DE102012104679A1

DE102012104679A1 - Biotechnologische konversion von glycerin zu 2-amino-1,3-propandiol (serinol) in rekombinanten escherichia coli

Info

Publication number: DE102012104679A1
Application number: DE102012104679A
Authority: DE
Inventors: Björn Andreeßen; Alexander Steinbüchel
Original assignee: Westfaelische Wilhelms Universitaet Muenster
Current assignee: Westfaelische Wilhelms Universitaet Muenster
Priority date: 2011-05-30
Filing date: 2012-05-30
Publication date: 2012-12-06

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2-Amino-1,3-Propanediol (Serinol) ausgehend von einem Substrat enthaltend Glycerin, wobei dieses Verfahren die Umwandlung von Glycerin mittels einer Dihydroxyaceton-Phosphat Aminotransferase/Dihydro-rhizobitoxin Synthase (RtxA), oder eines Teils hiervon, vorzugsweise eines Teils, welcher mindestens die ersten 513 Aminosäuren des N-Terminus des besagten Enzymes (RtxA513) aufweist, aufweist.

Description

Glycerin ist aufgrund des Vorkommens als Nebenprodukt der Biodieselproduktion zu einer günstigen und im Überfluss vorhandenen Kohlenstoffquelle geworden. Aus 100 Tonnen Biodiesel, die durch die Transesterifikation von Pflanzenölen oder tierischen Fetten entstanden sind, werden 10 Tonnen Rohglycerin gebildet (Yazdani und Gonzalez, 2008). Das enorme Wachstum der Biodieselindustrie zwischen 2005 und 2007 führte zu einem Überschuss an Glycerin und damit einhergehend zu einem drastischen Preisverfall (Yazdani und Gonzalez, 2008). Als Folge davon entstanden Probleme für die Glycerin produzierende und raffinierende Industrie (McCoy, 2006). Beispiele hierfür sind Dow und Procter & Gamble, welche ihre Glycerin-Produktionen 2006 einstellten (Asad-ur-Rehman et al, 2008). Es ist daher nötig, hochwertige Produkte aus dem günstigen Rohstoff Glycerin herzustellen, um die Biodiesel Industrie wirtschaftlicher werden zu lassen.
Ein vielversprechendes Molekül hierfür ist das 2-Amino-1,3-Propandiol, besser bekannt als Serinol. Es ist in den letzten Jahren zu einem wichtigen Zwischenprodukt bei vielen chemischen Prozessen geworden (Darabantu 2010a and 2010b). Aminoalkohole wie Serinol werden als Vorläufermoleküle für die Synthese nicht ionischer Radiokontrastmittel wie 1-N,3-N-bis(1,3-Dihydroxypropan-2-yl)-5-[(2S)-2-Hydroxypropan-amido]-2,4,6-Triiodobenzen-1,3-Dicarboxamid (Iopamidol) verwendet und als Iopamiro^®, Isovue^® (beide Bracco Diagnostics Inc.) oder Scanlux^® (Sanochemia) vertrieben. Iopamidol dient als Kontrastmittel unter anderem bei der Angiographie des kardiovaskulären Systems (Villa und Paiocchi, 2003).
Außerdem ist Serinol ein Intermediat bei der Synthese von Schmerzmitteln. Hierfür werden verzweigte oder nicht verzweigte Alkylketten, die aus 12 bis 22 Kohlenstoffatomen bestehen, mit dem C2 Atom des Serinols verknüpft (Michaelis et al. 2009). Seit 1947 werden chirale (1R,2R) Phenylserinole als Vorstufen für die Synthese von Chloramphenicol verwendet (Darabantu et al. 1995).
Bis heute wird Serinol hauptsächlich chemisch aus 2-Nitro-1,3-Propandiol (Pfeiffer 1980, Thewalt et al. 1984, Felder et al. 1987), Dihydroxyaceton und Ammoniak (Felder et al. 1985), Dihydroxyaceton Oxim (Piloty und Ruff, 1897, Fedoronko et al. 1989, Nardi et al. 1999) oder 5-Amino-1,3-Dioxan (Quirk et al.1989, Kodali 2008) hergestellt.
Die erste Synthese von Serinol wurde 1897 von Piloty und Ruff beschrieben. Sie reduzierten 1,3-Dihydroxyaceton Oxim mit Natriumamalgam in Gegenwart von Aluminumsulphat. Um das entstandene Serinol zu reinigen wurde es in das entsprechende Hydrochlorid mit einer Ausbeute von 15% des eingesetzten Oxims umgewandelt. Effizienter war dagegen die Synthese durch Reaktion von Dihydroxyaceton Oxim mit Rhodium auf Aluminium durch Nardi et al. (1999). Sie erhielten 42% Serinol Hydrochlorid im Vergleich zum Ausgangsmaterial.
Um Serinol biologisch in vitro herzustellen wurden Aminoalkohol Dehydrogenasen verwendet. Itoh et al. (2000) isolierten eine Aminoalkohol Dehydrogenase (AMDH) aus Streptomyces virginiae IFO 12827. Diese katalysierte die reversible Dehydrogenierung von Serinol in Gegenwart von NAD⁺ zu Dihydroxyaceton, Ammonium-Ionen und NADH. Die reduktive Aminierung nutzt NADH als Cofaktor. Der K_m-Wert für Serinol liegt bei 4,0 mM. r Der K_m-Wert für Dihydroxyaceton in der reduktiven Aminierungsreaktion liegt bei nur 2,2 mM.
Des Weiteren ist Serinol ein Intermediat in der Rhizobitoxin (2-Amino-4-(2-Amino-3-Hydropropoxy)-trans-Buten-3-Säure) Synthese in Pflanzen durch den Pflanzen pathogenen Stamm Burkholderia andropogonis (Mitchell et al. 1986) und dem Leguminosen Symbionten Bradyrhizobium japonicum und seinem nahen Verwandten Bradyrhizobium elkanii (Owen et al. 1972). Serinol ist außerdem eine Verbindung die in Zuckerrohr vorkommt, wo es die Toxinbildung durch den pathogenen Pilz Helminthosporium sacchari vermittelt (Babczinski et al., 1978).
Tn5 Insertion in dem rtxA Gen von B. elkanii bewirkt eine Rhizobitoxin Null Mutante. Der N-terminale Bereich der Aminosäuresequenz von RtxA besitzt ein Motiv, das Homologien zu anderen Aminotransferasen besitzt (Ruan und Peters 1992, Ruan et al. 1993). Die 346 N-terminalen Aminosäuren von RtxA verfügen über 24 % Identität und 40 % Übereinstimmungen zu einer Aminotransferase aus Methanobacterium thermoautotrophicum (Smith et al., 1997). Mutanten mit der Insertion einer Kanamycin Resistenz Kassette innerhalb des rtxA Gens, die eine Disruption innerhalb der N-terminalen Domäne des Proteins verursacht, können kein Serinol akkumulieren (Yasuta et al 2001). Eine Insertion in dem C-terminalen Bereich führt zu einer Verminderung an Dihydrorhizobitoxin, einem Vorläufermolekül des Rhizobitoxins. Die 443 C-terminalen Aminosäurereste besitzen 41 % Identität und 56 % Übereinstimmungen mit einer O-Acetylhomoserin Sulfhydrolase aus Leptospira meyer (Bourhy et al., 1997). Yasuta et al. (2001) kamen so zu der Schlussfolgerung, dass RtxA mit einem Molekulargewicht von 90 kDa ein bifunktionales Enzym ist, das über Dihydroxyacetonephosphat Aminotransferase- und Dihydrorhizobitoxin Synthase-Aktivität verfügt.
Toxizität von Serinol
Der Wildtyp von E. coli K-12 (E. coli MG1655) wurde in Riesenberg(Rb)-Medium mit verschiedenen Serinol-Konzentrationen und 100 mM Glycerin als einzige Kohlenstoffquelle inkubiert. Eine extrazelluläre Konzentration von 0 bis 50 mM Serinol besitzt keinen Einfluss auf das Wachstumsverhalten. Bei einer weiteren Erhöhung des Serinol-Gehaltes sinkt das Wachstum bis es schließlich bei 200 mM Serinol zum Erliegen kommt. Des Weiteren kann E. coli Rb-Medium mit 50 mM Serinol selbst als alleinige Kohlenstoffquelle nicht verwerten.
Konstruktion rekombinanter E. coli Stämme
Genomische DNA wurde aus B. elkanii USD94 isoliert und für die Amplifikation von rtxA durch PCR verwendet. Dieses PCR-Produkt wurde anschließend mit den entsprechenden Enzymen geschnitten und in die Vektoren (i) pBBR1MCS-2, (ii) pACYCDuet-1, (iii) pCDFDuet-1, und (iv) pET19b unter der Kontrolle eines T7-Promoters ligiert. Um eine höhere Plasmidstabilität zu erreichen wurde eine Gentamicin Resistenz Kassette in den pET19b Vector integriert. Um den Einfluss der N-terminalen Domäne auf die Serinol Produktion zu untersuchen, wurde pET19b::rtxA::Gm mit Cfr42I (SacII) geschnitten und religiert (pET19b::rtxA513::Gm). Das entstandene Derivat verfügt nur über die ersten 513 Aminosäuren von RtxA. Protein Expression und in vivo Serinol Produktion wurde im Hintergrund des E. coli BL21(DE3), E. coli HMS174(DE3) oder E. coli Rosetta-gami B(DE3)/pLysS durchgeführt.
Enzym-Aktivität
E. coli strain BL21(DE3) und E. coli Rosetta-gami B(DE3)/pLysS wurden mit dem Plasmid pET19b::rtxA::Gm bzw. pET19b::rtxA513::Gm transformiert und mit oder ohne IPTG inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und Rohextrakte durch Ultraschall-Aufschluss hergestellt. 10His RtxA bzw. 10His RtxA513 wurden durch Ni⁺ NTA Affinitätschromatographie gereinigt. Der Puffer wurde anschließend mit Hife von Vivaspin 500 Säulen ausgetauscht. Sowohl RtxA als auch RtxA513 zeigten Aktivität mit Alanin, Asparagin- und Glutaminsäure als Cosubstrat. Allerdings ist die spezifische Aktivität mit Asparaginsäure am geringsten (RtxA: 0.086 µmol·mg protein^–1 min^–1 ± 0.006, RtxA513: 0.071 µmol mg protein^–1 min^–1 ± 0.005), mit Glutaminsäure wurde dagegen die höchste spezifische Aktivität erreicht (RtxA: 0.267 µmol mg protein^–1 min^–1 ± 0.020, RtxA513: 0.256 µmol mg protein^–1·min^–1 ± 0.019). Transaminierung mit Alanin und DHAP resultiert in einer spezifischen Aktivität von 0.155 µmol·mg protein^–1·min^–1 ± 0.013 (RtxA) bzw. 0.119 µmol·mg protein^–1·min^–1 ± 0.010 (RtxA513). Wie zu erwarten war, zeigen die Negativkontrollen ohne DHAP bzw. ohne Protein nur marginale Aktivitäten.
In vivo Serinolproduktion
E. coli HMS174(DE3) mit dem Plasmid pBBR1MCS-2::rtxA kann Serinol aus Glycerin durch Expression des bifunktionalen Enzyms Dihydroxyacetonphosphat Aminotransferase/Dihydrorhizobitoxin Synthase RtxA aus B. elkanii USD94 herstellen. Im Kulturüberstand konnten bis zu 200 mg/l (ca. 2.2 mM) Serinol durch high-pressure liquid chromatography (HPLC) nachgewiesen werden. Durch die Wahl unterschiedlicher Expressionsvektoren und Induktion mit bzw. ohne IPTG konnte die Ausbeute erhöht werden. Der Serinolgehalt konnte unter Verwendung von pACYCDuet-1 (induziert: 0.7 g/l, 7,7 mM; nicht induziert: 0.9g/l, 9.9mM) erhöht werden und erreicht mit dem Vektor pCDFDuet-1 (induziert: 0.95 g/l, 10.4 mM; nicht induziert: 2.8g/l, 30.7mM) den Maximalwert. Die Verwendungung eines anderen E. coli Stammes (E. coli C43 anstelle von E. coli BL21(DE3), HMS174(DE3), oder Rosetta-gami B(DE3)/pLysS) führte zu einer verminderten Serinol Produktion (E coli C43(DE3)/pCDFDuet-1::rtxA: 230 mg/l, 2,5 mM,). Allerdings konnte mit diesem Stamm der Einfluss auf die Serinol Produktion durch Supplementation mit verschiedenen Aminosäuren untersucht werden. Während die Zugabe von Asparagin- oder Glutaminsäure nur einen marginalen Effekt auf die Serinol Produktion von E. coli HMS174(DE3)/pCDFDuet-1::rtxA, E. coli BL21(DE3)/pCDFDuet-1::rtxA, bzw. E. coli Rosettagami B(DE3)/pLysS/pCDFDuet-1::rtxA hat, wird die Serinol Produktion um das 11fache erhöht, wenn E. coli C43(DE3)/pCDFDuet-1::rtxA in Gegenwart von 10 mM Glutaminsäure kultiviert wird. Mit geringeren Glutaminsäure Konzentrationen wird dieser Effekt reduziert (3,7fach bei 1 mM Glu, 7,5fach bei 5 mM Glu). Mit Asparaginsäure als Cosubstrat ist dieser Effekt geringer (kein Einfluss bei 1mM Asp, 1,33fach bei 5 mM Asp, 1,64fach bei 10 mM Asp). Die Zugabe beider Aminosäuren führt zu Ausbeuten vergleichbar mit der Supplementation von Glutaminsäure.
Aufgrund der Tatsache, dass IPTG Induktion zu Einschlusskörper-Bildung und damit einhergehend zu einer geringeren Serinol Konzentrationen führt, wurde ein anderer Weg der Induktion in Erwägung gezogen. Hierfür wurde das Hitze-Induktionssystem von Tabor und Richardson (1985) angewendet (pCDFDuet-1::rtxA::heat). In E. coli XL1-blue, der über keine chromosomal Kopie der T7-RNA Polymerase besitzt und gleichzeitig unter nicht induzierenden Bedingen kultiviert wurde (30 °C), wurden 0,4 g/l (4,4 mM) Serinol im Überstand akkumuliert. Eine Erhöhung der Kultivierungstemperatur auf 37 °C resultierte in einem 3,5fach höheren Serinol-Gehalt. In E. coli HMS174(DE3) und Rosetta-gami B(DE3)/pLysS, die beide über den lysogenen λ(DE3) Phagen verfügen, liegt die basale Serinolproduktion unter nicht induzierenden Bedingungen bei ca 2,8 g/l (30.7 mM, E. coli HMS174(DE3)/pCDFDuet-1::rtxA::heat) bzw. 0,8g/l (8,8 mM E. coli Rosetta-gami B(DE3)//pLysS/pCDFDuet-1::rtxA::heat). Durch die Hitze Induktion wird dieser Wert bei beiden Stämmen auf etwa 3,3g/l (36,2 mM) angehoben.
Reinigung von Serinol
Letztendlich konnten 36.2 mM (3,3g/l) Serinol mit E. coli HMS174(DE3)/pCDFDuet-1::rtxA::heat bzw. E. coli Rosetta-gami B(DE3)/pLysS/pCDFDuet-1::rtxA::heat im Überstand akkumuliert werden. Das Serinol konnte isoliert werden, indem es in das entsprechende Hydrochlorid überführt und das überschüssige Medium evaporiert wurde. Der getrocknete Rückstand wurde anschließend mit Aceton gewaschen und die Aceton-unlösliche Fraktion in Wasser gelöst. Die weitere Reinigung erfolgte mit Hilfe einer DOWEX^® 50WX8-100 Ionenaustausch Chromatographie. Serinol wurde mit 2 M NH₄OH Lösung eluiert. Auf diese Weise konnten 60% des Serinols aus dem Kulturüberstand gewonnen werden.
In vitro Derivatisierung von Serinol
Da Serinol Konzentrationen größer als 3,3 g/l erreicht werden konnten, scheint der intrazelluläre Serinol-Gehalt toxisch zu sein. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Konversion von Serinol in den entsprechenden Acylester angestrebt. Es wurde bereits beschrieben, dass die unspezifische Wachsester Synthase/Acyl-CoA:Diacylglycerol Acyltransferase (WS/DGAT) aus Acinetobacter baylyi ADP1 über ein breites Substratspektrum verfügt (Stöveken et al., 2005, Bin Kim et al., 2009). Serinol, Palmitoyl-CoA und gereinigte WS/DGAT aus A. baylyi ADP1 wurden für eine Stunde bei 30 °C inkubiert. Eine dominante Bande auf Höher der freien Säuren war deutlich im Autoradiogramm sichtbar. Sowohl GC-MS oder ESI-MS Analysen des Enzymtests mit nicht radioaktiv markiertem Pamitoyl-CoA ergaben, dass keine Acylester des Serinols gebildet wurden. Allerdings konnte bei HPLC-Analysen inklusive OPA-Vorsäulenderivatisierung eine Abnahme des Serinols gemessen werden. Allerdings wurden auch hier keine Serinol Acylester nachgewiesen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Stöveken et al., 2005 [0015]
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Claims

Verfahren zur Herstellung von 2-Amino-1,3-Propanediol (Serinol) ausgehend von einem Substrat enthaltend Glycerin, wobei dieses Verfahren die Umwandlung von Glycerin mittels einer Dihydroxyaceton-Phosphat Aminotransferase/Dihydrorhizobitoxin Synthase (RtxA), oder eines Teils hiervon, vorzugsweise eines Teils, welcher mindestens die ersten 513 Aminosäuren des N-Terminus des besagten Enzymes (RtxA513) aufweist, aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren ein in vitro Verfahren ist, in welchem RtxA und/oder ein Teil hiervon, vorzugsweise RtxA513, durch heterologe Expression eines rtxA Gens und/oder eines Teils hiervon, vorzugsweise eines Teils welcher mindestens fürRtxA513 kodiert, in einem geeigneten Expressionsstamm gewonnen wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren ein in vivo Verfahren ist, in welchem ein Mikroorganismus verwendet wird, der ein rtxA Gen und/oder einen Teil hier von, vorzugsweise einen Teil welcher mindestens für RtxA513 kodiert, aufweist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–3, wobei in dem Verfahren Glutaminsäure als Co-Substrat verwendet wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei das Substrat Glycerin, bevorzugt gewonnen aus der Biodieselproduktion, aufweist.
Ein Expressionsstamm und/oder ein Mikroorganismus, welcher ein rtxA Gen und/oder einen Teil hiervon, vorzugsweise mindestens einen Teil welcher für RtxA513 kodiert, aufweist.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5, oder ein Expressionsstamm oder ein Mikroorganismus gemäß Anspruch 6, wobei das rtxA Gen und/oder der Teil hiervon, vorzugsweise mindestens der Teil welcher für RtxA513 kodiert, aus Bradyrhizobium elkanii stammt.
Ein Expressionsstamm oder ein Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 2–7, wobei der Expressionsstamm oder der Mikroorganismus rekombinant und/oder prokaryotisch ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5 oder 7, oder ein Expressionsstamm oder ein Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 2–8, wobei der Expressionsstamm oder der Mikroorganismus ein rekombinanter E. coli ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5, und/oder 7–9, oder ein Expressionsstamm oder ein Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 2–9, wobei die Expression von RtxA und/oder eines Teils hiervon, vorzugsweise RtxA513, mit einem Hitze-Induktionssystem induziert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5, und/oder 7–10, wobei das Verfahren, um den toxischen Effekt für den Expressionsstamm oder den Mikroorganismus zu verbessern, darüber hinaus einen weiteren in vitro Derivatisierungsschritt des Serinols aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, worin das Serinol in den entsprechenden Acylester derivatisiert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5, und/oder 7–12, wobei das Verfahren darüber hinaus einen Schritt zur Aufreinigung des Serinols, vorzugsweise durch Umwandlung in Serinolhydrochlorid und Evaporation des restlichen Überstandes, aufweist.