend erfolgt eine Aufnahme eines ersten mikroskopischen Bildes einer ersten Reihe der mikroskopischen Bilder mit einer ersten Fokusposition eines Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen und unter der ersten Einstellung der Beleuchtung. In einem folgenden Schritt der zweiten bevorzugten Ausführungsform wird geprüft, ob überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem ersten mikroskopischen Bild der ersten Reihe der mikroskopischen Bilder vorhanden sind. Werden keine überbelichteten oder unterbelichteten Bereiche detektiert, so ist es nicht notwendig, ein weiteres mikroskopisches Bild mit dieser ersten Fokusposition aufzunehmen, sodass die erste Reihe nur das erste mikroskopische Bild umfasst. Werden jedoch überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem ersten mikroskopischen Bild der ersten Reihe der mikroskopischen Bilder detektiert, so erfolgt ein Einrichten einer sich von der ersten Einstellung unterscheidenden zweiten Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe. Anschließend wird ein zweites mikroskopisches Bild der ersten Reihe der mikroskopischen Bilder mit der ersten Fokusposition des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen unter der zweiten Einstellung der Beleuchtung aufgenommen. Durch die zweite Einstellung der Beleuchtung sollen die im ersten Bild der ersten Reihe der mikroskopischen Bilder vorhandenen überbelichteten oder unterbelichteten Bereiche vermieden werden. Anschließend wird wieder die erste Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe eingerichtet und ein erstes mikroskopisches Bild einer zweiten Reihe der mikroskopischen Bilder mit einer zweiten Fokusposition des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen unter der ersten Einstellung der Beleuchtung aufgenommen. Wie im Falle der ersten Fokusposition wird geprüft, ob überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem ersten mikroskopischen Bild der zweiten Reihe der mikroskopischen Bilder vorhanden sind. Werden keine überbelichteten oder unterbelichteten Bereiche detektiert, so ist es nicht notwendig, ein weiteres mikroskopisches Bild mit dieser zweiten Fokusposition aufzunehmen. Werden jedoch überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem ersten mikroskopischen Bild der zweiten Reihe der mikroskopischen Bilder detektiert, so erfolgt wiederum ein Einrichten der zweiten Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe. Anschließend wird ein zweites mikroskopisches Bild der zweiten Reihe der mikroskopischen Bilder mit der zweiten Fokusposition des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen unter der zweiten Einstellung der Beleuchtung aufgenommen.
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Falls das erste mikroskopische Bild und das zweite mikroskopische Bild einer der Reihen der mikroskopischen Bilder trotz der unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung jeweils überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche aufweisen, wird bei der zweiten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt noch jeweils ein drittes mikroskopisches Bild in der betreffenden Reihe der mikroskopischen Bilder aufgenommen. Hierfür umfasst die zweite bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt weitere Schritte. In einem der weiteren Schritte wird geprüft, ob überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem zweiten mikroskopischen Bild der ersten Reihe der mikroskopischen Bilder vorhanden sind, insofern das zweite mikroskopische Bild der ersten Reihe aufgenommen wurde. Es wird eine sich von der ersten und zweiten Einstellung unterscheidende dritte Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe eingerichtet, wenn überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem zweiten mikroskopischen Bild der ersten Reihe der mikroskopischen Bilder detektiert wurden. Anschließend wird ein drittes mikroskopisches Bild der ersten Reihe der mikroskopischen Bilder mit der ersten Fokusposition des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen unter der dritten Einstellung der Beleuchtung aufgenommen. In einem weiteren Schritt wird geprüft, ob überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem zweiten mikroskopischen Bild der zweiten Reihe der mikroskopischen Bilder vorhanden sind, insofern das zweite mikroskopische Bild der zweiten Reihe aufgenommen wurde. Es wird die dritte Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe eingerichtet, wenn überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem zweiten mikroskopischen Bild der zweiten Reihe der mikroskopischen Bilder detektiert wurden. Anschließend wird ein drittes mikroskopisches Bild der zweiten Reihe der mikroskopischen Bilder mit der zweiten Fokusposition des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen unter der dritten Einstellung der Beleuchtung aufgenommen.
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Falls das erste mikroskopische Bild, das zweite mikroskopische Bild und das dritte mikroskopische Bild einer der Reihen der mikroskopischen Bilder trotz der unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung jeweils überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche aufweisen, wird bei der zweiten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt noch jeweils ein weiteres mikroskopisches Bild in der betreffenden Reihe der mikroskopischen Bilder aufgenommen. Hierfür umfasst die zweite bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt weitere Schritte. In einem der weiteren Schritte wird geprüft, ob überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem dritten mikroskopischen Bild der ersten Reihe der mikroskopischen Bilder vorhanden sind, falls das dritte mikroskopische Bild der ersten Reihe aufgenommen wurde. Es wird eine weitere sich von den übrigen Einstellungen unterscheidende Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe eingerichtet, wenn überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem dritten mikroskopischen Bild der ersten Reihe der mikroskopischen Bilder detektiert wurden. Anschließend wird ein weiteres mikroskopisches Bild der ersten Reihe der mikroskopischen Bilder mit der ersten Fokusposition des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen unter der weiteren Einstellung der Beleuchtung aufgenommen. In einem weiteren Schritt wird geprüft, ob überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem dritten mikroskopischen Bild der zweiten Reihe der mikroskopischen Bilder vorhanden sind, falls das dritte mikroskopische Bild der zweiten Reihe aufgenommen wurde. Es wird die weitere Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe eingerichtet, wenn überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem dritten mikroskopischen Bild der zweiten Reihe der mikroskopischen Bilder detektiert wurden. Anschließend wird ein weiteres mikroskopisches Bild der zweiten Reihe mit der zweiten Fokusposition des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen unter der weiteren Einstellung der Beleuchtung aufgenommen.
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Bevorzugt werden jeweils nicht lediglich zwei Reihen der mikroskopischen Bilder, sondern jeweils auch eine dritte Reihe und weitere Reihen aufgenommen. Hierfür umfasst die zweite bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt weitere Schritte. Es erfolgt ein erneutes Einrichten der ersten Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe. Es wird ein ersten mikroskopisches Bildes einer dritten Reihe der mikroskopischen Bilder mit einer dritten Fokusposition des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen unter der ersten Einstellung der Beleuchtung aufgenommen. Es wird geprüft, ob überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem ersten mikroskopischen Bild der dritten Reihe der mikroskopischen Bilder vorhanden sind. Falls überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem ersten mikroskopischen Bild der dritten Reihe der mikroskopischen Bilder detektiert wurden, erfolgt ein Einrichten der zweiten Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe. Anschließend erfolgt eine Aufnahme eines zweiten mikroskopischen Bildes der dritten Reihe der mikroskopischen Bilder mit der dritten Fokusposition des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen unter der zweiten Einstellung der Beleuchtung.
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Bei der zweiten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bevorzugt jeweils auch eine weitere Reihe der mikroskopischen Bilder aufgenommen. Entsprechend erfolgt zunächst ein erneutes Einrichten der ersten Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe. Es wird ein erstes mikroskopischen Bildes der weiteren Reihe der mikroskopischen Bilder mit einer weiteren Fokusposition des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen unter der ersten Einstellung der Beleuchtung aufgenommen. Es wird geprüft, ob überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem ersten mikroskopischen Bild der weiteren Reihe der mikroskopischen Bilder vorhanden sind. Falls überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche in dem ersten mikroskopischen Bild der weiteren Reihe der mikroskopischen Bilder detektiert wurden, erfolgt ein Einrichten der zweiten Einstellung der Beleuchtung zum Beleuchten der Probe. Anschließend erfolgt eine Aufnahme eines zweiten mikroskopischen Bildes der weiteren Reihe der mikroskopischen Bilder mit der weiteren Fokusposition des Satzes der unterschiedlichen Fokuspositionen unter der zweiten Einstellung der Beleuchtung.
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Falls das erste mikroskopische Bild und das zweite mikroskopische Bild der dritten oder einer der weiteren Reihen der mikroskopischen Bilder trotz der unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung jeweils überbelichtete oder unterbelichtete Bereiche aufweisen, wird bei der zweiten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt noch jeweils ein drittes mikroskopisches Bild und bevorzugt noch ein weiteres mikroskopisches Bild in der betreffenden Reihe der mikroskopischen Bilder aufgenommen, wie dies bereits oben beschrieben ist.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die mit jeweils einer der Fokuspositionen und unter unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung aufgenommenen mikroskopischen Bilder bevorzugt zu einem einzigen die jeweilige Fokusposition repräsentierenden mikroskopischen Bild umgewandelt, um zumindest einen der detektierten überbelichteten bzw. unterbelichteten Bereiche durch einen nicht überbelichteten bzw. nicht unterbelichteten Bereich zu ersetzen. Bevorzugt werden die mit jeweils einer der Fokuspositionen und unter unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung aufgenommenen mikroskopischen Bilder zu einem einzigen die jeweilige Fokusposition repräsentierenden mikroskopischen Bild umgewandelt, um sämtliche der detektierten überbelichteten und unterbelichteten Bereiche durch jeweils einen nicht überbelichteten bzw. nicht unterbelichteten Bereich zu ersetzen. Das die jeweilige Fokusposition repräsentierende mikroskopische Bild bildet eines der mikroskopischen Bilder des zu aufzunehmenden Stapels von mit unterschiedlichen Fokuspositionen aufgenommenen mikroskopischen Bildern der Probe. Der Stapel aus den mit den unterschiedlichen Fokuspositionen aufgenommenen mikroskopischen Bildern umfasst bevorzugt jeweils genau ein mikroskopisches Bild je Fokusposition, welches unmittelbar mit dieser Fokusposition aufgenommen wurde oder aus mehreren unmittelbar mit dieser Fokusposition aufgenommenen mikroskopischen Bildern gebildet wurde.
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Der Stapel aus den mit den unterschiedlichen Fokuspositionen aufgenommenen mikroskopischen Bildern wird bevorzugt zur Erzeugung eines Bildes mit einer erweiterten Tiefenschärfe verwendet. Hierzu werden aus den einzelnen mikroskopischen Bildern des Stapels jeweils die scharf abgebildeten Bereiche zu einem einzigen Bild mit einer erweiterten Tiefenschärfe berechnet, sodass im Vergleich zu einzelnen mikroskopischen Bildern mit vergleichsweiser geringer Tiefenschärfe ein meist künstlich scharfes Abbild mehrerer Tiefenschärfeebenen der Probe erzeugt werden kann.
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Der Stapel aus den mit den unterschiedlichen Fokuspositionen aufgenommenen mikroskopischen Bildern wird bevorzugt zur Erzeugung eines dreidimensionalen Bildes verwendet. Hierzu wird aus den mit unterschiedlichen Fokuspositionen aufgenommenen mikroskopischen Bildern eine Tiefeninformation gewonnen.
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Das erfindungsgemäße digitale Mikroskop umfasst zunächst ein Objektiv zum vergrößerten optischen Abbilden einer Probe. Das Objektiv umfasst optische Komponenten zum vergrößerten optischen Abbilden der Probe in einer Bildebene. Die optischen Komponenten sind insbesondere durch optische Linsen und ggf. auch durch eine oder mehrere Spiegel, Blenden und Filter gebildet. Das erfindungsgemäße Mikroskop umfasst weiterhin einen Bildsensor zum Wandeln des von dem Objektiv unmittelbar oder mittelbar auf den Bildsensor abgebildeten Bildes in ein elektrisches Signal. Das erfindungsgemäße digitale Mikroskop umfasst weiterhin eine Beleuchtung zum Beleuchten der Probe.
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Das erfindungsgemäße Mikroskop umfasst ein Mittel zum Verändern einer Fokusposition des Mikroskops. Das Mittel ist bevorzugt durch ein manuell zu bedienendes Einstellelement gebildet. Das Einstellelement ist bevorzugt dazu ausgebildet, einen Abstand zwischen einer Probe und dem Objektiv manuell verändern zu können. Das Mittel ist alternativ bevorzugt durch einen Aktuator gebildet. Der Aktuator ist bei einfachen Ausführungsformen bevorzugt dazu ausgebildet, einen Abstand zwischen einer Probe und dem Objektiv zu verändern. Hierfür umfasst der Aktuator bevorzugt einen Elektromotor zum Verfahren eines die Probe tragenden Objekttisches oder zum Verfahren des Objektivs. Der Aktuator ist bevorzugt dazu ausgebildet, eine Brennweite des Objektivs zu verändern. Der Aktuator dient bevorzugt zum Betätigen eines aktiven optischen Elementes, mit welchem die Fokussierung verstellbar ist. Besonders bevorzugt ist der Aktuator des aktiven optischen Elementes durch ein Mikrosystem zum mechanischen Bewegen von Mikrospiegeln und/oder Mikrolinsen gebildet. Die Mikrospiegel bilden bevorzugt eine Linse, insbesondere eine Fresnel-Linse aus. Durch eine Veränderung der Lage der Mikrospiegel kann auf sehr schnelle Weise die Brennweite der Fresnel-Linse verändert werden. Diese schnelle Veränderung der Brennweite erlaubt eine sehr schnelle Einstellung der Fokusposition. Alternativ bevorzugt ist der Aktuator zum Verformen einer verformbaren optischen Linse ausgebildet.
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Das erfindungsgemäße Mikroskop umfasst eine elektronische Steuereinheit zum Steuern der Beleuchtung und bevorzugt auch zum Steuern des Aktuators. Die Steuereinheit ist zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens konfiguriert. Die Steuereinheit ist bevorzugt zur Ausführung bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens konfiguriert. Im Übrigen weist das Mikroskop bevorzugt auch Merkmale auf, die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und dessen bevorzugten Ausführungsformen angegeben sind.
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Das erfindungsgemäße Mikroskop ist bevorzugt dazu ausgebildet, die Fokusposition bzw. die Einstellung des Aktuators zu messen, um Messdaten darüber zu erhalten. Das erfindungsgemäße Mikroskop ist bevorzugt weiterhin dazu ausgebildet, die Messdaten zu übertragen, aufzuzeichnen und/oder zu speichern. Das erfindungsgemäße Mikroskop ist bevorzugt weiterhin dazu ausgebildet, Daten, welche die Ansteuerung des Aktuators zum Verändern der Fokusposition beschreiben, zu messen, zu übertragen, aufzuzeichnen und/oder zu speichern.
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Weitere Einzelheiten und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung, unter Bezugnahme auf die Zeichnung. Es zeigen:
- 1: einen Ablaufplan einer ersten bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens;
- 2: einen Ablaufplan einer zweiten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens;
- 3: ein Schema zur Darstellung von erfindungsgemäß zu verwendenden Fokuspositionen und unterschiedlichen Einstellungen einer Beleuchtung; und
- 4: die in 3 gezeigten Fokuspositionen mit zugeordneten Einstellungen der Beleuchtung gemäß einer beispielhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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1 zeigt einen Ablaufplan einer ersten bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Aufnehmen eines Stapels von mikroskopischen Bildern einer Probe mit einem digitalen Mikroskop. Der Ablauf des Verfahrens wird mit einem Schritt „Start Vorschau/Aufnahme/Anzeige“ begonnen, bei welchem eine Vorschau und eine Anzeige der aufzunehmenden mikroskopischen Bilder gestartet werden. Mit einem folgenden Schritt „Start Datenaufnahme“ beginnen Abläufe zur Akquisition der aufzunehmenden mikroskopischen Bilder. In einem Schritt „Einstellen der Beleuchtung“ wird eine erste Einstellung einer Beleuchtung des digitalen Mikroskops zum Beleuchten der zu mikroskopierenden Probe vorgenommen. In einem darauffolgenden Schritt „Aufnahme eines Bildes mit Fokusposition n“ wird beginnend mit n = 1 ein erstes mikroskopisches Bild der Probe mit dem digitalen Mikroskop aufgenommen, wobei die Probe unter der ersten Einstellung der Probe beleuchtet wird und eine erste Fokusposition am digitalen Mikroskop eingestellt ist. Der aufzunehmende Stapel soll im Ergebnis eine Vielzahl der mikroskopischen Bilder umfassen, die mit unterschiedlichen Fokuspositionen aufgenommen wurden, wobei die zu erzielende Anzahl der mikroskopischen Bilder beispielsweise gleich 10 ist. Nachdem das mikroskopische Bild aufgenommen wurde, erfolgt eine Abfrage „Stapel vollständig?“, in welcher geprüft wird, ob mit dem zuletzt aufgenommenen mikroskopischen Bild die zu erzielende Anzahl der mikroskopischen Bilder bereits erreicht wurde. Ist dies nicht der Fall, so wird in einem Schritt „Inkrementieren von n“ der Zähler n um Eins erhöht und der Schritt „Aufnahme eines Bildes mit Fokusposition n“ wird erneut durchgeführt. Ergab die folgende Prüfung, dass mit dem zuletzt aufgenommenen mikroskopischen Bild die zu erzielende Anzahl der mikroskopischen Bilder erreicht wurde, so wird eine Abfrage „Änderungen der Beleuchtung vollständig?“ durchgeführt. In dieser Abfrage wird geprüft, ob eine vordefinierte Anzahl unterschiedlicher Einstellungen der Beleuchtung bereits erreicht wurde. Beispielsweise kann vorab definiert sein, dass die verschiedenen mikroskopischen Bilder des Stapels unter zwei, vier oder acht verschiedenen Einstellungen der Beleuchtung aufzunehmen sind. Nachdem die ersten n mikroskopischen Bilder unter der ersten Einstellung der Beleuchtung aufgenommen wurden, ergibt die Prüfung, dass die vordefinierte Anzahl unterschiedlicher Einstellungen der Beleuchtung noch nicht erreicht wurde. Dieses negative Ergebnis der Prüfung führt dazu, dass in einem weiteren Schritt „Ändern der Beleuchtung“ eine zweite Einstellung der Beleuchtung gewählt wird, sodass die Probe nun in einer anderen Weise beleuchtet wird, wodurch beispielsweise zuvor abgeschattete Bereiche der Probe nun ausgeleuchtet werden. Hierfür wird der Schritt „Einstellen der Beleuchtung“ erneut durchgeführt, woraufhin die zweiten n mikroskopischen Bilder unter der zweiten Einstellung der Beleuchtung aufgenommen werden, wobei zumindest für mehrere der n Fokuspositionen jeweils einzeln entschieden wird, ob ein mikroskopischen Bild unter der jeweiligen Einstellung der Beleuchtung aufgenommen wird. Sobald für die vordefinierte Anzahl der unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung jeweils n mikroskopische Bilder aufgenommen wurden, führt die Abfrage „Änderungen der Beleuchtung vollständig?“ zu einem positiven Ergebnis. Daraufhin werden in einem Schritt „Korrektur des Stapels“ diejenigen der mikroskopischen Bilder, die mit einer gleichen Fokusposition, aber unter den unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung aufgenommen wurden, zu jeweils einem mikroskopischen Bild zusammengeführt. Bei dieser Zusammenführung wird angestrebt, nur korrekt belichtete Anteile aus den einzelnen mikroskopischen Bildern für das zusammengeführte Bild zu verwenden. Im Ergebnis liegen n zusammengeführte Bilder des Stapels vor, die in einem Schritt „Anzeige des Stapels“ angezeigt werden, woraufhin mit dem Schritt „Start Datenaufnahme“ die Abläufe zur Akquisition der aufzunehmenden mikroskopischen Bilder erneut durchgeführt werden.
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In einem Schritt „Auslösemoment“ wird der Ablauf des Verfahrens automatisch, halbautomatisch oder durch einen Benutzer abgebrochen, sodass in einem Schritt „Stopp Vorschau/Aufnahme/Anzeige“ die Vorschau, die Aufnahme und die Anzeige der mikroskopischen Bilder beendet werden.
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2 zeigt einen Ablaufplan einer zweiten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Aufnehmen eines Stapels von mikroskopischen Bildern einer Probe mit einem digitalen Mikroskop. Der Ablauf des Verfahrens wird mit einem Schritt „Start Vorschau/Aufnahme/Anzeige“ begonnen, bei welchem eine Vorschau und eine Anzeige der aufzunehmenden mikroskopischen Bilder gestartet werden. In einem Schritt „Einstellen einer initialen Beleuchtung“ wird eine erste Einstellung einer Beleuchtung des digitalen Mikroskops zum Beleuchten der zu mikroskopierenden Probe vorgenommen, was manuell, automatisch oder gemäß einer Voreinstellung erfolgen kann. Mit einem folgenden Schritt „Start Datenaufnahme“ beginnen Abläufe zur Akquisition der aufzunehmenden mikroskopischen Bilder. In einem darauffolgenden Schritt „Aufnahme eines Bildes mit Fokusposition n“ wird beginnend mit n = 1 ein erstes mikroskopisches Bild der Probe mit dem digitalen Mikroskop aufgenommen, wobei die Probe unter der ersten Einstellung der Probe beleuchtet wird und eine erste Fokusposition am digitalen Mikroskop eingestellt ist. Der aufzunehmende Stapel soll im Ergebnis eine Vielzahl der mikroskopischen Bilder umfassen, die mit unterschiedlichen Fokuspositionen aufgenommen wurden, wobei die zu erzielende Anzahl der mikroskopischen Bilder beispielsweise gleich 10 ist. Nachdem das mikroskopische Bild aufgenommen wurde, erfolgt eine Abfrage „Reflexionen? Schatten?“, in welcher geprüft wird, ob in dem zuletzt aufgenommenen mikroskopischen Bild Schatten, Reflexionen oder andere fehlerhafte Bildbereiche vorhanden sind, welche durch eine Über- oder Unterbelichtung versuracht wurden. Ist das Ergebnis dieser Abfrage positiv, so bedarf es mindestens eines weiteren mikroskopischen Bildes, welches mit der ersten Fokusposition, aber unter einer anderen Einstellung der Beleuchtung aufgenommen wurde. In diesem Fall wird in einem weiteren Schritt „Ändern der Beleuchtung“ eine zweite Einstellung der Beleuchtung gewählt, sodass die Probe nun in einer anderen Weise beleuchtet wird, wodurch beispielsweise zuvor abgeschattete Bereiche der Probe nun ausgeleuchtet werden. In einem weiteren Schritt „Aufnahme eines Bildes mit der Fokusposition n unter geänderter Beleuchtung“ wird ein mikroskopisches Bild unter der geänderten Einstellung der Beleuchtung, aber noch mit der ersten Fokusposition aufgenommen. Anschließend erfolgt eine Abfrage „Änderungen der Beleuchtung vollständig?“. In dieser Abfrage wird geprüft, ob eine vordefinierte Anzahl unterschiedlicher Einstellungen der Beleuchtung bereits erreicht wurde. Ergibt die Prüfung, dass die vordefinierte Anzahl unterschiedlicher Einstellungen der Beleuchtung noch nicht erreicht wurde, so wird in einem weiteren Schritt „Ändern der Beleuchtung“ eine dritte Einstellung der Beleuchtung gewählt. Anschließend wird der Schritt „Aufnahme eines Bildes mit der Fokusposition n unter geänderter Beleuchtung“ erneut durchgeführt. Nach der dann erneut folgenden Abfrage „Änderungen der Beleuchtung vollständig?“ kommt es zu weiteren Änderungen der Einstellungen der Beleuchtung, wenn die vordefinierte Anzahl der unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung noch nicht erreicht wurde. Sobald die vordefinierte Anzahl der unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung erreicht wurde, werden in einem Schritt „Korrektur des Stapels“ die mit der gleichen Fokusposition und unter unterschiedlichen Einstellungen der Beleuchtung aufgenommenen mikroskopischen Bilder zu einem mikroskopischen Bild zusammengeführt. Bei dieser Zusammenführung wird angestrebt, nur korrekt belichtete Anteile aus den einzelnen mikroskopischen Bildern für das zusammengeführte Bild zu verwenden. Anschließend wird die Abfrage „Reflexionen, Schatten“ erneut durchgeführt.
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Ist das Ergebnis der Abfrage „Reflexionen? Schatten?“ negativ, so bedarf es keines weiteren mikroskopischen Bildes, welches mit der jeweiligen Fokusposition aufgenommen wurde. In diesem Fall erfolgt eine Abfrage „Stapel vollständig?“, in welcher geprüft wird, ob mit dem zuletzt aufgenommenen mikroskopischen Bild die zu erzielende Anzahl der mikroskopischen Bilder bereits erreicht wurde. Ist dies nicht der Fall, so wird in einem Schritt „Inkrementieren von n“ der Zähler n um Eins erhöht und der Schritt „Aufnahme eines Bildes mit Fokusposition n“ wird erneut durchgeführt. Sobald mit dem zuletzt aufgenommenen mikroskopischen Bild die zu erzielende Anzahl der mikroskopischen Bilder erreicht ist, die in einem Schritt „Anzeige des Stapels“ angezeigt werden, woraufhin mit dem Schritt „Start Datenaufnahme“ die Abläufe zur Akquisition der aufzunehmenden mikroskopischen Bilder erneut durchgeführt werden.
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In einem Schritt „Auslösemoment“ wird der Ablauf des Verfahrens automatisch, halbautomatisch oder durch einen Benutzer abgebrochen, sodass in einem Schritt „Stopp Vorschau/Aufnahme/Anzeige“ die Vorschau, die Aufnahme und die Anzeige der mikroskopischen Bilder beendet werden.
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3 zeigt ein Schema zur Darstellung von erfindungsgemäß zu verwendenden Fokuspositionen 01, 02, 03, 04, 05, deren Anzahl beispielhaft fünf beträgt. Jeder der fünf Fokuspositionen 01, 02, 03, 04, 05 können unterschiedliche Einstellungen 11, 12, 13, 14 einer Beleuchtung zum Beleuchten einer zu mikroskopierenden Probe zugeordnet sein. Die erste Einstellung 11 führt beispielsweise zu einer Verteilung des Lichtes unter einem einzigen Öffnungswinkel, was beispielsweise durch ein nicht segmentiertes Ringlicht bewirkt werden kann. Die zweite Einstellung 12 stellt beispielsweise zwei Status von unterschiedlichen Öffnungswinkeln der Lichtausbreitung dar, was beispielsweise durch ein Ringlicht mit zwei Segmenten bewirkt werden kann. Die dritte Einstellung 13 stellt beispielsweise vier Status von unterschiedlichen Öffnungswinkeln der Lichtausbreitung dar, was beispielsweise durch ein Ringlicht mit vier Segmenten bewirkt werden kann, wobei die jeweils beiden gegenüberliegenden Segmente gleichzeitig leuchten. Die vierte Einstellung 14 stellt beispielsweise acht Status von unterschiedlichen Öffnungswinkeln der Lichtausbreitung dar, was beispielsweise durch ein Ringlicht mit acht Segmenten bewirkt werden kann, wobei die Segmente einzeln leuchten können.
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Das Maß, in welchem Reflexionen und/oder Schatten in den mikroskopischen Bildern erfindungsgemäß vermieden wird, steigt beginnend von der ersten bis zur vierten Einstellung 11, 12, 13, 14. Ebenso sinkt die Geschwindigkeit der Aufnahme der mikroskopischen Bilder beginnend von der ersten bis zur vierten Einstellung 11, 12, 13, 14.
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4 zeigt die in 3 gezeigten Fokuspositionen 01, 02, 03, 04, 05 mit zugeordneten Einstellungen 11, 12, 13, 14 der Beleuchtung gemäß einer beispielhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Einstellungen 11, 12, 13, 14 der Beleuchtung werden für jede der Fokuspositionen 01, 02, 03, 04, 05 so gewählt, dass Reflexionen und/oder Schatten in den aufzunehmenden mikroskopischen Bildern vermieden werden.
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Bezugszeichenliste
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- 01 -
- erste Fokusposition
- 02 -
- zweite Fokusposition
- 03 -
- dritte Fokusposition
- 04 -
- vierte Fokusposition
- 05 -
- fünfte Fokusposition
- 06 -
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- 07 -
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- 08 -
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- 09 -
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- 10 -
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- 11 -
- erste Einstellung der Beleuchtung
- 12 -
- zweite Einstellung der Beleuchtung
- 13 -
- dritte Einstellung der Beleuchtung
- 14 -
- vierte Einstellung der Beleuchtung
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 7345816 B2 [0002]
- WO 2005/119331 A1 [0003]
- WO 2007/134264 A2 [0003]
- EP 2687890 A1 [0004]
- EP 2687893 A1 [0005]
- DE 102014006717 A1 [0007]
