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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Wechselmodul zur Verwendung in einer Analysevorrichtung zum patientennahen Nachweis von Verbindungen in einer Blutprobe, eine Analysevorrichtung zum patientennahen Nachweis von Verbindungen in einer Blutprobe, ein System aus einem Wechselmodul und einer Analysevorrichtung sowie ein Verfahren zum patientennahen Nachweis von Verbindungen in einer Blutprobe.
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Im menschlichen Körper werden die Zellbausteine Cholesterol und Triacylglyceride in Form von Lipoproteinkomplexen durch das Blut zu unterschiedlichen Zielzellen transportiert. Hierzu bilden sich Komplexe unterschiedlicher Dichte und Größe, die ein oder mehrere Typen von Apolipoproteinen, verestertes und unverestertes Cholesterin, Phospholipide und Triacylglyceride umfassen. Die Hauptklassen der Lipoproteinkomplexe wurden an Hand ihrer Dichte als VLDL (Very Low Density Lipoprotein), LDL (Low Density Lipoprotein) und HDL (High Density Lipoprotein) charakterisiert.
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Die Konzentration und die Zusammensetzung der einzelnen Lipoproteinkomplexe sowie das Verhältnis der Komplexklassen zueinander spielen offenbar in der Entwicklung verschiedener Erkrankungen, wie z.B. bei der Entwicklung von Arteriosklerose, Schilddrüsenerkrankungen, Pankreatitis, Nephrose, Hyperlipoproteinämie, Diabetes und ischämischen Herzerkrankungen, eine entscheidende Rolle. Derzeit werden z.B. Hyperlipidämien und ischämische Herzerkrankungen üblicherweise durch Verabreichung von Statinen (HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren) behandelt. Deren Verabreichung ist jedoch mit vielen Nebenwirkungen verbunden. Kenntnisse über die Konzentration und Verhältnisse von VLDL, LDL und HDL sind daher entscheidend für die Optimierung von Diagnoseverfahren und Therapien für betroffene Patienten.
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Derzeit werden für die Diagnose der oben genannten Erkrankungen vorrangig Verfahren eingesetzt, die Lipoproteinkomplexe unterschiedlicher Zusammensetzung nicht voneinander trennen können. Verfahren, die über die bloße Detektion der Gesamtkonzentration an Lipoproteinkomplexen hinausgehen und eine Differenzierung zwischen verschiedenen Komplexen ermöglichen, sind zu kostenintensiv, ungenau und/oder zu kompliziert in der Ausführung, um in der Routinediagnostik von Nutzen zu sein.
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Ein Verfahren, das in der Lage ist, Lipoproteinkomplexe unterschiedlicher Zusammensetzung voneinander zu trennen und ein vollständiges Blutlipidprofil zu erzeugen, basiert auf einer aufwändigen Ultrazentrifugation. Dieses Verfahren kann ausschließlich in wenigen hochspezialisierten Laboren unter großem Zeit- und Kostenaufwand durch entsprechend vorgebildete Fachleute durchgeführt werden.
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Eine Alternative zur Ultrazentrifugation ist die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Traditionelle HPLC Verfahren basieren auf einer chromatographischen Trennung, indem eine zu trennende mobile Phase durch eine stationäre Phase geleitet wird. Die großen Lipoproteinkomplexe werden in diesem Verfahren zunächst von der stationären Phase (z.B. in einer Säule) absorbiert und anschließend nach ihrer Größe oder Ladung sukzessive von der Säule eluiert. Diese HPLC-Systeme sind flexibel und für den Hochdurchsatz geeignet. Die Geräte sind jedoch groß, benötigen einen hohen Verbrauchsmaterialeinsatz, sind kompliziert in der Bedienung, teuer in Anschaffung und Unterhaltung und erfordern somit die Infrastruktur eines analytischen Labors. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die Auftrennung von Lipoproteinkomplexen unterschiedlicher Zusammensetzung relativ ungenau und die Analysequalität somit ungenügend ist.
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Neben diesen traditionellen chromatographischen HLPC-basierten Trennverfahren, gibt es auch die Möglichkeit HPLC-basierte Fluss-Feldflussfraktionierungs(FFF)-Verfahren zur Trennung unterschiedlicher Lipoproteinkomplexe einzusetzen. Feldflussfraktionierung verwendet zur Trennung von Substanzen in einer Flüssigkeit Flusskanäle und ist in der Lage, Lipoproteinkomplexe unterschiedlicher Zusammensetzung effizient zu differenzieren. HPLC-FFF hat jedoch, wie chromatographische HPLC, den Nachteil, dass große, teure und schwer zu bedienende Geräte für die Analyse erforderlich sind, so dass das Verfahren für die schnelle Routinediagnostik am Patienten ungeeignet ist.
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Es besteht somit ein Bedarf an kostengünstigen, einfach durchzuführenden Verfahren zur Erstellung eines vollständigen Blutlipidprofils. Darüber hinaus wäre es wünschenswert, eine patientennahe Labordiagnostik unmittelbar am Krankenbett oder durch den Patienten selber zu ermöglichen.
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Bestehende Verfahren zur patientennahen Labordiagnostik (sogenannte Point-Of-Care (POC) Verfahren) sind in der Lage, absolute Konzentrationen für Cholesterol, HDL und Triacylglyceride zu bestimmen. Diese Verfahren können Lipoproteinkomplexe unterschiedlicher Zusammensetzung nicht voneinander trennen. Die LDL Konzentration wird nach Messung von HDL und Cholesterin durch die Friedewald-Formel abgeschätzt (LDL-Cholesterin = Gesamt-Cholesterin – (HDL + [Triglyceride/5])). Eine spezifische Konzentrationsbestimmung für VLDL oder LDL ist mit Hilfe dieses Verfahrens jedoch nicht möglich.
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Diese traditionellen patientennahen Diagnoseverfahren verwenden eine enzymatische Oxidationsreaktion in Kombination mit einer kolorimetrischen Auswertung. Entsprechende Verfahren zum Nachweis von Triglyceriden und Cholesterol wurden unter anderem von Fossati und Prencipe (1982, Clin Chem, 28:2077–2080) bzw. von Allain et al. (1974, Clin Chem, 20/4:470–475) und Deacon et al. (1979, Clin Chem, 25/6:976–984) beschrieben. Fossati und Prencipe (1982) sowie Allain et al. (1974) und Deacon et al. (1979) beschreiben den Nachweis von Triglyceriden und Cholesterolestern durch enzymatische Umsetzung in farbiges Chinonimin und anschließende Absorptionsmessung bei 500 nm. Die Verfahren sind zur Ermittlung absoluter Konzentrationswerte geeignet.
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Es besteht somit ein Bedarf an patientennahen, genauen und einfach durchzuführenden Nachweisverfahren für Lipoproteinkomplexe. Ein Bedarf an patientennahen Diagnostikverfahren besteht auch für andere Blutplasmaverbindungen, die mit den oben genannten oder anderen Krankheiten assoziiert sind.
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Die Erfindung basiert auf der physikalischen Trennung von Fraktionen in einer Probe, z.B. Blutplasmafraktionen, in einem einzelnen Gerät mittels Hohlfaser-Fluss-Feldflussfraktionierung. Feldflussfraktionierung verwendet zur Trennung von Substanzen in einer Flüssigkeit Flusskanäle. Die Variante Fluss-Feldflussfraktionierung (Fluss-FFF) setzt als Trennfeld eine Querströmung ein. In der erfindungsgemäß besonders bevorzugten Variante Hohlfaser-Fluss-Feldflussfraktionierung (HF5) ist eine Hohlfaser aus semipermeablem Material der Trennkanal und ein Laufmittel erzeugt das Trennfeld.
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Das Verfahren erfordert nur ein äußerst geringes Probenvolumen (z.B. einen einzelnen Tropfen Blut) und daher auch nur eine sehr geringe Menge an Detektionslösung. Die Erfindung stellt damit ein kostengünstiges Verfahren zur Verfügung mit dem im Blutplasma enthaltene Verbindungen hochauflösend nach ihrem Diffusionskoeffizienten (bzw. Molekulargewicht) auftrennbar und ihre Konzentration bestimmbar sind. Darüber hinaus ist das System einfach und somit auch durch Laien zu bedienen.
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Die Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt ein Wechselmodul zum patientennahen Nachweis von Verbindungen zur Verwendung in einer Analysevorrichtung zum patientennahen Nachweis von Verbindungen in einer Blutprobe, wobei das Wechselmodul zur Analyse einer einzelnen Blutprobe ausgebildet ist. Das Wechselmodul weist eine Aufnahmeeinheit zur Aufnahme einer Blutprobe, eine Anschlusseinheit zur Verbindung des Wechselmoduls mit einer Analysevorrichtung, ein Hohlfasermembranmodul und eine Reaktor-Detektor-Einheit auf. Das Hohlfasermembranmodul weist eine für eine Fluss-Feldflussfraktionierung einer Blutprobe geeignete Hohlfaser auf. Die Anschlusseinheit ist dazu eingerichtet, eine Fluidverbindung mit einer Analysevorrichtung bereitzustellen, wobei über die Fluidverbindung ein Laufmittel aus der Analysevorrichtung in das Wechselmodul eingebracht werden kann. Die Reaktor-Detektor-Einheit umfasst ein Reservoir für eine Detektionslösung, einen Bubble-Train-Reaktor sowie eine Detektionszone. Die Aufnahmeeinheit steht mit der Anschlusseinheit und der Hohlfaser derart in Fluidverbindung, dass eine in die Aufnahmeeinheit aufgenommene Blutprobe zusammen mit einem über die Anschlusseinheit in das Wechselmodul eingebrachten Laufmittel in die Hohlfaser strömen kann. Das Hohlfasermembranmodul ist dazu eingerichtet, eine zusammen mit einem Laufmittel in die Hohlfaser eingeströmte Blutprobe mittels Fluss-Feldflussfraktionierung in verschiedene Fraktionen aufzuteilen. Die Hohlfaser und das Reservoir für eine Detektionslösung stehen derart mit dem Bubble-Train-Reaktor und der Detektionszone in Fluidverbindung, dass die in dem Hohlfasermembranmodul in Fraktionen aufgeteilte Blutprobe zusammen mit einer Detektionslösung aus dem Reservoir durch den Bubble-Train-Reaktor zu der Detektionszone der Reaktoreinheit strömen kann. Die Detektionszone ist derart ausgebildet, dass eine Konzentration einer Verbindung in der zusammen mit der Detektionslösung in die Detektionszone eingeströmten Blutprobe mittels einer Detektionseinheit nachgewiesen werden kann, wobei die Detektionseinheit in einer Analysevorrichtung angeordnet ist, in der das Wechselmodul verwendet wird.
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Das Wechselmodul ist eine austauschbare Einheit oder auch Kartusche, die zur Analyse einer einzelnen Probe in eine geeignete Analyseeinrichtung eingebracht wird. Das Wechselmodul enthält sämtliche Komponenten, die zur Analyse der Blutprobe notwendig sind, die durch die Probe selbst kontaminiert werden können und nicht bzw. nur nach hinreichender Reinigung, die in der Regel nicht patientennah durchgeführt werden kann, für die Analyse einer weiteren Probe zur Verfügung stehen.
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Das Wechselmodul weist zunächst eine Aufnahmeeinheit zur Aufnahme einer Probe auf. Derartige Aufnahmeeinheiten, in die lediglich ein einzelner Tropfen Blut gegeben wird, sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt. Alternativ ist es auch denkbar, statt eines Tropfens Blut, der einem Patienten direkt entnommen worden ist, auch eine Aufnahmeeinheit vorzusehen, in die eine Blutprobe eingebracht werden kann, die bereits auf Blutplasma reduziert worden ist, d.h. aus der mit einer Blutplasmaabtrennungseinheit bereits alle Komponenten entfernt worden sind, die kein Blutplasma darstellen.
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Die Anschlusseinheit ist dazu vorgesehen, eine Fluidverbindung zwischen dem Wechselmodul und einer Analysevorrichtung bereitzustellen. Über die Fluidverbindung kann ein Laufmittel, das zur Durchführung der HF5 benötigt wird, mittels einer in der Analysevorrichtung angeordneten Pumpe in das Wechselmodul eingebracht werden. Die Pumpe ist dabei dazu eingerichtet, das Laufmittel mit einem hinreichend hohen Druck, mit der nötigen Fließgeschwindigkeit und mit einer geeigneten zeitlichen Variation der Fließgeschwindigkeit bereitzustellen.
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Das Hohlfasermembranmodul umfasst eine semipermeable Hohlfaser oder auch Hohlfasermembran. Die semipermeable Hohlfasermembran ist eine hohle Faser aus semipermeablem Material. Geeignete Materialien sind im Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise Polyethersulfon und Polysulfon. Insbesondere ist die Membran geeignet, den Durchtritt des Laufmittels zuzulassen. Die Hohlfasermembran hat vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 150 µm und 1000 µm, noch bevorzugter zwischen 150 µm und 450 µm und noch bevorzugter einen Durchmesser von 200 µm. Die Länge der Hohlfasermembran beträgt vorzugsweise zwischen 4 cm und 20 cm und noch bevorzugter 10 cm.
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Beispielsweise kann die Hohlfaser in dem Hohlfasermembranmodul in ein Rohr oder einen anders geformten, in das Wechselmodul integrierten geeigneten Raum an beiden Seiten dicht eingeklebt werden. Zwischen dem Rohr und einer Außenseite der Hohlfaser ist ein Hohlraum zur Aufnahme des durch die Membran permeierenden Laufmittels. Das Rohr hat einen Auslass, der mit einem Behälter zur Aufnahme von verbrauchtem Laufmittel verbunden ist.
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Die Reaktor-Detektor-Einheit umfasst zunächst ein Reservoir für eine Detektionslösung. Das Reservoir kann beispielsweise ein zylinderförmiger Hohlraum mit einem beweglichen Deckel sein, der in dem Modul angeordnet ist. Um eine Detektionslösung aus dem Reservoir heraus zu fördern, kann beispielsweise ein in der Analysevorrichtung vorgesehener Stift auf den Deckel drücken und so die Lösung fördern. Das Reservoir bildet somit einen Zylinder, in den der Deckel als Kolben durch den Stift hinein gedrückt wird. Das Reservoir ist somit zeitgleich eine kostengünstige Pumpe, die mit der Kartusche entsorgt werden kann.
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Die Detektionslösung umfasst vorzugsweise ein Enzym oder ein anderes Molekül, das geeignet ist, nach oder während des Kontakts mit einer spezifischen Blutplasmaverbindung eine Änderung des Lichtabsorptionsspektrums der Mischung aus Detektionslösung und Blutplasmakomponenten zu erzeugen. Bevorzugt reagiert das Enzym oder das andere Molekül mit einer Verbindung aus dem Blutplasma zu einem Farbstoff. Die Detektionslösung umfasst z.B. ein oder mehrere Enzyme, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Lipase, Glycerolkinase, Glycerol-3-phosphat-Oxidase, Cholesterolesterase, Cholesteroloxidase und Peroxidase.
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Die Menge an Triglyceriden kann z.B. wie von Fossati und Prencipe (1982, Clin Chem, 28:2077–2080) beschrieben bestimmt werden. Hierbei werden zunächst Triglyceride durch eine Lipase in Glycerol und freie Fettsäuren umgesetzt; Glycerol mit ATP dann durch eine Glycerolkinase in Glycerol-3-phosphat und ADP; Glycerol-3-phosphat mit Sauerstoff durch eine Glycerol-3-Phosphat-Oxidase in Dihydroxyaceton-Phosphat und Wasserstoffperoxid; und letzteres mit 4-Chlorophenol und 4-Amino-Antipyrin durch Peroxidase zu magentafarbenen Chinonimin und H2O. In einer Ausführungsform umfasst die Detektionslösung daher Lipase, Glycerolkinase, Glycerol-3-phosphat-Oxidase und Peroxidase. Die Absorption des Chinonimins, gemessen bei 500 nm, ist proportional zu der Menge an Triglyceriden.
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Die Menge an Cholesterol kann z.B. wie von Allain et al. (1974, Clin Chem, 20/4:470–475) und Deacon et al. (1979, Clin Chem, 25/6:976–984) beschrieben bestimmt werden. Hierbei können Cholesterolester zunächst durch eine Cholesterolesterase in Cholesterol und freie Fettsäuren umgesetzt werden; Cholesterol wird dann mit Sauerstoff durch eine Cholesteroloxidase in 4-Cholesten-3-on und Wasserstoffperoxid umgesetzt; und letzteres wird mit Phenol und 4-Amino-Antipyrin durch eine Peroxidase zu farbigem, pinkem Chinonimin und H2O umgesetzt. In einer Ausführungsform umfasst die Detektionslösung daher Cholesteroloxidase und Peroxidase. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Detektionslösung Cholesterolesterase, Cholesteroloxidase und Peroxidase. Die Absorption von Chinonimin, gemessen bei 500 nm, ist proportional zu der Menge an Cholesterol.
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In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Reaktor-Detektor-Einheit einen Y-Kanal mit einem ersten Eingang, einem zweiten Eingang und einem Ausgang auf, wobei der erste Eingang oder Einlass in Fluidverbindung mit dem Reservoir für eine Detektionslösung steht, der zweite Eingang oder Einlass in Fluidverbindung mit der Hohlfaser steht und der Ausgang in Fluidverbindung mit dem Bubble-Train-Reaktor steht. Der Y-Kanal dient zum Zusammenführen der der in Fraktionen separierten Blutprobe und einer Detektionslösung. Kanalbreite, -höhe und -materialien entsprechen denen des in Strömungsrichtung nachfolgenden Bubble-Train-Reaktors. Die Strömungsführung der Einlässe ist vorzugsweise symmetrisch, damit keine der beiden Flüssigkeiten bevorzugt einströmt. Der Öffnungswinkel des Y-Kanals, d.h. der Winkel den der erste und der zweite Eingang zwischen sich einschließen, sollte kleiner als 90° sein, beispielsweise 30°. Da die Vermischung der Flüssigkeiten im Y-Kanal so weit wie möglich verhindert werden sollte, sind kleine Öffnungswinkel von 30° bevorzugt.
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Weiterhin umfasst die Reaktor-Detektor-Einheit einen Bubble-Train-Reaktor. Bubble-Train-Reaktoren sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt. Ein Bubble-Train-Reaktor wird beispielsweise in der Dissertation von Rainer Gruber mit dem Titel "Radial Mass Transfer Enhancement in Bubble-Train Flow", Aachen, 2001, näher beschrieben.
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Der Bubble-Train-Reaktor verhindert auf vorteilhafte Weise eine axiale Rückvermischung durch Kompartmentierung des Flüssigkeitsstroms. Hierdurch kann die Konzentration der nachzuweisenden Verbindung in jedem einzelnen Tropfen bestimmt und eine Verteilungskurve erstellt werden. In der Verteilungskurve sind auch geringste Änderungen in der Zusammensetzung einzelner Lipoproteinkomplexe erkennbar, da dies zu einer Verschiebung oder Veränderung der Verteilungskurve führen würde. So wird es beispielsweise möglich, auch denaturierte Proteine innerhalb eines Lipoproteinkomplexes nachzuweisen.
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Darüber hinaus umfasst der Bubble-Train-Reaktor beispielswiese eine Meanderstruktur, welche die Tropfen durchlaufen. Die Tropfen werden hierdurch zusätzlich besonders gut durchmischt. In einer beispielhaften Ausführungsform ist es bevorzugt, wenn der Bubble-Train-Reaktor durch eine elektrische Heizvorrichtung geheizt oder durch ein Peltierelement beheizt oder gekühlt wird, um optimale Reaktionsbedingungen einzustellen. Die Enzymreaktionen laufen typischerweise zwischen 30°C und 40°C ab. Prinzipiell können auch andere Reaktionen in dem Gerät durchgeführt werden. Bei exothermen Reaktionen kann somit gezielt gekühlt, bei endothermen Reaktionen geheizt werden.
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Die Mischung aus dem Blutplasma und der Detektionslösung wird vorzugsweise von einem Ölstrom in Tropfen zerteilt, bevor sie in den Bubble-Train-Reaktor einströmt. Alternativ können auch andere hydrophobe Phasen verwendet werden, solange keine Löslichkeit für die Probe oder das als Detektionslösung verwendete Enzym besteht. Zum Beispiel sind auch Gase wie Luft, Stickstoff und Argon grundsätzlich zur Verwendung im Bubble-Train-Reaktor geeignet. Vorzugsweise ist die Frequenz, mit der die Tropfen in den Ölstrom abtropfen, zwischen 50 Hz und 1000 Hz, noch bevorzugter 100 Hz. Das durchschnittliche Tropfenvolumen ist 5 nl oder weniger, z.B. 5 nl, 4.5 nl, 4 nl, 3.5 nl, 3 nl, 2.5 nl, 2 nl oder 1.5 nl. Vorzugsweise ist das durchschnittliche Tropfenvolumen 2.5 nl. Anders ausgedrückt ist das durchschnittliche Tropfenvolumen zwischen 1.5 nl und 5 nl, vorzugsweise zwischen 2 nl und 3 nl.
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Der Bubble-Train-Reaktor hat eine Kanallänge von 30 mm bis 1500 mm. Die Kanäle sind durch die Meanderstruktur sehr platzsparend angeordnet, daher verändert sich die Kartuschengröße durch Änderung der Reaktorkanallänge nicht. Durch die kleinen Volumnia der Tropfen und die exakte Bestimmung der Konzentration durch den Detektor ist es möglich, die Reaktion schon vor Ende abzubrechen und somit die Gesamtanalysezeit zu verringern. Dadurch verkürzt sich die Länge des Bubble-Train-Reaktors.
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Am Ende des Reaktors hört die bevorzugte Meanderstruktur auf und der Kanal wird auf einer gewissen Länge gerade weiter geführt, bevor er über einen Auslass in einen Abfallbehälter geleitet wird. Der Reaktor ist beispielsweise komplett aus Kunststoff, aus mit Glas verklebtem Kunststoff oder komplett aus Glas gefertigt, wobei zumindest der Detektionsbereich transparent ist. Diese transparenten Bereiche bilden die Detektionszone, die so ausgestaltet ist, dass eine in der Analysevorrichtung angeordnete Detektionseinheit die Konzentration einer Verbindung in einer durch die Detektionszone fließenden Probe erfassen kann.
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Beispielsweise umfasst die Detektionseinheit einen Detektionslaser und einen Detektor, beispielsweise einen Photodetektor. Der Laser leuchtet von oben in die Detektionszone und der Detektor befindet sich darunter (oder umgekehrt). Mit einer (doppelten) Laserlichtschranke wird vorzugsweise die Tropfengeschwindigkeit und -größe unmittelbar vor der eigentlichen Detektionseinheit ermittelt. Mit dieser Information werden Pulsdauer und -frequenz des Detektionslasers so eingestellt, dass jeder Tropfen zumindest einmal und vorzugsweise mehrmals verteilt über seine Länge vom Detektionslaser getroffen bzw. beleuchtet wird und der Detektor einen oder mehrere Messwerte aufnehmen kann. Die Verwendung einer Laserlichtschranke ist nicht zwingend notwendig, aber vorteilhaft. Alternativ ist es möglich, auf diese oder ein anderes Mittel zur Erfassung der Geschwindigkeit und der Länge der Tropfen zu verzichten und Länge und Fließgeschwindigkeit der Tropfen bei Auswertung der von dem Detektor erfassten Messwerte rechnerisch zu bestimmen.
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In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Aufnahmeeinheit eine Blutplasmaabtrennungseinheit, die derart angeordnet und ausgebildet ist, dass eine in der Aufnahmeeinheit aufgenommene Blutprobe in der Blutplasmaabtrennungseinheit auf Blutplasma reduziert werden kann, bevor die auf das Blutplasma reduzierte Blutprobe nachfolgend zusammen mit einem über die Anschlusseinheit in das Wechselmodul eingebrachten Laufmittel in die Hohlfaser strömen kann.
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Die Blutplasmaabtrennungseinheit ist in der Lage, einer Blutprobe Blutplasma zu entziehen, d.h. aus einer Blutprobe Blutplasma abzutrennen. Geeignete Blutplasma-Abtrennungseinheiten, deren Größe für patientennahe Diagnoseverfahren geeignet ist, sind im Stand der Technik bekannt und wurden beispielsweise durch Lee und Ahn (2013, Lab Chip, 13:3261–3267) und Yang et al. (2006, Lab Chip, 6:871–880) beschrieben.
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Lee und Ahn beschreiben z.B. eine Blutplasma-Abtrennungseinheit, in welcher die Plasmafraktion von der zellulären Fraktion des Blutes mittels eines asymmetrischen kapillaren Mikrokanals getrennt wird, der einen hydrophoben Abschnitt und eine superhydrophile Oberfläche umfasst. Während die zellulären Komponenten den hydrophoben Abschnitt nicht passieren können, ist das Plasma in der Lage diesen Bereich der Kapillare zu durchfließen. Diese Blutplasma-Abtrennungseinheit hat den Vorteil, dass unverdünntes Blut verwendet werden kann, ohne dass es zu einer Verstopfung kommt. Gleichzeitig ist die Abtrennungseinheit ausreichend schnell und einfach zu bedienen, so dass sie für eine patientennahe Anwendung in Frage kommt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Blutplasma-Abtrennungseinheit daher die von Lee und Ahn in Lab Chip, 2013, 13:3261–3267, beschriebene Blutplasma-Abtrennungseinheit.
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Yang et al. beschreiben eine Blutplasma-Abtrennungseinheit, in welcher die Plasmafraktion von der zellulären Fraktion des Blutes durch einen Y-förmigen Kanal unter Ausnutzung des Zweifach-Fung-Effektes getrennt wird. In einer weiteren Ausführungsform ist die Blutplasma-Abtrennungseinheit die von Yang et al. in Lab Chip, 2006, 6:871–880 beschriebene Blutplasma-Abtrennungseinheit.
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Alternativ können die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren Blutplasma verwenden, das durch andere Verfahren und Vorrichtungen von den zellulären Blutbestandteilen getrennt wurde. Geeignete weitere Verfahren zur Plasmagewinnung sind z.B. die Trennung durch Zentrifugation oder die direkte Plasmagewinnung durch Plasmapheresegeräte.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Reaktor-Detektor-Einheit ein weiteres Reservoir für eine weitere Detektionslösung, einen weiteren Bubble-Train-Reaktor sowie eine weitere Detektionszone. Die Hohlfaser und das weitere Reservoir stehen für eine weitere Detektionslösung derart mit dem weiteren Bubble-Train-Reaktor und der weiteren Detektionszone in Fluidverbindung, dass die in dem Hohlfasermembranmodul in Fraktionen aufgeteilte Blutprobe zusammen mit der weiteren Detektionslösung aus dem weiteren Reservoir durch den weiteren Bubble-Train-Reaktor zu der weiteren Detektionszone strömen kann. Die weitere Detektionszone ist derart ausgebildet, dass eine Konzentration einer Verbindung in der zusammen mit der Detektionslösung in die weitere Detektionszone eingeströmten Blutprobe mittels einer Detektionseinheit nachgewiesen werden kann, wobei die Detektionseinheit in einer Analysevorrichtung angeordnet ist, in der das Wechselmodul verwendet wird. So wird die gleichzeitige Detektion von mehreren verschiedenen Verbindungen aus dem Blutplasma möglich.
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Dabei ist es weiterhin bevorzugt, wenn die Reaktor-Detektor-Einheit einen weiteren Y-Kanal mit einem ersten Eingang, einem zweiten Eingang und einem Ausgang aufweist, wobei der erste Eingang des weiteren Y-Kanals in Fluidverbindung mit dem weiteren Reservoir für eine Detektionslösung steht, der zweite Eingang des weiteren Y-Kanals in Fluidverbindung mit der Hohlfaser steht und der Ausgang des weiteren Y-Kanals in Fluidverbindung mit dem weiteren Bubble-Train-Reaktor steht. Die weiteren Elemente der Reaktor-Detektor-Einheit sind entsprechend zu den übrigen Elementen ausgebildet, so dass die verschiedenen Ausführungsformen und Vorteile auch auf diese Elemente zutreffen.
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Die Erfindung ist insbesondere für die Verwendung in patientennaher Labordiagnostik geeignet. Patientennahe Labordiagnostik bezeichnet diagnostische Untersuchungen, die nicht in einem Labor, sondern z.B. im Krankenhaus unmittelbar auf der Krankenstation, in der Praxis eines niedergelassenen Arztes, in einer Apotheke, in der Wohnung eines Patienten oder in einem Notarztwagen durchgeführt werden.
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Es ist daher besonders vorteilhaft, dass das erfindungsgemäße Wechselmodul eine sehr geringe Größe aufweisen kann. Vorzugsweise weist das Wechselmodul maximale äußere Abmessungen von 20 cm × 15 cm × 10 cm oder weniger auf. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform weist das Wechselmodul maximale Abmessungen von 15 cm × 12 cm × 7,5 cm oder weniger auf. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform weist das Wechselmodul maximale Abmessungen von 10 cm × 7.5 cm × 5 cm oder weniger auf.
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Eine "Verbindung" im Sinne der Erfindung kann ein einzelnes Molekül oder ein Molekülkomplex sein. Molekülkomplexe werden z.B. durch Van-der-Waals-Kräfte und/oder Ionenbindungen zusammengehalten.
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Die nachgewiesene Verbindung ist eine Verbindung, die in Blutplasma, vorzugsweise humanem Blutplasma vorkommt. Der Begriff "Blutplasma" umfasst alle nicht-zellulären Verbindungen des Blutes, wie z.B. Zucker (wie Glukose), Proteine, Lipide, Proteinkomplexe (wie Lipoproteinkomplexe), Cholesterin, Hormone, Stoffwechselprodukte, physiologische Salze, Kohlenstoffdioxid, Stickstoffmonoxid und Sauerstoff. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindung ein oder mehrere Lipoproteinkomplexe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus VLDL, LDL, und HDL. Das Wechselmodul ist somit vorzugsweise für die Erstellung eines Lipoproteinprofils (d.h. eines Lipoproteinkomplexprofils) vorgesehen.
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Die erfindungsgemäßen Wechselmodule unterscheiden sich je nach nachzuweisender Verbindung. Insbesondere unterscheidet sich die Detektionslösung je nach nachzuweisender Verbindung. In einer Ausführungsform ist die Verbindung VLDL, LDL und/oder HDL und die Detektionslösung umfasst die Enzyme Lipase, Glycerolkinase, Glycerol-3-phosphat-Oxidase und Peroxidase. In dieser Ausführungsform werden Triacylglyceride in VLDL, LDL und HDL nachgewiesen. In einer weiteren Ausführungsform ist die Verbindung VLDL, LDL und/oder HDL und die Detektionslösung umfasst die Enzyme Cholesterolesterase, Cholesteroloxidase und Peroxidase. In dieser Ausführungsform werden Cholesterol und Cholesterolester in VLDL, LDL und HDL nachgewiesen. Die Anregung des Reaktionsprodukts erfolgt bei 532 nm. Die Fluoreszenzantwort erfolgt bei 580 nm. Die Intensität der Fluoreszenz korreliert mit der Konzentration und dem Reaktionsfortschritt. In einer weiteren Ausführung könnte die Absorption bei 500 nm gemessen werden.
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Das Wechselmodul weist in einer bevorzugten Ausführungsform einen Tank für ein Laufmittel auf, der dazu eingerichtet ist, mit einer in einer Analysevorrichtung angeordneten Pumpe in Fluidverbindung gebracht zu werden, wenn das Wechselmodul in der Analysevorrichtung verwendet wird. Dies hat den Vorteil, dass sämtliche Verbrauchsmittel der Analysevorrichtung im Wechselmodul bereitgestellt werden und keine zusätzlichen Verbrauchsmittel manuell in die Analysevorrichtung eingeführt werden müssen. Der Tank hat beispielsweise ein Volumen von 20 ml. Der Tank kann allerdings auch ein Volumen von 15 ml oder weniger, 10 ml oder weniger, oder 5 ml oder weniger aufweisen.
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Das Laufmittel dient als Transportmedium für das Blutplasma und ist in der Lage, vom Inneren der semipermeablen Hohlfasermembran nach außen auszutreten. Bei dem Laufmittel handelt es sich um eine wässrige Flüssigkeit, wie z.B. Wasser oder eine wässrige Pufferlösung. Vorzugsweise ist das Laufmittel eine physiologische Lösung, d.h. eine Lösung, die Blutplasmakomponenten, wie Proteine, nicht denaturiert. Geeignete pH-Werte, Salzkonzentrationen etc. für physiologische Lösungen sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für geeignete physiologische Lösungen sind z.B. phosphatgepufferte oder Tris-gepufferte Salzlösung oder andere gegenüber dem Blutplasma isotonische Salzlösungen.
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Alternativ ist es allerdings auch möglich, einen Tank für ein Laufmittel in einer Analysevorrichtung vorzusehen.
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In einem weiteren Aspekt wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe durch eine Analysevorrichtung zum patientennahen Nachweis von Verbindungen in einer Blutprobe mit einer Pumpe, einer Steuerungseinheit und zumindest einer Detektionseinheit gelöst. Die Analysevorrichtung ist zur Verwendung eines Wechselmoduls nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen eingerichtet. Die Pumpe ist dazu eingerichtet, mit einer Anschlusseinheit eines mit der Analysevorrichtung verwendeten Wechselmoduls derart in Fluidverbindung gebracht zu werden, dass Laufmittel aus der Analysevorrichtung mittels der Pumpe über die Anschlusseinheit in das Wechselmodul eingebracht werden kann. Die Steuerungseinheit ist dazu eingerichtet, die Pumpe, die Detektionseinheit und die Komponenten eines mit der Analysevorrichtung verwendeten Wechselmoduls zu steuern. Die Detektionseinheit ist dazu eingerichtet, eine Konzentration einer Verbindung in einer zusammen mit einer Detektionslösung in eine Detektionszone eines in der Analysevorrichtung verwendeten Wechselmoduls eingeströmten Blutprobe nachzuweisen.
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Die Analysevorrichtung weist in einer beispielhaften Ausführungsform einen mit einem Deckel verschlossenen Aufnahmemechanismus auf. Das Öffnen des Deckels legt einen Aufnahmemechanismus für das Wechselmodul frei. Das Wechselmodul wird in das Gerät eingelegt und vorzugsweise mittels einer oder mehrerer Schienen oder aber mittels einer Schnappverbindung oder durch ein Stecksystem justiert. Durch das Schließen des Deckels wird ein Anschlussmechanismus in Gang gesetzt. Der Mechanismus stellt die elektrischen, optischen, mechanischen und fluidischen Verbindungen zwischen dem Gehäuse, dem Wechselmodul und dem Deckel her. Ein Verriegelungsmechanismus verhindert das Öffnen des Deckels im Betrieb.
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Erfindungsgemäß ist lediglich eine Pumpe für den Plasmatransport und die Auftrennung des Plasmas in der HF5 notwendig. Durch eine geeignete Verschaltung des Laufmittels und eine entsprechende Steuerung der Pumpe wird das Laufmittel verwendet, um das Plasma durch den Hohlfasertrennkanal zu transportieren. Das Plasma wird als Flüssigkeitspfropfen in die Hohlfaser geschoben. Sobald der Pfropfen in der Hohlfasermembran ist, wird die Strömung umgeschaltet und das Laufmittel fließt von beiden Enden in die Hohlfaser ein und permeiert durch die Membran, so dass das Plasma in der Membran fokussiert wird. Nach der Fokussierungsphase wird die Flussrichtung des Laufmittels wieder verändert. Dann spült das Laufmittel das getrennte Plasma aus der Hohlfaser in den Bubble-Train-Reaktor.
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Zur Steuerung der Analysevorrichtung und eines darin eingesetzten Wechselmoduls ist eine Steuereinheit vorgesehen. Dabei handelt es sich beispielsweise um einen oder mehrere Mikrocontroller oder einen oder mehrere integrierte Schaltkreise.
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Vorzugsweise ist eine optische Detektoreinheit vorgesehen, die eine Lichtquelle und einen Detektor umfasst, mit dem eine Intensität einer in der untersuchten Probe angeregten Strahlung oder eine Absorption des von der Lichtquelle emittierten Lichts durch die untersuchte Probe erfasst werden kann. Beispielsweise kann zur Anregung ein Laser verwendet werden. Alternativ ist es auch möglich, wenn viele verschiedene Wellenlängen zur Bestimmung der Konzentration verschiedener Verbindungen benötigt werden, beispielsweise eine Xenonlampe zu verwenden, die Licht mit einem breitbandigen Spektrum erzeugt, dass über dichorische Spiegel in die benötigten Wellenlängen getrennt werden kann, oder eine Anzahl an Lasern mit verschiedener Wellenlänge zu verwenden. Der Detektor ist geeignet, eine Farbänderung in der Mischung aus Detektionslösung und Blutplasmakomponenten zu erkennen, z.B. durch Fluoreszenz- oder Absorptionsmessungen.
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Vorzugsweise weist die Analysevorrichtung eine weitere Detektionseinheit auf, die dazu eingerichtet ist, eine Konzentration einer weiteren Verbindung in einer zusammen mit einer weiteren Detektionslösung in eine weitere Detektionszone eines in der Analysevorrichtung verwendeten Wechselmoduls eingeströmten Blutprobe nachzuweisen. So können Konzentrationen mehrerer Verbindungen parallel bestimmt werden.
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Die Detektionseinheit weist vorzugsweise ein Mittel zur Erfassung einer Fließgeschwindigkeit der zusammen mit der Detektionslösung in die Detektionszone eines in der Analysevorrichtung verwendeten Wechselmoduls einströmenden Blutprobe auf. Die weitere Detektionseinheit weist vorzugsweise ebenfalls ein Mittel zur Erfassung einer Fließgeschwindigkeit der zusammen mit der weiteren Detektionslösung in die weitere Detektionszone eines in der Analysevorrichtung verwendeten Wechselmoduls einströmenden Blutprobe auf. Beispielsweise können hier doppelte Laserlichtschranken verwendet werden.
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Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der Analysevorrichtung und deren Vorteile ergeben sich aus den bereits beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der verwendeten Wechselmodule.
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In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein System zum patientennahen Nachweis von Verbindungen in einer Blutprobe mit einem Wechselmodul gemäß einer der beschriebenen Ausführungsformen und einer Analysevorrichtung gemäß einer der beschriebenen Ausführungsformen. Die Vorteile des Systems entsprechen den Vorteilen der in dem System verwendeten Komponenten.
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In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum patientennahen Nachweis von Verbindungen in einer Blutprobe, bei dem
- (a) die Blutprobe mit einem Laufmittel durch eine Hohlfasermembran strömt und dabei mittels Fluss-Feldflussfraktionierung in verschiedene Fraktionen aufgeteilt wird;
- (b) die aus der Hohlfasermembran austretende und in Fraktionen aufgeteilte Blutprobe und eine Detektionslösung unter Mischung der Blutprobe und der Detektionslösung zusammengeführt werden;
- (c) die Mischung aus Blutprobe und Detektionslösung durch einen Bubble-Train-Reaktor strömt, wodurch die Mischung in Tropfen unterteilt wird; und
- (d) eine Konzentration einer Verbindung in der in Tropfen aufgeteilten Blutprobe detektiert wird.
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In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren einen Schritt (a1), bei dem man Blutplasma aus einer Blutprobe abtrennt. Das Volumen der Blutprobe ist vorzugsweise zwischen 100 µl und 300 µl. Für die Analyse ist lediglich ungefähr 1 µl Blutplasma nötig. Somit wird etwa 4 µl Blut benötigt. Technisch ist weniger als 100 µl Blut schwer abzunehmen. Überschüssiges Blutvolumen wird verworfen oder verbleibt in der Aufnahmeeinheit.
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Vorzugsweise beträgt die Flussrate des Laufmittels vor der Mischung mit der Blutplasmaprobe 5 µl/min. Die Flussrate des Laufmittels kann jedoch auch schneller oder langsamer sein.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann überraschenderweise in einer sehr geringen Zeit durchgeführt werden. Die Zeitspanne von der Trennung des Blutplasmas aus einer Blutprobe bis zur abgeschlossenen Detektion aller Plasmafraktionen ist 30 min oder weniger, vorzugsweise 15 min oder weniger.
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Die Erfindung wird nachfolgend detaillierter anhand von Beispielen von Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben, wobei
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1 eine schematische Darstellung einer beispielhaften Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Systems mit einer beispielhaften Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Analysevorrichtung und einer beispielhaften Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Wechselmoduls zeigt und
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2 ein Ablaufdiagramm ist, das einen beispielhaften Ablauf eines erfindungsgemäßen Verfahrens darstellt.
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In 1 ist ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Systems 1 zum patientennahen Nachweis von Verbindungen in einer Blutprobe mit einem Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Wechselmoduls 3 zum patientennahen Nachweis von Verbindungen in einer Blutprobe und einem Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Analysevorrichtung 5 dargestellt, wobei in 1 das Wechselmodul 3 in der Analysevorrichtung 5 angeordnet ist. Das erfindungsgemäße Wechselmodul 3 umfasst eine Aufnahmeeinheit 7 für eine Blutprobe, eine Anschlusseinheit 9 zur Verbindung des Wechselmoduls 3 mit der Analysevorrichtung 5, ein Hohlfasermembranmodul 11 sowie eine Reaktor-Detektor-Einheit 13. Von der Analysevorrichtung 5 sind lediglich eine Pumpe 15, eine Detektionseinheit 17 sowie eine Steuerungseinheit 19 dargestellt.
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Das Wechselmodul 3 ist eine austauschbare Einheit, oft auch als Kartusche bezeichnet, die zur Analyse einer einzelnen Probe in die Analysevorrichtung 5 eingesetzt wird. Hierfür kann die Analysevorrichtung 5 beispielsweise einen verschließbaren Aufnahmeschacht mit entsprechenden Führungselementen aufweisen. In dem Aufnahmeschacht sind zudem diverse Verbindungselemente vorgesehen, über die eine Verbindung zwischen dem Wechselmodul 3 und der Analysevorrichtung 5 hergestellt werden kann. Dabei umfasst das Wechselmodul 3 sämtliche nachfolgend näher beschriebenen Komponenten, die zur Analyse der Blutprobe notwendig sind und die während der Analyse durch die Blutprobe kontaminiert werden. So ist auf vorteilhafte Weise keine Dekontamination der Analysevorrichtung 5 selbst notwendig, nachdem eine Blutprobe analysiert worden ist.
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Zunächst umfasst das Wechselmodul 3 die Aufnahmeeinheit 7, die zur Aufnahme eines einzelnen Bluttropfens vorgesehen ist. Derartige Aufnahmeeinheiten 7 sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Grundsätzlich können entsprechende Aufnahmeeinheiten 7 zur Aufnahme von einer bereits auf Blutplasma reduzierten Blutprobe oder auch – wie im vorliegenden Ausführungsbeispiel – zur Aufnahme einer Blutprobe, die noch nicht auf Blutplasma reduziert worden ist, geeignet sein. Um eine Blutprobe, die durch eine Aufnahmeöffnung 21 in die Aufnahmeeinheit 7 eingebracht worden ist, auf Blutplasma zu reduzieren, ist in der Aufnahmeeinheit 7 eine Blutplasmaabtrennungseinheit 23 in Form einer Zellbarriere 23 angeordnet. Die Aufnahmeeinheit 7 weist zudem eine Zufuhröffnung 25 auf, durch die ein Laufmittel in die Aufnahmeeinheit 7 einströmen kann.
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Das Laufmittel, beispielsweise Wasser oder eine wässrige Pufferlösung, entstammt aus einem Tank 27 für Laufmittel, der in dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel ebenfalls in dem Wechselmodul 3 angeordnet ist. Grundsätzlich ist auch denkbar, dass dieser Tank 27 in der Analysevorrichtung 5 selbst angeordnet ist. Die Anordnung innerhalb des Wechselmoduls 3 hat jedoch den Vorteil, dass sämtliche Verbrauchsmittel mit dem Wechselmodul 3 bereitgestellt werden und ein Verwender des Wechselmoduls 3 und der Analysevorrichtung 5 beispielsweise keinen gesonderten Tank für Laufmittel auffüllen muss. Zur Förderung des Laufmittels aus dem Tank 27 ist die Pumpe 15 vorgesehen, die Teil der Analysevorrichtung 5 ist und nicht mit dem Wechselmodul 3 ausgetauscht wird. Sofern im Folgenden auf eine Steuerung bzw. einen Betrieb der Pumpe 15 Bezug genommen wird, so erfolgt diese Steuerung durch die Steuerungseinheit 19 der Analysevorrichtung 5 über nicht dargestellte Signal- und/oder Datenleitungen.
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Um den Tank 27 für das Laufmittel mit der Pumpe 15 zu verbinden und das Laufmittel nach dem Durchlaufen der Pumpe 15 wieder in das Wechselmodul 3 einzubringen, ist die Anschlussvorrichtung 9 mit einem Einlass 29 und einem Auslass 31 vorgesehen. Über den Auslass 31 kann Laufmittel von der Pumpe 15 aus dem Tank 27 entnommen werden und wieder über den Einlass 29 in das Wechselmodul 3 eingebracht werden.
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Das über den Einlass 29 wieder in das Wechselmodul 3 eingebrachte Laufmittel kann über ein 3/2-Wege-Ventil 33 wahlweise der Zufuhröffnung 25 der Aufnahmeeinheit 7 oder dem Hohlfasermembranmodul 11 zugeführt werden. Im Betrieb erfolgt die Steuerung des 3/2-Wege-Ventils 33 und auch der weiteren Steuermittel der für das Laufmittel vorgesehenen Leitungen durch die Steuereinheit 19 der Analysevorrichtung 5 über eine nicht dargestellte Daten- bzw. Signalschnittstelle zwischen dem Wechselmodul 3 und der Analysevorrichtung 5 und entsprechenden Daten- bzw. Signalleitungen. In dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel sind nur einige der Steuerelemente der für das Laufmittel vorgesehenen Leitungen schematisch dargestellt. Die dargestellten Steuerelemente und Leitungen sind keinesfalls als abschließend zu betrachten. Vielmehr stellen sie lediglich eine Auswahl von Steuerelementen dar, die die Erklärung des Betriebs des Wechselmoduls 3 erleichtern sollen. Die Notwendigkeit und mögliche Anordnungen weiterer Steuerelemente ergeben sich für den Fachmann aus der Beschreibung des Betriebs des erfindungsgemäßen Systems 1.
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Die Aufnahmeeinheit 7 steht über nicht näher bezeichnete Leitungen mit dem Hohlfasermembranmodul 11 derart in Fluidverbindung, dass die auf Blutplasma reduzierte Blutprobe gemeinsam mit durch die Zufuhröffnung 25 eingeströmten Laufmittel in eine in dem Hohlfasermembranmodul 11 angeordnete Hohlfasermembran 35 einströmen kann. Die Hohlfasermembran 35 weist eine Länge von ungefähr 10 cm und einen Durchmesser von ungefähr 200 µm auf. Das Hohlfasermembranmodul 11 weist weiterhin einen Hohlraum 37 auf, in den durch die Hohlfasermembran 35 hindurchgetretenes Laufmittel entweichen kann. Das in den Hohlraum 37 entwichene Laufmittel kann über einen Auslass 39 in einen ebenfalls im Wechselmodul 3 angeordneten Abfalltank 41 ablaufen. Durch die Anordnung des Abfalltanks 41 in dem Wechselmodul 3 wird sichergestellt, dass sämtliches verunreinigtes Laufmittel in dem Wechselmodul 3 aufgefangen wird und die Analysevorrichtung 5 auch hierdurch nicht verunreinigt werden kann.
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Zur Durchführung der HF5 ist die Hohlfasermembran 35 aus einem semi-permeablen Material, wie beispielsweise Polyethersulfon und Polysulfon, gebildet, das für das Laufmittel durchlässig ist. Durch entsprechende Ansteuerung des 3/2-Wege-Ventils 33 und der Pumpe 15 sowie einem steuerbaren Ventil 42 kann Laufmittel in die Hohlfasermembran 35 aus zwei Richtungen eingeleitet werden, so dass die auf das Blutplasma reduzierte Blutprobe in der eigentlichen HF5 in ihre verschiedenen Fraktionen aufgeteilt wird. Während der HF5 ist ein in Strömungsrichtung hinter der Hohlfasermembran 35 angeordnetes steuerbares Ventil 43 geschlossen.
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Sobald die auf das Blutplasma reduzierte Blutprobe, im folgenden kurz als Blutprobe bezeichnet, vollständig in ihre einzelnen Fraktionen aufgeteilt worden ist, wird das steuerbare Ventil 43 geöffnet und das 3/2-Wege-Ventil 33 wieder so geschaltet, dass die in Fraktionen aufgeteilt Blutprobe in Richtung der Reaktor-Detektor-Einheit 13 strömen kann. Bevor die Blutprobe in die Reaktor-Detektor-Einheit 13 einströmt, passiert sie noch ein weiteres 3/2-Wege-Ventil 45, über das Laufmittel und Komponenten der Probe, die nicht untersucht werden sollen, direkt in den Abfalltank 41 geleitet werden können.
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In dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel ist die Reaktor-Detektor-Einheit 13 dazu eingerichtet, dass Konzentrationen zweier verschiedener Komponenten, beispielsweise Cholesterol und Triacylglyceride, in der Blutprobe nachgewiesen werden können. Hierzu umfasst die Reaktor-Detektoreinheit 13 zwei Reservoire 47, 49 für Detektionslösungen, zwei Y-Kanäle 51, 53, zwei Bubble-Train-Reaktoren 55, 57 und zwei Detektionszonen 59, 61. Jedes der Reservoire 47, 49 umfasst eine Detektionslösung zum Nachweis der Konzentration einer bestimmten Komponente in der Blutprobe.
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Das Reservoir 47 umfasst in dem beschriebenen Ausführungsbeispiel z.B. eine Detektionslösung zum Nachweis der Konzentration von Triglyceriden, während das Reservoir 49 z.B. eine Detektionslösung zum Nachweis der Konzentration von Cholesterol umfasst.
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Die Detektionslösung zum Nachweis der Konzentration von Triglyceriden in Reservoir 47 würde z.B. Lipase, Glycerolkinase, Glycerol-3-phosphat-Oxidase und Peroxidase umfassen. Dabei ist die Lipase zur Umsetzung von Triglyceriden in Glycerol und freie Fettsäuren; die Glycerolkinase zur Umsetzung von Glycerol mit ATP in Glycerol-3-phosphat und ADP; die Glycerol-3-Phosphat-Oxidase zur Umsetzung von Glycerol-3-phosphat mit Sauerstoff in Dihydroxyaceton-Phosphat und Wasserstoffperoxid; und die Peroxidase zur Umsetzung von 4-Chlorophenol und 4-Amino-Antipyrin zu Chinonimin und H2O geeignet. Die Detektionslösung kann neben den genannten Enzymen weitere notwendige oder vorteilhafte Verbindungen, wie z.B. ATP, Sauerstoff und H2O, umfassen.
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Die Detektionslösung zum Nachweis der Konzentration von Cholesterol in Reservoir 49 würde z.B. Cholesterolesterase, Cholesteroloxidase und Peroxidase umfassen. Dabei ist die Cholesterolesterase zur Umsetzung von Cholesterolester in Cholesterol und freie Fettsäuren; die Cholesteroloxidase zur Umsetzung von Cholesterol mit Sauerstoff in 4-Cholesten-3-on und Wasserstoffperoxid; und die Peroxidase zur Umsetzung von Wasserstoffperoxid mit Phenol und 4-Amino-Antipyrin zu Chinonimin und H2O geeignet. Die Detektionslösung kann neben den genannten Enzymen weitere notwendige oder vorteilhafte Verbindungen, wie z.B. Sauerstoff, Phenol und 4-Amino-Antipyrin und H2O, umfassen.
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Die Reservoire 47, 49 sind als Zylinder-Kolben-Anordnung ausgebildet, wobei die Kolben so angeordnet sind, dass sie von in der Analysevorrichtung 5 angeordneten Aktuatoren betätigt werden können. Die Zylinder-Kolben-Anordnung ist in der Zeichnung nicht dargestellt. Damit stellen die Reservoire 47, 49 auf vorteilhafte Weise gleichzeitig günstige Einwegpumpen dar. Bei Betätigung der Kolben werden die Detektionslösungen über einen ersten Eingang 63 in einen der Y-Kanäle 51, 53 gedrückt. Über einen zweiten Eingang 65 strömt zeitgleich in die Y-Kanäle 51, 53 die in Fraktionen aufgeteilte Blutprobe ein. Dabei bilden der erste und der zweite Eingang 63, 65 jeweils einen Winkel von ungefähr 30° zwischen einander aus, um eine Vermischung der Flüssigkeiten in den Y-Kanälen 51, 53 so weit wie möglich zu vermeiden. Die Vermischung sollte an dieser Stelle so weit wie möglich vermieden werden, damit es nicht zu einer axialen Rückvermischung kommt. Mit anderen Worten soll vermieden werden, dass sich beim Mischen der Detektionslösungen mit der in Fraktionen aufgeteilten Blutprobe Verwirbelungen bilden, die dazu führen, dass sich die einzelnen Fraktionen der Blutprobe wieder vermischen und die Aufteilung der Blutprobe in Fraktionen nachträglich verschlechtert wird.
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In Strömungsrichtung hinter den Y-Kanälen 51, 53 wird die Mischung aus Blutprobe und Detektionslösung durch einen Ölstrom zerteilt, der aus einem Ölreservoir 67 entnommen wird. Das Ölreservoir 67 kann analog den Reservoiren 47, 49 für die Detektionslösungen als Zylinder-Kolben-Anordnung ausgebildet sein, die von einem Aktuator betätigt wird, der Teil der Analysevorrichtung 5 ist. Die Frequenz, mit der die Mischung aus Blutprobe und Detektionslösung in den Ölstrom abtropft, beträgt 100 Hz und das bevorzugte Tropfenvolumen 2.5 nl. Die Tropfen durchlaufen nachfolgend eine Meanderstruktur 69, in der die Tropfen gut durchmischt werden. Da die Blutprobe an dieser Stelle bereits in verschiedene Tropfen aufgeteilt ist, besteht die Gefahr einer axialen Rückvermischung und damit der Verschlechterung der Fraktionierung nicht mehr. Die schematische Zeichnung in 1 zeigt, um die Darstellung zu vereinfachen, eine Meanderstruktur 69 mit nur wenigen Bögen.
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Tatsächlich umfassen die Bubble-Train-Reaktoren 55, 57 Meanderstrukturen 69 mit einer Vielzahl von Bögen.
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In Strömungsrichtung hinter den Bubble-Train-Reaktoren 55, 57 strömt die Mischung aus Blutprobe und Detektionslösung in die Detektionszonen 59, 61, in denen die Konzentration der verschiedenen Komponenten mittels Detektionseinheiten 17, die in der Analyseeinrichtung 5 angeordnet sind, untersucht werden. In dem dargestellten Ausführungsbeispiel wird zur Untersuchung der Konzentration jeweils eine Anordnung aus einem Detektionslaser 71, 73 und einem Fotodetektor 75, 77 verwendet. Werden die oben beschriebenen Detektionslösungen zum Nachweis der Konzentration von Triacylglyceriden und Cholesterol in Reservoir 47, 49 verwendet, so wird vorzugsweise die Absorption von Chinonimin bei 500 nm gemessen. Die Detektionslaser 71, 73 und die Fotodetektoren 75, 77 sind über nicht dargestellte Datenleitungen mit der Steuerungseinheit 19 verbunden. Die Bestimmung der Konzentrationen kann beispielsweise durch Absorptionsmessungen oder über die Messung einer Intensität von Fluoreszenz bei bekannten Wellenlängen erfolgen. Eine Auswertung der Absorptionsmessungen bzw. Fluoreszenzmessungen durch die auf die Konzentration von Verbindungen Beziehung alle Komponenten in der Blutprobe geschlossen werden kann, erfolgt in der beispielhaften Ausführungsform in 1 durch die Steuerungseinheit 19. Werden die oben beschriebenen Detektionslösungen zum Nachweis der Konzentration von Triacylglyceriden und Cholesterol in Reservoir 47, 49 verwendet, und die Absorption des Chinonimin bei 500 nm gemessen, so ist die Absorption des Chinonimins proportional zu der Menge an Triglyceriden bzw. Cholesterol.
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Nicht dargestellt sind in 1 Leitungen die im Anschluss an die Detektionszonen 59, 61 die untersuchten Blutproben in den Abfalltank 41 zurückführen und auch so eine Kontamination der Analysevorrichtung 5 vermeiden.
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Mit dem erfindungsgemäßen System 1 aus einem Wechselmodul 3 und einer Analysevorrichtung 5 mit den in den vorhergehenden Absätzen beschriebenen Komponenten lässt sich eine auf ein Blutplasma reduzierte Blutprobe auf vorteilhafte Weise patientennah in Fraktionen zerlegen und die in Fraktionen zerlegte Blutprobe auf die Konzentration verschiedener Komponenten untersuchen.
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Ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens, wie es beispielsweise mit dem in 1 dargestellten System 1 durchgeführt werden könnte, soll nachfolgend kurz anhand des Ablaufdiagramms in 2 erläutert werden. In dem Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens wird zunächst in einem ersten Schritt 79 eine Blutprobe in die Aufnahmeeinheit 7 gegeben. Von dort strömt die Blutprobe, nachdem sie in der Aufnahmeeinheit 7 mittels der Zellbarriere 23 auf Blutplasma reduziert worden ist, gemeinsam mit einem Laufmittel in einem zweiten Schritt 81 durch die Hohlfasermembran 35 des Hohlfasermembranmoduls 11, wo sie einer Trennung mittels HF5 unterzogen wird. Am Ausgang des Hohlfasermembranmoduls 11 strömt die in Fraktionen aufgeteilte Blutprobe in einem dritten Schritt 83 durch einen Y-Kanal 51, 53, wo eine Detektionslösung zugeführt wird. Die Mischung aus Detektionslösung und der in Fraktionen aufgeteilten Blutprobe tropft in einem vierten Schritt 85 in einen Bubble-Train-Reaktor 55, 57 ab, d.h., sie wird unter Beigabe eines Öls in Tropfen unterteilt. Schließlich wird in einem fünften Schritt 87 eine Konzentration einer Verbindung in der Blutprobe in den Detektionszonen 59, 61 von einer Detektionseinheit 17 detektiert. Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen den Vorteilen des erfindungsgemäßen Systems 1, mit dem das Verfahren durchgeführt wird.
