DE102014108044A1

DE102014108044A1 - Lichtmikroskop mit einer rotierbaren Scheibe und Verfahren zum Mikroskopieren mit diesem

Info

Publication number: DE102014108044A1
Application number: DE102014108044.0A
Authority: DE
Inventors: Manfred Loth; Gunter Möhler
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2014-06-06
Filing date: 2014-06-06
Publication date: 2015-12-17
Anticipated expiration: 2034-06-07
Also published as: DE102014108044B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Mikroskopieren einer Probe mit einem Lichtmikroskop, welches insbesondere die Gewinnung konfokaler Aufnahmen gemäß der Aperture Correlation Microscopy ermöglicht. Die Erfindung betrifft im Weiteren ein Lichtmikroskop mit einer rotierbaren Scheibe (04) und mit Lichtquellen (14, 16, 17), welche die Aufnahme eines Übersichtsbildes ermöglichen. Gemäß dem Verfahren wird eine in einem Beleuchtungsstrahlengang (03) angeordnete Scheibe (04) rotiert. Die Scheibe (04) umfasst einen strukturierten Kreisausschnitt (08) zum Erzeugen von strukturiertem Beleuchtungslicht und einen unstrukturierten Kreisausschnitt (07) zur Aufnahme des Übersichtsbildes. Es erfolgt abwechselndes Beleuchten der Probe zumindest mit Licht in einem ersten Wellenlängenbereich und mit Licht in einem vom ersten Wellenlängenbereich verschiedenen zweiten Wellenlängenbereich, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt (07) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet. Weiterhin erfolgt ein abwechselndes Beleuchten der Probe zumindest mit Licht im ersten Wellenlängenbereich und mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich jeweils mit einer Frequenz oberhalb einer Flimmerverschmelzungsfrequenz, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt (08) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein Verfahren zum Mikroskopieren einer Probe mit einem Lichtmikroskop, welches insbesondere eine rotierende Scheibe (Spinning Disk) mit einem strukturierten Kreisausschnitt umfasst, zur Durchführung einer sogenannten Aperture Correlation Microscopy. Die Erfindung betrifft im Weiteren ein Lichtmikroskop mit einer rotierbaren Scheibe (Spinning Disk) und mit Lichtquellen, welche die Aufnahme eines Übersichtsbildes ermöglichen.
Die DE 10 2012 007 045 A1 zeigt eine Vorrichtung zur konfokalen Mikroskopie, bei welcher zusätzlich zur konfokalen Information eine Weitfeldinformation aufgenommen wird. Im Beleuchtungsstrahlengang befindet sich eine Anregungsmaske, die bevorzugt ein- oder zweidimensionale Strukturierungen aufweist. Die Anregungsmaske ist für ein Licht mit einer ersten physikalischen Eigenschaft transparent, während sie einem Licht mit einer zweiten physikalischen Eigenschaft eine räumliche Struktur aufprägt. Die unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften können durch unterschiedliche Wellenlängenbereiche gebildet sein. Das Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft ist zur Gewinnung der konfokalen Information vorgesehen, während das Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft die Gewinnung der Weitfeldinformation ermöglichen soll.
Die DE 10 2012 009 836 A1 zeigt ein konfokales Lichtmikroskop mit einer polychromatischen Lichtquelle. Im Beleuchtungsstrahlengang befindet sich ein strukturiertes Element zum Erzeugen von strukturiertem Beleuchtungslicht. Das Lichtmikroskop umfasst weiterhin Fokussiermittel zum Erzeugen einer Tiefenauflösung. Die Fokussiermittel weisen eine chromatische Längsaberration auf.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Darstellung eines farbigen Übersichtsbildes einer zu mikroskopierenden Probe für die Einrichtung eines Objektivs eines konfokalen Lichtmikroskops zu verbessern und auch ein unmittelbares Betrachten der im Lichtmikroskop befindlichen Probe zu erleichtern.
Die genannte Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß dem beigefügten Anspruch 1 sowie durch ein Lichtmikroskop gemäß dem beigefügten nebengeordneten Anspruch 6.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Mikroskopieren einer Probe mit einem Lichtmikroskop, welches insbesondere die Gewinnung konfokaler Aufnahmen gemäß der Aperture Correlation Microscopy ermöglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht zum einen die Aufnahme eines farbigen Übersichtbildes, welches zusätzlich zu den konfokalen Aufnahmen gewonnen wird und die verbesserte Einrichtung eines Objektivs erlaubt. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht zum anderen das flimmerfreie unmittelbare Betrachten der Probe durch einen Benutzer.
Gemäß dem Verfahren wird eine in einem Beleuchtungsstrahlengang angeordnete Scheibe rotiert. Derartige Scheiben werden auch als Messscheibe oder als Spinning Disk bezeichnet. Die Scheibe umfasst einen strukturierten Kreisausschnitt zum Erzeugen von strukturiertem Beleuchtungslicht, insbesondere zur Durchführung der Aperture Correlation Microscopy. Die Scheibe umfasst weiterhin einen unstrukturierten Kreisausschnitt, welcher die Aufnahme eines Übersichtsbildes erlaubt. Der unstrukturierte Kreisausschnitt ist transparent und bevorzugt durch einen freien Durchgang, d. h. durch eine Öffnung in der Scheibe gebildet, oder er umfasst zumindest einen solchen freien Durchgang. Jedenfalls ist der unstrukturierte Kreisausschnitt bzw. der freie Durchgang der Scheibe dazu geeignet, dass durch diesen hindurch das Übersichtsbild der Probe aufgenommen werden kann. Die Scheibe kann weitere Kreisausschnitte, beispielweise opake Kreisausschnitte umfassen. Die rotierende Scheibe führt zu periodischen Phasen, in denen die Probe mit dem strukturierten Licht beleuchtet wird, und zu periodischen Phasen, in denen die Aufnahme des Übersichtsbildes ermöglicht ist. Die Scheibe befindet sich gleichfalls in einem Bildaufnahmestrahlengang. Bei den beiden Kreisausschnitten handelt es sich insbesondere um Kreissektoren.
Gemäß dem Verfahren erfolgt ein Beleuchten der Probe, wenn sich der unstrukturierte transparente Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, um in dieser Zeit das Übersichtsbild aufzunehmen. Um ein farbiges Übersichtsbild mit einer monochromatischen Detektionseinheit aufnehmen zu können, erfolgt ein abwechselndes Beleuchten der Probe zumindest mit Licht in einem ersten Wellenlängenbereich und mit Licht in einem vom ersten Wellenlängenbereich verschiedenen zweiten Wellenlängenbereich in den zeitlichen Abschnitten, in denen sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Dies bedeutet nicht, dass bereits innerhalb eines einzigen dieser zeitlichen Abschnitte, d. h. innerhalb eines einzigen Durchlaufes des unstrukturierten Kreisausschnittes der Scheibe durch den Beleuchtungsstrahlengang der Wellenlängenbereich gewechselt werden muss. Im einfachsten Fall werden die mindestens zwei Wellenlängenbereiche aufeinanderfolgend für je eine Umdrehung der rotierenden Scheibe aktiviert. Das farbige Übersichtbild wird bevorzugt aus den spektralen Anteilen der mindestens zwei Wellenlängenbereiche additiv zusammengesetzt. Das abwechselnde Beleuchten der Probe zumindest mit Licht im ersten Wellenlängenbereich und mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, stellt einen ersten Modus des Beleuchtens dar.
Gemäß dem Verfahren erfolgt außerdem ein abwechselndes Beleuchten der Probe zumindest mit Licht im ersten Wellenlängenbereich und mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich jeweils mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Somit erfolgt das aufeinander folgende Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz und das aufeinander folgende Beleuchten der Probe mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich erfolgt ebenfalls mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz, wobei sich das Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich und das Beleuchten der Probe mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich abwechseln.
Bei der Flimmerverschmelzungsfrequenz handelt es sich um die Frequenz, bei der eine Folge von Lichtblitzen vom menschlichen Sehsinn als ein kontinuierliches Licht wahrgenommen wird. Unterhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz tritt ein Flimmern auf. Die Flimmerverschmelzungsfrequenz hängt von der Stärke der Reize, dem Adaptationszustand der Netzhaut sowie vom allgemeinen Aktivationsniveau des menschlichen Betrachters ab.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt die Flimmerverschmelzungsfrequenz bevorzugt mehr als 30 Hz; weiter bevorzugt mehr als 50 Hz und besonders bevorzugt mehr als 100 Hz.
Das abwechselnde Beleuchten der Probe zumindest mit Licht im ersten Wellenlängenbereich und mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich jeweils mit der Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, dient dazu, dass die Probe derart beleuchtet wird, dass sie durch den Benutzer unmittelbar und ohne störendes Flimmern betrachtet werden kann. Der Benutzer kann die in einem Messraum des Lichtmikroskops befindliche Probe beobachten, ohne dass die Probe bzw. der Messraum für den Benutzer flimmert.
Das abwechselnde Beleuchten der Probe zumindest mit Licht im ersten Wellenlängenbereich und mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich jeweils mit der Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, stellt einen zweiten Modus des Beleuchtens dar.
Der erste Modus des Beleuchtens und der zweite Modus des Beleuchtens alternieren während des Rotierens der Scheibe. Bevorzugt wechseln sich der erste Modus des Beleuchtens und der zweite Modus des Beleuchtens während einer Umdrehung der Scheibe genau ein Mal ab. Bevorzugt ist dabei permanent eine Beleuchtung gegeben, entweder im ersten Modus des Beleuchtens oder im zweiten Modus des Beleuchtens, sodass die Probe ständig durch das sich abwechselnde Licht, welches zumindest im ersten Wellenlängenbereich und im zweiten Wellenlängenbereich liegt, beleuchtet wird. Zwar wird die Probe im ersten Modus mit einer Frequenz ggf. unterhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz beleuchtet, jedoch führen die kurzen zeitlichen Abschnitte des ersten Modus nicht dazu, dass die Probe für den Betrachter flimmernd erscheint, da das flimmerfreie Beleuchten im zweiten Modus für den visuellen Sinneseindruck überwiegt. Die Scheibe liegt im Bildaufnahmestrahlengang sowohl der konfokalen Aufnahmen als auch des Übersichtsbildes.
Da ein abwechselndes Beleuchten der Probe mit dem Licht, welches zumindest im ersten Wellenlängenbereich und im zweiten Wellenlängenbereich liegt, sowohl dann erfolgt, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, als auch dann, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, kann ein quasi kontinuierliches Beleuchten der Probe gewährleistet werden. Das abwechselnde Beleuchten in denjenigen Zeitabschnitten, in denen sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, erfolgt für jeden der Wellenlängenbereiche jeweils mit der Einzelfrequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz. Besonders bevorzugt führt diese Beleuchtung dazu, dass die Probe sowohl im strukturierten als auch im unstrukturierten Modus im Wesentlichen zeitlich durchgehend beleuchtet wird. Wahrnehmbare Helligkeitsschwankungen treten damit nicht mehr auf. Damit wird die Probe in Bezug auf den menschlichen Sehsinn flimmerfrei beleuchtet. Somit ist das beim Benutzer entstehende Bild beim unmittelbaren Betrachten der Probe flimmerfrei.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass lediglich durch eine veränderte Ansteuerung bereits vorhandener Komponenten ein flimmerfreies unmittelbares Betrachten der Probe durch den Benutzer möglich ist, ohne dass es hierfür zusätzlicher Komponenten bedarf.
Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das abwechselnde Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich und mit Licht in einem vom ersten Wellenlängenbereich und vom zweiten Wellenlängenbereich verschiedenen dritten Wellenlängenbereich, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Bei diesen Ausführungsformen erfolgt das abwechselnde Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich und mit Licht im dritten Wellenlängenbereich jeweils mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Somit erfolgen das Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz, das Beleuchten der Probe mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz und das Beleuchten der Probe mit Licht im dritten Wellenlängenbereich mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz, wobei sich das Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, das Beleuchten der Probe mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich und das Beleuchten der Probe mit Licht im dritten Wellenlängenbereich abwechseln. Bei diesen Ausführungsformen kann das farbige Übersichtbild aus den spektralen Anteilen der drei Wellenlängenbereiche additiv zusammengesetzt werden, sodass zumindest ein sehr großer Teil der durch den Menschen wahrnehmbaren Farben im Übersichtsbild wiedergegeben werden kann.
Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens, liegen der erste Wellenlängenbereich im roten Spektralbereich des sichtbaren Lichtes, der zweite Wellenlängenbereich im grünen Spektralbereich des sichtbaren Lichtes und der dritte Wellenlängenbereich im blauen Spektralbereich des sichtbaren Lichtes. Insoweit ist ein RGB-System ausgebildet, welches als Farbsystem weit verbreitet ist und aufwandsarm zur Generierung des farbigen Übersichtsbildes genutzt werden kann.
Während des Beleuchtens der Probe mit dem strukturierten Beleuchtungslicht, d. h. während der periodisch auftretenden zeitlichen Phasen, in denen sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, werden bevorzugt die konfokalen Aufnahmen gewonnen. Das zu strukturierende Beleuchtungslicht wird bevorzugt mit einer Hauptlichtquelle erzeugt und ist unabhängig von dem Licht im ersten Wellenlängenbereich, dem Licht im zweiten Wellenlängenbereich und den Licht im dritten Wellenlängenbereich.
Während des Beleuchtens der Probe mit dem sich abwechselnden Licht, welches zumindest im ersten Wellenlängenbereich und im zweiten Wellenlängenbereich liegt, in den periodisch auftretenden zeitlichen Phasen, in denen sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, wird bevorzugt das Übersichtsbild gewonnen.
Die konfokalen Aufnahmen und das Übersichtsbild werden bevorzugt jeweils durch monochrome Bildwandlungen erzeugt, wobei zur Erzeugung des farbigen Übersichtsbildes mindestens zwei monochrome Bildwandlungen erfolgen. Die monochromen Bildwandlungen für die konfokalen Aufnahmen und für das Übersichtsbild erfolgen bevorzugt mit einer einzigen monochromen Detektionseinrichtung. Bei der monochromen Bildwandlung wird Licht, welches zumindest den ersten Wellenlängenbereich, den zweiten Wellenlängenbereich und ggf. auch den dritten Wellenlängenbereich umfassen kann, aber bevorzugt dem gesamten visuellen Spektrum entstammen kann, in ein elektrisches Signal gewandelt.
Der erste Wellenlängenbereich, der zweite Wellenlängenbereich und ggf. der dritte Wellenlängenbereich sind bevorzugt jeweils durch ein Linienspektrum gebildet, sodass zur Erzeugung des Lichtes im ersten Wellenlängenbereich, im zweiten Wellenlängenbereich und im dritten Wellenlängenbereich monochromatische Lichtquellen, wie z. B. LEDs verwendbar sind.
Die Einzelfrequenz, mit welcher die Probe jeweils mit Licht im ersten Wellenlängenbereich bzw. mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich bzw. mit Licht im dritten Wellenlängenbereich beleuchtet wird, beträgt bevorzugt mindestens 40 Hz; besonders bevorzugt mindestens 100 Hz. Folglich beträgt eine Globalfrequenz, mit welcher die Probe abwechselnd mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich und mit Licht im dritten Wellenlängenbereich beleuchtet wird, das Dreifache der genannten Einzelfrequenz, nämlich bevorzugt mindestens 120 Hz und weiter bevorzugt mindestens 300 Hz. Diese Globalfrequenz beträgt besonders bevorzugt mindestens 500 Hz. Bei den genannten Frequenzen ist eine flimmerfreie Beobachtung gewährleistet.
Die Scheibe wird mit einer Rotationsgeschwindigkeit rotiert, die bevorzugt zwischen 1.000 Umdrehungen/min und 10.000 Umdrehungen/min liegt. Besonders bevorzugt beträgt die Rotationsgeschwindigkeit 3.000 Umdrehungen/min. Entsprechend der Rotationsgeschwindigkeit ergibt sich eine Rotationsfrequenz in Hz, welche ein Sechzigstel der Rotationsgeschwindigkeit in Umdrehungen/min beträgt.
Das abwechselnde Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich und ggf. mit Licht im dritten Wellenlängenbereich erfolgt besonders bevorzugt mit einer der Rotationsfrequenz der Scheibe gleichenden Frequenz, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Somit erfolgt während genau einer Umdrehung der Scheibe ein Beleuchten entweder mit Licht im ersten Wellenlängenbereich oder mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich oder mit Licht im dritten Wellenlängenbereich, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet, wobei bei der nächsten Umdrehung der Scheibe ein Beleuchten mit Licht in einem anderen der mindestens zwei bzw. drei Wellenlängenbereiche erfolgt, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet.
Während einer Umdrehung der Scheibe befindet sich bevorzugt entweder der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe oder der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang.
Während der Dauer einer Umdrehung der Scheibe befindet sich der unstrukturierte Kreisausschnitt bevorzugt weniger als die Hälfte der Dauer der Umdrehung im Beleuchtungsstrahlengang. Besonders bevorzugt befindet sich während der Dauer einer Umdrehung der Scheibe der unstrukturierte Kreisausschnitt weniger als 20 % der Dauer der Umdrehung im Beleuchtungsstrahlengang, d.h. der unstrukturierte Kreisausschnitt nimmt ein Kreissegment von weniger als 20 % ein.
Das Licht zum Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, im zweiten Wellenlängenbereich und ggf. im dritten Wellenlängenbereich, welches insbesondere zur Aufnahme des Übersichtbildes und zum unmittelbaren Betrachten der Probe dient, fällt bevorzugt nicht durch die Scheibe.
Das erfindungsgemäße Lichtmikroskop dient insbesondere der Aperture Correlation Microscopy unter Nutzung einer Spinning Disk. Es umfasst bevorzugt eine Hauptlichtquelle zum Bereitstellen von Beleuchtungslicht. Das Lichtmikroskop umfasst weiterhin eine Detektionseinrichtung zum Nachweis des von einer Probe zurückgestrahlten Lichts. Eine weitere Komponente des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops bildet eine Mikroskopoptik zum Leiten des Beleuchtungslichtes auf die Probe und zum Leiten des von der Probe zurückgestrahlten Lichts in Richtung der Detektionseinheit.
In einem Beleuchtungsstrahlengang ist eine rotierbare Scheibe angeordnet, welche die Spinning Disk darstellt. Die Scheibe weist einen strukturierten Kreisausschnitt zum Erzeugen von strukturiertem Beleuchtungslicht aus dem von der Hauptlichtquelle bereitgestellten Beleuchtungslicht auf. Weiterhin besitzt die Scheibe einen unstrukturierten Kreisausschnitt zur Aufnahme eines Übersichtsbildes.
Das erfindungsgemäße Lichtmikroskop umfasst zudem mindestens eine erste Lichtquelle zur Aussendung von Licht in einem ersten Wellenlängenbereich und eine zweite Lichtquelle zur Aussendung von Licht in einem vom ersten Wellenlängenbereich verschiedenen zweiten Wellenlängenbereich, um das farbige Übersichtsbild aus mehreren monochromatischen Bildern aufnehmen zu können.
Eine weitere Komponente des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops bildet eine Ansteuereinheit zum Ansteuern zumindest der ersten Lichtquelle und der zweiten Lichtquelle. Die Ansteuereinheit ist dazu konfiguriert, die erste Lichtquelle und die zweite Lichtquelle abwechselnd einzuschalten, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Die Ansteuereinheit ist zudem dazu konfiguriert, die erste Lichtquelle und die zweite Lichtquelle abwechselnd und jeweils mit einer Frequenz oberhalb einer Flimmerverschmelzungsfrequenz einzuschalten, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet.
Die Ansteuereinheit kann als eine Einheit aus zwei Automaten aufgefasst werden. Der erste Automat steuert zumindest die erste Lichtquelle und die zweite Lichtquelle, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Somit dient der erste Automat zum Betreiben zumindest der ersten Lichtquelle und der zweiten Lichtquelle im oben beschriebenen ersten Modus. Der zweite Automat steuert zumindest die erste Lichtquelle und die zweite Lichtquelle, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Somit dient der zweite Automat zum Betreiben zumindest der ersten Lichtquelle und der zweiten Lichtquelle im oben beschriebenen zweiten Modus. Bevorzugt sind beide Automaten für einen durchlaufenen Betrieb ausgebildet, wobei der erste Automat eine höhere Priorität als der zweite Automat besitzt.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops umfassen weiterhin eine dritte Lichtquelle zur Aussendung von Licht in einem vom ersten Wellenlängenbereich und vom zweiten Wellenlängenbereich verschiedenen dritten Wellenlängenbereich. Bei diesen Ausführungsformen ist die Ansteuereinheit auch zum Ansteuern der dritten Lichtquelle ausgebildet. Die Ansteuereinheit ist dazu konfiguriert, die erste Lichtquelle, die zweite Lichtquelle und die dritte Lichtquelle abwechselnd einzuschalten, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet. Die Ansteuereinheit ist weiterhin dazu konfiguriert, die erste Lichtquelle, die zweite Lichtquelle und die dritte Lichtquelle abwechselnd und jeweils mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz einzuschalten, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe im Beleuchtungsstrahlengang befindet.
Die Detektionseinheit ist bevorzugt zur Aufnahme eines konfokalen Mikroskopbildes der mit dem strukturierten Beleuchtungslicht beleuchteten Probe und auch zur Aufnahme des Übersichtbildes ausgebildet. Somit umfasst das erfindungsgemäße Lichtmikroskop bevorzugt nur eine einzige monochrome Detektionseinheit.
Die Detektionseinheit ist bevorzugt zur Aufnahme monochromatischer Bilder ausgebildet. Dabei ist Detektionseinheit bevorzugt zur Wandlung von Licht aus dem gesamten visuellen Spektrum in ein elektrisches Signal ausgebildet.
Die Detektionseinheit weist bevorzugt ein zweidimensionales Feld aus Detektorelementen auf. Insbesondere ist die Detektionseinheit bevorzugt durch eine elektronische Messkamera gebildet.
Die rotierbare Scheibe ist bevorzugt kreisrund. Das erfindungsgemäße Lichtmikroskop umfasst bevorzugt weiterhin einen Elektromotor zum Antrieb der Scheibe.
Der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe ist bevorzugt durch eine willkürliche Anordnung von Lochblenden gebildet, die auch als Pinholes bezeichnet werden. Eine solche Struktur ermöglicht eine Aperture Correlation Microscopy.
Bei alternativen bevorzugten Ausführungsformen ist der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe durch mindestens ein Rastergitter gebildet.
Bevorzugt umfasst der strukturierte Kreisausschnitt der Scheibe zwei sich unterscheidende strukturierte Teilkreisausschnitte, beispielsweise zwei unterschiedliche Rastergitter.
Das erfindungsgemäße Lichtmikroskop umfasst bevorzugt weiterhin einen Positionssensor zur Bestimmung des Drehwinkels der Scheibe, der elektrisch mit der Ansteuereinheit verbunden ist. Entsprechend eines vom Positionssensor ausgegebenen Signals kann die Ansteuereinheit entweder in den ersten Modus oder in den zweiten Modus schalten.
Die erste Lichtquelle, die zweite Lichtquelle und ggf. auch die dritte Lichtquelle sind bevorzugt jeweils durch eine LED gebildet. Die erste Lichtquelle, die zweite Lichtquelle und ggf. auch die dritte Lichtquelle sind bevorzugt zwischen der Scheibe und der Probe angeordnet.
Das erfindungsgemäße Lichtmikroskop weist bevorzugt auch solche Merkmale auf, die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und dessen bevorzugten Ausführungsformen beschrieben sind. Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt bei dem erfindungsgemäßen Lichtmikroskop und dessen bevorzugten Ausführungsformen angewendet.
Weitere Vorteile, Einzelheiten und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung, unter Bezugnahme auf die Zeichnung. Es zeigen:
1: eine Prinzipdarstellung einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops;
2: eine Prinzipdarstellung einer LED-Ansteuerung des in 1 gezeigten Lichtmikroskops;
3: eine abgewandelte Ausführungsform einer in 1 gezeigten Messscheibe; und
4: ein zeitliches Diagramm zweier Modi des in 1 gezeigten Lichtmikroskops.
1 zeigt eine Prinzipdarstellung einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops. Das Lichtmikroskop umfasst ein Objektiv 01, welches auf eine zu mikroskopierende Probe (nicht gezeigt) zu richten ist. Die Bildaufnahme erfolgt mit einer monochromen Messkamera 02. Zwischen dem Objektiv 01 und der Messkamera 02 ist ein Strahlengang 03 ausgebildet, in welchem sich u. a. eine rotierbare kreisförmige Messscheibe 04 befindet, welche durch einen Motor 05 antreibbar ist, der wiederum durch eine Motorsteuerung 06 angesteuert wird. Die Messscheibe 04 rotiert bevorzugt mit 3.000 Umdrehungen/min. Die Messscheibe 04 ist in einen ersten Kreisausschnitt 07 und einen zweiten Kreisausschnitt 08 aufgeteilt, wobei der zweite Kreisausschnitt 08 wiederum in einen ersten Teilkreisausschnitt 09 und in einen zweiten Teilkreisausschnitt 11 aufgeteilt ist. Die beiden Kreisausschnitte 07, 08 und auch die beiden Teilkreisausschnitte 09, 11 sind jeweils durch einen Kreissektor gebildet. Der erste Kreisausschnitt 07 und die beiden Teilkreisausschnitte 09, 11 weisen jeweils einen Mittelpunktswinkel von 120° auf. Der erste Kreisausschnitt 07 weist einen freien Durchgang 12 auf, durch welchen Licht ungehindert hindurchtreten kann. Der zweite Kreisausschnitt 08 weist Strukturen (nicht dargestellt) auf, durch welche durch den zweiten Kreisausschnitt 08 hindurchtretendes Licht strukturiert wird, um eine Aperture Correlation Microscopy zu ermöglichen, bei welcher konfokale Aufnahmen mit der monochromen Messkamera 02 durchgeführt werden. Die Strukturen in den beiden Teilkreisausschnitten 09, 11 unterscheiden sich.
Zwischen der Messscheibe 04 und dem Objektiv 01 ist ein LED-Halter 13 angeordnet, der eine erste LED 14, eine zweite LED 16 und eine dritte LED 17 trägt. Die erste LED 14 emittiert bei Bestromung rotes Licht, die zweite LED 16 grünes Licht und die dritte LED 17 blaues Licht. Die drei LEDs 14, 16, 17 dienen insbesondere zur Beleuchtung der Probe, wenn mit der monochromen Messkamera 02 ein Übersichtsbild aufgenommen wird und auch zur ständigen Beleuchtung der Probe, damit diese durch den Benutzer unmittelbar betrachtet werden kann. Das Übersichtsbild wird in zeitlichen Abschnitten aufgenommen, in welchen sich der im ersten Kreisausschnitt 07 angeordnete freie Durchgang 12 im Strahlengang 03 befindet. Die drei LEDs 14, 16, 17 leuchten mit jeder Umdrehung der Messscheibe 04 abwechselnd, um die Probe abwechselnd mit rotem Licht, mit grünem Licht und mit blauem Licht zu beleuchten, sodass aus den Aufnahmen der monochromen Messkamera 02 ein farbiges Übersichtsbild generiert werden kann.
2 zeigt eine Prinzipdarstellung einer LED-Ansteuerung des in 1 gezeigten Lichtmikroskops. Die Ansteuerung der drei LEDs 14, 16, 17 erfolgt mithilfe eines FPGA 18, wofür der FPGA 18 über entsprechende Treiber 19 verfügt. Der FPGA 18 ist elektrisch mit einem Positionssensor 21 verbunden, mit welchem die Winkelposition der rotierenden Messscheibe 04 messbar ist. Der FPGA 18 ist dazu ausgebildet, die drei LEDs 14, 16, 17 abwechselnd in einem ersten Modus 22 und in einem zweiten Modus 23 zu betreiben. Die drei LEDs 14, 16, 17 werden im ersten Modus 22 betrieben, wenn sich der im ersten Kreisausschnitt 07 (gezeigt in 1) angeordnete freie Durchgang 12 im Strahlengang 03 befindet, d. h. wenn das Übersichtsbild aufgenommen wird. Die drei LEDs 14, 16, 17 werden im zweiten Modus 23 betrieben, wenn sich der zweite Kreisausschnitt 08 (gezeigt in 1) im Strahlengang 03 befindet.
Im ersten Modus 22 wird jeweils eine der drei LEDs 14, 16, 17 betrieben, solang sich der im ersten Kreisausschnitt 07 (gezeigt in 1) angeordnete freie Durchgang 12 im Strahlengang 03 befindet. Bei der nächsten Umdrehung der Messscheibe 04 wird eine andere der drei LEDs 14, 16, 17 betrieben, solang sich der im ersten Kreisausschnitt 07 (gezeigt in 1) angeordnete freie Durchgang 12 im Strahlengang 03 befindet. Die drei LEDs 14, 16, 17 werden mit den Umdrehungen der Messscheibe 04 zyklisch durchgeschaltet, sodass die Probe abwechselnd mit rotem Licht, mit grünem Licht und mit blauem Licht beleuchtet wird.
Im zweiten Modus 23 werden die drei LEDs 14, 16, 17 zyklisch nacheinander betrieben, solang sich der zweite Kreisausschnitt 08 (gezeigt in 1) im Strahlengang 03 befindet. Die Wechselfrequenz bezogen auf alle drei LEDs 14, 16, 17 beträgt bevorzugt 500 Hz, sodass jede der drei LEDs 14, 16, 17 mit einer Frequenz von 166 ²/₃ Hz betrieben wird. Erfindungsgemäß wird jede der drei LEDs 14, 16, 17 mit einer Frequenz oberhalb einer Flimmerverschmelzungsfrequenz betrieben, wobei die Flimmerverschmelzungsfrequenz typischerweise zwischen 40 Hz und 60 Hz liegt. Der zweite Modus 23 erlaubt ein flimmerfreies unmittelbares Betrachten der Probe durch den Benutzer.
3 zeigt eine abgewandelte Ausführungsform der in 1 gezeigten Messscheibe 04. Bei dieser abgewandelten Ausführungsform weist der erste Kreisausschnitt 07 einen Mittelpunktswinkel von nur etwa 40° auf, während der zweite Kreisausschnitt 08 einen Mittelpunktswinkel von etwa 320° aufweist. Bei dieser Ausführungsform können die konfokalen Aufnahmen präziser angefertigt werden. Der erste Kreisausschnitt 07 führt zum ersten Modus 22 (gezeigt in 2), während der zweite Kreisausschnitt 08 zum zweiten Modus 23 (gezeigt in 2) führt.
4 zeigt die zeitlichen Verläufe des ersten Modus 22 und des zweiten Modus 23 in einem Diagramm. Im zweiten Modus 23 werden die drei LEDs 14, 16, 17 (gezeigt in 1) ständig abwechselnd betrieben, was durch Diagrammverläufe R, G, B veranschaulicht ist. Der erste Modus 22 ist nur dann aktiv, wenn sich der im ersten Kreisausschnitt 07 (gezeigt in 1) angeordnete freie Durchgang 12 im Strahlengang 03 befindet. In diesen zeitlichen Abschnitten leuchtet jeweils nur einer der drei LEDs 14, 16, 17 (gezeigt in 1), was wiederum durch Diagrammverläufe R, G, B veranschaulicht ist. Diese zeitlichen Abschnitte sind bei der gezeigten Ausführungsform etwa 2 ms lang und treten bei jeweils einer Umdrehung der Messscheibe 04 (gezeigt in 2) auf.
Bezugszeichenliste

01: Objektiv
02: Messkamera
03: Strahlengang
04: Messscheibe
05: Motor
06: Motorsteuerung
07: erster Kreisausschnitt
08: zweiter Kreisausschnitt
09: erster Teilkreisausschnitt
10
11: zweiter Teilkreisausschnitt
12: freier Durchgang
13: LED-Halter
14: erste LED
15
16: zweite LED
17: dritte LED
18: FPGA
19: Treiber
20
21: Positionssensor
22: erster Modus
23: zweiter Modus

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 102012007045 A1 [0002]
DE 102012009836 A1 [0003]

Claims

Verfahren zum Mikroskopieren einer Probe mit einem Lichtmikroskop, folgende Schritte umfassend: – Rotieren einer in einem Beleuchtungsstrahlengang (03) angeordneten Scheibe (04), welche einen strukturierten Kreisausschnitt (08) zum Erzeugen von strukturiertem Beleuchtungslicht und einen unstrukturierten Kreisausschnitt (07) zur Aufnahme eines Übersichtsbildes aufweist; – abwechselndes Beleuchten der Probe zumindest mit Licht in einem ersten Wellenlängenbereich und mit Licht in einem vom ersten Wellenlängenbereich verschiedenen zweiten Wellenlängenbereich, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt (07) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet; und – abwechselndes Beleuchten der Probe zumindest mit Licht im ersten Wellenlängenbereich und mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt (08) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet, wobei das Beleuchten mit Licht jedes der mindestens zwei Wellenlängenbereiche mit einer Frequenz oberhalb einer Flimmerverschmelzungsfrequenz erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass – das abwechselnde Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich und mit Licht in einem vom ersten Wellenlängenbereich und vom zweiten Wellenlängenbereich verschiedenen dritten Wellenlängenbereich erfolgt, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt (07) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet; und dass – das abwechselnde Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich und mit Licht im dritten Wellenlängenbereich jeweils mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz erfolgt, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt (08) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Wellenlängenbereich im roten Spektralbereich liegt, dass der zweite Wellenlängenbereich im grünen Spektralbereich und dass der dritte Wellenlängenbereich im blauen Spektralbereich liegt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das abwechselnde Beleuchten der Probe mit Licht im ersten Wellenlängenbereich, mit Licht im zweiten Wellenlängenbereich und mit Licht im dritten Wellenlängenbereich mit einer der Rotationsfrequenz der Scheibe (04) gleichenden Frequenz erfolgt, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt (07) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchten, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt (08) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet, und das Beleuchten, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt (07) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet, im Wesentlichen zur selben Lichtintensität führen.
Lichtmikroskop, folgende Komponenten umfassend: – eine Detektionseinrichtung (02) zum Nachweis des von einer Probe zurückgestrahlten Lichts; – eine Mikroskopoptik (01) zum Leiten des Beleuchtungslichtes auf die Probe und zum Leiten des von der Probe zurückgestrahlten Lichts in Richtung der Detektionseinheit (02); – eine in einem Beleuchtungsstrahlengang (03) angeordnete rotierbare Scheibe (04) mit einem strukturierten Kreisausschnitt (08) zum Erzeugen von strukturiertem Beleuchtungslicht und mit einem unstrukturierten Kreisausschnitt (07) zur Aufnahme eines Übersichtsbildes; – eine erste Lichtquelle (14) zur Aussendung von Licht in einem ersten Wellenlängenbereich und eine zweite Lichtquelle (16) zur Aussendung von Licht in einem vom ersten Wellenlängenbereich verschiedenen zweiten Wellenlängenbereich; und – eine Ansteuereinheit (18) zum Ansteuern der ersten Lichtquelle (14) und der zweiten Lichtquelle (16), welche dazu konfiguriert ist, die erste Lichtquelle (14) und die zweite Lichtquelle (16) abwechselnd einzuschalten, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt (07) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet, und die weiterhin dazu konfiguriert ist, die erste Lichtquelle (14) und die zweite Lichtquelle (16) abwechselnd und jeweils mit einer Frequenz oberhalb einer Flimmerverschmelzungsfrequenz einzuschalten, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt (08) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet.
Lichtmikroskop nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es weiterhin eine dritte Lichtquelle (17) zur Aussendung von Licht in einem vom ersten Wellenlängenbereich und vom zweiten Wellenlängenbereich verschiedenen dritten Wellenlängenbereich umfasst, wobei die Ansteuereinheit (18) auch zum Ansteuern der dritten Lichtquelle (17) ausgebildet ist und dazu konfiguriert ist, die erste Lichtquelle (14), die zweite Lichtquelle (16) und die dritte Lichtquelle (17) abwechselnd einzuschalten, wenn sich der unstrukturierte Kreisausschnitt (07) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet, und die dazu konfiguriert ist, die erste Lichtquelle (14), die zweite Lichtquelle (16) und die dritte Lichtquelle (17) abwechselnd und jeweils mit einer Frequenz oberhalb der Flimmerverschmelzungsfrequenz einzuschalten, wenn sich der strukturierte Kreisausschnitt (08) der Scheibe (04) im Beleuchtungsstrahlengang (03) befindet.
Lichtmikroskop nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Lichtquelle, die zweite Lichtquelle und die dritte Lichtquelle jeweils durch eine LED (14, 16, 17) gebildet sind.
Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinheit (02) zur Aufnahme eines Mikroskopbildes der mit dem strukturierten Beleuchtungslicht beleuchteten Probe und zur Aufnahme des Übersichtbildes ausgebildet ist.
Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinheit (02) zur Aufnahme monochromatischer Bilder ausgebildet ist.